Clavibacter michiganensis, фитопатогени растанӣ аст, ки метавонад дар помидор бемории canker-и бактериявиро ба вуҷуд оварад, бофтаи ксилемаро колонизатсия кунад ва тавассути тухм интиқол ёбад. Ин таҳқиқот пас аз ворид кардани C. michiganensis LMG7333^T -и бо GFP нишондоршуда ба растании помидор тавассути се роҳи гуногуни инокулятсия муайян кардааст, ки бактерия дар кадом бофтаҳо ҷойгир мешавад ва бо пешрафти сироят дар бофтаҳои растанӣ кадом тағйироти гистологӣ ба вуҷуд меоянд. Муҳаққиқон тазриқи поя, drench-и хок бо буридани реша ё бе он ва усули пахта-pad-и ба сатҳи поя татбиқшавандаро муқоисавӣ истифода бурданд. Ҷойгиршавии бактерия бо флуорессенсияи GFP ва вайроншавии сохтори бофта бо рангкунии propidium iodide (PI) пайгирӣ карда шуд.

Натиҷаи муштараки се равиши инокулятсия ин буд, ки C. michiganensisдар паҳншавии системавӣ ксилемаро ҳамчун роҳи марказӣ истифода мебарад. Бо вуҷуди ин, роҳи маҳаллии бактерия пеш аз расидан ба ксилема ва пас аз колонизатсияи он вобаста ба шакли инокулятсия фарқ мекард. Ҳангоми тазриқи поя бактерия мустақиман ба бофтаҳои дохилии осебдида мерасид, бинобар ин дар ксилема, кортекс ва бофтаи мағзӣ колонизатсияи босуръат ва дар минтақаи инокулятсия рушди равшани canker мушоҳида шуд. Дар drench-и хок бо буридани реша бактерия аввал рагҳои ксилемаро колонизатсия карда, тавассути ксилема ба боло ҳаракат намуда, сипас ба бофтаи мағзии ҳамсоя паҳн шуд. Дар усули пахта-pad бошад, бактерия дар рӯзи 5 дар атрофи трихомаҳо, сӯрохиҳои табиӣ ва фосилаҳои байниҳуҷайравии кортекс дида шуда, баъдтар ба ксилема расид.

Пас аз тазриқи поя, гарчанде дар рӯзи 5 ҳанӯз аломати намоён вуҷуд надошт, сигналҳои GFP дар кортекс ва бофтаи мағзӣ ошкор шуданд. Аломатҳои canker дар рӯзи 10 оғоз ёфта, дар рӯзи 15 бо кафидани поя равшантар шуданд ва дар рӯзи 20 canker-и вазнинтар, тағйири ранг ва фурӯравии бофта мушоҳида гардид. Мушоҳидаҳо дар қисмҳои болоии поя нишон доданд, ки бактерия барои паҳншавӣ ба боло асосан ксилемаро истифода мебарад ва гузариши уфуқӣ ба бофтаи мағзӣ маҳдудтар аст.

Дар drench-и хок бо буридани реша ҳаракати системавии бактерия дар дохили растанӣ равшантар пайгирӣ гардид. MoneyMaker дар помидорҳои MoneyMaker сигнали GFP дар рагҳои ксилема дар рӯзи 10 дида шуда, дар рӯзҳои 15 ва 20 қавитар шуд. Бактерия аз қисми поёнии растанӣ дар рӯзи 5 тавассути фарҳанг барқарор карда шуд, аз қисми болоии поя бошад дар рӯзи 15. Дар минтақаҳои болотар аввал колонизатсияи ксилема, баъд паҳншавӣ ба бофтаи мағзӣ ва вайроншавии ташкили бофта мушоҳида шуд. Дар рӯзи 32 бактерия дар тамоми растанӣ паҳн шуда, фурӯравии ксилема, кортекс ва бофтаи мағзӣ ҳамроҳ бо пажмурдашавӣ ва фурӯравии поя ба вуҷуд омад.

Усули пахта-pad равиши таҷрибавие буд, ки дар он поя бо сӯзан сӯрох намешуд ва воридшавии бактерия аз сатҳи поя пайгирӣ мешуд. Бактерияҳо дар рӯзи 5 дар атрофи трихомаҳо, сӯрохиҳои табиӣ ва фосилаҳои байниҳуҷайравии кортекс дида шуданд. Вайрон шудани пайвастагии ҳуҷайраҳои кортекс ва ҷудошавии бофта дар рӯзи 25 равшан гардид. Сигнали GFP дар ксилема дар рӯзи 35 ошкор шуд; бо вуҷуди ин, то ин вақт дар ксилема вайроншавии равшани гистологӣ дида нашуд. Набудани canker бо набудани колонизатсияи равшан дар бофтаи мағзӣ дар ҳамин таҷриба мувофиқ буд.

Дар манбаъ оид ба вақти оғози пажмурдашавӣ дар таҷрибаи пахта-pad номувофиқии гузориш вуҷуд дорад: матни Results мегӯяд, ки пажмурдашавӣ дар рӯзи 25 пайдо шудааст, дар ҳоле ки шарҳи Расми 6 ва бахши Discussion онро дар рӯзи 15 гузориш мекунанд. Аз ин рӯ, Verianla як вақтро ҳамчун “дуруст” қабул карда, хомӯшона ислоҳ намекунад. Хулосаи боэътимод ин аст, ки пас аз инокулятсияи пахта-pad пажмурдашавӣ инкишоф ёфт ва дар рӯзи 25 равшантар шуд.

Модели умумии сироят, ки таҳқиқот нишон медиҳад, чунин аст: бактерия аз нуқтаҳои вуруд, аз ҷумла трихома, сӯрохиҳои табиӣ ё захм ба кортекс мерасад, сипас тавассути гузарише, ки механизми он ҳанӯз пурра шарҳ дода нашудааст, ба ксилема дохил мешавад, дар тӯли ксилема системавӣ интиқол меёбад ва дар баъзе шароит ба бофтаи мағзии ҳамсоя паҳн шуда, ба фурӯравии бофта ва некроз мусоидат мекунад. Муҳаққиқон пешниҳод мекунанд, ки ферментҳои вайронкунандаи девори ҳуҷайра метавонанд ба ин гузариши байнибофтавӣ кӯмак кунанд; аммо ин механизм дар ин таҳқиқот мустақиман таҷрибавӣ исбот нашудааст.

