UBE2N (ubiquitin-conjugating enzyme E2N; Ubc13) ферменти конъюгатсиякунандаи убиквитини синфи E2 мебошад, ки махсусан дар ташаккули занҷирҳои убиквитини бо K63 пайваст иштирок мекунад. Ин таҳқиқот санҷидааст, ки оё боздории UBE2N ба таври фармакологӣ бо NSC697923 ё ба таври генетикӣ бо siRNA бо зиёд кардани ретсептори марг 5 (death receptor 5, DR5) ҳуҷайраҳои саратонро ба tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) ҳассостар мекунад ё не. Таҳқиқот аз таҷрибаҳои in vitro дар ҳуҷайраҳои Caki ва ACHN renal carcinoma, HCT116 саратони рӯдаи ғафс, PC3 саратони простата ва ҳуҷайраҳои муқаррарии эндотелиалии рагии инсон EA.hy926 иборат аст.

Дар ҳуҷайраҳои Caki, 4-6 µM NSC697923 ё 50 ng/mL TRAIL ҳангоми истифодаи ҷудогона дар шароити 24 соатаи таҳқиқшуда апоптози назаррас ба вуҷуд наовард, аммо истифодаи якҷояи ду агент популятсияи sub-G1, конденсатсияи ядроӣ, фрагментатсияи DNA ва фаъолияти каспаза-3-ро зиёд кард. Ингибитори пан-каспаза z-VAD-fmk апоптози аз ин комбинация ба вуҷудомадаро боздошт; ҳамин тавр нишон дода шуд, ки марги ҳуҷайра бо раванди апоптотикии вобаста ба каспаза мувофиқ аст.

Боздории UBE2N DR5-ро дар ду сатҳи алоҳидаи танзимӣ зиёд кардааст. Дар механизми аввал NSC697923 ва UBE2N siRNA убиквитиншавии DR5-ро кам карда, устувории сафедаро зиёд карданд. Дар таҷрибаи убиквитини пайванд-махсус NSC697923 махсусан убиквитиншавии K63-пайвастаи DR5-ро кам кард, дар ҳоле ки дар убиквитиншавии K48-пайваста тағйири назаррас ба вуҷуд наовард. Дар механизми дуюм боздории UBE2N намудҳои реактивии оксигени дохилиҳуҷайравиро (reactive oxygen species, ROS) зиёд кард; афзоиши ROS омили транскрипсионии CHOP-ро боло бурд ва транскрипсияи DR5-и вобаста ба CHOP-ро пурзӯр кард.

Аҳамияти функсионалии CHOP бо таҷрибаҳои siRNA ва мутатсияи promoter санҷида шуд. Ҳангоми хомӯш кардани CHOP афзоиши DR5 mRNA ва сафеда, ки аз NSC697923 ба вуҷуд омада буд, ба таври назаррас коҳиш ёфт; ҳангоми мутатсия кардани минтақаи пайвастшавии CHOP дар promoter-и DR5, NSC697923 фаъолияти promoter-ро зиёд накард. Баръакс, сатҳи сафедаи p53 тағйир наёфт. Ин натиҷаҳо дастгирӣ мекунанд, ки дар шароити таҳқиқшуда болоравии транскрипсионии DR5 бо CHOP алоқаманд аст.

Нақши ROS низ бо таҷрибаи дахолатӣ санҷида шуд. Кам кардани ROS бо N-acetylcysteine (NAC) ё GEE афзоиши ROS аз NSC697923, болоравии CHOP/DR5 ва апоптози аз комбинацияи NSC697923+TRAIL ба вуҷудомадаро боздошт. Аммо манбаи дақиқи ҳуҷайравии ROS муайян нашудааст. Манбаъҳои митохондриявии ROS ва NADPH оксидаза, ки дар мақола муҳокима шудаанд, ин таъсирро шарҳ дода натавонистанд.

Боздории UBE2N дар ҳуҷайраҳои саратонии PC3 ва ACHN низ DR5-ро зиёд карда, апоптози миёнаравии TRAIL-ро пурзӯр кард. Баръакс, дар ҳуҷайраҳои муқаррарии эндотелиалии рагии EA.hy926, ки дар таҳқиқот санҷида шуданд, комбинацияи NSC697923+TRAIL апоптози назаррас ба вуҷуд наовард. Ин натиҷа танҳо барои модели ҳуҷайра ва шароити таҷрибавии санҷидашуда эътибор дорад; он амниятро дар ҳамаи бофтаҳои муқаррарии инсон ё интихобпазирии терапевтиро дар одамон исбот намекунад.

Таҳқиқот озмоиши клиникии табобати саратон нест. NSC697923 ва TRAIL дар одамон истифода нашудаанд, ҷавоби бемор, фармакокинетика, токсикияти дарозмуддат ё коҳиши варам чен карда нашудааст. Натиҷаҳо меҳвари UBE2N-DR5-ро ҳамчун стратегияи таҷрибавии комбинационӣ барои бартараф кардани муқовимат ба TRAIL дастгирӣ мекунанд; самаранокии клиникӣ бояд алоҳида таҳқиқ шавад.

TRAIL чист ва чаро дар таҳқиқоти саратон муҳим аст?

