Dondoo ya klorofomu ya pumba ya mchele mweusi wa Sembada Hitam (chloroform extract of black rice bran; CBRB) ni dondoo ya mimea iliyotayarishwa katika utafiti huu kwa kuchujwa kwa pumba ya aina ya Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’ kwa klorofomu na kujaribiwa in vitro kwenye seli za saratani ya ini HepG2. Watafiti walichunguza athari ya CBRB kwa njia tatu za majaribio: uhai wa seli/sitotoksisiti kwa kipimo cha MTT, uhamaji wa seli kwa kipimo cha wound-healing, na aina ya kifo cha seli kwa Annexin V-FITC flow cytometry. Athari zilizo wazi za CBRB kwa ujumla zilionekana katika viwango vya juu. Kwa CBRB, IC₅₀ ilikuwa 1.265 μg/mL baada ya saa 24 na 1.868 μg/mL baada ya saa 48, huku kwa doxorubicin ikiwa 0,44 na 0,18 μg/mL mtawalia. CBRB katika 1.500 μg/mL ilipunguza kwa kiasi kikubwa uhamaji wa HepG2 na katika uchanganuzi wa flow cytometry ilionyesha %60,35±0,01 ya apoptosis ya mapema. Hata hivyo, utafiti ulifanywa tu katika utamaduni wa seli za HepG2; hauonyeshi kwamba huzuia au kutibu saratani kwa binadamu, haujathibitisha usalama wa kliniki wala njia mahususi ya molekuli.

Katika kipimo cha MTT cha saa 48, CBRB katika 2.000 μg/mL ilipunguza uhai wa HepG2 hadi %30,39±12,23 na katika 3.000 μg/mL hadi %4,9±0,67. Kinyume chake, doxorubicin ilionyesha athari kali ya sitotoksiki katika viwango vya chini sana. Kwa sababu hiyo, chanzo kinasisitiza kwamba CBRB ina uwezo mdogo wa sitotoksiki ikilinganishwa na doxorubicin.

Katika jaribio la uhamaji wa seli, CBRB ya 250, 500, 1.000 na 1.500 μg/mL ilijaribiwa. Thamani za gap closure na migration velocity zilionyesha mwelekeo wa kupungua kadiri kiwango kilivyoongezeka; ukandamizaji wa uhamaji wenye umuhimu wa kitakwimu ulionekana katika CBRB 1.500 μg/mL. Doxorubicin 2 μg/mL pia ilionyesha migration inhibition yenye nguvu.

Katika jaribio la flow cytometry, viwango vya CBRB vya 500, 1.000 na 1.500 μg/mL vilijaribiwa kwa saa 48. Katika 1.500 μg/mL CBRB, apoptosis ya mapema ilifikia %60,35±0,01; katika kundi hilo hilo necrosis iliripotiwa kuwa %2,45±0,06. Ingawa watafiti wanasema kuwa kifo cha seli kilikuwa kwa kiasi kikubwa sambamba na apoptosis, wanakubali wazi kwamba intrinsic au extrinsic apoptotic pathway haikuweza kubainishwa kwa majaribio yaliyofanywa.

Tatizo kuu la utafiti

Utafiti unachunguza kama dondoo ya klorofomu iliyopatikana kutoka sehemu ya pumba ya ‘Sembada Hitam’, mojawapo ya aina za mchele mweusi wa kienyeji unaolimwa Indonesia, inaonyesha shughuli ya kibaolojia katika seli za HepG2 zenye asili ya hepatocellular carcinoma.

Katika muktadha wa fasihi iliyonukuliwa, pumba ya mchele mweusi inahusishwa na viambato vinavyovutia kibayolojia kama anthocyanin, γ-oryzanol, polyphenol, isoform za vitamin E na hydroxycinnamic acid. Hata hivyo, utafiti huu haukuchambua moja kwa moja muundo wa kemikali wa CBRB. Kwa hiyo, haikuonyeshwa kwa majaribio ni kiambato gani mahususi kinachowajibika kwa athari ya seli iliyozingatiwa.

Swali kuu la utafiti la chanzo linaweza kugawanywa katika sehemu tatu:

• Je, CBRB inapunguza uhai wa seli za HepG2?
• Je, CBRB inapunguza uhamaji wa seli za HepG2 juu ya uso?
• Je, kifo cha seli kinachosababishwa na CBRB kinahusiana na apoptosis?

Seli za HepG2 Zinawakilisha Nini Katika Utafiti Huu?

HepG2 ni laini ya seli za binadamu yenye asili ya hepatoma/hepatocellular carcinoma iliyotumiwa katika utafiti huu kutathmini uwezo wa kupambana na saratani wa dondoo ya pumba ya mchele mweusi katika mazingira ya maabara; matokeo yanayopatikana kwenye HepG2 yanaonyesha mwitikio wa modeli ya utamaduni wa seli na hayamaanishi moja kwa moja ufanisi au usalama wa matibabu kwa wagonjwa binadamu.

Muda wa utafiti na nyenzo ya kibaolojia

Utafiti ulifanywa kati ya Desemba 2022 na Oktoba 2023.

Seli za HepG2 zilikuzwa katika Laboratory of Parasitology, Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada.