Clavibacter michiganensis Дар Помидор Кадом Бемориро Ба Вуҷуд Меорад?

Clavibacter michiganensis, фитопатогени колонизатсиякунандаи ксилема аст, ки метавонад дар помидор бемориро бо canker-и бактериявӣ, пажмурдашавӣ, фурӯравии бофтаи поя ва дар баъзе сироятҳо нишонаҳои барг ё мева ба вуҷуд оварад; таваҷҷуҳи ин таҳқиқот махсусан ба он равона шудааст, ки бактерия дар пояи помидор кадом бофтаҳоро бо кадом тартиб колонизатсия мекунад ва ин колонизатсия бо вайроншавии бофта ва рушди нишонаҳо чӣ гуна алоқаманд аст.

Оё “canker” дар ин ҷо маънои саратонро дорад?

Дар патологияи растанӣ canker, ҳамон падидаи биологии саратони инсон ё ҳайвонот нест. Ин истилоҳ осеби маҳаллиеро ифода мекунад, ки дар бофтаи поя ё шоха бо некроз, фурӯравӣ, тағйири ранг, кафидан ва аз даст рафтани бофта ба вуҷуд меояд. Гарчанде истилоҳи «саратони бактериявӣ» метавонад истифода шавад, хонанда набояд онро бо биологияи омос омехта кунад.

Ксилема чист?

Ксилема, бофтаи гузаронандаест, ки барои интиқоли об ва минералҳои ҳалшуда аз решаҳои растанӣ ба поя ва баргҳо масъул аст. Колонизатсияи шадиди рагҳои ксилема бо бактерия ё вайрон шудани сохтори онҳо метавонад интиқоли обро халалдор кунад. Аз ин рӯ, дар патогенҳои колонизатсиякунандаи ксилема пажмурдашавӣ танҳо аломати сатҳи барг нест, балки метавонад натиҷаи намоёни вайроншавии системаи интиқоли оби растанӣ бошад.

Кортекс чист?

Кортекс, қабатҳои ҳуҷайравие мебошанд, ки байни эпидермиси поя ва бофтаҳои гузаронандаи дарунтар ҷойгиранд. Дар таҷрибаи пахта-pad қисми муҳими локализатсияи барвақти бактерия пас аз воридшавӣ аз сатҳи поя дар фосилаҳои байниҳуҷайравии кортекс дида шуд.

Бофтаи мағзӣ ё pith чист?

Бофтаи мағзӣ (pith), бофтаи асосан паренхимавӣ дар қисми марказии поя мебошад. Он метавонад ба захираи об ва моддаҳои ғизоӣ мусоидат кунад. Дар таҳқиқот паҳншавии бактерия аз ксилема ба бофтаи мағзии ҳамсоя бо суст шудани пайвастагии ҳуҷайраҳо, вайроншавии бофта, некрози мағз ва дар ҳолати пешрафта фурӯравии поя алоқаманд карда шуд.

Камбий чист?

Камбийи васкулярӣ, қабати меристематикӣ аст, ки байни ксилема ва флоэма ҷойгир буда, ба ташаккули бофтаҳои нави гузаронанда мусоидат мекунад. Дар таҷрибаи drench-и хок ҳангоми пешрафти сироят дар минтақаи камбий низ сигналҳои қавии GFP ва вайроншавии ташкили бофта мушоҳида шуданд.

Трихома чист?

Трихома, сохтори мӯймонандест, ки аз эпидермиси растанӣ инкишоф меёбад. Дар таҷрибаи пахта-pad дида шудани ҳуҷайраҳои бо GFP нишондоршудаи C. michiganensis дар атрофи трихомаҳо ва минтақаҳои вобаста ба сӯрохиҳои табиӣ нишон медиҳад, ки ин сохторҳои сатҳи поя метавонанд бо нуқтаҳои эҳтимолии воридшавӣ алоқаманд бошанд. Аммо таҳқиқот исбот намекунад, ки ҳар трихома барои бактерия “дарвозаи” кушода аст.

Нишонгузорӣ Бо GFP Ҷойи Бактерияро Дар Дохили Растанӣ Чӣ Гуна Нишон Дод?

Нишонгузорӣ бо GFP C. michiganensis ҳуҷайраҳоро ба таври генетикӣ тавре нишонгузорӣ мекунад, ки enhanced green fluorescent protein истеҳсол кунанд ва ҳамин тавр минтақаҳои колонизатсияи бактериявӣ дар микроскопи флуоресцентӣ тавассути сигнали сабз пайгирӣ мешаванд; таҳқиқот GFP-ро бо рангкунии гистологии PI ва ченкуниҳои CFU-и фарҳангӣ якҷоя истифода бурда, ҷойгиршавии бактерияро аз осеби бофта ҷудо карданӣ шуд.

GFP чист?

GFP (green fluorescent protein; сафедаи сабзи флуоресцентӣ), сафедаест, ки ҳангоми барангехтан бо нури дарозии мавҷи мувофиқ флуорессенсияи сабз медиҳад. Муҳаққиқон C. michiganensis LMG7333^T-ро бо вектори pBL34, ки гени enhanced GFP дорад, трансформатсия карда, тавонистанд паҳншавии бактерияро дар бофтаҳои растанӣ зери микроскоп пайгирӣ кунанд.

Трансформатсия чӣ гуна анҷом дода шуд?

Вектори pBL34 ба ҳуҷайраҳои компетентии бактериявӣ тавассути электропоратсия ворид карда шуд. Трансформантҳо дар муҳити King's B дорои неомисин интихоб ва бо primer-ҳои хоси вектор тавассути PCR тасдиқ шуданд.

Дар муҳити интихобӣ ба ҳар литр 20 g proteose peptone No. 3, 1.5 g K₂HPO₄, 6 mL 1 M MgSO₄ ва 16 mL %50 глисерол истифода шуда, муҳит бо 100 μg/mL неомисин ғанӣ карда шуд.

Чаро сигнали GFP мустақиман “шумораи бактерияҳо” нест?

Сигнали флуоресцентӣ локализатсияи бактерияҳои нишондоршударо дар бофта нишон медиҳад; аммо равшании микроскопӣ худ аз худ шумораи дақиқи бактерияҳои зинда нест. Ба шиддати сигнал на танҳо зичии бактериявӣ, балки дастрасии оптикӣ, сохтори бофта, флуорессенсияи замина ва ҳадди ошкорсозӣ низ таъсир мерасонанд. Аз ин рӯ, муҳаққиқон дар баъзе таҷрибаҳо бори бактериявии зиндаро алоҳида парвариш намуда, бо CFU чен карданд.