TRAIL ихтисораи tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand буда, узви супероилаи TNF мебошад. TRAIL ба ретсепторҳои марги сатҳи ҳуҷайра DR4 ва DR5 пайваст шуда, ба оғоз шудани роҳи экстринсикии апоптоз мусоидат мекунад. Фаъолшавии ретсептор ҷамъшавии FADD ва procaspase-8 ва ташаккули death-inducing signaling complex (DISC)-ро дастгирӣ мекунад. Пас аз он шабакаи каспаза метавонад фаъол шавад ва ҳуҷайра ба таври назоратшаванда ба апоптоз гузарад.

Яке аз хусусиятҳои ҷолиби TRAIL барои таҳқиқот ин аст, ки дар бисёр системаҳои таҷрибавӣ метавонад ба ҳуҷайраҳои саратон нисбат ба ҳуҷайраҳои муқаррарӣ таъсири қавитари апоптотикӣ нишон диҳад. Бо вуҷуди ин, бисёр ҳуҷайраҳои саратон метавонанд аз сабаби камшавии DR4/DR5, афзоиши сафедаҳои зиддиапоптотикӣ ё тағйирот дар дигар марҳилаҳои роҳи сигналии апоптоз ба TRAIL муқовимат дошта бошанд. Саволи асосии ин таҳқиқот ин аст, ки оё бо боздории UBE2N ин остонаи муқовиматро паст кардан мумкин аст ё не.

DR5 чист?

DR5 яке аз ретсепторҳои марги сатҳи ҳуҷайра аст, ки TRAIL метавонад ба он пайваст шавад. Афзоиши миқдори DR5 ва дастрасии он дар сатҳи ҳуҷайра метавонад дар шароити муайян қобилияти ҳуҷайраро барои қабул кардани сигнали TRAIL зиёд кунад. Дар ин таҳқиқот NSC697923 на танҳо сафедаи умумии DR5, балки сатҳи DR5-и сатҳи ҳуҷайраро, ки бо flow cytometry чен карда шудааст, низ зиёд кард.

UBE2N чист?

UBE2N, ки бо номи Ubc13 низ маълум аст, ферменти конъюгатсиякунандаи убиквитин аз синфи E2-и системаи убиквитиншавӣ мебошад. Убиквитиншавӣ умуман кори ҳамоҳангшудаи ферменти фаъолкунандаи E1, ферменти конъюгатсияи E2 ва лигазаи E3-ро дар бар мегирад. E1 убиквитинро фаъол мекунад, E2 убиквитини фаъолшударо интиқол медиҳад ва системаи E3 ба интихоби сафедаи ҳадаф кӯмак мекунад.

UBE2N махсусан бо занҷирҳои полиубиквитини бо K63 пайваст алоқаманд аст. Убиквитиншавии K63-пайваста танҳо маънои вайроншавии классикии протеасомалии сафедаро надорад; он метавонад дар сигнализатсияи ҳуҷайравӣ, интиқоли сафеда ва равандҳои гуногуни turnover иштирок кунад. Ин фарқ барои фаҳмидани механизми DR5 дар таҳқиқот муҳим аст.

Боздории UBE2N DR5-ро Дар Ду Сатҳи Алоҳида Чӣ Гуна Зиёд Мекунад?

Боздории UBE2N DR5-ро ҳам бо устувор кардани он дар сатҳи post-translational ва ҳам бо афзоиши транскрипсияи гени DR5 тавассути меҳвари ROS-CHOP зиёд мекунад; ҳамин тавр, ҳамзамон бо кам шудани талафи сафедаи ҳамон ретсептори марг, истеҳсоли mRNA-и нав низ зиёд мешавад.

Шохаи аввал: устувории сафедаи DR5

Таҳқиқотчиён бо истифода аз cycloheximide (CHX), ки синтези сафедаро бозмедорад, коҳиши сафедаи мавҷудаи DR5-ро бо гузашти вақт назорат карданд. Ҳангоми мавҷудияти CHX DR5 кам мешуд, аммо истифодаи NSC697923 боиси он шуд, ки сафеда муддати дарозтар нигоҳ дошта шавад. Кам кардани UBE2N бо siRNA низ деградатсияи DR5-ро суст кард.

Ин таҷриба нишон медиҳад, ки афзоиши DR5 танҳо аз синтези сафедаи нав сар намезанад; захираи мавҷудаи сафедаи DR5 сусттар аз байн меравад.

Шохаи дуюм: афзоиши транскрипсияи DR5

Пас аз истифодаи NSC697923 ва UBE2N siRNA сатҳи DR5 mRNA низ баланд шуд. Таҷрибаҳои DR5 promoter-luciferase нишон доданд, ки NSC697923 фаъолияти promoter-ро зиёд мекунад. Ҳамин тавр муайян шуд, ки боздории UBE2N DR5-ро на танҳо дар сатҳи turnover-и сафеда, балки дар сатҳи экспрессияи ген низ танзим мекунад.

Нақши CHOP чӣ гуна санҷида шуд?

CHOP омили транскрипсионӣ мебошад, ки бо пайваст шудан ба DNA метавонад транскрипсияи генҳои муайяни ҷавоби стрессро танзим кунад. NSC697923 ва UBE2N knockdown сатҳи CHOP-ро зиёд карданд, дар ҳоле ки p53 ба ҳамин шакл зиёд нашуд. Истифодаи CHOP siRNA таъсири NSC697923-ро дар зиёд кардани DR5 mRNA ва сафеда ба таври назаррас коҳиш дод.

