HT-LM1004 ni maandalizi ya kimikrobu yanayotengenezwa kutoka kwa aina ya Lactiplantibacillus plantarum LM1004 iliyotengwa kutoka kimchi, kisha baada ya uchachushaji kuzimwa kwa joto na kukaushwa, huku ikikusudiwa kutokuwa na bakteria hai. Utafiti ulitathmini athari za HT-LM1004 kwenye kinga kupitia jaribio la binadamu la wiki 8 lililofanywa kwa nasibu, kwa upofu maradufu na kudhibitiwa kwa placebo; huku njia zinazowezekana za athari kwenye microbiome ya utumbo zikichunguzwa kwa mfumo tofauti wa Simulated Human Intestinal Microbiome Ecosystem (SHIME®). Katika jaribio la kliniki, watu 120 walipangiwa kwa nasibu kwa uwiano wa 1:1, na mwisho mkuu wa utafiti, yaani shughuli ya seli muuaji wa asili au natural killer (NK) cell activity, iliongezeka kwa kiasi kikubwa zaidi katika kundi la HT-LM1004 kuliko placebo katika uchanganuzi uliorekebishwa kwa covariate. Kwa upande mwingine, majaribio ya SHIME yalionyesha kuongezeka kwa baadhi ya taxa za vijidudu zenye wingi mdogo na mabadiliko ya utofauti wa vijidudu, asidi za nyongo na asidi za mafuta za mnyororo mfupi kulingana na eneo la koloni.

Ushahidi wenye nguvu zaidi katika jaribio la binadamu ni cytotoxicity ya seli za NK. Katika uchanganuzi wa ITT, tofauti iliyorekebishwa ya mabadiliko kutoka mwanzo kati ya HT-LM1004 na placebo iliripotiwa kuwa 4,1883 (p=0,0136) kwa E:T 6,25:1, 5,0487 (p=0,0139) kwa 12,5:1, 4,0441 (p=0,0465) kwa 25:1 na 4,1829 (p=0,0319) kwa 50:1. Katika uchanganuzi wa PP pia kulionekana tofauti yenye maana katika uwiano wote wanne. Hivyo, mwisho mkuu wa utafiti ulitoa matokeo katika mwelekeo uleule katika uwiano tofauti wa seli za NK/seli lengwa na katika makundi mawili ya uchanganuzi.

Hata hivyo, utafiti hauonyeshi moja kwa moja hitimisho kwamba “HT-LM1004 huzuia maambukizi au saratani.” Jaribio la kliniki halikupima marudio ya maambukizi, matukio ya saratani au hatari ya ugonjwa wa muda mrefu kama mwisho mkuu wa kliniki. Matokeo makuu yaliyopimwa ni cytotoxicity ya seli za NK iliyotathminiwa maabara. Kwa sababu ya jukumu la kibayolojia la seli za NK katika ulinzi dhidi ya virusi na ufuatiliaji wa uvimbe, waandishi wanajadili maana inayoweza kuwa ya kinga; lakini maana hii ya kibayolojia lazima itenganishwe na matokeo halisi ya kuzuia ugonjwa.

Sehemu ya SHIME pia si utafiti wa mekanizimu wa binadamu unaofuatilia microbiome ya utumbo ya washiriki wale wale wa kliniki. Kiigaji kilitumia jamii za vijidudu zilizoundwa kutoka kwa wafadhili tofauti wenye afya wa kinyesi katika vyumba vya koloni vya in vitro vilivyodhibitiwa. Kwa hiyo, utafiti huu haujathibitisha kwamba bakteria zenye wingi mdogo, asidi za nyongo na mabadiliko ya SCFA yaliyoonekana katika SHIME ndiyo yaliyosababisha moja kwa moja ongezeko la NK lililoonekana kwa washiriki wa kliniki. Waandishi pia wanatathmini uhusiano kati ya uundaji upya wa microbiome, mabadiliko ya metabolite na shughuli ya NK kama uhusiano unaowezekana wa kimahusiano na kimakanika, na wanaeleza kuwa uthibitisho wa moja kwa moja wa sababu na athari bado unahitajika.

Kwa upande wa usalama, katika kipindi cha wiki 8 malalamiko madogo ya mfumo wa upumuaji yaliripotiwa kwa %8,47 (watu 5) katika kundi la matibabu na %6,67 (watu 4) katika kundi la udhibiti; hakuna tukio baya la wastani au kali lililoripotiwa. Chanzo kinasema kuwa matukio haya yalikuwa ya muda mfupi na hayakuchukuliwa kuwa yanahusiana na bidhaa ya utafiti. Hata hivyo, matokeo haya yanapaswa kufasiriwa tu kwa muda wa wiki 8 wa utafiti na sampuli iliyochaguliwa ya watu wazima; usalama wa muda mrefu au usalama kwa wazee na watu wenye upungufu wa kinga haukujaribiwa moja kwa moja.

Je, HT-LM1004 ni Probiotic au Postbiotic?

Kulingana na maelezo ya utengenezaji katika chanzo, HT-LM1004 si maandalizi ya probiotic yenye viumbe hai, bali ni maandalizi yanayojumuisha seli za L. plantarum LM1004 na miundo yake ya seli iliyohifadhiwa ambayo, baada ya kuongezwa kwa uchachushaji, imekusudiwa kuzimwa kabisa kwa joto; katika utangulizi wa makala hali hii ya kibayolojia inaelezwa kwa dhana ya “postbiotic”, ingawa katika baadhi ya maelezo ya vielelezo na majadiliano pia hutumika neno “probiotic supplementation”.

Neno Probiotic kwa kawaida hutumika kwa vijidudu hai ambavyo, vinapotolewa kwa kiasi cha kutosha, humpa mwenyeji manufaa ya kiafya. Postbiotic hueleza wazo la kutumia vijidudu visivyo hai na/au vipengele vyake kama maandalizi yanayotoa manufaa ya kiafya kwa mwenyeji.

Katika utengenezaji wa HT-LM1004 lengo si kuruhusu bakteria hai kutawala utumbo. Chanzo kinaeleza kwamba biomasi ilikusanywa baada ya uchachushaji, uhai wa bakteria ukaondolewa kwa matibabu ya joto na kisha ikakaushwa. Miundo kama peptidoglycan, lipoteichoic acids na protini za uso katika ukuta na gamba la seli inaweza isiondolewe kabisa. Miundo hii ya kimikrobu huitwa microbe-associated molecular patterns (MAMPs) na inaweza kutambuliwa na pattern recognition receptors (PRRs) katika seli za kinga, kwa mfano Toll-like receptor 2 (TLR2).