Чаро автофлуорессенсияи растанӣ метавонад мушкил бошад?

Бофтаҳои растанӣ, махсусан ҷузъҳои девори ҳуҷайра, ҳатто бе истифодаи GFP флуорессенсияи табиӣ тавлид карда метавонанд. Ин автофлуорессенсия, метавонад бо сигнали ҳақиқии бактериявии GFP омехта шавад. Дар таҳқиқот барои GFP барангезиши 460–500 nm ва филтри эмиссияи 512–542 nm истифода шуд; барои фарқ кардани автофлуорессенсияи растанӣ маҷмӯи дуюми филтр бо барангезиши 323–375 nm ва эмиссияи 435–485 nm татбиқ гардид.

Propidium iodide чиро нишон дод?

Propidium iodide (PI), дар ин таҳқиқот ҳамчун ранги флуоресцентӣ барои визуализатсияи деворҳои ҳуҷайраи растанӣ ва махсусан сохторҳои дорои пектин истифода шуд. Ба буришҳо %0.05 PI татбиқ шуда, 5 дақиқа инкубатсия ва сипас ду маротиба бо оби стерилии дистиллшуда шуста шуданд. Сигналҳои PI дар диапазони барангезиши 532–558 nm ва эмиссияи 572–648 nm тасвир карда шуданд.

Нақши асосии тасвирҳои PI ҷавоб додан ба саволи “бактерия куҷост?” нест, балки арзёбии он аст, ки меъмории бофтаи растанӣ дар минтақае, ки бактерия дида мешавад, нигоҳ дошта шудааст ё не. Вайроншавиҳои сохторие, ки бо тирҳои сафед нишон дода шудаанд, бо аз даст рафтани пайвастагии байниҳуҷайравӣ, ҷудошавии бофта ва дар марҳилаи пешрафта фурӯравии бофта алоқаманд карда шуданд.

Чаро Се Усули Инокулятсия Якҷоя Истифода Шуданд?

Се усули инокулятсия барои ҷудо кардани роҳҳои эҳтимолии гуногуни воридшавии бактерия ва ғарази таҷрибавии ҳар усул истифода шуданд: тазриқи поя дастрасии зуд ба бофтаҳои дохилиро таъмин мекунад, аммо захми сунъӣ ба вуҷуд меорад; drench-и хок сирояти аз реша саршавандаро модел мекунад; усули пахта-pad бошад имкон медиҳад воридшавӣ аз трихомаҳо, сӯрохиҳои табиӣ ва захмҳои табиии сатҳи поя пайгирӣ шавад.

Чаро ду култивари гуногуни помидор истифода шуданд?

Тазриқи поя дар оғоз дар Betatini анҷом дода шуд. Drench-и хок низ аввал бо Betatini озмуда шуд; аммо азбаски дар ин култивар ҳангоми парвариши зиёда аз 20 рӯз рехтани барг ва дигар ғайримуқаррарии физиологӣ дида шуданд, барои арзёбии дарозмуддат ба MoneyMakerгузаштанд.

Дар растаниҳои Betatini бе буридани реша пажмурдашавӣ дар рӯзи 26 дида шуд, дар ҳоле ки дар растаниҳои решабурида дар рӯзи 13 ва шадидтар мушоҳида гардид. Ин муқоиса нишон медиҳад, ки захм метавонад рушди сироятро тезонад. Аммо манбаъ барои ин фарқ андозаи алоҳидаи таъсири миқдорӣ ё p-арзиши муқоисавӣ гузориш намекунад.

Чаро инокулум ҳамчун 10⁹ CFU/mL ифода мешавад?

CFU/mL (colony-forming units per milliliter), зичии тахминии воҳидҳои бактерияи зиндаро дар як миллилитр суспензия ифода мекунад, ки метавонанд дар муҳити фарҳангӣ колония ташкил кунанд. Дар таҳқиқот инокулум ба сатҳи 10⁹ CFU/mL танзим ва ин зичӣ бо OD₆₀₀=1.0 мувофиқ карда шуд.

OD₆₀₀ чист?

OD₆₀₀, зичии оптикии фарҳанги бактериявӣ дар дарозии мавҷи 600 nm аст. Бо зичтар шудани суспензияи ҳуҷайра парокандашавии нур зиёд ва арзиши OD баланд мешавад. OD₆₀₀ шумораи мустақими ҳуҷайраҳои зинда нест; он дар таҳқиқот ченаки оптикӣ барои стандартизатсияи инокулум мебошад. Барои чен кардани бактерияҳои зиндаи қобили колонизатсия усули CFU алоҳида истифода шуд.

Назорати манфӣ чӣ буд?

Дар ҳар се усули инокулятсия маҳлули 10 mM MgCl₂ , ки бактерия дар он суспензия шуда буд, бе бактерия ҳамчун mock-назорати манфӣ истифода гардид. Бо ин роҳ санҷида шуд, ки тағйироти бофта танҳо аз маҳлули интиқолдиҳанда ба вуҷуд омадаанд ё не.

Пас Аз Тазриқи Поя Бактерия Чӣ Гуна Паҳн Шуд?

Дар тазриқи поя захми мустақим ба бактерия имкон дод, ки зуд ба кортекс, ксилема ва бофтаи мағзӣ расад; canker-и маҳаллӣ аз рӯзи 10 инкишоф ёфт, дар ҳоле ки дар қисмҳои болоии поя интиқоли бактерия ба боло асосан бо ксилема алоқаманд менамуд.

Рӯзи 5

Гарчанде аломати намоёни canker набуд, сигналҳои GFP дар кортекс ва бофтаи мағзӣ ошкор шуданд. Ин нишон медиҳад, ки аломати намоёни беморӣ метавонад баъд аз оғози колонизатсияи бактериявӣ пайдо шавад.

Рӯзи 10

Дар минтақаи инокулятсия аломатҳои canker намоён шуданд. Суст шудани пайвастагии байниҳуҷайравӣ дар бофтаи мағзӣ дар рангкунии PI равшан шудан гирифт.