Таҳқиқотчиён инчунин promoter-и DR5-ро бо минтақаи солими пайвастшавии CHOP бо promoter-е, ки ҳамон минтақааш мутатсия шудааст, муқоиса карданд. NSC697923 фаъолияти promoter-и wild-type-ро зиёд кард, аммо дар мутанти CHOP-binding-site чунин афзоиш дида нашуд. Ин таҷриба дастгирӣ мекунад, ки CHOP танҳо нишондиҳандае нест, ки ҳамроҳи DR5 зиёд мешавад, балки дар фаъолшавии promoter нақши функсионалӣ дорад.

Чаро p53 алоҳида чен карда шуд?

Транскрипсияи DR5 танҳо аз ҷониби CHOP танзим намешавад; p53 низ яке аз омилҳои транскрипсионӣ аст, ки метавонад дар назорати promoter-и DR5 нақш дошта бошад. Аз ин рӯ, таҳқиқотчиён p53-ро ҳамчун механизми алтернативӣ арзёбӣ карданд. NSC697923 ё UBE2N siRNA CHOP-ро зиёд карданд, аммо дар сатҳи p53 тағйири назаррас ба вуҷуд наоварданд. Аз ин рӯ манбаъ афзоиши DR5 mRNA-ро дар шароити таҳқиқшуда ба меҳвари CHOP нисбат медиҳад.

Чаро Фарқи Байни Убиквитиншавии Бо K63 ва K48 Пайваст Дар Ин Таҳқиқот Муҳим Аст?

Зеро ҳангоми кам кардани убиквитиншавии умумии DR5 аз ҷониби NSC697923 ин тағйир махсусан дар занҷирҳои убиквитини бо K63 пайваст дида шуд, аммо дар занҷирҳои K48-пайваста, ки аксаран бо вайроншавии классикии протеасомалӣ алоқаманданд, чунин камшавӣ мушоҳида нашуд; аз ин рӯ таҳқиқот пешниҳод мекунад, ки turnover-и DR5 раванди бо K63 алоқаманди ҳанӯз пурра ҳалнашударо дар бар мегирад, ки аз модели классикии K48-протеасома фарқ мекунад.

“K63” ва “K48” чӣ маъно доранд?

Дар худи молекулаи убиквитин якчанд боқимондаи лизин мавҷуд аст. Ба кадом лизини убиквитини қаблӣ пайваст шудани молекулаи нави убиквитин метавонад маънои биологии занҷири ҳосилшударо тағйир диҳад. Дар занҷири “K48-пайваста” пайвастшавӣ тавассути лизини 48.; дар занҷири “K63-пайваста” бошад тавассути лизини 63. сурат мегирад.

Полиубиквитиншавии K48-пайваста барои бисёр сафедаҳо ҳамчун сигнали деградатсияи протеасомалӣ маълум аст. Занҷирҳои K63-пайваста бошанд, аксаран дар сигнализатсияи ғайрипротеасомалӣ, endosomal trafficking, равандҳои lysosomal ё мутақобилаи сафеда-сафеда нақш доранд. Дар ин таҳқиқот ҳамзамон мушоҳида шудани камшавии убиквитиншавии K63-пайвастаи DR5 ва устуворшавии DR5 қобили таваҷҷуҳ аст.

Аммо таҳқиқот мустақиман муайян накардааст, ки занҷири K63 DR5-ро ба кадом компартименти ҳуҷайравӣ мебарад ё кадом механизми деградатсия марҳилаи ниҳоӣ аст. Аз ин рӯ хулосаи қавитаре мисли “UBE2N бо илова кардани K63 DR5-ро ҳатман ба лизосома мефиристад” баровардан мумкин нест.

Оё UBE2N бо DR5 мутақобилаи физикӣ дорад?

Дар таҷрибаи Immunoprecipitation UBE2N ва DR5 дар як комплекси сафедагӣ муайян шуданд. Ин натиҷа дастгирӣ мекунад, ки UBE2N метавонад turnover-и DR5-ро мустақиман ё ҳамчун қисми комплекси сафедагии хеле наздик танзим кунад.

Бо вуҷуди ин, ферменти E2 танҳо тамоми ҷузъиёти интихоби ҳадафро муайян намекунад. Манбаъ ба таври возеҳ мегӯяд, ки лигазаи махсуси E3, ки ҳамроҳи UBE2N дар DR5 амал мекунад, ҳанӯз маълум нест.

Оё c-Cbl метавонад ин лигазаи E3 бошад?

Таҳқиқоти қаблӣ нишон додаанд, ки c-Cbl метавонад дар деградатсияи ретсептори TRAIL нақш дошта бошад. Аз ин рӯ таҳқиқотчиёни манбаъ таҷрибаи c-Cbl overexpression гузаронданд. Экспрессияи аз ҳад зиёди c-Cbl афзоиши DR5 аз NSC697923-ро бартараф накард. Ин натиҷа нишон медиҳад, ки c-Cbl таъсири мушоҳидашудаи UBE2N-DR5-ро танҳо худ шарҳ дода наметавонад.

Манбаъ ин натиҷаи c-Cbl-ро ҳамчун “data not shown” гузориш медиҳад; графики миқдорӣ ё маълумоти хом пешниҳод намекунад. Аз ин рӯ Verianla барои ин таҷриба арзиши дар манбаъ набударо эҷод намекунад.

Механизми Байни ROS, CHOP ва DR5 Чист?

