UBE2N (ubiquitin-conjugating enzyme E2N; Ubc13) өзгөчө K63-байланышкан убиквитин чынжырларын түзүүгө катышкан E2 убиквитин-конъюгациялоочу фермент. Бул изилдөө UBE2Nди фармакологиялык түрдө NSC697923 менен же генетикалык түрдө siRNA аркылуу ингибирлөө өлүм рецептору 5ти (death receptor 5, DR5) көбөйтүп, рак клеткаларын tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligandга (TRAIL) сезгичирээк кылабы же жокпу, ошону изилдеген. Изилдөө Caki жана ACHN renal carcinoma, HCT116 жоон ичеги рагы, PC3 простата рагы клеткаларында жана нормалдуу адамдын кан тамыр эндотелий EA.hy926 клеткаларында жүргүзүлгөн in vitro тажрыйбалардан турат.

Caki клеткаларында өзүнчө берилген 4-6 µM NSC697923 же 50 ng/mL TRAIL изилденген 24 сааттык шарттарда байкаларлык апоптоз жараткан эмес, бирок эки агентти чогуу колдонуу sub-G1 клетка популяциясын, ядролук конденсацияны, DNA фрагментациясын жана каспаза-3 активдүүлүгүн көбөйткөн. Пан-каспаза ингибитору z-VAD-fmk бул комбинациядан келип чыккан апоптозду баскан; ошентип клетканын өлүмү каспазага көз каранды апоптотикалык процесс менен шайкеш экени көрсөтүлгөн.

UBE2N ингибициясы DR5ти эки өзүнчө жөнгө салуучу деңгээлде көбөйткөн. Биринчи механизмде NSC697923 жана UBE2N siRNA DR5тин убиквитинделишин азайтып, белоктун туруктуулугун жогорулаткан. Байланыш-спецификалык убиквитин тажрыйбасында NSC697923 өзгөчө K63-байланышкан DR5 убиквитинделишин азайткан, ал эми K48-байланышкан убиквитинделүүдө байкаларлык өзгөрүү жараткан эмес. Экинчи механизмде UBE2N ингибициясы клетка ичиндеги реактивдүү кычкылтек түрлөрүн (reactive oxygen species, ROS) көбөйткөн; ROS көбөйүшү CHOP транскрипция факторун жогорулатып, CHOPко көз каранды DR5 транскрипциясын күчөткөн.

CHOPтун функционалдык мааниси siRNA жана promoter-мутация тажрыйбалары менен текшерилген. CHOP басаңдатылганда NSC697923 себеп болгон DR5 mRNA жана белок көбөйүшү байкаларлык азайган; DR5 promoterиндеги CHOP байланыш аймагы мутацияланганда NSC697923 promoter активдүүлүгүн көбөйткөн эмес. Тескерисинче, p53 белок деңгээли өзгөргөн эмес. Бул табылгалар изилденген шарттарда DR5тин транскрипциялык жогорулашы CHOP менен байланыштуу экенин колдойт.

ROSтун ролу да кийлигишүү тажрыйбасы менен текшерилген. N-acetylcysteine (NAC) же GEE менен ROSту азайтуу NSC697923 себеп болгон ROS көбөйүшүн, CHOP/DR5 жогорулашын жана NSC697923+TRAIL комбинациясы пайда кылган апоптозду баскан. Бирок ROS кайсы клеткалык булактан пайда болору так аныкталган эмес. Макалада талкууланган митохондриялык ROS жана NADPH оксидаза булактары бул таасирди түшүндүрө алган эмес.

UBE2N ингибициясы PC3 жана ACHN рак клеткаларында да DR5ти көбөйтүп, TRAIL аркылуу жүргөн апоптозду күчөткөн. Ал эми изилдөөдө текшерилген нормалдуу кан тамыр эндотелий EA.hy926 клеткаларында NSC697923+TRAIL комбинациясы байкаларлык апоптоз жараткан эмес. Бул жыйынтык текшерилген клетка модели жана тажрыйба шарттары үчүн гана жарактуу; бардык нормалдуу адам ткандарында коопсуздукту же адамдардагы терапиялык селективдүүлүктү далилдебейт.

Изилдөө клиникалык рак дарылоо сыноосу эмес. NSC697923 жана TRAIL адамдарга колдонулган эмес, бейтаптын жообу, фармакокинетика, узак мөөнөттүү уулуулук же шишиктин кичирейиши өлчөнгөн эмес. Табылгалар UBE2N-DR5 огун TRAILге туруктуулукту жеңүүгө багытталган эксперименттик комбинация стратегиясы катары колдойт; клиникалык натыйжалуулук өзүнчө изилдениши керек.

TRAIL деген эмне жана ал рак изилдөөлөрүндө эмне үчүн маанилүү?

TRAIL, tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand деген сөз айкашынын кыскартылышы жана TNF суперүй-бүлөсүнүн мүчөсү. TRAIL клетка бетиндеги өлүм рецепторлору DR4 жана DR5ке байланышып, экстринсикалык апоптотикалык жолдун башталышына көмөк көрсөтөт. Рецептордун активдешүүсү FADD жана procaspase-8дин топтолушун жана death-inducing signaling complex (DISC) түзүлүшүн колдойт. Андан кийин каспаза тармагы активдешип, клетка көзөмөлдөнгөн түрдө апоптозго өтүшү мүмкүн.

TRAILдин изилдөө жагынан кызыктуу өзгөчөлүктөрүнүн бири көптөгөн эксперименттик системаларда рак клеткаларына нормалдуу клеткаларга караганда күчтүүрөөк апоптотикалык таасир көрсөтө ала турганы. Бирок көп рак клеткалары DR4/DR5 азайышы, анти-апоптотикалык белоктордун көбөйүшү же апоптотикалык сигнал жолунун башка баскычтарындагы өзгөрүүлөрдөн улам TRAILге туруктуу болушу мүмкүн. Бул изилдөөнүн негизги суроосу UBE2Nди ингибирлөө менен ушул туруктуулук босогосун төмөндөтүүгө болобу же жокпу деген суроо.

DR5 деген эмне?