Рӯзи 15

Canker шадидтар шуд ва кафидаҳои васеи поя мушоҳида гардиданд. Паҳншавии бактерия дар бофтаи мағзӣ васеътар шуд. Дар бофтаҳои дуртар аз болои котиледон дар interfascicular ксилема ва камбий сигнали GFP дида ва дар ҳамон минтақаҳо фурӯравии бофта ошкор гардид.

Рӯзи 20

Дар минтақаи инокулятсия canker, тағйири ранги бофта ва фурӯравии кортекс/бофтаи мағзӣ вазнинтар шуданд. Қисмҳои марказии бофтаи мағзӣ аз сабаби вайроншавии пешрафтаи ҳуҷайра ба дараҷае осеб диданд, ки дигар фарқ карда намешуданд.

Дар қисми болоии поя бактерия асосан дар ксилема ва бофтаи мағзии ҳамсояи ксилема дида шуд. Ин паҳншавӣ нишон медиҳад, ки ксилема барои ҳаракати дурмасофаи бактерия ба боло муҳимтар аст, дар ҳоле ки паҳншавии уфуқӣ дар бофтаи мағзӣ маҳдудтар мебошад.

Номувофиқии 10 cm / 20 cm дар манбаъ

Дар бахши Methods-и манбаъ барои мушоҳидаи қисми болоии поя дар рӯзи 20 “10 cm болотар аз котиледон” навишта шудааст. Матни Results ва шарҳи Расми 2 ҳамин мушоҳидаро ҳамчун “20 cm болотар аз котиледон” медиҳанд. PDF-и асосӣ шарҳи иловагӣ барои мувофиқ кардани ин ду гузориш надорад. Аз ин рӯ, Verianla масофаро ба як арзиши муайян хомӯшона табдил намедиҳад.

Drench-и Хок Нақши Ксилемаро Дар Сирояти Аз Реша Оғозшуда Чӣ Гуна Нишон Дод?

Дар drench-и хок бо буридани реша C. michiganensis аввал дар рагҳои ксилема ошкор шуд, тавассути ксилема ба қисмҳои болоии растанӣ интиқол ёфт ва бо пешрафти сироят ба бофтаи мағзии ҳамсоя паҳн шуда, бо вайроншавии бофтаҳои васкулярӣ ва мағзӣ ҳамроҳ гардид.

Минтақаи пайвасти котиледон

Сигнали GFP дар рагҳои ксилема дар рӯзи 10 дида шуда, дар рӯзҳои 15–20 қавитар шуд. Тибқи манбаъ, то рӯзи 20 дар ин минтақа фурӯравии равшани бофта дида нашуд, аммо дар рӯзи 32 сироят дар тамоми растанӣ пеш рафта, дар ксилема, кортекс ва бофтаи мағзӣ фурӯравӣ мушоҳида гардид.

Ошкор кардани бактерия бо фарҳанг дар қисмҳои поёнӣ ва болоии растанӣ

Пас аз drench-и хок бактерияҳо аз намунаи пояи поёнӣ 5 cm болотар аз сатҳи хок дар рӯзи 5 барқарор карда шуданд. Дар намунаи пояи болоӣ 5 cm поёнтар аз навдаи апикалӣ бактерияҳо бори аввал дар рӯзи 15 бо фарҳанг тасдиқ гардиданд. Ин фарқи вақт бо ҳаракати системавии бактерия ба боло пас аз сирояти аз реша оғозшуда мувофиқ аст.

5 cm болотар аз котиледон

Дар рӯзи 5 сигнали ошкоршавандаи GFP вуҷуд надошт. Дар рӯзи 10 бактерия дар рагҳои ксилема дида шуд. Дар рӯзи 15 паҳншавӣ ба ксилема ва бофтаи мағзии ҳамсоя равшантар шуд ва дар interfascicular ксилема ва бофтаи мағзӣ аввалин вайроншавиҳои гистологӣ мушоҳида гардиданд. Дар рӯзи 20 сигнали GFP ба минтақаи васеътар, аз ҷумла минтақаи камбий, паҳн шуда, ташкили бофта дар interfascicular ксилема, бофтаи мағзӣ ва минтақаҳои камбий вайрон шуд.

10 cm болотар аз котиледон

Сигнали GFP бори аввал дар рӯзи 15 дар рагҳои ксилема ошкор шуд. Дар рӯзи 20 бактерия ҳам дар ксилема ва ҳам дар бофтаи мағзӣ дида шуд; рангкунии PI вайрон шудани сохтори ксилема ва парокандашавии бофтаи мағзиро нишон дод.

Рӯзи 32

Манбаъ хабар медиҳад, ки дар ин марҳила бактерия тамоми растаниро колонизатсия карда, дар ксилема, кортекс ва бофтаи мағзӣ фурӯравии бофта вуҷуд дошт. Ҳамзамон дар растаниҳо пажмурдашавии равшан ва фурӯравии поя инкишоф ёфт.

Таҷрибаи Пахта-Pad Дар Бораи Роҳи Табиии Воридшавӣ Чӣ Нишон Дод?

Усули пахта-pad имкон дод, ки воридшавии бактерия тавассути сохторҳои эпидермалӣ бе сӯрох кардани поя пайгирӣ шавад; C. michiganensis аввал дар трихомаҳо, сӯрохиҳои табиӣ ва фосилаҳои байниҳуҷайравии кортекс дида шуда, сипас ба ксилема расид, аммо дар давоми таҷриба колонизатсияи бофтаи мағзӣ ва рушди canker нишон дода нашуд.

Рӯзи 5

Бактерияҳои бо GFP нишондоршуда дар трихомаҳо, минтақаҳои вобаста ба сӯрохиҳои табиӣ ва фосилаҳои байниҳуҷайравии кортекс мушоҳида шуданд. Бактерия инчунин бо усули фарҳанг аз растанӣ барқарор карда шуд.

Рӯзи 25

Дар бофтаи кортекс колонизатсияи қавӣ дида шуда, аз даст рафтани пайвастагии ҳуҷайраҳои кортикалӣ ба ҷудошавии бофта овард. Ин нишон медиҳад, ки бактерия баъд аз воридшавӣ аз сатҳи поя метавонад муддати назаррас дар компартменти кортекс бимонад.