Дар таҳқиқот боздории фармакологӣ ё генетикии UBE2N ROS-и дохилиҳуҷайравиро зиёд кард; боздоштани ROS бо антиоксидантҳо болоравии CHOP ва DR5 ва ҳассосият ба TRAIL-ро коҳиш дод, аз ин рӯ манбаъ ROS-ро ҳамчун танзимгари функсионалӣ дар болооби фаъолшавии CHOP ва афзоиши DR5 ҷой медиҳад; манбаи дақиқи органеллавӣ ё ферментии ROS бошад муайян нашудааст.

ROS чист?

Reactive oxygen species, яъне намудҳои реактивии оксиген, оилаи молекулаҳо ё радикалҳои дорои оксиген ва дорои реактивияти баланди химиявӣ мебошанд. Вақте ки сатҳи ROS-и дохилиҳуҷайравӣ паст ва назоратшаванда аст, он метавонад дар интиқоли сигнал иштирок кунад; ҳангоми аз ҳад зиёд баланд шудан бошад, метавонад ба сафедаҳо, липидҳо, DNA ва роҳҳои ҷавоби стресс таъсири назаррас расонад.

ROS чӣ гуна чен карда шуд?

Манбаъ аз пробаи флуоресцентии H₂DCF-DA истифода кардааст. Ҳуҷайраҳои Caki бо 20 µM H₂DCF-DA барои 10 дақиқа ранг карда шуда, сигнали флуоресцентӣ бо BD Accuri C6 flow cytometer чен карда шуд. Истифодаи NSC697923 ва UBE2N siRNA сигнали ROS-ро зиёд карданд.

Чаро таҷрибаи NAC ва GEE муҳим аст?

Танҳо нишон додани болоравии ROS исбот намекунад, ки ROS сабаби механизм аст. Аз ин рӯ таҳқиқотчиён бо моддаҳои коҳишдиҳандаи ROS дахолат карданд. Дар таҷрибаҳои Figure 5-и манбаъ ҳуҷайраҳо бо 5 mM NAC ё 2 mM GEE барои 30 дақиқа пешакӣ коркард шуданд.

Ин антиоксидантҳо сигнали ROS-и аз NSC697923 ба вуҷудомадаро кам карданд, афзоиши сафедаҳои CHOP ва DR5-ро боздоштанд ва ҷавоби sub-G1/апоптотикии комбинацияи NSC697923+TRAIL-ро коҳиш доданд. Ин таҷрибаи дахолатӣ дастгирӣ мекунад, ки ROS танҳо нишондиҳандаи коррелятсионӣ нест, балки дар механизм нақши функсионалӣ дорад.

Оё манбаи ROS ёфт шуд?

Не. Дар бахши муҳокима манбаъ мегӯяд, ки mitochondrial ROS inhibitor MitoTEMPO ва ингибиторҳои NADPH oxidase — diphenyleneiodonium ва apocynin — истифода шудаанд, аммо ин дахолатҳо апоптози аз NSC697923+TRAIL ба вуҷудомадаро кам накардаанд. Ин таҷрибаҳо ҳамчун “data not shown” гузориш шудаанд.

Аз ин рӯ манбаъ нишон намедиҳад, ки ROS ҳатман аз митохондрия ё системаи NOX меояд. Муаллифон қайд мекунанд, ки ROS-и зиёдшуда метавонад бо stress responses-и умумитари ҳуҷайравӣ алоқаманд бошад ва механизм бояд дар таҳқиқоти минбаъда шарҳ дода шавад.

Оё афзоиши CHOP маънои ER stress-ро дорад?

Гарчанде CHOP нишондиҳандаи маъмулан истифодашавандаи endoplasmic reticulum stress аст, дар ин таҳқиқот болоравии CHOP-ро худкор ба механизми классикии ER-stress баробар кардан дуруст нест. Таҳқиқотчиён chemical ER-stress inhibitors TUDCA ва 4-PBA-ро истифода карданд, аммо ин ингибиторҳо афзоиши DR5 аз NSC697923 ва TRAIL sensitization-ро пешгирӣ накарданд.

Ин натиҷаҳо низ дар манбаъ ҳамчун “data not shown” тавсиф мешаванд. Тафсири муаллифон ин аст, ки меҳвари мушоҳидашудаи UBE2N-DR5 нисбат ба фаъолшавии классикии ER-stress марказитар аст.

Оё осеби DNA дар оғози механизм қарор дорад?

Манбаъ сигнали γH2AX-ро низ таҳқиқ кардааст. Гуфта мешавад, ки NSC697923 танҳо γH2AX-ро каме зиёд кард, дар ҳоле ки дар комбинацияи NSC697923+TRAIL болоравии қавитар мушоҳида шуд. Муаллифон инро бештар ҳамчун натиҷаи downstream-и апоптоз, на ҳамчун механизми upstream-и оғозкунандаи афзоиши DR5, тафсир мекунанд.

Ин натиҷа низ дар гурӯҳи “data not shown” аст ва манбаъ маълумоти миқдории γH2AX пешниҳод намекунад.

NSC697923 чист ва ба UBE2N чӣ гуна таъсир мекунад?