Mekanizimu hii ya kibayolojia inaeleza kwa nini wazo rahisi kwamba “bakteria aliyekufa hawezi kufanya chochote” si sahihi. Ili microorganism izaliane lazima iwe hai; lakini mfumo wa kinga hauhitaji microorganism hiyo iwe hai ili kutambua ukuta wake wa seli au molekuli za uso.

LM1004 iliandaliwaje?

Chanzo kinaeleza kwamba LM1004 ilitengwa kutoka kimchi na utambulisho wa strain ukathibitishwa kwa 16S rRNA gene sequencing. Utengenezaji ulihusisha hatua za uchachushaji unaodhibitiwa, ukusanyaji wa biomasi, kuzimwa kwa joto na kukausha. Batch iliyotumika katika utafiti wa kliniki iliripotiwa kuwa 20OTF8, na batch iliyotumika katika jaribio la SHIME kuwa 10PTF6. Inasemwa kuwa namba hizi za batch ziliwekwa tofauti ili kuruhusu ufuatiliaji wa nyenzo katika majukwaa tofauti.

Katika maelezo ya kina ya utengenezaji katika sehemu ya majadiliano, kwanza culture ya seed ya saa 6–8 iliandaliwa katika medium yenye glucose, soy peptone na yeast extract katika 34 ± 0,5°C; kisha fermentation kuu ya saa 15–18 ilifanywa katika bioreactor ya 1.800 L katika medium yenye %6,6 glucose, %1,3 soy peptone, %1,5 yeast extract na chumvi za madini katika 34 ± 0,5°C. Gesi ya nitrojeni ilitumika kudumisha mazingira ya anaerobic katika fermentation kuu.

Wakati mkusanyiko wa bakteria ulipofikia takriban 1,6 × 10¹⁰ CFU/mL, biomasi ilikusanywa kwa centrifugation ya 12.000 rpm, ikachanganywa na cryoprotectants na, kama ilivyoripotiwa katika chanzo, ikatibiwa kwa joto la 90°C kwa dakika 30. Bidhaa ya mwisho ilikaushwa kwa kufungia na kusawazishwa.

Tofauti ya ndani ya chanzo kuhusu dozi

Sehemu mbili za chanzo kuhusu dozi na muundo wa capsule hazitumii maelezo yanayofanana kabisa. Sehemu ya mbinu inaeleza bidhaa ya utafiti kama capsule moja yenye 500 mg/siku ya unga wa HT-LM1004 na kusema kuwa capsule hai haikuwa na kiungo kingine hai au filler isiyo na shughuli. Hata hivyo, maelezo ya uzalishaji katika majadiliano yanaeleza kwamba unga ulisawazishwa kwa kiwango cha 2 × 10¹¹ seli/g, kiasi cha kila siku cha kiungo hai cha HT-LM1004 kilikuwa 0,1 g = 2 × 10¹⁰ cell equivalent, na kwamba kiasi hicho kilijazwa hadi uzito wa jumla wa capsule kwa kutumia excipients kama maltodextrin na magnesium stearate.

Chanzo hakielezi tofauti kati ya maelezo haya mawili ya formulation. Kwa hiyo, maandishi ya Verianla hayachagui kimya kimya moja kuwa “dozi sahihi” badala ya nyingine.

Shughuli ya Seli za NK Ilipimwaje?

Mwisho mkuu wa utafiti ulikuwa mabadiliko katika uwezo wa seli za NK zilizotengwa kutoka damu ya washiriki kuua seli lengwa za K562, yaliyopimwa kwa mbinu ya cytotoxicity ya ⁵¹Cr-release; mbinu hii inalenga kutathmini si idadi ya seli za NK pekee bali uwezo wao wa kiutendaji wa kuua seli lengwa.

Seli ya NK ni nini?

Natural killer (NK) cells ni lymphocytes za cytotoxic za mfumo wa kinga wa asili. Zinaweza hasa kutambua na kuua seli zilizoambukizwa virusi au zilizoonyesha mabadiliko ya malignant. Mekanizimu za seli za NK kuua seli lengwa zinajumuisha utoaji wa molekuli za cytotoxic kama perforin na granzyme.

Utafiti huu haukutumia mabadiliko rahisi katika idadi ya seli za NK kama matokeo ya msingi. Lengo kuu lilikuwa kupima mabadiliko katika shughuli ya cytotoxic ya seli za NK.

Kwa nini seli lengwa za K562 hutumiwa?

K562 ni cell line lengwa inayotumiwa sana katika vipimo vya cytotoxicity ya seli za NK. Katika jaribio, peripheral blood mononuclear cells za washiriki zilitenganishwa kwanza kwa Lymphoprep™, kisha seli za NK zikatengwa kwa kutumia MojoSort™ Human NK Cell Isolation Kit.

Kuvunjwa kwa seli lengwa za K562 na seli za NK kulitathminiwa kwa mbinu ya ⁵¹Cr-release. Chanzo hakitoi formula maalum ya hesabu ya utafiti huu, bali kinarejelea protocol iliyochapishwa hapo awali; kwa hiyo Verianla haiongezi formula ya cytotoxicity ambayo chanzo hakikuripoti kana kwamba ni formula ya utafiti.

Uwiano wa E:T unamaanisha nini?

E:T ni “effector-to-target”, yaani uwiano wa seli effector/seli lengwa. Hapa seli effector ni seli ya NK na seli lengwa ni K562.

Kwa mfano, uwiano wa 6,25:1 unawakilisha hali katika mpangilio maalum wa assay ambapo kuna idadi ndogo zaidi ya seli effector za NK kwa kila seli lengwa; 50:1 huwakilisha uwiano wa juu zaidi wa effector/target. Kupima seli katika uwiano tofauti wa E:T husaidia kuelewa kama shughuli ya cytotoxic inaonekana tu katika msongamano mmoja wa majaribio wa seli au la.

Ingawa sehemu ya mbinu ya chanzo inaorodhesha uwiano wa 6,25:1, 12,5:1 na 25:1, majedwali ya matokeo pia yanajumuisha uwiano wa 50:1. Kwa hiyo matokeo ya 50:1 yanahifadhiwa kama data ya jedwali, lakini hakuna dhana inayotolewa kuhusu kwa nini uwiano huu haukutajwa tofauti katika sehemu ya mbinu.