DR5 TRAIL байланыша ала турган клетка бетиндеги өлүм рецепторлорунун бири. DR5 көлөмүнүн жана клетка бетинде жеткиликтүүлүгүнүн көбөйүшү айрым шарттарда клетканын TRAIL сигналын кабыл алуу жөндөмүн жогорулатышы мүмкүн. Бул изилдөөдө NSC697923 жалпы DR5 белогун гана эмес, агымдык цитометрия менен өлчөнгөн клетка бетиндеги DR5 деңгээлин да көбөйткөн.

UBE2N деген эмне?

UBE2N, башкача айтканда Ubc13, убиквитинделүү системасынын E2 классына кирген убиквитин-конъюгациялоочу фермент. Убиквитинделүү жалпысынан E1 активдештирүүчү ферменттин, E2 конъюгация ферментинин жана E3 лигазанын координацияланган ишин камтыйт. E1 убиквитинди активдештирет, E2 активдешкен убиквитинди ташыйт, ал эми E3 системасы бута белокту тандоого жардам берет.

UBE2N өзгөчө K63-байланышкан полиубиквитин чынжырлары менен байланыштуу. K63-байланышкан убиквитинделүү классикалык протеасомалык белок бузулушун гана билдирбейт; ал клеткалык сигналдашууга, белок ташылышына жана ар кандай turnover процесстерине катышышы мүмкүн. Бул айырма изилдөөдөгү DR5 механизмин түшүнүү үчүн өтө маанилүү.

UBE2N Ингибициясы DR5ти Эки Өзүнчө Деңгээлде Кантип Көбөйтөт?

UBE2N ингибициясы DR5ти post-translational деңгээлде туруктуу кылуу жана ROS-CHOP огу аркылуу DR5 генинин транскрипциясын көбөйтүү жолу менен жогорулатат; ошентип бир эле өлүм рецепторунун белок жоготуусу азайып, жаңы mRNA өндүрүлүшү да көбөйөт.

Биринчи бутак: DR5 белогунун туруктуулугу

Изилдөөчүлөр белок синтезин токтотуучу cycloheximide (CHX) колдонуп, бар болгон DR5 белогунун убакыт өткөн сайын азайышын көзөмөлдөшкөн. CHX бар учурда DR5 азайганда NSC697923 колдонуу белоктун узагыраак сакталышын камсыз кылган. UBE2Nди siRNA менен азайтуу да DR5 деградациясын жайлаткан.

Бул тажрыйба DR5 көбөйүшү жаңы белок синтезинен гана келип чыкпасын; бар болгон DR5 белок резерви жайыраак жоголорун көрсөтөт.

Экинчи бутак: DR5 транскрипциясын көбөйтүү

NSC697923 жана UBE2N siRNA колдонулгандан кийин DR5 mRNA деңгээли да жогорулаган. DR5 promoter-luciferase тажрыйбалары NSC697923 promoter активдүүлүгүн көбөйтөрүн көрсөткөн. Ошентип UBE2N ингибициясы DR5ти белок turnover деңгээлинде гана эмес, ген экспрессиясы деңгээлинде да жөнгө салаары аныкталган.

CHOPтун ролу кантип текшерилди?

CHOP DNAга байланышып, айрым стресс жообу гендеринин транскрипциясын жөнгө сала алган транскрипция фактору. NSC697923 жана UBE2N knockdown CHOP деңгээлин көбөйткөн, ал эми p53 ушундай эле көбөйгөн эмес. CHOP siRNA колдонуу NSC697923дүн DR5 mRNA жана белогун көбөйтүү таасирин байкаларлык азайткан.

Изилдөөчүлөр ошондой эле CHOP байланыш аймагы бүтүн DR5 promoterин ошол аймагы мутацияланган promoter менен салыштырган. NSC697923 wild-type promoter активдүүлүгүн көбөйткөн, ал эми CHOP-binding-site мутантында мындай көбөйүү байкалган эмес. Бул тажрыйба CHOP DR5 менен кошо көбөйгөн жөнөкөй маркер эмес, promoter активдешүүсүндө функционалдык роль ойноорун колдойт.

p53 эмне үчүн өзүнчө өлчөндү?

DR5 транскрипциясын CHOP гана жөнгө салбайт; p53 да DR5 promoter көзөмөлүндө роль ойной ала турган транскрипция факторлорунун бири. Ошондуктан изилдөөчүлөр p53тү альтернативдүү механизм катары баалашкан. NSC697923 же UBE2N siRNA CHOPту көбөйткөн, бирок p53 деңгээлинде байкаларлык өзгөрүү жараткан эмес. Ошол себептен булак изилденген шарттардагы DR5 mRNA көбөйүшүн CHOP огуна топтогон.

K63 жана K48 Байланышкан Убиквитинделүүнүн Айырмасы Бул Изилдөөдө Эмне Үчүн Маанилүү?

Анткени NSC697923 DR5тин жалпы убиквитинделишин азайтканда бул өзгөрүү өзгөчө K63-байланышкан убиквитин чынжырларында байкалган, ал эми классикалык протеасомалык бузулуу менен көп байланышкан K48-байланышкан чынжырларда ошол эле азайуу байкалган эмес; ошондуктан изилдөө DR5 turnover процесси классикалык K48-протеасома моделинен айырмаланган, азырынча толук чечилбеген K63-байланыштуу процессти камтый турганын сунуштайт.

“K63” жана “K48” эмнени билдирет?

Убиквитин молекуласынын өзүндө бир нече лизин калдыгы бар. Жаңы убиквитин молекуласы мурунку убиквитиндин кайсы лизини аркылуу байланышы түзүлгөн чынжырдын биологиялык маанисин өзгөртө алат. “K48-байланышкан” чынжырда байланыш 48. лизин аркылуу; “K63-байланышкан” чынжырда болсо 63. лизин аркылуу түзүлөт.

K48-байланышкан полиубиквитинделүү көп белок үчүн протеасомалык деградация сигналы катары белгилүү. K63-байланышкан чынжырлар болсо көбүнчө протеасомадан тышкаркы сигналдашууда, endosomal trafficking, lysosomal процесстерде же белок-белок өз ара аракеттенүүлөрүндө роль ойнойт. Бул изилдөөдө DR5тин K63-байланышкан убиквитинделүүсүнүн азайышы менен DR5тин туруктуу болушунун бирге байкалышы көңүл бурууга арзыйт.