Рӯзи 35

Дар ксилема сигналҳои GFP ошкор шуданд; аммо то ин вақт дар бофтаи ксилема вайроншавии равшани гистологӣ дида нашуд. Ин нишон медиҳад, ки аз “агар бактерия дар ксилема дида шавад, пас ксилема ҳатман фурӯ рехтааст” чунин хулоса баровардан мумкин нест.

Номувофиқии манбаъ дар оғози пажмурдашавӣ

Матни Results менависад, ки дар гурӯҳи пахта-pad пажмурдашавӣ дар рӯзи 25 дида шуд. Баръакс, шарҳи Расми 6 пажмурдашавиро дар рӯзи 15 ва дар рӯзи 25 шадидтар тавсиф мекунад. Бахши Discussion низ мегӯяд, ки пажмурдашавӣ дар рӯзи 15 пайдо шудааст. Манбаи асосӣ ин номувофиқиро шарҳ намедиҳад. Хулосаи умумии боэътимод ин аст, ки пажмурдашавӣ дар давоми таҷриба инкишоф ёфта, дар рӯзи 25 равшан буд.

Чаро ҳангоми мавҷуд будани пажмурдашавӣ сигнали GFP дар ксилема дертар дида шуд?

Муаллифон муҳокима мекунанд, ки фарқи вақт байни пажмурдашавии рӯзи 15 ва дида шудани сигнали GFP дар ксилема дар рӯзи 35 метавонад аз ҳадди ҳассосияти ошкорсозии GFP бошад. Яъне набудани сигнали намоёни GFP зери микроскоп маънои онро надорад, ки бактерия тамоман вуҷуд надорад. Ин шарҳи эҳтимолӣ аст; таҳқиқот ин масъалаи ҳассосиятро бо таҷрибаи алоҳида ба таври миқдорӣ санҷидааст.

Оё Маълум Аст, Ки Бактерия Аз Кортекс Ба Ксилема Чӣ Гуна Мегузарад?

Не; таҳқиқот нишон медиҳад, ки бактерия аз кортекс ба ксилема мерасад, аммо бевосита муайян накардааст, ки бофтаи васкулярӣ тавассути кадом роҳи микроскопии гузариш ва кадом механизми молекулавӣ убур карда мешавад; механизме, ки ферментҳои вайронкунандаи девори ҳуҷайра бо тағйир додани pit мембранаҳо метавонанд ба гузариш мусоидат кунанд, танҳо гипотезаи пешниҳодкардаи муаллифон аст ва таҳқиқоти иловагӣ талаб мекунад.

Pit ва pit мембрана чист?

Дар деворҳои дуюмдараҷаи ҳуҷайравии унсурҳои гузаронандаи ксилема минтақаҳои тунукшуда мавҷуданд, ки ба гузариши об байни ҳуҷайраҳои ҳамсоя имкон медиҳанд. Ин минтақаҳо pit номида мешаванд ва pit мембрана метавонад бар зидди гузариши озоди сохторҳои калонтар, аз ҷумла бактерия, монеаи ҷисмонӣ эҷод кунад.

CWDE чист?

Cell wall-degrading enzymes (CWDEs), номи умумии ферментҳоест, ки метавонанд полисахаридҳои сохтории девори ҳуҷайраи растаниро таҷзия кунанд. Манбаъ таҳқиқоти пешинаро баррасӣ мекунад, ки C. michiganensisметавонад CWDE-ҳо, ба монанди cellulase, pectate lyase ва polygalacturonase тавлид кунад.

Оё таҳқиқот механизми CWDE-ро исбот кард?

Не. Муҳаққиқон фарз мекунанд, ки ин ферментҳо бо тағйир додани хусусиятҳои монеавии pit мембранаҳо ҳаракати бактерияро байни ҳуҷайраҳо ё бофтаҳо осон карда метавонанд. Аммо дар таҳқиқоти ҷорӣ мутанти CWDE, ченкунии фаъолияти фермент ё таҷрибаи баландтафсил барои бевосита нишон додани гузариш аз pit мембрана анҷом дода нашудааст. Муаллифон равшан мегӯянд, ки ин механизм бояд бо таҳқиқоти иловагии микроскопӣ омӯхта шавад.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Маводи растанӣ ва шароити парвариш

Штамми бактериявӣ ва нишонгузории GFP

C. michiganensis LMG7333^T, бо вектори pBL34 дорои гени enhanced GFP трансформатсия шудааст. Вектор тавассути электропоратсия ворид, интихоби неомисин анҷом ва трансформатсия бо primer-ҳои хоси вектор тавассути PCR тасдиқ шуд.

Омодасозии инокулум

Бактерияҳои бо GFP нишондоршуда дар муҳити King's B дар 26°C се рӯз инкубатсия шуданд. Ҳуҷайраҳо дар 10 mM MgCl₂ дубора суспензия шуда, зичии ниҳоӣ ба 10⁹ CFU/mL, OD₆₀₀=1.0 танзим шуд.

Протоколи тазриқи поя

Дар растаниҳои Betatini 1 cm болотар аз котиледон бо сӯзан сӯрохи хурд сохта шуда, ба поя 20 μL суспензияи бактериявӣ дода шуд. Барои mock-назорат бо ҳамон ҳаҷм 10 mM MgCl₂ бе бактерия истифода шуд.

Canker, GFP ва тағйироти гистологӣ дар минтақаи инокулятсия дар рӯзҳои 5, 10, 15 ва 20 пайгирӣ шуданд. Қисмҳои болоии поя низ алоҳида омӯхта шуданд; аммо байни Methods ва Results/Fig. 2 оид ба масофаи рӯзи 20 номувофиқии 10 cm–20 cm вуҷуд дорад.

Протоколи drench-и хок

Ба хоки атрофи растаниҳои MoneyMaker аз суспензияи бактериявии 10⁹ CFU/mL 20 mL рехта шуд. Таҷриба муқоисаи пешакии шароити бо решаи пешакӣ бо қайчии стерил буридашуда ва набуридашударо дар бар гирифт. Таҳқиқоти минбаъдаи гистологӣ бо растаниҳои MoneyMaker-и решабурида идома ёфт.

Тағйироти гистологӣ ва сигналҳои GFP дар пайвасти котиледон ва минтақаҳои поя 5 cm ва 10 cm болотар аз он дар рӯзҳои 5, 10, 15 ва 20 омӯхта шуданд. Дар рӯзи 32 пажмурдашавӣ арзёбӣ ва дар пайвасти котиледон таҳқиқоти гистологии пешрафта анҷом дода шуд.