NSC697923 ингибитори молекулавии хурд аст, ки дар таҳқиқот барои боздоштани фаъолияти UBE2N истифода шудааст. Манбаъ бо такя ба таҳқиқоти сохтории қаблӣ мегӯяд, ки NSC697923 ба cysteine 87 дар минтақаи фаъоли UBE2N ба таври ковалентӣ пайваст мешавад. Дар натиҷаҳои Western blot-и таҳқиқот NSC697923 миқдори сафедаи UBE2N-ро кам накардааст; бо вуҷуди ин, танзими DR5-и марбут ба фаъолияти UBE2N-ро тағйир додааст. Аз ин рӯ таҳқиқотчиён шарҳ додаанд, ки ингибитор бештар фаъолияти ферментро ҳадаф мегирад, на миқдори онро.

Чаро таъсири ингибитори фармакологӣ боз бо siRNA санҷида шуд?

Ингибиторҳои молекулавии хурд метавонанд ба ғайр аз сафедаи ҳадаф ба молекулаҳои дигар низ таъсир кунанд. Аз ин рӯ танҳо натиҷаи NSC697923 барои муайян кардани вазифаи воқеии биологии UBE2N кофӣ нест. Истифодаи siRNA-и махсуси UBE2N санҷид, ки оё ҳамин афзоиши DR5 ҳангоми генетикӣ кам кардани фермент низ ба вуҷуд меояд ё не.

Дар ҳуҷайраҳои Caki ва HCT116 UBE2N siRNA сафедаи DR5-ро зиёд кард. Ин натиҷаи параллелӣ дастгирӣ мекунад, ки афзоиши DR5 пурра таъсири химиявии off-target-и NSC697923 нест.

Чаро натиҷаи c-FLIP ба таври дигар тафсир шуд?

NSC697923 ҳангоми зиёд кардани DR5 сафедаи зиддиапоптотикии c-FLIP-ро кам кард. Аммо кам кардани генетикии UBE2N бо siRNA c-FLIP-ро тағйир надод. Аз ин рӯ таҳқиқотчиён камшавии c-FLIP аз NSC697923-ро на ҳамчун таъсири воқеии downstream-и боздории UBE2N, балки ҳамчун таъсири off-target-и ингибитор арзёбӣ карда, таҳлили механистиро ба DR5 равона карданд.

Усули 2^−ΔΔCt Дар Ин Таҳқиқот Чиро Ҳисоб Мекунад?

Усули 2^−ΔΔCt ҳисоби нисбии экспрессияи ген аст, ки дар qPCR барои арзёбии он истифода мешавад, ки сатҳи mRNA-и гени ҳадаф, мисли DR5, пас аз нормализатсия ба гени референсии actin нисбат ба шароити назоратӣ чанд маротиба тағйир ёфтааст; таҳқиқот тағйироти DR5 mRNA-ро бо ҳамин усул муайян кардааст.

Ифодаи истифодашуда дар манбаъ: \(2^{-\Delta\Delta Ct}\)

Ёддошти муҳими манбаъ: Мақола танҳо хабар медиҳад, ки усули 2^−ΔΔCt истифода шудааст; муодилаҳои мобайнии ΔCt ва ΔΔCt дар зер барои омӯзонидани тавсеаи стандартии математикии усул мебошанд ва натиҷаи нави таҳқиқот нестанд.

Қадами 1 — ΔCt:

\(\Delta Ct = Ct_{\mathrm{hedef}} - Ct_{\mathrm{referans}}\)

Дар ин таҳқиқот гени ҳадаф DR5 ва гени референсӣ actin мебошад. Ct шумораи cycle-ро ифода мекунад, ки дар он сигнали флуоресцентии qPCR аз ҳадди муқарраршуда мегузарад. Вақте ки миқдори ибтидоии кислотаи нуклеинии ҳадаф баландтар аст, ҳад одатан дар cycle барвақттар гузаронида мешавад ва Ct пасттар мешавад.

Қадами 2 — ΔΔCt:

\(\Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{\mathrm{işlem}} - \Delta Ct_{\mathrm{kontrol}}\)

Ин қадам фарқи Ct-и нормализатсияшудаи гени ҳадафро дар гурӯҳи коркард бо гурӯҳи назоратӣ муқоиса мекунад.

Қадами 3 — экспрессияи нисбӣ:

\(\mathrm{Göreli\ ekspresyon}=2^{-\Delta\Delta Ct}\)

1. Формула чиро ҳисоб мекунад? Тағйироти нисбии чандмаротибаи mRNA нисбат ба назорат.

2. Тағйирёбандаҳо кадоманд? Ct_hedef, Ct_referans, ΔCt ва ΔΔCt.

3. Воҳид чист? Азбаски натиҷа тағйироти чандмаротиба аст, беандоза мебошад.

4. Нақши математикӣ чист? Фарқҳои Ct миқёси логарифмии PCR cycle-ро ба тағйироти нисбии хаттии чандмаротиба табдил медиҳанд.

5. Маънои биологӣ чист? Нишон медиҳад, ки DR5 mRNA нисбат ба ҳуҷайраҳои назоратӣ зиёд ё кам шудааст.

6. Дар кадом шарт тафсир мешавад? Гени референсӣ бояд мувофиқ бошад ва рафтори амплификатсияи PCR ба фарзияҳои усул ба қадри кофӣ мувофиқат кунад.

7. Натиҷа чӣ гуна тафсир мешавад? Масалан, 1 сатҳи назоратиро, аз 1 боло афзоиши нисбӣ ва аз 1 поён камшавии нисбиро ифода мекунад; аммо манбаъ арзишҳои хоми Ct-ро барои ҳар таҷриба нашр накардааст, бинобар ин Verianla fold-change-и нави рақамӣ ҳисоб намекунад.