Mchele mweusi wa Sembada Hitam ulipatikana kutoka kwa wakulima wa eneo la Ngaglik, Sleman, Special Region of Yogyakarta. Chanzo kinaunganisha taarifa za nomenclature ya aina hiyo na Indonesian Minister of Agriculture Decree No. 125/HK.540/C/03/2019.

Dondoo ya klorofomu iliandaliwa vipi?

Hatua za uchimbaji zimeelezwa katika chanzo kama ifuatavyo:

1. 10 g ya unga wa pumba ya mchele mweusi wa Sembada Hitam ilitumika.
2. Pumba iliyeyushwa/kutawanywa katika 100 mL chloroform.
3. Mchanganyiko uliwekwa katika mchakato wa maceration kwa saa 48 huku ukikorogwa mara kwa mara.
4. Dondoo ilichujwa kwa Whatman No.1 filter paper.
5. Filtrate iliwekwa katika mchakato wa overnight remaceration.
6. Baadaye solvent iliondolewa na kupatikana dondoo ya paste-like solid.
7. Suluhisho la majaribio liliandaliwa kwa kuyeyusha CBRB katika %1 DMSO.

Maceration ni mchakato wa kuweka nyenzo ya mimea katika solvent kwa muda fulani ili viambato vinavyoweza kuyeyuka katika solvent vitolewe kutoka kwenye nyenzo hiyo.

Klorofomu hapa ni solvent ya uchimbaji. Sehemu ya discussion ya utafiti inaeleza klorofomu kama nonpolar extraction solvent na kujadili kwamba inaweza kuwa na ufanisi mdogo kuliko polar solvent katika kuchimba baadhi ya viambato vya phytochemical.

Chanzo hakitoi asilimia ya extraction yield. Aidha, viwango vya anthocyanin, cyanidin-3-glucoside, peonidin-3-glucoside au viambato vingine katika CBRB iliyotayarishwa havikupimwa kwa mbinu za uchanganuzi katika utafiti huu.

Viwango vya CBRB vilivyotumika kwa MTT

CBRB iliandaliwa katika viwango vifuatavyo:

7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1.000; 1.500; 2.000 na 3.000 μg/mL.

Wigo huu mpana wa viwango ulitumika kuchunguza mabadiliko ya uhai wa seli yanayotegemea dozi na thamani ya IC₅₀.

Kipimo cha MTT na IC50 Vinapima Nini?

Kipimo cha MTT ni kipimo cha uhai wa seli kinachotumia uwezo wa seli zenye shughuli za kimetaboliki kubadilisha kiwanja cha tetrazolium kinachoitwa MTT kuwa bidhaa za formazan zenye rangi, hivyo kutathmini kwa njia isiyo ya moja kwa moja kiasi cha seli hai; IC₅₀ inaonyesha kiwango cha dutu ya majaribio kinachohitajika kupunguza ukuaji au uhai wa seli kwa takribani %50 chini ya hali zilizowekwa za jaribio, na IC₅₀ ya chini kwa kawaida huashiria uwezo mkubwa zaidi wa sitotoksiki.

Mpangilio wa jaribio la MTT

Seli za HepG2 zilipandwa kwenye 96-well plate kwa msongamano wa:

\[ 1\times10^4\ \text{hücre/well} \]

.

Mazingira ya utamaduni yalikuwa Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) yenye:

• %10 fetal bovine serum (FBS),
• %2 penicillin–streptomycin,
• %0,5 amphotericin B

.

Seli kwanza ziliwekwa katika incubator yenye %5 CO₂ kwa saa 24.

Baadaye mazingira ya utamaduni yalibadilishwa na suluhisho za majaribio za CBRB.

Kwa nini vikundi vya udhibiti ni muhimu?

Katika jaribio la MTT kuna aina tatu kuu za kulinganisha:

• Cell control: Huonyesha kiwango cha msingi cha uhai wa seli zisizotibiwa.
• %1 DMSO control: Husaidia kutenganisha athari ya DMSO yenyewe iliyotumika kuyeyusha dondoo.
• Doxorubicin: Ilitumika kama dutu chanya ya kulinganisha yenye athari inayojulikana ya kupambana na saratani.

Doxorubicin:

0,25; 0,5; 1; 2; 4 na 8 μg/mL

ilijaribiwa katika viwango hivyo.

Vikundi vyote vya treatment na control vilitathminiwa katika hali za saa 24 na 48.

Mwitikio wa MTT ulifanywaje?

Mwishoni mwa incubation, 100 μL ya suluhisho la MTT iliongezwa kwenye kila well na kuachwa kwa saa nne.

Kisha mwitikio ulisimamishwa kwa kuongeza:

100 μL %10 sodium dodecyl sulfate (SDS)

na sampuli zikawekwa overnight.

Matokeo yalitazamwa kwa inverted microscope, na absorbance ikapimwa kwa ELISA microplate reader katika:

\[ 595\ \text{nm} \]

urefu wa mawimbi.

Fomula ya uhai wa seli

Fomula iliyotumika katika chanzo:

\[ \%\ \text{Cell Viability} = \frac{ A_{\text{treatment}}-A_{\text{medium}} }{ A_{\text{cell control}}-A_{\text{medium}} } \times100 \]

Hapa:

• \(A_{\text{treatment}}\): thamani ya absorbance ya well ya treatment,
• \(A_{\text{medium}}\): thamani ya absorbance ya medium/background isiyo na seli,
• \(A_{\text{cell control}}\): thamani ya absorbance ya untreated cell-control.