Протоколи пахта-pad

Падҳои пахтагии стерилӣ ба суспензияи бактериявии 10⁹ CFU/mL тар карда, дар пояи MoneyMaker поёнтар аз котиледонҳо печонида шуданд. Барои пешгирии зуд хушк шудани пад онро бо пластик пӯшонда, 17 соат пас бардоштанд.

GFP, тағйироти гистологӣ ва пажмурдашавӣ дар рӯзҳои 5, 15 ва 25 пайгирӣ шуданд. Сохторҳои эпидермалӣ махсусан дар рӯзи 5; кортекс ва ксилема дар марҳилаҳои дертар, рӯзҳои 25 ва 35 омӯхта шуданд.

Микроскопия

Намунаҳои поя бо теғ дастӣ ба буришҳои тунуки арзӣ омода, бо оби стерилии дистиллшуда мулоим шуста ва ба слайди шишагӣ гузошта шуданд. Тасвиргирӣ бо Leica DM6 B микроскопи флуоресцентӣ анҷом дода шуд.

Афзоиши бактериявӣ чӣ гуна чен карда шуд?

Дар гурӯҳи drench-и хок аз ду қисми поя намуна гирифта шуд: 5 cm болотар аз сатҳи хок ва 5 cm поёнтар аз навдаи апикалӣ. Дар таҷрибаи пахта-pad намунаҳои поя 5 cm болотар аз сатҳи хок истифода шуданд.

Пояҳои бурида бо %1 NaOCl безараргардонии сатҳӣ карда, ду маротиба бо оби стерилии дистиллшуда шуста шуданд. Намунаҳо дар халтаи пластикӣ бо кӯбаки резинӣ гомогенизатсия шуда, ба халта 1 mL оби стерилии дистиллшуда илова ва 30 дақиқа нигоҳ дошта шуданд. Сипас разрежонии пайдарпай анҷом дода шуда; аз ҳар разрежонӣ 20 μL ба KB agar дорои 100 μg/mL неомисин қатрагӣ гузошта шуд. Пас аз инкубатсияи плакаҳо дар 26°C се рӯз, воҳидҳои колониясоз шумурда шуданд.

Графики “Log CFU/g”-ро чӣ гуна бояд хонд?

Манбаъ бори бактериявиро дар графикҳо бо миқёси логарифмии CFU/g нишон медиҳад. Аз ин рӯ, як воҳид болоравӣ байни 8 ва 9 дар график ба таври хаттӣ “як бактерияи дигар” маъно надорад; он тақрибан дараҷаи даҳкаратаи тағйири CFU/g-ро ифода мекунад. Аммо азбаски PDF-и асосӣ ҷадвалҳои хоми CFU-ро намедиҳад, Verianla аз сутунҳои график арзишҳои дақиқи миёнаро ҳосил намекунад.

Таҳлили оморӣ

Ҳамаи маълумоти графикӣ ҳамчун миёна ± инҳирофи стандартӣ пешниҳод шудааст. Барои муқоисаи гурӯҳҳои мустақил Tukey's HSD истифода шуда, аҳамияти оморӣ ҳамчун P<0.001 арзёбӣ гардид.

Матни усули манбаъ тартиби алоҳидаи ANOVA-ро пеш аз Tukey HSD ошкоро гузориш намекунад. Аз ин рӯ, Verianla бо такя ба амалияи стандартии оморӣ қадами дар манбаъ набудаи “аввал ANOVA гузаронида шуд”-ро илова намекунад.

Дар матни усул ва шарҳҳои расмии PDF-и асосӣ шумораи растаниҳои таҷрибавӣ барои ҳар гурӯҳ n ошкоро гузориш нашудааст. Аз ин рӯ, дар бораи ҳаҷми намуна ё қувваи оморӣ рақам тавлид кардан мумкин нест. Маводи иловагӣ метавонад тафсилоти таҷрибавии иловагӣ дошта бошад; аммо PDF-и асосии пешниҳодшуда танҳо ин маълумотро тасдиқ карда наметавонад.

Натиҷаҳои асосии тазриқи поя

Натиҷаҳои асосии drench-и хок

Натиҷаҳои асосии таҷрибаи пахта-pad

Чаро паҳншавӣ ба бофтаи мағзӣ дар пояи болоӣ равшантар буда метавонад?

Муаллифон муҳокима мекунанд, ки бофтаи мағзии қисмҳои болоии поя метавонад камтар дифференсиатсия шуда бошад ва ташаккули лигнин ва суберин дар пояи поёнӣ ҳаракати уфуқии бактерияро бештар маҳдуд кунад. Ин тафсири биологиест, ки барои шарҳи намунаи колонизатсия пешниҳод шудааст; таҷрибаи ҷорӣ миқдори лигнин ё суберинро мустақиман чен накардааст.

Гумон меравад, ки бофтаи мағзӣ ба бактерия чӣ дода метавонад?

Азбаски бофтаи мағзӣ метавонад ҳамчун захираи об ва моддаҳои ғизоӣ хизмат кунад, колонизатсияи он аз ҷониби бактерия метавонад дастрасӣ ба энергия ва ғизоро зиёд кунад. Ҳамин раванд метавонад ба вайроншавии бофтаи мағзӣ, некроз ва аз даст рафтани тамомияти механикии поя мусоидат кунад. Аммо таҳқиқоти ҷорӣ метаболикӣ чен накардааст, ки бактерия кадом ғизоҳоро аз бофтаи мағзӣ ба чӣ миқдор истифода мекунад.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

• C. michiganensis дар ҳар се равиши инокулятсия тавонист растаниҳои помидорро сироят кунад.
• Ксилема роҳи марказии колонизатсия барои паҳншавии системавии бактерия аст.
• Тазриқи поя бо колонизатсияи маҳаллии кортекс, ксилема ва бофтаи мағзӣ ба рушди босуръати canker овард.
• Дар drench-и хок бо решаи бурида бактерия аввал дар ксилема дида шуда, баъд ба бофтаи мағзии ҳамсоя паҳн шуд.
• Пас аз drench-и хок бактерия аз пояи поёнӣ дар рӯзи 5 ва аз пояи болоӣ дар рӯзи 15 тавассути фарҳанг барқарор шуд.
• Дар инокулятсияи пахта-pad локализатсияи барвақти бактерия дар трихомаҳо, сӯрохиҳои табиӣ ва фосилаҳои байниҳуҷайравии кортекс дида шуд.
• Пас аз инокулятсияи пахта-pad бактерия дар марҳилаи дертар ба ксилема расид.
• Колонизатсияи бофтаи мағзӣ ва фурӯравии бофта бо рушди canker алоқаманд аст.
• Пажмурдашавӣ ҳатто бе вайроншавии вазнини намоёни гистологии ксилема пайдо шуда метавонад.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