Jaribio la kliniki lilifanywa kwa nani?

Wanawake na wanaume wenye umri wa 19–75 walijumuishwa katika utafiti. Hata hivyo, kauli “watu wazima wenye afya” haimaanishi watu waliochaguliwa kwa nasibu kabisa kutoka kwa jamii kwa ujumla. Ili kushiriki, alama ya Perceived Stress Scale (PSS) ilitakiwa kuwa angalau 16, idadi ya peripheral WBC kuwa kati ya 3 × 10³ na 10 × 10³ seli/µL, na kuwe na historia ya angalau maambukizi mawili ya njia ya juu ya upumuaji katika mwaka uliopita.

Waandishi wanaeleza kuwa vigezo hivi vilitumika kuchagua watu wenye hali ya msingi ya kinga iliyodhoofika kiasi au wenye unyeti mkubwa zaidi kwa mabadiliko ya kifizyolojia ya kinga. Kwa hiyo, haiwezi kudhaniwa kwamba ukubwa wa matokeo utatumika moja kwa moja kwa kiwango sawa kwa watu wazima wote wenye afya ambao hawana historia ya stress au maambukizi ya njia ya juu ya upumuaji yanayojirudia.

Vigezo vikuu vya kutengwa viliripotiwa kuwa BMI ≥30 kg/m², chanjo ndani ya miezi miwili iliyopita, maambukizi ya COVID-19 ndani ya miezi miwili iliyopita, ugonjwa wa mfumo ambao unaweza kuathiri mfumo wa kinga, matumizi ya dawa ya immunomodulatory au probiotic katika wiki nne zilizopita, ujauzito/kunyonyesha na allergy kwa bidhaa ya utafiti.

Randomization na blinding

Jumla ya watu 120 waligawanywa kwa uwiano wa 1:1 kuwa 60 HT-LM1004 na 60 placebo kwa mlolongo wa randomization uliotengenezwa na kompyuta. Capsule hai na placebo zililinganishwa kwa mwonekano, uzito na packaging, na washiriki pamoja na watafiti walifanywa wasijue mgao wa kundi.

Tofauti kati ya ITT na PP ni ipi?

Intention-to-treat (ITT) analysis inalenga kuchanganua watu ambao baada ya randomization walipokea bidhaa ya utafiti angalau mara moja na walikuwa na angalau kipimo kimoja cha efficacy baada ya baseline. Ni muhimu katika utafiti wa kliniki kwa sababu inalenga kuhifadhi kwa kadiri iwezekanavyo muundo wa kulinganisha makundi uliotolewa na randomization.

Per-protocol (PP) analysis, kwa upande mwingine, inajumuisha washiriki wasio na ukiukaji mkubwa wa protocol na waliokidhi sharti la adherence la angalau %80 lililotajwa katika chanzo. PP analysis hulenga zaidi kundi lililokamilisha intervention kwa kuzingatia protocol, huku ITT ikitoa mfumo wa uchanganuzi ulio karibu zaidi na mtiririko halisi wa jaribio la kliniki.

Katika utafiti huu, matokeo ya msingi ya shughuli ya NK yalikuwa katika mwelekeo uleule kwa ujumla katika uchanganuzi wa ITT na PP.

LOCF ni nini?

Kwa data iliyokosekana katika uchanganuzi wa ITT, chanzo kinasema kuwa kilitumia mbinu ya last observation carried forward (LOCF). LOCF ni mbinu ya kubeba mbele thamani ya mwisho iliyopatikana ikiwa kipimo cha baadaye cha mshiriki hakipo. Mbinu hii inaweza kuzuia mtu kuondolewa kabisa kwenye uchanganuzi kwa sababu ya data iliyokosekana; lakini kwa kuwa inatumia dhana yenye nguvu kwamba thamani halisi ya kibayolojia haikubadilika, mbinu yenyewe ya kushughulikia data iliyokosekana ni sehemu ya tafsiri ya matokeo.

Kwa nini ANCOVA ilitumika?

Ili kuzingatia kitakwimu kwamba thamani za msingi za kundi la matibabu zinaweza kutofautiana kidogo na kundi lingine, analysis of covariance (ANCOVA) inaweza kutumika. Chanzo pia kiliongeza hali ya HLD kama covariate katika modeli kwa sababu kulikuwa na tofauti ndogo katika marudio ya hyperlipidemia katika sifa za msingi za ITT.

Chanzo kinatoa wazi modeli ifuatayo katika Jedwali 1:

\[ \mathrm{CHANGE}=\alpha+\beta\cdot\mathrm{HLD}+\delta\cdot\mathrm{GROUP}+\varepsilon \]

CHANGE ni tofauti kati ya thamani ya mtu baada ya intervention na thamani yake ya msingi.

α ni regression constant; inawakilisha kiwango cha msingi cha modeli wakati vigezo vingine viko kwenye thamani ya marejeo.

HLD ni hali ya hyperlipidemia: imekodishwa 1 ikiwa hyperlipidemia ipo na 0 ikiwa haipo.

β ni coefficient ya modeli ya athari ya hali ya hyperlipidemia kwenye CHANGE.

GROUP imekodishwa 1 katika kundi la HT-LM1004 na 0 katika kundi la placebo/control.

δ inawakilisha ulinganisho mkuu wa matibabu katika modeli. Kwa maneno ya chanzo, δ ni tofauti ya matibabu minus control katika mabadiliko kutoka baseline yaliyorekebishwa kwa covariate.

ε ni error term inayowakilisha variability iliyobaki ambayo haijaelezwa na modeli.

Chanzo kilitumia ordinary regression kwa baadhi ya endpoints na robust regression kwa baadhi ya variables. Robust regression ni mbinu ya regression inayolenga kupunguza kuathirika kupita kiasi kwa modeli ya kawaida ya linear na outliers au sifa za distribution.

Matokeo ya shughuli ya NK yaliyorekebishwa kwa covariate

Jambo muhimu zaidi katika jedwali ni kwamba ulinganisho wa PP na ITT una p<0,05 katika hali zote nne za NK E:T. Kwa hiyo, matokeo makuu ya kliniki ya utafiti hayategemei uwiano mmoja wa E:T au pekee kundi la PP lililokamilisha protocol kikamilifu.

Kwa WBC pia, tofauti ya matibabu–control iliyorekebishwa ni yenye maana katika uchanganuzi wa PP na ITT. Kwa IL-12, p=0,0425 katika modeli ya ITT lakini p=0,1724 katika uchanganuzi wa PP; kwa hiyo si sahihi kusema kuwa IL-12 ilikuwa na “tofauti yenye maana kwa uthabiti katika uchanganuzi wote”.