Katika namba ya juu, ishara ya background inayotokana na medium hutolewa kwenye kipimo cha treatment. Namba ya chini ni ishara ya untreated cell control iliyosahihishwa kwa background. Kwa hivyo uhai wa seli katika treatment hunormalishwa kwa asilimia dhidi ya control.

Kwa mfano, ikiwa matokeo yako karibu na %100, ishara ya kimetaboliki ya kundi la treatment iko karibu na untreated control. Thamani za chini zinaendana na uhai mdogo wa seli chini ya treatment.

Hata hivyo, MTT si hesabu ya moja kwa moja ya “seli ngapi zimekufa”; ni kipimo cha viability kinachotegemea shughuli za kimetaboliki.

IC50 iliamuliwaje?

Chanzo kinasema kwamba thamani za IC₅₀ zilihesabiwa kwa probit analysis.

Probit analysis ni mbinu ya takwimu ya kuunda modeli ya uhusiano kati ya dozi/kiwango fulani na mwitikio wa kibaolojia wa aina mbili au wa uwiano. Hapa lengo ni kukadiria kiwango kinacholingana na takribani %50 growth inhibition.

Thamani za IC₅₀ za doxorubicin kuwa chini sana kuliko za CBRB zinaonyesha kwamba katika hali za majaribio za chanzo doxorubicin ilikuwa na potency kubwa zaidi katika kupunguza uhai wa HepG2.

Kwa nini mifumo miwili tofauti ya kuainisha sitotoksisiti katika chanzo inahitaji tahadhari?

Sehemu ya mbinu inatoa mifumo miwili tofauti ya tafsiri.

Katika maelezo yanayotegemea ISO 10993-5, madaraja ya non-cytotoxic, slight, mild, moderate na severe cytotoxicity yanaelezwa kulingana na kiwango cha cell-growth inhibition.

Katika sehemu hiyo hiyo, chanzo kwa kurejea US National Cancer Institute kinaainisha thamani za IC₅₀ kama:

• <20 μg/mL: cytotoxicity ya juu,
• 21–200 μg/mL: moderate cytotoxicity,
• 201–500 μg/mL: low cytotoxicity,
• >500 μg/mL: non-cytotoxic activity

hivyo.

Kwa kuwa thamani za IC₅₀ za CBRB ni 1.265 na 1.868 μg/mL, katika mfumo huu wa pili zinaangukia katika kiwango cha >500 μg/mL. Hata hivyo, sehemu ya Results inaeleza kupungua kwa wazi kwa uhai wa seli katika 1.500–3.000 μg/mL kama “moderate cytotoxicity”.

Kwa kuwa kauli hizi mbili zinategemea vipimo tofauti, hazipaswi kutumiwa kama mbadala wa nyingine: moja ni uainishaji wa potency kwa IC₅₀, na nyingine ni kiwango cha viability inhibition kinachoonekana katika viwango maalumu vya juu.

Matokeo makuu ya nambari ya kipimo cha MTT

Kipimo cha Wound-Healing Kinapimaje Uhamaji wa Seli?

Wound-healing au scratch assay ni mbinu ya in vitro inayounda pengo bandia katika tabaka la seli zilizokua karibu, kisha kufuatilia kiwango ambacho pengo hilo hufungwa na seli kadiri muda unavyopita ili kutathmini tabia ya uhamaji wa seli; katika utafiti huu upana wa mwanzo wa scratch ulilinganishwa na upana baada ya saa 24 na 48 ili kuhesabu asilimia ya gap closure na migration velocity.

Mpangilio wa jaribio la scratch assay

Seli za HepG2 zilipandwa kwenye 24-well plate kwa msongamano wa:

\[ 7.5\times10^3\ \text{hücre/well} \]

.

Seli ziliwekwa kwa saa 24 au hadi kupatikana takribani %80 confluence.

Confluence inaonyesha ni kiasi gani cha uso wa utamaduni kimefunikwa na seli. %80 confluence ina maana sehemu kubwa ya uso imefunikwa na seli zilizo karibu lakini bado haijafungwa kabisa.

Baadaye scratch wima iliundwa kwenye uso wa utamaduni kwa kutumia sterile yellow pipette tip.

Picha ya mwanzo ilirekodiwa kama data ya saa 0 chini ya inverted microscope kwa 4×10 magnification.

Jaribio lilijumuisha vikundi nane:

• Control,
• %1 DMSO,
• Doxorubicin 1 μg/mL,
• Doxorubicin 2 μg/mL,
• CBRB 250 μg/mL,
• CBRB 500 μg/mL,
• CBRB 1.000 μg/mL,
• CBRB 1.500 μg/mL.

Picha zilichukuliwa tena mwisho wa saa 24 na 48.

Fomula ya gap closure

\[ \text{Gap Closure} = \frac{i_l-i_f}{i_l}\times100\% \]

Hapa:

• \(i_l\): ukubwa wa mwanzo wa scratch/gap katika saa 0,
• \(i_f\): ukubwa wa gap uliobaki mwisho wa muda husika wa incubation.