Бирок изилдөө K63 чынжыры DR5ти так кайсы клеткалык компартментке багыттарын же кайсы деградация механизми акыркы баскыч экенин түз аныктаган эмес. Ошондуктан “UBE2N K63 кошуп DR5ти сөзсүз лизосомага жөнөтөт” деген күчтүүрөөк жыйынтык чыгарууга болбойт.

UBE2N DR5 менен физикалык өз ара аракеттенеби?

Immunoprecipitation тажрыйбасында UBE2N жана DR5 бир эле белок комплексинде аныкталган. Бул табылга UBE2N DR5 turnoverын түздөн-түз же өтө жакын белок комплексинин бөлүгү катары жөнгө сала алышы мүмкүн экенин колдойт.

Ошентсе да E2 ферменти жалгыз бута тандоонун бардык деталдарын аныктабайт. Булак UBE2N менен бирге DR5те иштеген спецификалык E3 лигаза азырынча белгисиз экенин ачык белгилейт.

c-Cbl ушул E3 лигаза болушу мүмкүнбү?

Мурунку изилдөөлөр c-Cbl TRAIL рецепторунун деградациясында роль ойной аларын билдирген. Ошондуктан булак изилдөөчүлөрү c-Cbl overexpression тажрыйбасын жүргүзгөн. c-Cblдин ашыкча экспрессиясы NSC697923 себеп болгон DR5 көбөйүшүн жок кылган эмес. Бул жыйынтык c-Cbl байкалган UBE2N-DR5 таасирин өзү гана түшүндүрө албасын көрсөтөт.

Булак бул c-Cbl жыйынтыгын “data not shown” деп берет; сандык график же чийки маалымат сунуштабайт. Ошондуктан Verianla бул тажрыйба үчүн булакта жок маанини чыгарбайт.

ROS, CHOP жана DR5 Ортосундагы Механизм Кандай?

Изилдөөдө UBE2Nди фармакологиялык же генетикалык ингибирлөө клетка ичиндеги ROSту көбөйткөн; ROSту антиоксиданттар менен басуу CHOP жана DR5 жогорулашын жана TRAIL сезгичтигин азайткан, ошондуктан булак ROSту CHOP активдешүүсү менен DR5 көбөйүшүнүн жогору жагында турган функционалдык жөнгө салуучу катары жайгаштырат; ROSтун так органеллалык же ферменттик булагы болсо аныкталган эмес.

ROS деген эмне?

Reactive oxygen species, башкача айтканда реактивдүү кычкылтек түрлөрү, кычкылтек камтыган жана жогорку химиялык реактивдүүлүк көрсөтө алган молекулалар же радикалдар үй-бүлөсү. Клетка ичиндеги ROS деңгээли төмөн жана көзөмөлдөнгөндө сигнал өткөрүүгө катыша алат; өтө көбөйгөндө белокторго, липиддерге, DNAга жана стресс жообу жолдоруна олуттуу таасир тийгизиши мүмкүн.

ROS кантип өлчөндү?

Булак H₂DCF-DA флуоресценттик пробасын колдонгон. Caki клеткалары 20 µM H₂DCF-DA менен 10 мүнөт боёлуп, флуоресценция сигналы BD Accuri C6 flow cytometer менен өлчөнгөн. NSC697923 колдонуу жана UBE2N siRNA ROS сигналын көбөйткөн.

NAC жана GEE тажрыйбасы эмне үчүн маанилүү?

ROS көбөйгөнүн гана көрсөтүү ROS механизмдин себеби экенин далилдебейт. Ошондуктан изилдөөчүлөр ROSту азайтуучу заттар менен кийлигишкен. Булак Figure 5 тажрыйбаларында клеткалар 5 mM NAC же 2 mM GEE менен 30 мүнөт алдын ала иштетилген.

Бул антиоксиданттар NSC697923 себеп болгон ROS сигналын азайткан, CHOP жана DR5 белок көбөйүшүн баскан жана NSC697923+TRAIL комбинациясы пайда кылган sub-G1/апоптотикалык жоопту азайткан. Бул кийлигишүү тажрыйбасы ROS жөн гана корреляциялык маркер эмес, механизмде функционалдык роль ойной турганын колдойт.

ROS булагы табылдыбы?

Жок. Талкуу бөлүмүндө булак mitochondrial ROS inhibitor MitoTEMPO жана NADPH oxidase ингибиторлору diphenyleneiodonium жана apocynin колдонулганын, бирок бул кийлигишүүлөр NSC697923+TRAIL себеп болгон апоптозду азайтпаганын билдирет. Бул тажрыйбалар “data not shown” катары берилген.

Ошондуктан булак ROS сөзсүз митохондриядан же NOX системасынан келип жатканын көрсөтпөйт. Авторлор көбөйгөн ROS жалпы клеткалык stress responses менен байланыштуу болушу мүмкүн экенин жана механизм кийинки изилдөөлөрдө такталышы керек экенин белгилешет.

CHOP көбөйүшү ER stress дегенди билдиреби?

CHOP кеңири колдонулган endoplasmic reticulum stress көрсөткүчү болгону менен, бул изилдөөдө CHOP жогорулашын автоматтык түрдө классикалык ER-stress механизмине теңөө туура эмес. Изилдөөчүлөр chemical ER-stress inhibitors TUDCA жана 4-PBA колдонгон, бирок бул ингибиторлор NSC697923 себеп болгон DR5 көбөйүшүн жана TRAIL sensitizationды алдын алган эмес.

Бул жыйынтыктар да булакта “data not shown” деп сүрөттөлөт. Авторлордун түшүндүрмөсү байкалган UBE2N-DR5 огу классикалык ER-stress активдешүүсүнө караганда борбордуураак экени.

DNA жабыркашы механизмдин башындабы?

Булак γH2AX сигналын да изилдеген. NSC697923 өзү гана γH2AXты бир аз көбөйткөн, ал эми NSC697923+TRAIL комбинациясында күчтүүрөөк жогорулаш байкалганы билдирилген. Авторлор муну DR5 көбөйүшүн баштоочу upstream механизмден көрө апоптоздун downstream натыйжасы катары түшүндүрүшөт.