• Роҳи дақиқи ҳуҷайравии гузариш аз кортекс ба ксилема муайян нашудааст.
• Бевосита исбот нашудааст, ки CWDE-ҳо pit мембранаҳоро вайрон карда гузаришро таъмин мекунанд.
• Нишон дода нашудааст, ки ҳар сирояти табиии саҳроӣ аз трихома оғоз мешавад.
• Набудани сигнали GFP қатъиян исбот намекунад, ки дар бофтаи дахлдор бактерия нест.
• Нишон дода нашудааст, ки ҳар колонизатсияи ксилема фавран ба фурӯравии намоёни ксилема оварда мерасонад.
• Тазриқи пояро модели дақиқи сирояти табиӣ гуфтан мумкин нест.
• Soil drench бо буридани реша ба сирояти табиии решаи бе захм дақиқ баробар нест.
• Муқоисаи назоратшавандаи генетикӣ оид ба муқовимат ё ҳассосияти беморӣ байни култиварҳо анҷом дода нашудааст.
• Азбаски манбаъ дар PDF-и асосӣ барои ҳар гурӯҳи таҷрибавӣ ҳаҷми намунаи равшан надодааст, умумисозии миқдорӣ дар сатҳи популятсия мумкин нест.

Ҷиҳатҳои қавии таҳқиқот

Ҷиҳати қавии аввал ин аст, ки он ба як усули сунъии инокулятсия маҳдуд нашуд. Истифодаи якҷояи тазриқи поя, drench-и хок аз реша ва усули пахта-pad аз сатҳи поя имкон дод, ки рафтори бактерия дар роҳҳои гуногуни воридшавӣ муқоиса шавад.

Ҷиҳати қавии дуюм ин аст, ки бактерия танҳо аз рӯи аломатҳои намоёни беморӣ пайгирӣ нашуд. Истифодаи якҷояи локализатсияи GFP, гистологияи PI ва ченкуниҳои CFU-и фарҳангӣ саволҳои “бактерия куҷост?”, “бофта дар чӣ ҳолат аст?” ва “оё бактерияи зиндаи қобили колонизатсия барқарор мешавад?”-ро дар сатҳҳои гуногуни ченкунӣ баррасӣ кард.

Ҷиҳати қавии сеюм ин аст, ки сироят на танҳо дар минтақаи инокулятсия, балки бо гузашти вақт дар қисмҳои болотари поя низ пайгирӣ шуд. Бо ин роҳ интиқоли системавӣ ва паҳншавии маҳаллии уфуқии бофта қисман аз ҳам ҷудо карда шуданд.

Ҷиҳати қавии чорум ин аст, ки манбаъ маҳдудияти усули сунъии инокулятсияи худро ошкоро муҳокима карда, ба равиши табиитарини воридшавии эпидермалӣ гузашт.

Маҳдудиятҳои асосии таҳқиқот

Тазриқи поя захми сунъӣ эҷод мекунад: Воридшавии мустақим ба бофта бо сӯзан метавонад марҳилаҳоеро, ки бактерия бояд табиатан эпидермис ва кортексро убур кунад, аз байн барад. Аз ин рӯ, колонизатсияи босуръат ва васеи маҳаллӣ дар таҷрибаи тазриқ набояд бо суръати сирояти табиӣ баробар карда шавад.

Буридани реша низ захм эҷод мекунад: Дар таҷрибаи soil-drench буридани реша боиси рушди барвақттари беморӣ шуд. Ин шароит ба сирояти табиии решаи бе захм дақиқ баробар нест.

Ҳадди ошкорсозии GFP: Дар таҷрибаи пахта-pad пажмурдашавӣ пештар аз намоён шудани колонизатсияи ксилема бо GFP гузориш шуд. Муаллифон мегӯянд, ки ин метавонад қисман бо ҳассосияти ошкорсозии GFP алоқаманд бошад.

Механизми воридшавӣ ба системаи васкулярӣ ҳал нашудааст: Тафсилоти анатомӣ ва молекулавии гузариш аз кортекс ба ксилема мустақиман нишон дода нашудааст.

Шарҳи CWDE гипотеза аст: Ферментҳо ба монанди cellulase, pectate lyase ва polygalacturonase ҳамчун механизми эҳтимолӣ муҳокима шуданд; дар ин таҳқиқот мутанти фермент ё санҷиши мустақими функсия анҷом дода нашуд.

Дар PDF-и асосӣ ҳаҷми намуна намерасад: Гарчанде графикҳо ҳамчун миёна ± инҳирофи стандартӣ ва бо Tukey HSD пешниҳод шудаанд, арзиши n барои ҳар гурӯҳи таҷрибавӣ дар матни асосӣ ё шарҳҳои расм равшан нишон дода нашудааст.

Ду номувофиқии дохилии гузориш: Дар тазриқи поя минтақаи болоӣ ҳамчун 10/20 cm гуногун навишта шудааст ва оғози пажмурдашавӣ дар пахта-pad ҳамчун 15/25 рӯз гуногун гузориш шудааст; ин тафсилоти вақт/мавқеи манбаро бояд бо эҳтиёт тафсир кард.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Унвони аслӣ: Invasion of Clavibacter michiganensis into the Xylem and Surrounding Tissues Drives Histological Alterations and Disease Development in Tomato.

Муаллифон ва тартиби пурра: Minho Chung, Eom-Ji Oh, In Woong Park, In Sun Hwang, Chang-Sik Oh.

Саҳми баробар: Minho Chung, Eom-Ji Oh ва In Woong Park саҳми баробар гузоштаанд.

Муаллифи масъул: Chang-Sik Oh.

Муассиса 1: Department of Agricultural Biotechnology, College of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, Seoul 08826, Korea.

Муассиса 2: Global Plant Immunity Research Center, Seoul National University, Seoul 08826, Korea.

Муассиса 3: Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, Seoul 08826, Korea.