Ikiwa pengo la mwanzo linafungwa kwa kiasi kikubwa, \(i_f\) hupungua na asilimia ya gap closure huongezeka. Ikiwa uwezo wa seli kufunga pengo unazuiwa, \(i_f\) hubaki kubwa na gap closure huwa ndogo.

Fomula ya migration velocity

\[ \text{Velocity} = \frac{i_l-i_f}{\text{total time}} \]

Fomula hii hugawanya mabadiliko ya upana wa scratch kwa muda uliopita.

Chanzo kinaonyesha kitengo cha velocity kama μm/h kwenye grafu.

Matokeo ya uhamaji wa seli

Katika kundi la CBRB, thamani za gap closure na migration velocity zilionyesha mwelekeo wa kupungua kadiri kiwango kilivyoongezeka.

Katika kiwango cha 250–1.000 μg/mL, chanzo kinaripoti ulinganisho usio na umuhimu wa kitakwimu.

CBRB 1.500 μg/mL ilionyesha kupungua kwa maana katika gap closure na migration velocity:

\[ p\le0.05 \]

Doxorubicin 2 μg/mL pia ilitoa gap closure na migration velocity ndogo katika hali za saa 24 na 48.

Matokeo haya yanaonyesha kuwa katika kiwango cha juu CBRB inaweza kupunguza tabia ya uhamaji inayohusiana na uwezo wa seli za HepG2 kufunga eneo la scratch.

Hata hivyo, scratch assay si kipimo cha cell migration pekee; mabadiliko makubwa katika uhai na proliferasyon ya seli yanaweza pia kuathiri matokeo ya gap closure. Katika utafiti huu CBRB 1.500 μg/mL pia iko katika kiwango ambacho athari ya sitotoksiki inaanza kuonekana. Kwa hiyo migration inhibition na cytotoxicity hazipaswi kuchukuliwa kama mifumo huru kabisa.

Uchanganuzi wa Apoptosis kwa Flow Cytometry Unaonyesha Nini?

Uchanganuzi wa flow cytometry ulitumia alama ya Annexin V-FITC kugawanya idadi ya seli katika maeneo ya viable, necrotic, early-apoptotic na late-apoptotic ili kutathmini ni fenotipu gani ya kifo cha seli inayohusiana na matumizi ya CBRB; matokeo makuu ya chanzo ni %60,35±0,01 ya apoptosis ya mapema katika CBRB 1.500 μg/mL.

Hali za jaribio la flow cytometry

Seli za HepG2 zilipandwa kwenye 6-well plate kwa msongamano wa:

\[ 3\times10^5\ \text{hücre/well} \]

.

Hali za kwanza za incubation:

• 37°C,
• %5 CO₂,
• 24 saa.

Baadaye mazingira ya utamaduni yalibadilishwa na vikundi vifuatavyo vya treatment:

• %1 DMSO,
• Doxorubicin 2 μg/mL,
• CBRB 500 μg/mL,
• CBRB 1.000 μg/mL,
• CBRB 1.500 μg/mL.

Muda wa treatment ni saa 48.

Annexin V-FITC ilitumika kwa seli kwa takribani dakika 30 na vipimo vikafanywa kwa FACS Calibur flow cytometer.

Maeneo manne ya flow-cytometry

Chanzo kinataja quadrant nne kama ifuatavyo:

• Quadrant 1: Necrosis cells,
• Quadrant 2: Late apoptosis cells,
• Quadrant 3: Live cells,
• Quadrant 4: Early apoptosis cells.

Apoptosis ya mapema

Kadiri kiwango cha CBRB kilivyoongezeka, kulionekana mwelekeo wa kuongezeka kwa uwiano wa early-apoptotic cell.

Katika CBRB 1.500 μg/mL:

\[ Early\ apoptosis=60.35\pm0.01\% \]

iliripotiwa na chanzo kikatoa matokeo haya kuwa tofauti kwa kiasi kikubwa na vikundi vingine:

\[ p\le0.05 \]

Necrosis

Chanzo kinaripoti:

Kwa Doxorubicin 2 μg/mL:

\[ Necrosis=6.10\pm0.04\% \]

Kwa CBRB 1.500 μg/mL:

\[ Necrosis=2.45\pm0.06\% \]

.

Hata hivyo, aya hiyo hiyo inaeleza matokeo haya kama “significant differences (p>0.05)”. Kwa istilahi za takwimu, “significant” na p>0,05 hazipatani. Kwa kuwa chanzo hakitoi exact corrected p-value, Verianla haibadilishi kuwa p≤0,05.

Apoptosis ya kuchelewa

Kundi la Doxorubicin 2 μg/mL:

\[ Late\ apoptosis=32.5\pm0.13\% \]

lilionyesha thamani ya juu zaidi katika chanzo.

Inaelezwa kuwa katika vikundi vya CBRB, late apoptosis iliongezeka kadiri kiwango kilivyoongezeka; lakini sehemu ya Results inaripoti tofauti za late-apoptosis kati ya vikundi kuwa:

\[ p>0.05 \]

.

Tofauti ya apoptosis kati ya Abstract na Results

Abstract inasema CBRB katika viwango vya zaidi ya 1.000 μg/mL ilionyesha “enhanced late apoptosis”.