Праймерҳои qPCR, ки дар таҳқиқот истифода шуданд

Чаро муҳим аст, ки апоптоз танҳо бо як нишондиҳанда арзёбӣ нашавад?

Афзоиши Sub-G1 барои марги апоптотикӣ нишондиҳандаи қавӣ аст, аммо танҳо худи он ченаки комил нест. Аз ин рӯ таҳқиқот ҳамон натиҷаи биологиро бо якчанд мушоҳидаи мустақил дастгирӣ кардааст: хурдшавии ҳуҷайра, конденсатсияи ядроӣ бо DAPI, фрагментатсияи DNA, фаъолияти caspase-3/DEVDase, PARP cleavage ва боздории вобастагӣ ба каспаза бо z-VAD-fmk.

Ин тасдиқи бисёрҷониба тақвият медиҳад, ки камшавии зиндамонии ҳуҷайра бештар бо марги апоптотикии ҳуҷайра мувофиқ аст, на танҳо бо сустшавии метаболикӣ ё тағйири муваққатии cell-cycle.

Популятсияи Sub-G1 чӣ маъно дорад?

Ҳангоми чен кардани миқдори DNA бо Flow cytometry, фрагментатсияи DNA дар вақти апоптоз метавонад боис шавад, ки баъзе ҳуҷайраҳо нисбат ба ҳуҷайраҳои муқаррарии G1 флуоресценсияи камтари DNA дошта бошанд. Ин минтақаи дорои миқдори ками DNA “sub-G1” номида мешавад ва барои арзёбии популятсияи ҳуҷайраҳои апоптотикӣ истифода мешавад.

PARP cleavage чиро нишон медиҳад?

PARP сафедаест, ки дар ҷавоби осеби DNA иштирок мекунад. Каспазаҳои фаъолшуда дар вақти апоптоз метавонанд PARP-ро дар минтақаҳои муайян буранд. Аз ин рӯ cleaved PARP ё фрагментатсияи PARP-и пурра яке аз нишондиҳандаҳои биохимиявии апоптози вобаста ба каспаза мебошад.

Таҷрибаи z-VAD-fmk чиро нишон дод?

z-VAD-fmk ингибитори васеъспектри pan-caspase мебошад. Пас аз коркарди пешакии ҳуҷайраҳои Caki бо 20 µM z-VAD барои 30 дақиқа, 6 µM NSC697923 ва 50 ng/mL TRAIL истифода шуданд. z-VAD ҷавоби апоптотикии аз комбинация ба вуҷудомадаро пурра боздошт. Ин натиҷа дастгирӣ мекунад, ки фаъолияти каспаза барои иҷрои марги ҳуҷайра зарур аст.

Оё Ин Натиҷаҳо Нишон Медиҳанд, Ки Табобати Саратон Бо Ингибитори UBE2N Дар Одамон Самаранок Аст?

Не. Таҷрибаҳои худи ин мақола дар фарҳангҳои ҳуҷайра гузаронида шудаанд; санҷида нашудааст, ки комбинацияи NSC697923+TRAIL дар беморон варамро хурд мекунад, бехатар аст, бо кадом доз истифода мешавад ё фоидаи клиникии дарозмуддат медиҳад, бинобар ин таҳқиқот меҳвари UBE2N-DR5-ро на ҳамчун табобати клиникӣ исботшуда, балки ҳамчун ҳадафи преклиникӣ ва стратегияи комбинационӣ барои таҳқиқоти оянда дастгирӣ мекунад.

Дар муҳокима ба адабиёте ишора мешавад, ки NSC697923 дар таҳқиқоти қаблии xenograft афзоиши варамро кам кардааст. Инҳо таҷрибаҳои нави ҳайвонии дар ҳамин таҳқиқот гузаронидашуда нестанд ва натиҷаҳои фарҳанги ҳуҷайраи мақолаи ҷориро мустақиман ба далели клиникӣ табдил намедиҳанд.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Моделҳои ҳуҷайра

Манбаъ ҳуҷайраҳоро дар Dulbecco's modified Eagle's medium, ки %10 fetal bovine serum ва %1 penicillin/streptomycin дошт, парвариш кардааст. Азбаски консентратсияи gentamicin дар матни манбаъ ҳангоми истихроҷи матн аз ҷиҳати аломати воҳид боэътимод намоён нест, Verianla ин арзишро хомӯшона ислоҳ карда аз нав намедиҳад.

Чен кардани sub-G1 бо Flow cytometry

Пас аз ҷамъ кардани ҳуҷайраҳо, онҳо дар 100 µL PBS дубора суспензия карда шуданд ва ҳангоми vortex 200 µL %95 ethanol илова шуд. Намунаҳо дар 4 °C як соат нигоҳ дошта шуданд; pellet баъдан дар %1.12 sodium citrate buffer, pH 8.4 дорои RNase A дар 37 °C барои 30 дақиқа инкубатсия карда шуд. Пас аз ранг кардани DNA бо Propidium iodide, популятсияи sub-G1 бо истифода аз BD Biosciences flow cytometer муайян карда шуд.

Western blotting

Сафедаҳо бо ERK lysis buffer омода шуданд, миқдори баробари сафеда бо SDS-PAGE ҷудо ва ба nitrocellulose membrane интиқол дода шуд. Антителаҳои primer дар 4 °C шабона ва HRP-conjugated secondary antibodies дар ҳарорати хона ду соат истифода шуданд. Сигналҳои сафеда бо усули enhanced chemiluminescence тасвир шуданд.