Бул жыйынтык да “data not shown” категориясында жана булак сандык γH2AX маалыматтарын бербейт.

NSC697923 деген эмне жана UBE2Nге кантип таасир этет?

NSC697923 изилдөөдө UBE2N активдүүлүгүн ингибирлөө үчүн колдонулган кичине молекулалуу ингибитор. Булак мурунку структуралык изилдөөгө таянып, NSC697923 UBE2Nдин активдүү аймагындагы cysteine 87ге коваленттик байланыш түзөрүн белгилейт. Изилдөөдөгү Western blot жыйынтыктарында NSC697923 UBE2N белогунун көлөмүн азайткан эмес; ошого карабастан UBE2N функциясы менен байланышкан DR5 жөнгө салынышын өзгөрткөн. Ошондуктан изилдөөчүлөр ингибитор ферменттин көлөмүнөн көрө активдүүлүгүн бутага алат деп түшүндүрүшкөн.

Фармакологиялык ингибитордун таасири эмне үчүн siRNA менен кайра текшерилди?

Кичине молекулалуу ингибиторлор бута белоктон тышкары башка молекулаларга да таасир этиши мүмкүн. Ошондуктан NSC697923дүн жыйынтыгы гана UBE2Nдин чыныгы биологиялык функциясын аныктоо үчүн жетишсиз. UBE2Nге спецификалык siRNA колдонуу ошол эле DR5 көбөйүшү фермент генетикалык түрдө азайтылганда да пайда болобу же жокпу, ошону текшерген.

Caki жана HCT116 клеткаларында UBE2N siRNA DR5 белогун көбөйткөн. Бул параллелдүү жыйынтык DR5 көбөйүшү NSC697923дүн толугу менен бутадан тышкаркы химиялык таасири эмес экенин колдойт.

c-FLIP жыйынтыгы эмне үчүн башкача түшүндүрүлдү?

NSC697923 колдонуу DR5ти көбөйткөндө анти-апоптотикалык c-FLIP белогун азайткан. Бирок UBE2Nди siRNA менен генетикалык азайтуу c-FLIPти өзгөрткөн эмес. Ошондуктан изилдөөчүлөр NSC697923 себеп болгон c-FLIP азайышын UBE2N ингибициясынын чыныгы downstream таасиринен көрө ингибитордун off-target таасири катары баалап, механистикалык анализдерин DR5ке топтошкон.

2^−ΔΔCt Ыкмасы Бул Изилдөөдө Эмнени Эсептейт?

2^−ΔΔCt ыкмасы qPCRда DR5 сыяктуу бута гендин mRNA деңгээли референс ген actinге нормалдаштырылгандан кийин контролдук шартка салыштырмалуу канча эсе өзгөргөнүн баалоо үчүн колдонулган салыштырмалуу ген экспрессиясынын эсеби; изилдөө DR5 mRNA өзгөрүүлөрүн ушул ыкма менен аныктаган.

Булакта колдонулган туюнтма: \(2^{-\Delta\Delta Ct}\)

Маанилүү булак эскертүүсү: Макала 2^−ΔΔCt ыкмасы колдонулганын гана билдирет; төмөнкү ΔCt жана ΔΔCt аралык теңдемелери ыкманын стандарттык математикалык ачылышын үйрөтүү үчүн берилет жана изилдөөнүн жаңы табылгасы эмес.

1-кадам — ΔCt:

\(\Delta Ct = Ct_{\mathrm{hedef}} - Ct_{\mathrm{referans}}\)

Бул изилдөөдө бута ген DR5, референс ген actin. Ct qPCR флуоресценция сигналы белгиленген чектен өткөн cycle санын билдирет. Баштапкы бута нуклеин кислотасынын көлөмү жогору болгондо чек көбүнчө эртерээк cycleда өтүлөт жана Ct төмөн болот.

2-кадам — ΔΔCt:

\(\Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{\mathrm{işlem}} - \Delta Ct_{\mathrm{kontrol}}\)

Бул кадам иштетүү тобундагы нормалдаштырылган бута-ген Ct айырмасын контролдук топ менен салыштырат.

3-кадам — салыштырмалуу экспрессия:

\(\mathrm{Göreli\ ekspresyon}=2^{-\Delta\Delta Ct}\)

1. Формула эмнени эсептейт? Контролго салыштырмалуу mRNAнын салыштырмалуу эселик өзгөрүшүн.

2. Өзгөрмөлөр кайсылар? Ct_hedef, Ct_referans, ΔCt жана ΔΔCt.

3. Бирдиги кандай? Жыйынтык эселик өзгөрүү болгондуктан өлчөмсүз.

4. Математикалык ролу кандай? Ct айырмалары логарифмдик PCR cycle шкаласын салыштырмалуу сызыктуу эселик өзгөрүүгө айландырат.

5. Биологиялык мааниси кандай? DR5 mRNAсы контролдук клеткаларга салыштырмалуу көбөйгөнүн же азайганын билдирет.

6. Кайсы шартта түшүндүрүлөт? Референс ген ылайыктуу болуп, PCR амплификациясынын жүрүм-туруму ыкманын божомолдоруна жетиштүү шайкеш болушу керек.

7. Жыйынтык кантип түшүндүрүлөт? Мисалы, 1 контролдук деңгээлди, 1ден жогору салыштырмалуу көбөйүүнү, 1ден төмөн салыштырмалуу азайууну билдирет; бирок булак ар бир тажрыйба үчүн чийки Ct маанилерин жарыялаган эмес, ошондуктан Verianla жаңы сандык fold-change эсептебейт.

Изилдөөдө колдонулган qPCR праймерлери

Апоптозду бир гана көрсөткүч менен баалабоо эмне үчүн маанилүү?

Sub-G1 көбөйүшү апоптотикалык өлүм үчүн күчтүү, бирок жалгыз өзү кемчиликсиз өлчөм эмес. Ошондуктан изилдөө ошол эле биологиялык жыйынтыкты бир нече көз карандысыз байкоо менен колдогон: клетканын кичирейиши, DAPI менен ядролук конденсация, DNA фрагментациясы, caspase-3/DEVDase активдүүлүгү, PARP cleavage жана z-VAD-fmk менен каспазага көз карандылыктын басылышы.