Kwa upande mwingine, Results ya kina inaripoti:

• ongezeko kubwa na lenye umuhimu la early apoptosis katika 1.500 μg/mL,
• mwelekeo wa kuongezeka kwa late apoptosis lakini p>0,05

.

Kwa hiyo, matokeo yenye nguvu zaidi na ya moja kwa moja ya kitakwimu kuhusu apoptosis katika utafiti ni ongezeko la early apoptosis katika CBRB 1.500 μg/mL.

Flow cytometry haithibitishi njia gani?

Ingawa matokeo ya flow cytometry yanaonyesha kifo cha seli kinacholingana na apoptosis, katika utafiti:

• Bax,
• Bcl-2,
• Bcl-xL,
• caspase-3,
• caspase-7,
• caspase-9,
• p53,
• PI3K/Akt,
• Erk

havikupimwa.

Mifumo hii ya molekuli inaelezwa katika sehemu ya Discussion kwa kurejea tafiti za awali. Utafiti huu haukuamua CBRB inaamilisha ipi kati ya intrinsic au extrinsic apoptosis pathway.

Njia tatu za majaribio zisomwe pamoja vipi?

Chanzo kinaona muundo wa kiwango unaofanana kati ya matokeo matatu:

1. Katika viwango vya juu vya CBRB, uhai wa seli hupungua.
2. Karibu na 1.500 μg/mL, cell migration hupungua.
3. Katika 1.500 μg/mL, early apoptosis huongezeka wazi.

Matokeo haya yanaendana kibayolojia.

Hata hivyo, chanzo hakitoi correlation coefficient tofauti wala formal correlation analysis. Kwa hiyo neno “correlation” hapa linapaswa kueleweka kama tafsiri ya waandishi kuhusu muundo unaofanana katika assay tatu.

Uchanganuzi wa takwimu

Data za Cytotoxicity, migration na apoptosis zilichanganuliwa kwa:

• One-way Analysis of Variance (ANOVA),
• kizingiti cha umuhimu p≤0,05,
• baada ya ANOVA yenye umuhimu Tukey Honestly Significant Difference (Tukey HSD),
• SPSS version 25

.

One-way ANOVA hujaribu kama kuna tofauti ya jumla yenye umuhimu kati ya wastani wa vikundi vingi vya treatment.

Tukey HSD ni post-hoc multiple-comparison test inayotathmini ni jozi zipi za vikundi zinazotofautiana baada ya ANOVA kuonyesha tofauti ya jumla.

Katika caption za Figure 1–3:

\[ n=3 \]

imeripotiwa, na herufi tofauti zinaonyesha tofauti muhimu za vikundi katika kiwango cha p≤0,05.

Chanzo hakielezi kwa undani kama marudio ya n=3 ni marudio huru ya kibaolojia, marudio ya kiufundi au muundo mwingine wa replication.

Je, Utafiti Huu Unaonyesha Kwamba Pumba ya Mchele Mweusi Hutibu Saratani kwa Binadamu?

Hapana. Utafiti unaonyesha tu kwamba katika laini ya seli za HepG2 katika maabara, CBRB katika viwango vya juu inaweza kubadilisha uhai wa seli, uhamaji na uwiano wa seli za apoptotic; kwa kuwa ufyonzwaji, kimetaboliki, dozi yenye ufanisi, sumu, mwitikio wa uvimbe, usalama wa kliniki au mafanikio ya matibabu kwa binadamu hayakuchunguzwa, matokeo hayawezi kufasiriwa kama ushahidi wa matibabu au kinga ya saratani kwa binadamu.

“Chemopreventive potential” inamaanisha nini?

Waandishi wanajadili matokeo katika muktadha wa utafiti wa natural chemopreventive-agent.

Hata hivyo, cytotoxic, antimigratory na apoptotic activity katika utamaduni wa HepG2 ni ushahidi wa awali wa maabara kuhusu shughuli ya kibaolojia ya dondoo kandidati.

Utafiti huu:

• haujapima kuzuia maendeleo ya saratani katika kiumbe hai,
• haujapima kutokea kwa metastasis katika modeli ya mnyama au binadamu,
• haujachunguza oral bioavailability,
• haujafanya utafiti wa pharmacokinetic,
• hauripoti kipimo cha selectivity kwa seli za kawaida za ini,
• haujatathmini usalama wa binadamu.

Kwa hiyo neno “potential” ni muhimu sana.

Kikomo cha kauli “Safe for further development”

Katika sehemu ya Discussion kuna tafsiri kwamba kifo cha seli kupitia apoptosis kinaashiria kuwa dondoo ni salama kwa uendelezaji zaidi kama natural chemopreventive agent.

Hata hivyo, jaribio lililopo halipimi:

• normal hepatocyte cytotoxicity,
• organ toxicity,
• genotoxicity,
• animal toxicity,
• human adverse effects

.

Kwa hiyo kwa mtazamo wa Verianla, data zilizopo haziungi mkono hitimisho kwamba “usalama umethibitishwa”. Usalama lazima uthibitishwe kwa majaribio tofauti.

Ni kiambato gani cha dondoo kinachowajibika kwa athari?

Utafiti huu haukuamua hilo.

Discussion inajadili anthocyanins na phytochemical compounds nyingine kama maelezo yanayowezekana; lakini katika CBRB:

• anthocyanin concentration,
• kiasi cha cyanidin-3-glucoside,
• kiasi cha peonidin-3-glucoside,
• wasifu wa active compound nyingine

havikupimwa.