Конденсатсияи ядроӣ ва фрагментатсияи DNA

Барои конденсатсияи ядроӣ ҳуҷайраҳо бо 300 nM DAPI барои панҷ дақиқа ранг карда шуда, бо fluorescence microscope мушоҳида шуданд. Фрагментатсияи DNA бо истифода аз Cell Death Detection ELISA Plus Kit арзёбӣ шуд.

Таҷрибаҳои siRNA

Control, UBE2N ва DR5 siRNA бо Lipofectamine RNAiMAX ба ҳуҷайраҳо ворид карда шуданд. UBE2N siRNA санҷид, ки оё натиҷаи фармакологии NSC697923 бо талафи воқеии UBE2N такрор мешавад, дар ҳоле ки DR5 siRNA зарурати функсионалии DR5-ро барои апоптози аз комбинация ба вуҷудомада санҷид.

Экспрессияи сатҳии DR5

Ҳуҷайраҳои Caki бо 2-6 µM NSC697923 барои 24 соат инкубатсия шуданд ва бо истифода аз DR5-phycoerythrin antibody DR5-и сатҳи ҳуҷайра бо flow cytometry чен карда шуд. NSC697923 сигнали DR5-ро дар сатҳ зиёд кард.

Протоколи assay-и убиквитиншавӣ

Ҳуҷайраҳо бо PBS дорои 10 mM N-ethylmaleimide (NEM) шуста, ба PBS/NEM buffer дорои 1% SDS гирифта шуда, дар 95 °C барои 10 дақиқа гарм карда шуданд. Лизатҳо бо buffer дорои PMSF ва NEM тунук карда шуда, дар 13.000×g барои 10 дақиқа дар 4 °C центрифуга шуданд. Supernatant бо primer antibody бар зидди сафедаи ҳадаф шабона инкубатсия шуда, комплексҳои сафеда-антитела бо agarose beads барои ду соат нигоҳ дошта шуданд. Убиквитини ба DR5 пайваст бо HRP-conjugated anti-ubiquitin antibody муайян карда шуд.

Figure 1: Таъсири апоптотикии комбинацияи NSC697923 ва TRAIL

Ҳуҷайраҳои Caki бо 4 ё 6 µM NSC697923, 50 ng/mL TRAIL ё комбинацияҳо барои 24 соат коркард шуданд. Табобатҳои ҷудогона дар шароити таҳқиқшуда апоптози назаррас ба вуҷуд наоварданд, дар ҳоле ки комбинация бо зиёд шудани дозаи NSC697923 популятсияи sub-G1-ро зиёд кард.

Комбинацияи 6 µM NSC697923 + 50 ng/mL TRAIL хурдшавии ҳуҷайра, конденсатсияи ядроӣ, фрагментатсияи DNA ва фаъолияти caspase-3/DEVDase-ро зиёд кард. Коркарди пешакӣ бо 20 µM z-VAD-fmk апоптози аз комбинация ба вуҷудомадаро пешгирӣ кард. Манбаъ аҳамияти омориро дар муқоисаҳои дахлдор ҳамчун p<0.05 нишон медиҳад.

Figure 2: Боздории UBE2N DR5-ро баланд мекунад

Дар ҳуҷайраҳои Caki 2-6 µM NSC697923 пас аз 24 соат сафедаи DR5-ро зиёд кард. c-FLIP низ кам шуд, аммо аксари сафедаҳои дигари апоптотикии таҳқиқшуда тағйири назаррас надоштанд. Миқдори сафедаи UBE2N тағйир наёфт.

Дар ҳуҷайраҳои Caki ва HCT116, UBE2N siRNA DR5-ро зиёд кард, аммо c-FLIP-ро кам накард. Аз ин рӯ камшавии c-FLIP ҳамчун таъсири UBE2N-берун/off-target-и NSC697923 арзёбӣ шуд.

Figure 3: Устувории DR5 ва убиквитиншавӣ

Барои боздоштани синтези сафеда 20 µg/mL CHX истифода шуд. Ба ҳуҷайраҳои Caki аввал 6 µM NSC697923 барои 12 соат дода шуда, баъдан CHX илова шуд. Ҳангоми мавҷудияти NSC697923 сафедаи DR5 дар шароити CHX дарозтар нигоҳ дошта шуд. UBE2N siRNA низ деградатсияи DR5-ро ба таъхир андохт.

Immunoprecipitation мутақобилаи UBE2N-DR5-ро нишон дод. Дар таҷрибаҳои убиквитиншавӣ HA-ubiquitin ва 0.5 µM MG132 истифода шуданд; NSC697923 ва UBE2N knockdown убиквитиншавии DR5-ро кам карданд. Дар таҷрибаи Linkage-specific убиквитиншавии K63-пайваста кам шуд, дар ҳоле ки убиквитиншавии K48-пайваста ба таври назаррас тағйир наёфт.

DR5 siRNA ҷавоби sub-G1/апоптотикии аз комбинацияи NSC697923+TRAIL ба вуҷудомадаро ба таври назаррас кам кард. Ҳамин тавр DR5-и зиёдшуда на танҳо ҳамчун биомаркер, балки ҳамчун ҷузъи функсионалии ҳассосияти комбинация дастгирӣ шуд.