Бул көп тараптуу ырастоо клетка жашоого жөндөмдүүлүгүнүн төмөндөшү жөн гана метаболизмдин жайлашы же убактылуу клетка-cycle өзгөрүшү эмес, апоптотикалык клетка өлүмүнө шайкеш экенин күчөтөт.

Sub-G1 популяциясы эмнени билдирет?

Flow cytometry менен DNA көлөмү өлчөнгөндө апоптоз учурунда DNAнын бөлүнүшү айрым клеткалардын нормалдуу G1 клеткаларына караганда төмөн DNA флуоресценциясына ээ болуп көрүнүшүнө алып келиши мүмкүн. Бул төмөн DNA көлөмү бар аймак “sub-G1” деп аталат жана апоптотикалык клетка популяциясын баалоо үчүн колдонулушу мүмкүн.

PARP cleavage эмнени көрсөтөт?

PARP DNA жабыркашына жооп берүүдө катышкан белок. Апоптоз учурунда активдешкен каспазалар PARPты белгилүү жерлерден кесиши мүмкүн. Ошондуктан cleaved PARP же толук узундуктагы PARPтын бөлүнүшү каспазага көз каранды апоптоздун биохимиялык көрсөткүчтөрүнүн бири.

z-VAD-fmk тажрыйбасы эмнени көрсөттү?

z-VAD-fmk кең спектрдеги pan-caspase ингибитору. Caki клеткалары 20 µM z-VAD менен 30 мүнөт алдын ала иштетилгенден кийин 6 µM NSC697923 жана 50 ng/mL TRAIL колдонулган. z-VAD комбинация себеп болгон апоптотикалык жоопту толугу менен баскан. Бул жыйынтык каспаза активдүүлүгү клетка өлүмүн ишке ашырууда зарыл экенин колдойт.

Бул Жыйынтыктар Адамдарда UBE2N Ингибитору менен Ракты Дарылоо Натыйжалуу Экенин Көрсөтөбү?

Жок. Бул макаланын өз тажрыйбалары клетка культураларында жүргүзүлгөн; NSC697923+TRAIL комбинациясы бейтаптарда шишикти кичирейтеби, коопсузбу, кандай дозада колдонулушу мүмкүн же узак мөөнөттүү клиникалык пайда береби — текшерилген эмес, ошондуктан изилдөө UBE2N-DR5 огун клиникалык жактан далилденген дарылоо катары эмес, келечекте изилдене турган преклиникалык бута жана комбинация стратегиясы катары колдойт.

Талкууда NSC697923 мурунку xenograft изилдөөлөрүндө шишиктин өсүшүн азайткан деген адабият шилтемелери бар. Булар ушул изилдөөдө жүргүзүлгөн жаңы жаныбар тажрыйбалары эмес жана учурдагы макаланын клетка культурасы жыйынтыктарын түздөн-түз клиникалык далилге айлантпайт.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Клетка моделдери

Булак клеткаларды Dulbecco's modified Eagle's medium ичинде %10 fetal bovine serum жана %1 penicillin/streptomycin камтыган чөйрөдө өстүргөн. Булак текстиндеги gentamicin концентрациясы текст чыгарууда бирдик белгиси жагынан ишенимдүү көрүнбөгөндүктөн, Verianla бул маанини унчукпай оңдоп кайра бербейт.

Flow cytometry менен sub-G1 өлчөө

Клеткалар жыйналгандан кийин 100 µL PBS ичинде кайра суспензияланып, vortex учурунда 200 µL %95 ethanol кошулган. Үлгүлөр 4 °Cде бир саат кармалып; pellet андан кийин RNase A камтыган %1.12 sodium citrate buffer, pH 8.4 ичинде 37 °Cде 30 мүнөт инкубацияланган. Propidium iodide менен DNA боёлгондон кийин BD Biosciences flow cytometer колдонулуп sub-G1 популяциясы аныкталган.

Western blotting

Белоктор ERK lysis buffer менен даярдалып, бирдей белок көлөмдөрү SDS-PAGE менен бөлүнүп, nitrocellulose membraneге өткөрүлгөн. Primer антителолор 4 °Cде түнү бою, HRP-conjugated secondary antibodies болсо бөлмө температурасында эки саат колдонулган. Белок сигналдары enhanced chemiluminescence ыкмасы менен сүрөттөлгөн.

Ядролук конденсация жана DNA фрагментациясы

Ядролук конденсация үчүн клеткалар 300 nM DAPI менен беш мүнөт боёлуп, fluorescence microscope менен байкалган. DNA фрагментациясы Cell Death Detection ELISA Plus Kit колдонулуп бааланган.

siRNA тажрыйбалары

Control, UBE2N жана DR5 siRNAлар Lipofectamine RNAiMAX менен клеткаларга берилген. UBE2N siRNA фармакологиялык NSC697923 жыйынтыгы чыныгы UBE2N жоготуусу менен кайталанабы, ал эми DR5 siRNA комбинация себеп болгон апоптоз үчүн DR5тин функционалдык зарылдыгын текшерген.

DR5 беттик экспрессиясы

Caki клеткалары 2-6 µM NSC697923 менен 24 саат инкубацияланып, DR5-phycoerythrin antibody колдонулуп клетка бетиндеги DR5 flow cytometry менен өлчөнгөн. NSC697923 беттеги DR5 сигналын көбөйткөн.

Убиквитинделүү assay протоколу

Клеткалар 10 mM N-ethylmaleimide (NEM) камтыган PBS менен жуулуп, 1% SDS камтыган PBS/NEM bufferге салынып, 95 °Cде 10 мүнөт ысытылган. Лизаттар PMSF жана NEM камтыган buffer менен суюлтулуп, 13.000×gде 10 мүнөт 4 °Cде центрифугаланган. Supernatant бута белокко каршы primer antibody менен түнү бою инкубацияланып, белок-антитело комплекстери agarose beads менен эки саат кармалган. DR5ке байланышкан убиквитин HRP-conjugated anti-ubiquitin antibody менен аныкталган.

Figure 1: NSC697923 жана TRAIL комбинациясынын апоптотикалык таасири

Caki клеткалары 4 же 6 µM NSC697923, 50 ng/mL TRAIL же комбинациялар менен 24 саат иштетилген. Жеке дарылоолор изилденген шарттарда байкаларлык апоптоз жараткан эмес, ал эми комбинация NSC697923 дозасы менен бирге sub-G1 популяциясын көбөйткөн.