Kwa hiyo waandishi wanapendekeza solvent fractionation, phytochemical characterization na molecular-mechanism studies.

Kwa nini mbinu ya uchimbaji ni kikwazo?

Katika sehemu ya Discussion, inajadiliwa kwamba kwa kuwa klorofomu ni nonpolar solvent, inaweza kutoa baadhi ya viambato vya phytochemical kwa ufanisi mdogo kuliko polar solvent.

Chanzo pia kinaeleza kwamba dondoo ilihifadhiwa katika 4°C na mchakato wa extraction ulifanywa katika room temperature na katika mgusano wa moja kwa moja na hewa.

Waandishi wanajadili kwamba anthocyanin zinaweza kuathiriwa na mwanga, unyevu, pH, joto na oksijeni; hali za extraction na storage zinaweza kuwa zimeathiri phytochemical stability.

Hata hivyo, kwa kuwa kiasi cha anthocyanin hakikupimwa moja kwa moja kabla na baada ya jaribio, maelezo haya si matokeo yaliyopimwa ya degradation bali ni tafsiri inayotegemea fasihi.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Muhtasari wa jumla wa muundo wa majaribio

Figure 1 inaonyesha nini?

Chanzo Figure 1 kinaonyesha HepG2 cell viability katika paneli mbili: panel A ya saa 24 na panel B ya saa 48.

Katika grafu:

• Control,
• %1 DMSO,
• viwango sita vya doxorubicin concentration,
• viwango kumi na moja vya CBRB concentration

vinalinganishwa.

Mhimili Y ni thamani ya Cell Viability (%).

Bar zinaonyeshwa kama mean±standard deviation.

n=3.

Herufi tofauti juu ya bar zinawakilisha tofauti za kitakwimu katika kiwango cha p≤0,05.

Ujumbe mkuu wa kisayansi wa Figure 1 ni kwamba viwango vya chini na vya kati vya CBRB vina athari ndogo kwa HepG2 viability, huku kupungua kwa wazi kwa uhai kukitokea hasa katika eneo la 1.500–3.000 μg/mL. Doxorubicin hupunguza uhai katika viwango vya chini sana katika kiwango cha μg/mL.

Figure 2 inaonyesha nini?

Chanzo Figure 2 kina paneli nne:

• A: 24 saa Gap closure (%),
• B: 24 saa Velocity (μm/h),
• C: 48 saa Gap closure (%),
• D: 48 saa Velocity (μm/h).

Katika vikundi vya Control na %1 DMSO, kufungwa kwa eneo la scratch ni juu zaidi.

Doxorubicin 2 μg/mL na CBRB 1.500 μg/mL zinaonyesha gap closure na velocity ndogo.

Kadiri kiwango cha CBRB kinavyoongezeka, kuna mwelekeo wa kupungua katika viashiria vya cell migration.

Kwa kuwa thamani kamili za nambari za bar zote za Figure 2 hazijatolewa katika Results prose, Verianla haitoi thamani za makadirio kutoka kwenye grafu kama vipimo sahihi.

Figure 3 inaonyesha nini?

Figure 3 inaonyesha matokeo manne tofauti ya flow-cytometry:

• A: viable cells,
• B: necrosis,
• C: early apoptosis,
• D: late apoptosis.

Katika picha ya Figure 3, kundi la CBRB 1.500 μg/mL lina bar ya viable-cell iliyo chini na bar ya early-apoptosis iliyo juu zaidi.

Chanzo prose kinaripoti thamani hii ya apoptosis ya mapema kwa uhakika kama:

\[ 60.35\pm0.01\% \]

.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• CBRB ilionyesha cytotoxic potency ndogo sana kuliko doxorubicin katika viwango vya chini kwenye seli za HepG2.
• Kupungua kwa wazi kwa cell-viability kutokana na CBRB kulionekana hasa katika viwango vya juu kama 1.500–3.000 μg/mL.
• Baada ya saa 48, CBRB 2.000 μg/mL ilipunguza viability hadi %30,39±12,23.
• Baada ya saa 48, CBRB 3.000 μg/mL ilipunguza viability hadi %4,9±0,67.
• IC50 ya CBRB ni 1.265 μg/mL baada ya saa 24 na 1.868 μg/mL baada ya saa 48.
• IC50 ya Doxorubicin ni 0,44 μg/mL baada ya saa 24 na 0,18 μg/mL baada ya saa 48.
• CBRB 1.500 μg/mL ilipunguza kwa kiasi kikubwa thamani za HepG2 gap closure na migration velocity.
• Katika CBRB 1.500 μg/mL, early apoptosis iliongezeka wazi hadi %60,35±0,01.
• Cell death pattern katika matumizi ya CBRB inalingana na apoptosis.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono moja kwa moja

• Haijaonyeshwa kuwa CBRB hutibu saratani ya ini kwa binadamu.
• Haijaonyeshwa kuwa CBRB huzuia saratani kwa binadamu.
• Dozi salama kwa binadamu haijabainishwa.
• Selectivity dhidi ya seli za kawaida za ini haijajaribiwa moja kwa moja.
• Hakuna modeli ya mnyama iliyotumika.
• Clinical pharmacokinetics au bioavailability haijachunguzwa.
• Haijabainishwa ni chemical compound ipi ya CBRB inayowajibika kwa athari.
• Anthocyanin concentration haikupimwa katika utafiti huu.
• Intrinsic au extrinsic apoptosis pathway haijathibitishwa.
• Microtubule disruption haikupimwa moja kwa moja.
• RAS/RAF/MAPK, PI3K/Akt, Erk au caspase pathways hazijathibitishwa na jaribio hili.
• Hakuna correlation coefficient tofauti iliyochapishwa kwa kauli ya “Correlation”.