Kwa nini matokeo ya cytokine yanahitaji kutafsiriwa kwa tahadhari zaidi?

Viwango vya serum TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12 na IL-15 vilipimwa kama biomarker za kimakanika za kusaidia. Waandishi wanaeleza kuwa variability ya cytokine kati ya watu ni kubwa na kwamba matokeo haya hayapaswi kuonekana kama matokeo ya msingi ya efficacy.

Zaidi ya hayo, hakuna marekebisho rasmi ya multiple comparisons yaliyofanywa kwa p-values za cytokine. Wakati idadi kubwa ya vipimo huru vya takwimu vinafanywa, kutumia tu kiwango cha p<0,05 mara kwa mara kunaweza kuongeza uwezekano wa kupata matokeo yenye maana kwa bahati. Waandishi wanaeleza uamuzi wa kutofanya marekebisho kama juhudi ya kutopoteza mienendo inayowezekana ya kibayolojia katika cohort yenye afya na kupunguza hatari ya Type II error; kwa hiyo wanawasilisha matokeo ya cytokine kama exploratory na supportive.

Je, SHIME Ni Sawa na Utumbo wa Binadamu?

Hapana. SHIME® ni modeli ya in vitro ya mfumo wa ikolojia wa utumbo inayotengeneza kwa udhibiti hali za pH, joto, mazingira ya anaerobic na uchachushaji wa vijidudu katika sehemu tofauti za koloni halisi la binadamu; haijumuishi kikamilifu epithelium ya utumbo, mzunguko wa damu, mfumo wa kinga, mfumo wa homoni na mwingiliano wote wa mwenyeji–vijidudu wa binadamu hai.

Mpangilio wa SHIME uliundwaje?

Utafiti ulitumia vitengo viwili sambamba vya SHIME. Kitengo kimoja kilikuwa control bila matibabu, na kingine kilikuwa kitengo cha majaribio kilichopewa HT-LM1004. Kila mfumo una vyombo vinavyowakilisha maeneo matatu ya koloni:

• AC: ascending colon — koloni inayopanda/proximal.
• TC: transverse colon — koloni ya transverse.
• DC: descending colon — koloni inayoshuka/distal.

Mfumo ulihifadhiwa katika 37°C, pH ilidhibitiwa mfululizo na mazingira ya utumbo yasiyo na oksijeni yaliigwa kwa gesi ya anaerobic. Medium ya kawaida ya lishe ilikuwa na arabinogalactan, pectin, xylan, starch, glucose, yeast extract, peptone, mucin na L-cysteine HCl. Suluhisho la pancreatic lilikuwa na NaHCO₃, pancreatin na oxgall.

Inoculum ya kinyesi iliandaliwa kutoka kwa nyenzo za wafadhili wenye afya wa kike na kiume kwa uwiano wa 1:1; ikatumika kwa kiasi cha %5 ya working volume ya vyumba vya AC, TC na DC.

Jaribio liligawanywa katika vipindi vitatu: wiki 1 ya stabilization, wiki 4 za intervention ya HT-LM1004 na wiki 1,5 za observation/washout baada ya intervention.

Katika SHIME, dozi ya HT-LM1004 ilikuwa 0,1 g, yaani 2 × 10¹⁰ cell equivalent kama ilivyoelezwa katika chanzo; ilisitishwa katika 10 mL ya maji yaliyodistiliwa na sterilized na kutolewa siku tano kwa wiki saa 10:30 kwenye chumba cha AC2 cha kitengo cha matibabu.

Sampuli zilikusanywa katika pointi nne za muda: Pre, Mid, End na Post. Chanzo kinaeleza kuwa sampuli kuchukuliwa saa 10:00 kabla ya dozi ya kila siku kulilenga kutathmini athari ya mfumo wa ikolojia inayojikusanya, si tu athari ya muda mfupi ya mara baada ya dozi.

Mchoro huru unaoonyesha mtiririko wa chanzo wa jaribio la SHIME

Uchambuzi wa 16S rRNA unapima nini?

Maeneo yanayobadilika ya jeni la 16S rRNA yanaweza kutumika katika uainishaji wa taxonomic wa bakteria. Katika utafiti, eneo la hypervariable V4 lililengwa na primers zinazofunika eneo la 515–806 zilitumika. Chanzo kinaripoti urefu unaotarajiwa wa amplicon kuwa 359 bp.

DNA ilitengwa kwa QIAamp DNA Mini Kit, kiasi chake kikapimwa kwa Qubit 4, integrity ikakaguliwa kwa 0,8% agarose gel electrophoresis na purity ikatathminiwa kwa uwiano wa A260/A280.

Libraries ziliandaliwa kwa Illumina Nextera XT adapters, zikasafishwa kwa AMPure XP, %10 PhiX ikaongezwa na chanzo kinasema paired-end sequencing ilifanywa kwenye jukwaa la Illumina iSeq100. Sequences zilipitia demultiplexing, quality filtering, error correction na taxonomic classification kwa pipeline inayotegemea QIIME 2.

Alpha na beta diversity zinamaanisha nini?

Alpha diversity inaeleza utofauti wa vijidudu ndani ya sampuli moja au compartment moja ya mfumo wa ikolojia. Utafiti ulitumia metrics kama observed features/OTU, ACE, Chao1, Jackknife, Shannon, Simpson, NPShannon na phylogenetic diversity.

Richness, yaani utajiri, huzingatia zaidi ni features/taxa ngapi tofauti zilizopo. Indices za diversity kama Shannon zinaweza kuzingatia si idadi ya species pekee, bali pia jinsi distribution ndani ya jamii ilivyo sawia.

Phylogenetic diversity haizingatii idadi ya taxa pekee, bali pia jinsi microorganisms zinavyotofautiana kwa upande wa evolution.

Beta diversity hutathmini jinsi jamii mbili zinavyofanana au kutofautiana. Chanzo kilitumia weighted UniFrac na kikatumia Principal Coordinate Analysis (PCoA) kuwasilisha kwa muhtasari wa kuona tofauti za multidimensional za jamii.

Nini kilitokea katika diversity ya microbiome?

Katika AC hakukuonekana mabadiliko yenye maana katika vipimo vya richness. Kinyume chake, ongezeko la richness lilionekana katika TC mwishoni mwa intervention na katika DC wakati wa Post.