6 µM NSC697923 + 50 ng/mL TRAIL комбинациясы клетка кичирейишин, ядролук конденсацияны, DNA фрагментациясын жана caspase-3/DEVDase активдүүлүгүн көбөйткөн. 20 µM z-VAD-fmk алдын ала иштетүү комбинация себеп болгон апоптозду токтоткон. Булак тиешелүү салыштырууларда статистикалык маанилүүлүктү p<0.05 деп көрсөткөн.

Figure 2: UBE2N ингибициясы DR5ти көбөйтөт

Caki клеткаларында 2-6 µM NSC697923, 24 сааттын аягында DR5 белогун көбөйткөн. c-FLIP да азайган, бирок изилденген башка апоптотикалык белоктордун көпчүлүгү байкаларлык өзгөргөн эмес. UBE2N белок көлөмү өзгөргөн эмес.

Caki жана HCT116 клеткаларында UBE2N siRNA DR5ти көбөйткөн, бирок c-FLIPти азайткан эмес. Ошондуктан c-FLIP азайышы NSC697923дүн UBE2Nден тышкаркы/off-target таасири катары бааланган.

Figure 3: DR5 туруктуулугу жана убиквитинделүү

Белок синтезин токтотуу үчүн 20 µg/mL CHX колдонулган. Caki клеткаларына алгач 6 µM NSC697923 12 саат колдонулуп, андан кийин CHX кошулган. NSC697923 бар болгондо DR5 белогу CHX шартында узагыраак сакталган. UBE2N siRNA да DR5 деградациясын кечеңдеткен.

Immunoprecipitation UBE2N-DR5 өз ара аракеттенүүсүн көрсөткөн. Убиквитинделүү тажрыйбаларында HA-ubiquitin жана 0.5 µM MG132 колдонулган; NSC697923 жана UBE2N knockdown DR5 убиквитинделишин азайткан. Linkage-specific тажрыйбада K63-байланышкан убиквитинделүү азайып, K48-байланышкан убиквитинделүү байкаларлык өзгөргөн эмес.

DR5 siRNA NSC697923+TRAIL комбинациясы жараткан sub-G1/апоптотикалык жоопту байкаларлык азайткан. Ошентип көбөйгөн DR5 жөн гана биомаркер эмес, комбинация сезгичтигинин функционалдык компоненти катары колдоого алынган.

Figure 4: CHOPко көз каранды DR5 транскрипциясы

6 µM NSC697923 убакыт өткөн сайын DR5 mRNAны көбөйткөн; UBE2N siRNA да DR5 mRNAны жогорулаткан. DR5/SacI жана DR5/−605 promoter-luciferase constructтардын экөөндө тең NSC697923 promoter активдүүлүгүн көбөйткөн.

NSC697923 9 сааттык тажрыйбада CHOPту көбөйткөн, бирок p53тү өзгөрткөн эмес. UBE2N siRNA да ошол эле CHOP көбөйүү багытын колдогон. CHOP siRNA NSC697923 себеп болгон DR5 mRNA жана белок көбөйүшүн азайткан.

CHOP-binding site бүтүн болгон DR5/−605 promoter NSC697923гө жооп берген, ал эми CHOP аймагы мутацияланган mCHOP promoter ошол эле активдешүү жообун берген эмес. Бул жыйынтык DR5 транскрипциясында CHOP байланыш аймагынын функционалдык маанисин колдойт.

Figure 5: ROSтун функционалдык ролу

2-6 µM NSC697923, 30 мүнөттүк колдонууда H₂DCF-DA флуоресценциясын көбөйтүп, клетка ичиндеги ROS көбөйүшүнө шайкеш жыйынтык берген. UBE2N siRNA да ROS деңгээлин жогорулаткан.

5 mM NAC же 2 mM GEE менен 30 мүнөттүк алдын ала иштетүү 6 µM NSC697923 себеп болгон ROS көбөйүшүн баскан. Ошол эле ROS тазалагычтар CHOP жана DR5 жогорулашын да азайткан.

NSC697923+50 ng/mL TRAIL комбинациясынын 24 сааттык апоптотикалык таасири NAC же GEE бар кезде байкаларлык азайган. Ошентип ROS UBE2N ингибициясы менен CHOP/DR5 жана TRAIL sensitization ортосундагы функционалдык аралык баскычтардын бири катары колдоого алынган.

Figure 6: Ар башка рак клеткалары жана нормалдуу клетка салыштыруусу

PC3 простата рагы жана ACHN renal рак клеткаларында NSC697923 DR5 белогун көбөйткөн. UBE2N siRNA менен окшош DR5 көбөйүшү алынган.

6 µM NSC697923 жана 50 ng/mL TRAIL комбинациясы PC3 жана ACHN клеткаларында sub-G1 популяциясын жана PARP cleavageты көбөйткөн. UBE2N siRNAдан кийин TRAIL колдонуу да Caki, PC3 жана ACHN клеткаларында апоптотикалык жоопту күчөткөн.

Нормалдуу адамдын кан тамыр эндотелий EA.hy926 клеткаларында ошол эле 6 µM NSC697923 + 50 ng/mL TRAIL, 24 сааттык шартта Caki клеткаларындагыдай байкаларлык sub-G1 көбөйүшүн жараткан эмес.

Бул контролду “нормалдуу адам клеткалары жалпы таасирленбейт” деген жыйынтыкка кеңейтүүгө болбойт. Изилдөөдө бир гана нормалдуу endothelial cell модели салыштырылган; ар түрдүү нормалдуу клетка түрлөрү, органоиддер, жаныбар токсикологиясы же адам коопсуздугу бааланган эмес.

Статистикалык анализ

Бардык тажрыйбалар triplicate түрүндө жүргүзүлгөнү билдирилген. Жыйынтыктар орточо ± стандарттык четтөө (mean ± SD) түрүндө берилген. Статистикалык анализ SPSS version 26.0 менен жүргүзүлүп; топтор one-way analysis of variance (ANOVA) жана андан кийин Student-Newman-Keuls post-hoc comparison менен бааланган.