Masuala ya kuripoti katika chanzo yanayohitaji tahadhari

Nguvu kuu za utafiti

Utafiti haukutegemea assay moja tu; ulitathmini kwa pamoja ngazi tatu za kibaolojia: uhai wa seli, cell migration na cell-death phenotype.

Vikundi vya Doxorubicin na solvent-control vilitumika.

Vipindi vya saa 24 na 48 vilichunguzwa kwa pamoja katika majaribio ya cytotoxicity na migration.

Vipimo tofauti vilitumika: IC₅₀ kwa viability, gap closure/velocity kwa migration na usambazaji wa flow-cytometric cell-state kwa apoptosis.

Vikwazo vikuu

Laini moja ya seli: Matokeo yalipatikana tu katika laini ya seli za HepG2.

Hakuna ulinganisho wa seli za kawaida: Hitimisho la moja kwa moja kuhusu Cancer-cell selectivity haliwezi kutolewa.

Viwango vya juu vya CBRB: Activity iliyo wazi ilionekana hasa katika 1.500 μg/mL na viwango vya juu zaidi.

Hakuna Phytochemical characterization: Viambato hai ndani ya dondoo havikubainishwa kwa kiasi.

Nonpolar extraction: Waandishi wanasema uchimbaji kwa klorofomu unaweza kuwa kikwazo kwa baadhi ya phytochemicals.

Hakuna Molecular pathway analysis: Haijabainishwa ni njia gani mahususi ya molekuli inayowajibika kwa apoptosis na migration.

Kikomo cha In vitro: Absorption, metabolism, systemic toxicity na in vivo tumor response havikutathminiwa.

Maelezo ya Replication: Figure zinaonyesha n=3, lakini muundo wa marudio ya kiufundi/kibaolojia haujaelezwa kikamilifu.

Extract yield haijaripotiwa: Kiasi/asili mia ya dondoo ya mwisho kutoka 10 g ya pumba haijatajwa.

Maelezo ya Cell-line reproducibility: Chanzo kinatoa taarifa ya HepG2 culture location; cell-line catalog number, authentication au mycoplasma-testing hazijaripotiwa.

Lugha ya takwimu ndani ya chanzo: Katika sehemu ya Necrosis, “significant” na p>0,05 zimetumika katika sentensi moja.

Mwelekeo wa utafiti wa baadaye

Utafiti unaofuata unaopendekezwa moja kwa moja na waandishi unalenga:

• solvent fractionation,
• active compound isolation,
• phytochemical characterization,
• molecular mechanism analysis

.

Lengo ni kubainisha ni viambato gani ndani ya CBRB vinawajibika kwa biological activity iliyoonekana na kutathmini chemopreventive potential ya pumba ya mchele mweusi wa Sembada Hitam kwa njia inayodhibitiwa zaidi.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Utafiti wa asili: Anticancer Potential of Chloroform Extract from Black Rice (Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’) Bran Against HepG2 Liver Cancer Cells.

Waandishi: Bima Mahendra, Nabila Ramiza Puteri, Yekti Asih Purwestri, Sekar Rahayu, Ardaning Nuriliani.

Mpangilio wa waandishi: Mpangilio wa PDF ya chanzo na metadata rasmi ya sasa ya jarida umehifadhiwa.

Mchango sawa: Chanzo hakina taarifa ya equal-contribution.

Mwandishi wa mawasiliano: Ardaning Nuriliani.

Taasisi 1: Department of Tropical Biology, Faculty of Biology, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Taasisi 2: Department of Biomedical Science, Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Taasisi 3: Master Program, Faculty of Biology, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Jarida: HAYATI Journal of Biosciences.

Muundo wa uchapishaji: Department of Biology, Bogor Agricultural University/IPB University na Indonesian Society for Biology.

Juzuu / namba: Vol. 33 No. 6.

Tarehe ya toleo: November 2026.

Kurasa: 1403–1413.

DOI: 10.4308/hjb.33.6.1403-1413.

ISSN: 1978-3019.

EISSN: 2086-4094.

Aina ya chanzo: Short Communication.

Mapitio ya rika: HAYATI Journal of Biosciences hutumia double-blind peer review. Sera ya jarida inasema aina ya Short Communication hupata review yenye kina sawa na Research Article.

Received: September 19, 2025.

Received in revised form: July 17, 2026.

Accepted: September 8, 2026.

PDF Available Online: October 1, 2026.

Tarehe ya Published katika metadata rasmi ya web: November 1, 2026.

Maelezo ya tarehe: Tarehe ya Available Online katika PDF na tarehe ya issue/publication metadata ya jarida zinaonyesha hatua tofauti za uchapishaji.

Leseni: Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC 4.0).