Kwa Shannon, Simpson, NPShannon na phylogenetic diversity, AC ilionyesha mwelekeo endelevu zaidi wa kuongezeka, huku indices za diversity katika TC na DC zikibadilika kwa namna zisizo sawa kadri muda ulivyopita.

Katika uchanganuzi wa ziada, mwishoni mwa intervention ya wiki nne, phylogenetic diversity ya AC ilikuwa juu zaidi kwa kiasi cha maana katika kundi la HT-LM1004 kuliko control (p=0,0099). Uchambuzi wa PCoA ulionyesha kutengana kwa jamii za vijidudu za control na HT-LM1004, na chanzo kiliripoti p<0,05 katika uchanganuzi wa beta-set.

Waandishi wanatafsiri pattern hii kama mabadiliko ya diversity/evenness yanayotokea kwanza katika proximal colon na baadaye enrichment ya taxa zenye wingi mdogo katika TC na DC zilizo distal zaidi. Hata hivyo, ni muhimu kukumbuka kwamba tafsiri hii ya “proximal-to-distal gradient” ni ya mfumo wa SHIME na trajectory hiyo haikupimwa moja kwa moja katika utumbo wa binadamu.

Kwa nini bakteria zenye wingi mdogo zinaweza kuwa muhimu?

Kuwa na uwiano mdogo wa bakteria katika utumbo hakumaanishi kuwa hana umuhimu wa kibayolojia. Baadhi ya taxa zenye wingi mdogo zinaweza kuwa na jukumu la kiutendaji katika mabadiliko fulani ya metabolic au katika mitandao ya mfumo wa ikolojia.

Chanzo kinajadili enrichment ya Clostridia, Dialisteraceae na Lentilactobacillus katika TC; na Bacteroidales, Rikenellaceae, Lactonifactor na Christensenella katika DC. Kazi “zenye manufaa” za taxa hizi hazikujaribiwa moja kwa moja moja baada ya nyingine katika jaribio hili; waandishi wanatafsiri uhusiano wao na afya, barrier, uzalishaji wa SCFA au kazi za metabolic kwa kutegemea literature iliyotangulia.

Metabolomics ilifanywaje?

Katika uchanganuzi wa metabolomics, culture fluid kutoka kwenye compartments za koloni ilichanganuliwa kwa Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS).

Metabolite signals zilinormalishwa kulingana na total ion chromatogram (TIC). NPClassifier na ClassyFire zilitumika katika chemical classification, matokeo ya NPClassifier yakapewa kipaumbele, na probability ≥0,8 ikatumika kama sharti la uaminifu wa classification.

Ili kutathmini mabadiliko ya metabolic, mixed-design ANOVA ilitumika. Muda, yaani Pre–Mid–End–Post, ulikuwa repeated/within factor; hali ya control–HT-LM1004 ilikuwa between factor. Chanzo pia kilitathmini thamani kubwa za partial eta squared (η_p²) pamoja na p<0,05 kama kiashiria cha athari kwenye variance.

Ni features ngapi ziligunduliwa katika metabolomics?

Idadi ya “feature” hapa haimaanishi moja kwa moja idadi sawa ya metabolites huru ambazo utambulisho wake umethibitishwa kwa uhakika. Katika LC-MS/MS data processing, analytical signals zenye mass/charge, retention time na signal characteristics fulani hutolewa; baadhi yake hulinganishwa na standard libraries, huku chemical class ya baadhi ya features zilizobaki ikiwa imefanyiwa annotate kwa prediction tools.

Nini kilibadilika katika asidi za nyongo?

Katika AC, ongezeko liliripotiwa katika primary bile acids kama cholic acid na baadhi ya signals za chenodeoxycholic acid.

Katika TC, metabolic restructuring ilionekana wazi zaidi na ongezeko liliripotiwa katika 3-oxocholate na signals mbalimbali za secondary bile acid/derivatives zinazohusiana. Baadhi ya signals za primary bile acid zilipungua kwa kiasi.

Katika DC, mabadiliko hayakuwa na mipaka ya bile acids pekee. Pamoja na baadhi ya secondary bile acids, ongezeko lilionekana pia katika metabolites mbalimbali zisizo za bile acid.

Waandishi wanajadili hasa kwamba mabadiliko katika uwiano wa primary–secondary bile acid yanaashiria kuundwa upya kwa microbial metabolism ya utumbo. Uhusiano wa bile acids na immune functions kupitia receptors kama FXR na TGR5 ndio msingi wa uhusiano unaowezekana wa kimakanika kati ya matokeo haya ya metabolic na finding ya NK. Hata hivyo, receptor pathways hizi hazikupimwa moja kwa moja katika jaribio la sasa la binadamu.

SCFA ni nini?

Short-chain fatty acids (SCFAs) ni organic acids za mnyororo mfupi ambazo microorganisms za utumbo zinaweza kuzalisha katika michakato ya fermentation. Utafiti ulitathmini kwa kiasi SCFA nne: acetic acid, propionic acid, butyric acid na valeric acid.

Uchambuzi wa SCFA ulifanywa kwa headspace GC-MS. Sampuli ziliandaliwa kwa NaCl na %2 sulfuric acid; calibration curves ziliundwa kwa kutumia standard solutions za 1–100 mg/L kwa acetic, propionic, butyric na valeric acid. Utambulisho wa metabolite uliamuliwa kwa kulinganisha retention time na mass spectrum na authentic standards.

Ni pattern gani ya muda ilionekana katika SCFA?

Katika AC, viwango vya SCFA vilipungua katika point ya Mid na kurudi katika viwango vilivyo karibu na baseline au juu ya baseline katika End na Post.

Katika TC, concentrations za SCFA ziliongezeka katika vipindi vya Mid na End na kuonyesha mwelekeo wa kurudi karibu na baseline katika hatua ya Post baada ya intervention kusimamishwa.

Katika DC, kwa namna inayofanana, kulikuwa na ongezeko katika Mid na End na kurudi kwa sehemu katika Post.

Matokeo haya hayawezi kurahisishwa kuwa “HT-LM1004 iliongeza SCFA mfululizo katika koloni yote.” Athari inategemea eneo la koloni na muda; hasa mwelekeo wa AC katika kipindi cha kati ni tofauti na TC na DC.

Je, Sababu na Athari Kati ya Ongezeko la Kliniki la NK na Mabadiliko ya Microbiome ya SHIME Imethibitishwa?