Булак Figure түшүндүрмөлөрүндө статистикалык маанилүүлүк үчүн p<0.05 белгилерин колдонот. Макала confidence interval же таасир көлөмүн бербейт. Ошондуктан Verianla p<0.05 жыйынтыгын “таасир чоң” же “клиникалык маанилүү” деп кеңейтпейт.

ANOVA эмнени текшерет?

One-way ANOVA бир нече топтун орточо маанилери бир эле популяция орточосунан келип чыккан деген нөл гипотезасын жалпы баалайт. ANOVA маанилүү болгондо кайсы топтордун ортосунда айырма бар экенин аныктоо үчүн post-hoc салыштыруу керек. Бул изилдөөдө post-hoc ыкма катары Student-Newman-Keuls колдонулган.

Стандарттык четтөө эмнени көрсөтөт?

Стандарттык четтөө кайталанган өлчөөлөрдүн орточо маанинин айланасындагы таралышын көрсөтөт. Кичине SD кайталоолор бири-бирине жакын, чоң SD болсо өзгөрмөлүүлүк жогору экенин көрсөтөт. SD түздөн-түз confidence interval же биологиялык таасир көлөмү эмес.

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

• NSC697923 жана UBE2N siRNA изилденген рак клеткаларында DR5 экспрессиясын көбөйтө алат.
• UBE2N ингибициясы DR5тин K63-байланышкан убиквитинделишин азайтып, DR5 белогунун туруктуулугун жогорулатат.
• K48-байланышкан DR5 убиквитинделиши NSC697923 менен ошол эле түрдө азайбайт.
• UBE2N жана DR5 бир эле белок комплексинде аныкталган.
• UBE2N ингибициясы DR5 mRNAны да көбөйтөт.
• CHOP NSC697923 себеп болгон DR5 транскрипциялык жогорулашында функционалдык роль ойнойт.
• UBE2N ингибициясы ROS деңгээлин көбөйтөт жана ROS scavengerлер CHOP/DR5 көбөйүшүн жана TRAIL sensitizationды басат.
• DR5 knockdown NSC697923+TRAIL апоптозун азайтат; DR5 комбинация жообунун функционалдык компоненти.
• PC3 жана ACHN клеткаларында да UBE2N ингибициясы DR5 көбөйүшү жана TRAIL сезгичтиги менен байланышкан.
• Текшерилген нормалдуу EA.hy926 клеткаларында комбинация байкаларлык апоптотикалык жооп жараткан эмес.

Изилдөө колдобогон жыйынтыктар

• NSC697923+TRAIL комбинациясы адамдарда натыйжалуу рак дарылоосу экени көрсөтүлгөн эмес.
• Бул макаланын өз тажрыйбаларында чычкан xenograft же башка in vivo шишик модели жок.
• Бардык нормалдуу адам клеткалары комбинацияга туруктуу экени көрсөтүлгөн эмес; EA.hy926 клеткалары гана текшерилген.
• ROSтун так клеткалык булагы аныкталган эмес.
• DR5 менен UBE2N бирге иштеген спецификалык E3 лигаза аныкталган эмес.
• K63-байланышкан убиквитинделүү DR5ти так кайсы trafficking/degradation жолуна багыттай турганы чечилген эмес.
• CHOP көбөйүшү классикалык ER-stress pathway тарабынан сөзсүз пайда болору көрсөтүлгөн эмес.
• NSC697923 себеп болгон c-FLIP азайышы UBE2Nге көз каранды экени көрсөтүлгөн эмес; siRNA жыйынтыгы бул таасир off-target экенин колдойт.
• p<0.05 жыйынтыктары клиникалык натыйжалуулук, бейтапка пайда же коопсуздук дегенди билдирбейт.

Изилдөөнүн күчтүү жактары

Изилдөөнүн эң күчтүү жактарынын бири фармакологиялык ингибитор жыйынтыгын UBE2N siRNA менен салыштырганы. Ошентип кичине молекуланын бардык таасирлерин автоматтык түрдө UBE2Nге таандык кылууга жол берилбей, c-FLIP азайышы сыяктуу бутадан тышкаркы таасир бөлүнгөн.

Экинчи күчтүү жак DR5 көбөйүшү транскрипция жана белок туруктуулугу деңгээлдеринде тең изилденгени. qPCR, promoter-luciferase, CHOP siRNA, CHX chase, immunoprecipitation жана linkage-specific ubiquitination тажрыйбалары бир эле белоктун ар түрдүү жөнгө салуу катмарларын изилдеген.

Үчүнчү күчтүү жак ROS үчүн флуоресценция гана өлчөнбөстөн, NAC жана GEE менен функционалдык rescue/inhibition ыкмасы колдонулганы.

Төртүнчү күчтүү жак апоптоз sub-G1, морфология, DAPI, DNA фрагментациясы, caspase-3 активдүүлүгү, PARP cleavage жана z-VAD тажрыйбасы сыяктуу көз карандысыз көрсөткүчтөр менен текшерилгени.

Негизги чектөөлөр

Биринчи чектөө: Изилдөө in vitro клетка культурасы деңгээлинде. Фармакокинетика, шишик микроайланасы, иммундук система, системалык уулуулук жана организм деңгээлиндеги дары таралышын учурдагы тажрыйбалар менен баалоого болбойт.

Экинчи чектөө: Нормалдуу клетка коопсуздугун салыштыруу EA.hy926 кан тамыр эндотелий клетка модели менен гана жүргүзүлгөн. Ар башка нормалдуу орган клеткалары изилденген эмес.

Үчүнчү чектөө: UBE2N ингибициясынан кийин ROSтун так булагы белгисиз.

Төртүнчү чектөө: DR5ти UBE2N менен бирге убиквитиндеген спецификалык E3 лигаза жана K63-байланышкан убиквитинделүүдөн кийинки так trafficking/turnover жолу чечилген эмес.

Бешинчи чектөө: TUDCA/4-PBA, γH2AX, c-Cbl, MitoTEMPO жана NOX ингибиторлоруна байланыштуу айрым механистикалык контролдор “data not shown” катары берилген жана чийки сандык маалыматтары макалада көрсөтүлгөн эмес.