Муассиса 4: Plant Genomics and Breeding Institute, Seoul National University, Seoul 08826, Korea.

Муассиса 5: Plant Health Center, Seoul National University, Seoul 08826, Korea.

Маҷалла: The Plant Pathology Journal.

Ношир / ташкилоти нашркунанда: The Korean Society of Plant Pathology.

Навъи манбаъ: Research Article; таҳқиқоти таҷрибавии патологияи растанӣ бо сирояти назоратшавандаи растанӣ, микроскопия, гистология ва ченкунии бактериявии фарҳангӣ.

DOI: 10.5423/PPJ.OA.06.2026.0089.

Received: 26 июни 2026.

Revised: 30 июли 2026.

Accepted: 30 июли 2026.

Online publication: 21 августи 2026.

Ҳолати версияи PDF-и боршуда: Epub ahead of print.

Сабти библиографии ҷорӣ: Plant Pathology Journal, 2026, ҷилди 42, шумораи 5, саҳифаҳои 698–711; сабти шумораи чопии октябри 2026.

Ҳолати тақриз: Мақолаи таҳқиқотии маҷаллаи тақризшуда.

Ҳолати preprint: Ҳуҷҷати боршуда preprint нест; он версияи ahead-of-print-и мақолаи тақризшуда мебошад.

Литсензия: Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International (CC BY-NC 4.0).

Пайванди расмӣ: https://doi.org/10.5423/PPJ.OA.06.2026.0089

Калидвожаҳо: canker, Clavibacter michiganensis, histological alteration, pith tissue, xylem colonization.

Растаниҳои таҷрибавӣ: Solanum lycopersicum cv. Betatini ва MoneyMaker.

Шароити парвариш: 26°C, 14 соат рӯшноӣ/10 соат торикӣ, %50 намии нисбӣ.

Синни растанӣ: 4 ҳафта.

Штамми бактериявӣ: Clavibacter michiganensis LMG7333^T.

Вектори GFP: pBL34; Korean Patent No. 10-2877826.

Трансформатсия: Электропоратсия.

Тасдиқи трансформант: PCR бо primer-ҳои хоси вектор.

Селексия: Муҳити King's B + 100 μg/mL неомисин.

Инокулум: 10⁹ CFU/mL; OD₆₀₀=1.0; 10 mM MgCl₂ суспензия.

Stem injection: Betatini; сӯрохи сӯзан 1 cm болотар аз котиледон; 20 μL суспензияи бактериявӣ.

Soil drench: Дар таҷрибаи давомдори MoneyMaker; 20 mL, 10⁹ CFU/mL; шароити бо решаи пешакӣ буридашуда истифода шуд.

Cotton-pad: MoneyMaker; пади стерилии ба бактерия таркардашуда дар зери котиледон ба поя печонда, бо пластик пӯшида ва пас аз 17 соат бардошта шуд.

Mock-назорат: 10 mM MgCl₂.

Микроскоп: Leica DM6 B.

Барангезиш/эмиссияи GFP: 460–500 nm / 512–542 nm.

Барангезиш/эмиссияи назорати автофлуорессенсия: 323–375 nm / 435–485 nm.

Консентратсияи PI: %0.05.

Инкубатсияи PI: 5 дақиқа.

Барангезиш/эмиссияи PI: 532–558 nm / 572–648 nm.

Омодасозии намуна барои CFU: Безараргардонии сатҳӣ бо %1 NaOCl; ду шустан бо оби стерилӣ; гомогенизатсия бо 1 mL оби стерилӣ ва 30 дақиқа нигоҳдорӣ.

Кишт ба плака: Аз разрежониҳои пайдарпай 20 μL; KB agar дорои 100 μg/mL неомисин.

Инкубатсияи плака: 26°C, се рӯз.

Омор: Миёна ± инҳирофи стандартӣ; Tukey's HSD; P<0.001.

Ҳаҷми намуна: Дар PDF-и асосӣ n барои ҳар гурӯҳ равшан гузориш нашудааст.

Ҳолати формулаи математикӣ: Дар манбаъ муодилаи математикӣ, ки натиҷаи биологии таҳқиқотро тавлид кунад, вуҷуд надорад; Verianla формулаи берун аз манбаъ илова накардааст.

Номувофиқии дохили манбаъ 1: Methods мавқеи арзёбии рӯзи 20-ро дар тазриқи поя 10 cm болотар аз котиледон, Results ва шарҳи Fig. 2 бошад 20 cm болотар гузориш мекунанд.

Номувофиқии дохили манбаъ 2: Матни Results-и пахта-pad мегӯяд, ки пажмурдашавӣ дар 25 dai пайдо шудааст; шарҳи Fig. 6 ва Discussion мегӯянд, ки он дар 15 dai оғоз шудааст.

Ҳадди механизми асосӣ: Роҳи дақиқи анатомӣ ва молекулавии гузариш аз кортекс ба системаи васкулярӣ ҳал нашудааст.

Ҳадди CWDE: Гузариш тавассути pit-мембрана бо cellulase, pectate lyase ва polygalacturonase гипотезаи муаллифон аст; таҷрибаи ҷорӣ санҷиши мустақими механизм нест.

Бархӯрди манфиатҳо: Муаллифон бархӯрди эҳтимолии манфиатҳоро вобаста ба мақола гузориш накардаанд.

Маблағгузорӣ 1: National Research Foundation of Korea, Korean government/MSIT; 2023R1A2C1002641.

Маблағгузорӣ 2: Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry (IPET), Agriculture and Food Convergence Technologies Program for Research Manpower Development; RS-2024-00398300; Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA).

Маводи иловагӣ: Electronic Supplementary Material дар вебсайти The Plant Pathology Journal зикр шудааст.

Дастрасии маълумот: Дар PDF-и асосӣ бахши алоҳидаи Data Availability вуҷуд надорад.

Баёнияи CRediT/саҳми муаллифон: Дар PDF-и асосӣ бахши муфассали CRediT author-contribution вуҷуд надорад; маълумоти саҳми баробар танҳо барои се муаллифи аввал равшан зикр шудааст.

Кумитаи ахлоқӣ: Таҳқиқот таҳқиқоти инсон ё ҳайвони таҷрибавии сутунмӯҳрадор нест; дар PDF-и асосӣ бахши алоҳидаи кумитаи ахлоқӣ вуҷуд надорад.