Hapana. Katika jaribio la binadamu shughuli ya NK ilipimwa, huku mekanizimu ya microbiome na metabolite ikichunguzwa katika mfumo tofauti wa in vitro SHIME; kwa sababu mlolongo binafsi wa mediation wa mabadiliko ya microbiome → mabadiliko ya metabolite → shughuli ya NK haukupimwa kwa washiriki wale wale wa kliniki, matokeo ya SHIME hayawezi kuchukuliwa kuwa sababu ya moja kwa moja ya ongezeko la kliniki la NK.

Tofauti hii ni ya msingi katika tafsiri ya kisayansi ya makala. Chanzo kinapendekeza modeli ya kimakanika: vipengele vya seli vya HT-LM1004 vilivyohifadhiwa baada ya matibabu ya joto vinaweza kuathiri moja kwa moja PRR/TLR signaling; wakati huo huo jamii ya vijidudu vya utumbo na uzalishaji wa microbial metabolites unaweza kubadilika; bile acids na SCFA zinaweza kuingiliana na mfumo wa kinga. Hata hivyo, utafiti wa sasa hauonyeshi hatua zote za mlolongo huu katika jaribio moja la causal.

Chanzo kinaeleza wazi kwamba hata kati ya datasets za microbiome na metabolomics hakuna kiungo cha moja kwa moja cha kimakanika kilichoanzishwa, na kwamba enrichment ya taxa fulani pamoja na mabadiliko katika njia za SCFA na bile acid inapendekeza tu uhusiano unaowezekana na kuongezeka kwa kinga.

Kwa hiyo, kauli sahihi ya kisayansi ni: “HT-LM1004 iliongeza shughuli ya seli za NK katika jaribio la kliniki na mabadiliko ya microbiome/metabolite yaliyoonekana katika modeli tofauti ya SHIME yanaweza kutoa maelezo ya kibayolojia yanayowezekana kwa matokeo hayo.” Kauli kwamba “HT-LM1004 iliongeza shughuli ya NK kwa hakika kwa kuongeza bakteria hawa” inavuka mpaka wa ushahidi wa muundo wa jaribio uliopo.

Je, mekanizimu ya moja kwa moja ya seli ilipimwa?

Chanzo kinajadili kwamba peptidoglycan, lipoteichoic acid na protini za uso za seli zilizozimwa kwa joto zinaweza kuingiliana na miundo ya PRR/TLR na kuanzisha pathways kama MAPK, AP-1 na NF-κB; na kwamba hii inaweza kuhusishwa na cytotoxic effectors kama perforin, granzyme B na IFN-γ.

Hata hivyo, waandishi wanasisitiza kwamba utafiti wa sasa haukujaribu pathways hizi za signaling moja kwa moja. Kwa hiyo, mekanizimu ya TLR2/MAPK/NF-κB si mekanizimu ya kliniki iliyopimwa moja kwa moja katika utafiti huu, bali ni maelezo yanayowezekana ya kibayolojia yanayoungwa mkono na tafiti zilizotangulia.

Je, ongezeko la NK linamaanisha systemic inflammation pana?

Ingawa cytotoxicity ya NK iliongezeka kwa kiasi cha maana katika utafiti, hakukuonekana ongezeko lenye maana la matibabu–control katika serum cytokines kama IFN-γ na TNF-α. Waandishi wanatafsiri hili kuwa kuongezeka kwa NK effector function hakulazimishi kuwepo kwa ongezeko pana la systemic katika cytokines zote za inflammatory zinazozunguka kwenye damu.

Matokeo haya hayapaswi kubadilishwa kuwa hitimisho la uhakika kwamba “HT-LM1004 haina athari yoyote ya inflammatory.” Vipimo vimewekewa mipaka na serum cytokines maalum na hali za jaribio la wiki nane.

Matokeo ya usalama

Matukio madogo yalielezwa kuwa dalili za kawaida za mafua kama kikohozi na rhinorrhea, yalikuwa ya muda mfupi na hayakuchukuliwa kuwa yanahusiana na bidhaa ya utafiti. Hematology, biochemistry, lipid, electrolyte, renal indices, CRP/ESR na vital signs kwa ujumla hazikuonyesha tatizo la kliniki lenye maana linalotokana na matibabu.

Ingawa baadhi ya thamani za maabara zilionyesha mabadiliko ya kitakwimu ndani ya kundi, iliripotiwa kuwa hayakuhusishwa na dalili za kliniki na hayakuunda tofauti yenye maana kati ya matibabu na control. Ni muhimu hapa kwamba statistical significance na clinical significance si kitu kilekile.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• Katika sampuli iliyochaguliwa ya watu wazima, matumizi ya HT-LM1004 kwa wiki 8 yalihusishwa na ongezeko kubwa zaidi katika cytotoxicity ya seli za NK, mwisho mkuu wa utafiti, kuliko placebo.
• Matokeo ya NK yalikuwa yenye maana katika uwiano wote wanne wa E:T ulioripotiwa na katika uchanganuzi uliorekebishwa wa ITT na PP.
• Katika mabadiliko ya WBC pia, tofauti ya matibabu–control iliyorekebishwa ilikuwa yenye maana katika uchanganuzi wa PP na ITT.
• Katika kipindi cha wiki 8 cha utafiti wa kliniki, hakuna serious safety signal iliyohusishwa na bidhaa ya utafiti iliyoripotiwa.
• Katika mfumo tofauti wa SHIME, HT-LM1004 ilibadilisha microbial diversity, distribution ya taxa zenye wingi mdogo, bile acid profiles na uzalishaji wa SCFA kwa namna inayotegemea eneo la koloni na muda.
• Matokeo haya ya in vitro yanatoa hypotheses za kimakanika ambazo zinaweza kuendana na matokeo ya kliniki ya NK.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono

• Jaribio hili halikuonyesha kwamba HT-LM1004 huzuia maambukizi ya virusi kwa binadamu.
• Halikuonyesha kwamba hupunguza ukuaji wa saratani au kurudi kwa uvimbe.
• Efficacy na usalama kwa wazee au watu wenye immunodeficiency haukujaribiwa moja kwa moja.
• Usalama wa matumizi ya muda mrefu hauwezi kuhitimishwa kutoka utafiti wa wiki nane.
• Haikuonyeshwa kwamba mabadiliko ya microbiome yaliyoonekana katika SHIME hutokea kwa namna ileile kwa washiriki wa kliniki.
• Mabadiliko ya microbiome au SCFA katika kinyesi cha binadamu hayakuonyeshwa kama mechanistic endpoint ya jaribio hili la kliniki.
• Haijathibitishwa kwamba enrichment ya bakteria fulani ndiyo ilisababisha moja kwa moja ongezeko la NK.
• Haikuonyeshwa kwamba mabadiliko ya bile acid au SCFA yalieleza ongezeko la shughuli ya NK kupitia mediation analysis.
• Matokeo ya exploratory cytokine hayako katika kiwango sawa cha ushahidi na matokeo ya msingi ya NK.
• Bidhaa ya utafiti haipaswi kutathminiwa kama tiba ya ugonjwa au immunotherapy iliyoidhinishwa.