Алтынчы чектөө: Бардык тажрыйбалар triplicate экени билдирилгени менен, изилдөөдө кененирээк биологиялык үлгү, көз карандысыз лабораториялык ырастоо, confidence interval же effect-size анализи берилген эмес.

Жетинчи чектөө: NSC697923дүн c-FLIPке таасири off-target экени көрүнүшү кичине молекула UBE2Nден тышкары биологиялык буталарга да таасир этиши мүмкүн экенин көрсөтөт.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска аталыш: Inhibition of UBE2N enhances TRAIL-mediated apoptosis through upregulation of DR5 in cancer cells.

Авторлор жана ирети: Yu Jin Jeong, Seon Min Woo, Seung Un Seo, So Rae Song, Taeg Kyu Kwon.

Тең салым: Булакта тең салым кошкон/тең биринчи автор жөнүндө билдирүү көрүнбөйт.

Жооптуу автор: Taeg Kyu Kwon.

Мекеме 1: Department of Immunology, School of Medicine, Keimyung University, Daegu 42601, South Korea.

Мекеме 2: Center for Forensic Pharmaceutical Science, Keimyung University, Daegu 42601, South Korea.

Журнал: International Journal of Medical Sciences.

Басмакана/платформа: Ivyspring International Publisher / International Journal of Medical Sciences.

Том / номер / беттер: 23(8), 2647-2656.

DOI: 10.7150/ijms.130235.

Келип түшкөн күнү: 19 Декабрь 2025.

Кабыл алынган күнү: 23 Июнь 2026.

Жарыяланган күнү: 13 Июль 2026.

Булак түрү: Research Paper / рецензияланган Journal Article.

Preprint статусу: Булак preprint эмес; жарыяланган журнал макаласы.

Лицензия: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Изилдөөнүн илимий түрү: In vitro клетка культурасы жана молекулалык механизм изилдөөсү.

Адам/жаныбар кийлигишүүсү: Бул макалада бейтапка дарылоо же эксперименттик жаныбарда жаңы кийлигишүү берилбейт. Адамдан алынган туруктуу клетка линиялары колдонулган.

Рак клеткалары: Caki жана ACHN renal carcinoma, HCT116 colon cancer жана PC3 prostate cancer.

Нормалдуу салыштыруу клеткасы: EA.hy926 human normal vascular endothelial cell модели.

Негизги фармакологиялык кийлигишүү: UBE2N ингибитору NSC697923.

Генетикалык ырастоо: UBE2N siRNA; ошондой эле механистикалык зарылдык үчүн DR5 siRNA жана CHOP siRNA.

Негизги комбинация шарты: Caki кошулган тиешелүү негизги тажрыйбаларда 6 µM NSC697923 жана 50 ng/mL TRAIL, көбүнчө 24 саат; булак Figure 1де кошумча 4 µM NSC697923 колдонулган.

Апоптоз ыкмалары: sub-G1 flow cytometry, клетка морфологиясы, DAPI ядролук боёо, DNA fragmentation assay, caspase-3/DEVDase assay, PARP cleavage жана z-VAD-fmk кийлигишүүсү.

Белок ыкмалары: Western blotting, immunoprecipitation, ubiquitination assay, CHX protein-stability assay жана linkage-specific HA-K48-Ub/HA-K63-Ub анализи.

Транскрипция ыкмалары: qRT-PCR, 2^-ΔΔCt салыштырмалуу экспрессия эсеби, DR5 promoter luciferase assay жана CHOP-binding-site mutant promoter.

ROS анализи: 20 µM H2DCF-DA жана BD Accuri C6 flow cytometer; функционалдык ROS контролдору катары NAC жана GEE.

Статистика: Тажрыйбалар triplicate; mean±SD; one-way ANOVA; Student-Newman-Keuls post-hoc comparison; SPSS version 26.0; сүрөттөрдө p<0.05 маанилүүлүк чеги.

Каржылоо: Korean Government (MSIP) тарабынан каржыланган National Research Foundation of Korea grant RS-2024-00348057.

Автордук салымдар: Conceptualization: T.K.K. жана S.M.W.; Investigation: Y.J.J.; Validation: S.U.S. жана S.R.S.; Formal analysis: Y.J.J. жана S.M.W.; Writing-original draft: Y.J.J. жана T.K.K.; Writing-review and editing: S.M.W. жана T.K.K.; Supervision: T.K.K.; Project administration: T.K.K.; Funding acquisition: T.K.K.

Маалымат жеткиликтүүлүгү: Изилдөөдө колдонулган маалыматтар негиздүү суроо боюнча corresponding authorдон алынышы мүмкүн экени билдирилген.

Кызыкчылыктардын кагылышы: Авторлор competing interest жок экенин билдирген.

Булак ичиндеги жазуу эскертүүсү: Жыйынтыктар бөлүмүнүн бир сүйлөмүндө ингибитордун аты “NSC67923” түрүндө берилген. Макаланын калган бөлүгүндө, сүрөттөрдө жана негизги тажрыйба түшүндүрмөлөрүндө canonical ат NSC697923; Verianla тексти булак ичиндеги бул жазуу айырмасын илимий молекула аты катары кайталаган эмес.

Булак ичиндеги шилтеме эскертүүсү: Introductionдагы TRAIL дарылоо ыкмалары тууралуу сүйлөмдө [8] катары берилген булак библиография тизмесинде оозеки контрацептивдер жана мээ тромбоэмболиясы тууралуу изилдөө болуп көрүнөт жана сүрөттөлгөн TRAIL контекстине туура келбейт. Бул библиографиялык дал келбестик Verianla тарабынан илимий негиз катары колдонулган эмес.

Критикалык K63 чеги: Булак K63-байланышкан DR5 убиквитинделиши азайганын көрсөтөт; мунун так endosomal/lysosomal же башка turnover механизмине кантип айланары аныкталган эмес.

Критикалык ROS чеги: ROS көбөйүшү механизмде зарыл экени antioxidant кийлигишүүсү менен колдоого алынган; ROSтун так клеткалык булагы аныкталган эмес.

Критикалык клиникалык чек: Бул изилдөө клетка культурасы деңгээлинде гана. Адамдарда дарылоонун натыйжалуулугу же коопсуздугу көрсөтүлгөн эмес.