Preprint: Hakuna preprint tofauti iliyoainishwa katika PDF ya chanzo na rekodi rasmi iliyothibitishwa.

Muda wa utafiti: December 2022 – October 2023.

Aina ya utafiti: Experimental in vitro cell-culture study.

Laini ya seli: HepG2.

Nyenzo ya mmea: Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’ black rice bran.

Chanzo cha nyenzo: Local farmers, Ngaglik, Sleman, Special Region of Yogyakarta, Indonesia.

Uchimbaji: 10 g bran powder + 100 mL chloroform; 48 saa maceration; Whatman No.1 filtration; overnight remaceration; evaporation to paste-like solid.

Solvent ya majaribio: %1 DMSO.

Viwango vya MTT CBRB: 7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1.000; 1.500; 2.000; 3.000 μg/mL.

Viwango vya Doxorubicin MTT: 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 μg/mL.

MTT cell seeding: 1×10⁴ cells/well, 96-well plate.

MTT culture medium: DMEM + %10 FBS + %2 penicillin–streptomycin + %0,5 amphotericin B.

MTT reaction: 100 μL MTT, 4 saa; 100 μL %10 SDS, overnight.

Absorbance: 595 nm, ELISA microplate reader.

Mbinu ya IC50: Probit analysis.

CBRB IC50: 1.265 μg/mL at 24 h; 1.868 μg/mL at 48 h.

Doxorubicin IC50: 0,44 μg/mL at 24 h; 0,18 μg/mL at 48 h.

48 h CBRB viability: 2.000 μg/mL → %30,39±12,23; 3.000 μg/mL → %4,9±0,67.

Wound-healing cell seeding: 7,5×10³ cells/well, 24-well plate.

Wound-healing CBRB: 250, 500, 1.000, 1.500 μg/mL.

Wound-healing doxorubicin: 1 na 2 μg/mL.

Vipimo vya Migration: Gap closure (%) na velocity (μm/h).

Matokeo ya Migration: reduction yenye umuhimu katika 1.500 μg/mL CBRB; p≤0,05.

Flow-cytometry cell seeding: 3×10⁵ cells/well, 6-well plate.

Flow-cytometry treatment: %1 DMSO, doxorubicin 2 μg/mL na CBRB 500, 1.000, 1.500 μg/mL.

Muda wa Flow-cytometry treatment: 48 saa.

Reagent: Annexin V-FITC; takribani dakika 30.

Kifaa: FACS Calibur flow cytometer.

CBRB 1.500 μg/mL early apoptosis: %60,35±0,01.

CBRB 1.500 μg/mL necrosis: %2,45±0,06.

Doxorubicin 2 μg/mL necrosis: %6,10±0,04.

Doxorubicin 2 μg/mL late apoptosis: %32,5±0,13.

Takwimu: One-way ANOVA, p≤0,05; baada ya significant result Tukey HSD; SPSS version 25.

Replication: Caption za Figure 1–3 zinaonyesha n=3; muundo wa marudio ya kiufundi au kibaolojia haujaelezwa kwa undani.

Funding: Doctoral Competency Grant (Hibah Kompetensi Doktor) 2023, Universitas Gadjah Mada; Assignment Letter No. 7743/UN1.P.II/Dit-Lit/PT.01.03/2023.

Ethical approval: Ethics Committee of the Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada; Ref. No. KE/FK/1299/EC/2022.

Data Availability: Hakuna data-availability statement tofauti katika PDF ya chanzo.

Conflict of Interest: Hakuna conflict-of-interest statement tofauti katika PDF ya chanzo.

CRediT / Author Contributions: Hakuna sehemu tofauti ya author-contribution/CRediT katika PDF ya chanzo.

Phytochemical quantification: Kiasi cha anthocyanin au active compound nyingine katika CBRB hakikupimwa moja kwa moja katika utafiti.

Molecular pathway analysis: Haikufanywa; intrinsic/extrinsic apoptosis pathway haikubainishwa.

Normal-cell selectivity: Chanzo hakiripoti normal hepatocyte comparison.

In vivo / clinical validation: Hakuna.

Kikomo kikuu cha tafsiri: Matokeo yanatumika tu kwa hali za HepG2 in vitro zilizotumika; hayatoi hitimisho kuhusu matibabu ya saratani, kinga ya saratani au matumizi/dozi salama kwa binadamu.

Maelezo ya kuripoti ndani ya chanzo 1: Abstract inasisitiza ongezeko la late-apoptosis, huku Results ikitoa matokeo yenye nguvu na umuhimu zaidi kwa early apoptosis; late apoptosis iliripotiwa kuwa p>0,05.

Maelezo ya kuripoti ndani ya chanzo 2: Sentensi ya Necrosis Results ina kauli “significant differences (p>0.05)”.

Maelezo ya kuripoti ndani ya chanzo 3: CBRB inaelezwa kama “moderate cytotoxicity” kwa viability inhibition katika viwango vya juu, huku katika uainishaji wa IC50 uliotolewa na chanzo >500 μg/mL ikiangukia katika kategoria tofauti ya potency.

Maelezo ya kuripoti ndani ya chanzo 4: Discussion sehemu moja inaita HeLa “breast cancer cells”, huku Introduction ikiieleza HeLa kama human cervical cancer cell line.