Mapungufu makuu ya utafiti

Kizuizi cha kwanza: Clinical population inajumuisha watu wazima wenye afya waliochaguliwa. Haiwezi kujumlishwa kwa wazee, watu wenye mfumo wa kinga uliodhoofishwa au wenye ugonjwa mkubwa sugu.

Kizuizi cha pili: SHIME inaiga hali za physicochemical na microbial za utumbo lakini haijumuishi epithelium, mfumo wa kinga, mzunguko wa damu, mfumo wa neva na mwingiliano wote wa metabolism ya mwenyeji katika utumbo halisi wa binadamu.

Kizuizi cha tatu: Matokeo ya kliniki ya NK na matokeo ya in vitro ya microbiome/metabolite hayajaunganishwa kwa causal relationship ya moja kwa moja.

Kizuizi cha nne: Intervention ya kliniki ya wiki nane na observation ya wiki 1,5 baada ya intervention ya SHIME hazionyeshi uimara wa athari ya muda mrefu.

Kizuizi cha tano: Uchambuzi wa cytokine ni exploratory na formal multiple-comparison correction haikutumika.

Kizuizi cha sita: Patterns za SCFA na microbiome zilizoonekana katika SHIME zinahitaji kuthibitishwa katika kinyesi cha binadamu au sampuli za utumbo wa binadamu.

Kizuizi cha saba: Kuna tofauti kati ya sehemu za chanzo kuhusu dozi/formulation ya capsule na uwiano wa NK E:T ulioripotiwa; maelezo haya yanapaswa kuthibitishwa kando kwa kutumia protocol ya asili/supplementary material kabla ya kutumiwa kwa replication au matumizi ya kliniki.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Muundo wa utafiti wa kliniki

Vipimo vya takwimu

Continuous variables ziliwasilishwa kama mean ± standard deviation, na categorical variables kama idadi na asilimia. Shapiro–Wilk test ilitumika katika tathmini ya normal distribution.

Ulinganisho wa ndani ya kundi kati ya baseline–wiki ya 8 ulifanywa kwa paired t-test kwa variables zenye normal distribution na Wilcoxon signed-rank test kwa variables zisizo normal.

Ulinganisho kati ya makundi ulifanywa kwa modeli za ANCOVA/regression na athari za tofauti za baseline zilijaribiwa kudhibitiwa kwa covariates.

Chanzo kilitumia ordinary regression kwa baadhi ya variables na robust regression kwa nyingine. p<0,05 ilikubaliwa kuwa mpaka wa statistical significance.

Muundo wa utafiti wa SHIME

Matokeo ya 16S rRNA

Chanzo kinaripoti ongezeko endelevu katika baadhi ya diversity indices katika AC, ongezeko la richness katika TC wakati wa End na katika DC wakati wa Post. Mwishoni mwa intervention ya wiki nne, tofauti ya phylogenetic diversity ya AC ilikuwa yenye maana kwa upande wa HT-LM1004 (p=0,0099). Uchambuzi wa PCoA na beta-set pia ulionyesha kutengana katika muundo wa jamii za control na matibabu.

Matokeo ya metabolomics

Matokeo ya metabolomics ni maalum kwa eneo la koloni. Katika AC, mabadiliko ya primary bile acid yalionekana zaidi; katika TC, mabadiliko ya secondary bile acid yalionekana zaidi; na katika DC, metabolic restructuring pana zaidi inayojumuisha metabolites zisizo bile acid iliripotiwa.

Tofauti hii ya kikanda inaonyesha kwamba HT-LM1004 haitoi athari sawa ya metabolic katika utumbo wote.

Matokeo ya SCFA

Katika AC kulikuwa na recovery katika End/Post baada ya kushuka wakati wa Mid; katika TC na DC kulikuwa na ongezeko wakati wa intervention na kurudi kwa sehemu kuelekea baseline katika Post. Hivyo, response ya SCFA ilitegemea muda na eneo la koloni.

Tafsiri ya pamoja ya matokeo ya kliniki na in vitro

Jaribio la kliniki linaonyesha kuwa shughuli ya seli za NK iliongezeka kwa HT-LM1004. SHIME inaonyesha kwamba maandalizi hayo hayo yanaweza kubadilisha jamii ya vijidudu na profaili za metabolite katika mfumo wa ikolojia wa utumbo uliodhibitiwa.

Matokeo haya mawili kwa pamoja yanaunga mkono hypothesis kwamba HT-LM1004 inaweza kuathiri njia za moja kwa moja za utambuzi wa kinga kupitia vipengele vya seli za vijidudu na pia microbiome–metabolite axis. Hata hivyo, muundo wa utafiti wa chanzo hauwezi kukokotoa ni kwa uwiano gani njia hizi mbili zinachangia kwa binadamu au ikiwa moja inafanya mediation ya nyingine.

Utafiti wa baadaye

Chanzo kinapendekeza makundi ya washiriki yaliyo tofauti zaidi, vipindi virefu zaidi vya intervention na follow-up, na vipimo vya moja kwa moja vya causality. Hasa, kulinganisha mabadiliko ya SCFA na microbiome yaliyoonekana katika SHIME na sampuli za kinyesi au utumbo za washiriki wa kliniki ni muhimu ili kuthibitisha uhalali wa kifizyolojia wa matokeo ya simulator.

Waandishi pia wanajadili kwamba mbinu kama immune-cell phenotyping na transcriptomics zinaweza kutumika kuthibitisha mekanizimu za moja kwa moja za seli zilizopendekezwa, kama TLR/MAPK/NF-κB.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Utafiti wa asili: Microbiome-Modulating Effects of Heat-Treated Lactiplantibacillus plantarum LM1004 and Its Enhancement of NK Cell Activity: Evidence from a Clinical Trial and a Simulated Human Intestinal Microbiome Ecosystem

Waandishi: Sukyung Kim; Hoonhee Seo; Tae-Rahk Kim; Md Abdur Rahim; Hanieh Tajdozian; Youjin Yoon; Sujin Jo; Md Sarower Hossen Shuvo; Indrajeet Barman; Chaeeun Park; Saebim Lee; Sangwon Lee; Min Hyung Cho; Jangho Ha; Hansol Hong; Sohee An; SungJune Chu; Minn Sohn; Yoo Kyung Ahn; Yoon Ju So; Sungsue Rheem; Seong-Ho Han; Ho-Yeon Song.

Mchango sawa: Sukyung Kim na Hoonhee Seo wamewekewa alama katika chanzo kama waandishi waliochangia kwa usawa.

Corresponding authors: Seong-Ho Han na Ho-Yeon Song.

Taasisi: LactoMason Co., Ltd.; Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, Soonchunhyang University; K-Microbiome Institute, Soonchunhyang University; Department of Family Medicine, College of Medicine, Dong-A University; Bioinformatics and Molecular Design Research Center (BMDRC), Yonsei University; Division of Big Data Science, Korea University.

Muktadha wa maslahi ya kitaasisi: Chanzo kinaonyesha kwamba baadhi ya waandishi wana affiliation na LactoMason Co., Ltd., mtengenezaji wa maandalizi ya utafiti. Makala pia inatoa tamko “authors have no financial conflicts of interest to declare”. Taarifa hizi mbili zinapaswa kuhifadhiwa pamoja na bila kubadilishwa.

Jarida: Journal of Microbiology and Biotechnology.

Juzuu / namba ya makala: Volume 36, e2604046.

DOI: 10.4014/jmb.2604.04046

Aina ya chanzo: Utafiti wa majaribio uliochapishwa katika jarida; unachanganya jaribio la binadamu la randomized controlled na jaribio tofauti la in vitro la mfumo wa ikolojia wa SHIME. Label ya aina iliyo juu ya ukurasa wa kwanza wa PDF inaonekana kama “Review”; label hii imehifadhiwa kama maelezo ya bibliografia ambayo hayalingani na muundo mpya wa majaribio wa Methods/Results ndani ya hati.

Imepokelewa: 17 Aprili 2026.

Imekubaliwa: 28 Juni 2026.

Tofauti ya tarehe ya kuchapishwa: PDF inatoa taarifa “Published: July 23, 2026” kwenye ukurasa wa kwanza. Rekodi ya metadata ya e-publication ya PubMed/Crossref inaonyesha tarehe 3 Julai 2026. Tofauti kati ya tarehe hizo mbili haijarekebishwa kimya kimya.

Leseni: Creative Commons Attribution (CC BY). PDF inaeleza kwamba makala ni open access na inasambazwa chini ya masharti ya CC BY.

Ufadhili: Ufadhili wa MSIT kupitia National Research Foundation of Korea (RS-2023-00219563); MOTIE industrial innovation infrastructure construction project (P0021516); Ministry of SMEs and Startups Korea Technology Development Program for SMEs (S3373174) na msaada wa Soonchunhyang University Research Fund uliripotiwa.

Upatikanaji wa data: Makala inaeleza kwamba data zilizowasilishwa na datasets kuu zinazounga mkono utafiti zinaweza kupatikana kutoka kwa corresponding author kwa ombi linalofaa.

Mgongano wa maslahi: Chanzo kinatangaza kuwa hakuna mgongano wa maslahi ya kifedha.

Maadili na usajili: Utafiti wa kliniki ulifanywa chini ya idhini ya Dong-A University Hospital IRB DAUHIRB-23-152 na kusajiliwa katika ClinicalTrials.gov kama NCT07433855. Kwa sampuli za kinyesi, Seoul National University Bundang Hospital IRB No. B-1810-497-308; na kwa tafiti za genome/metabolome na artificial digestive system, rekodi ya mradi/maadili ya Soonchunhyang University 202406-SB-067 / 202406-SB-067-01 iliripotiwa.

Ridhaa yenye taarifa: Ridhaa ya maandishi yenye taarifa ilipatikana kutoka kwa washiriki wa kliniki.

Mwisho mkuu wa kliniki: Mabadiliko ya shughuli ya seli za NK kutoka baseline hadi wiki ya 8.

Uchambuzi wa takwimu: SPSS 26 na SAS 9.4; paired t-test au Wilcoxon signed-rank test; ANCOVA/regression; p<0,05; uchanganuzi wa ITT na PP; LOCF kwa data iliyokosekana katika ITT.

Tofauti ya E:T ndani ya chanzo: Sehemu ya mbinu inataja uwiano wa 6,25:1, 12,5:1 na 25:1, huku majedwali ya matokeo ya kliniki pia yakiripoti uwiano wa 50:1.

Tofauti ya dozi/formulation ndani ya chanzo: Sehemu ya mbinu inasema 500 mg/siku ya unga wa HT-LM1004 na kutokuwepo kwa filler, huku maelezo ya kina ya uzalishaji katika majadiliano yakisema 0,1 g ya kiungo hai cha HT-LM1004 kilichosanifishwa hujazwa kwa excipients hadi uzito wa jumla wa capsule. Chanzo hakielezi sababu ya tofauti hii.

Mpaka wa mekanizimu ya kliniki: Mlolongo wa microbiome na metabolomics wa SHIME haukupimwa moja kwa moja kwa washiriki wa kliniki. Causality ya moja kwa moja kati ya mabadiliko ya microbiome/metabolite na ongezeko la shughuli ya NK haijathibitishwa.

Mpaka wa SHIME: Mfumo ni ekosistimu ya in vitro inayomodeli hali za microbial na physicochemical za koloni ya binadamu; hauundi upya mfumo halisi wa kinga ya binadamu na physiology yote ya mwenyeji.

Mpaka wa uchanganuzi wa cytokine: Cytokines ni biomarker za exploratory/supportive na formal multiple-testing correction haikutumika.

Michango ya waandishi: Conceptualization: T.-R.K., S.-H.H., H.-Y.S.; draft ya kwanza: S.K. na H.S.; review/editing: S.K., H.S., M.A.R., T.-R.K., S.-H.H., H.-Y.S.; supervision: T.-R.K., S.-H.H., H.-Y.S.; funding acquisition: T.-R.K. na H.-Y.S. Chanzo pia kinatoa kwa kina michango ya methodology, investigation, formal analysis, resources, visualization na project management kwa muundo wa CRediT.