Figure 4: Транскрипсияи DR5-и вобаста ба CHOP

6 µM NSC697923 DR5 mRNA-ро бо гузашти вақт зиёд кард; UBE2N siRNA низ DR5 mRNA-ро баланд кард. Дар ҳар ду DR5/SacI ва DR5/−605 promoter-luciferase construct, NSC697923 фаъолияти promoter-ро зиёд кард.

Дар таҷрибаи 9 соата NSC697923 CHOP-ро зиёд кард, аммо p53-ро тағйир надод. UBE2N siRNA низ самти ҳамин афзоиши CHOP-ро дастгирӣ кард. CHOP siRNA афзоиши DR5 mRNA ва сафедаро, ки аз NSC697923 ба вуҷуд омада буд, кам кард.

DR5/−605 promoter бо CHOP-binding site-и солим ба NSC697923 ҷавоб дод, аммо mCHOP promoter бо минтақаи CHOP-и мутатсияшуда чунин ҷавоби фаъолшавӣ надод. Ин натиҷа аҳамияти функсионалии минтақаи пайвастшавии CHOP-ро дар транскрипсияи DR5 дастгирӣ мекунад.

Figure 5: Нақши функсионалии ROS

2-6 µM NSC697923 дар истифодаи 30 дақиқа флуоресценсияи H₂DCF-DA-ро зиёд карда, натиҷаи мувофиқ бо афзоиши ROS-и дохилиҳуҷайравӣ дод. UBE2N siRNA низ сатҳи ROS-ро зиёд кард.

Коркарди пешакии 30 дақиқа бо 5 mM NAC ё 2 mM GEE афзоиши ROS аз 6 µM NSC697923-ро боздошт. Ҳамин тозакунандаҳои ROS болоравии CHOP ва DR5-ро низ кам карданд.

Таъсири апоптотикии 24 соатаи комбинацияи NSC697923+50 ng/mL TRAIL дар мавҷудияти NAC ё GEE ба таври назаррас кам шуд. Ҳамин тавр ROS ҳамчун яке аз марҳилаҳои функсионалии мобайнӣ байни боздории UBE2N ва CHOP/DR5 ва TRAIL sensitization дастгирӣ шуд.

Figure 6: Муқоисаи ҳуҷайраҳои гуногуни саратон ва ҳуҷайраи муқаррарӣ

Дар ҳуҷайраҳои саратони простатаи PC3 ва саратони renal ACHN, NSC697923 сафедаи DR5-ро зиёд кард. Бо UBE2N siRNA низ афзоиши монанди DR5 ба даст омад.

Комбинацияи 6 µM NSC697923 ва 50 ng/mL TRAIL дар ҳуҷайраҳои PC3 ва ACHN популятсияи sub-G1 ва PARP cleavage-ро зиёд кард. Истифодаи TRAIL пас аз UBE2N siRNA низ ҷавоби апоптотикиро дар ҳуҷайраҳои Caki, PC3 ва ACHN пурзӯр кард.

Дар ҳуҷайраҳои муқаррарии эндотелиалии рагии инсон EA.hy926 ҳамин 6 µM NSC697923 + 50 ng/mL TRAIL дар шароити 24 соат афзоиши sub-G1-и ба андозаи Caki ҳуҷайраҳо назаррасро ба вуҷуд наовард.

Ин назорат набояд ба хулосаи “ҳуҷайраҳои муқаррарии инсон умуман таъсир намегиранд” васеъ карда шавад. Дар таҳқиқот танҳо як модели normal endothelial cell муқоиса шудааст; намудҳои дигари ҳуҷайраҳои муқаррарӣ, organoidҳо, токсикологияи ҳайвонот ё амнияти инсон арзёбӣ нашудаанд.

Таҳлили оморӣ

Гуфта шудааст, ки ҳамаи таҷрибаҳо triplicate гузаронида шудаанд. Натиҷаҳо ҳамчун миёна ± инҳирофи стандартӣ (mean ± SD) пешниҳод шудаанд. Таҳлили оморӣ бо SPSS version 26.0 анҷом шуда; гурӯҳҳо бо one-way analysis of variance (ANOVA) ва пас аз он Student-Newman-Keuls post-hoc comparison арзёбӣ шуданд.

Манбаъ дар шарҳҳои Figure барои аҳамияти оморӣ аломатҳои p<0.05-ро истифода мебарад. Мақола confidence interval ё андозаи таъсирро гузориш намекунад. Аз ин рӯ Verianla натиҷаи p<0.05-ро ба маънои “таъсир калон аст” ё “аз ҷиҳати клиникӣ муҳим аст” васеъ намекунад.

ANOVA чиро месанҷад?

One-way ANOVA фарзияи сифриро ба таври умумӣ арзёбӣ мекунад, ки миёнаҳои якчанд гурӯҳ аз як миёнаи популятсия омадаанд. Вақте ANOVA аҳамиятнок аст, барои фаҳмидани он ки фарқ байни кадом гурӯҳҳо вуҷуд дорад, муқоисаи post-hoc лозим мешавад. Дар ин таҳқиқот Student-Newman-Keuls ҳамчун усули post-hoc истифода шудааст.

Инҳирофи стандартӣ чиро нишон медиҳад?

Инҳирофи стандартӣ паҳншавии ченкуниҳои такрориро дар атрофи миёна нишон медиҳад. SD-и хурд нишон медиҳад, ки такрорҳо ба ҳам наздиктаранд, SD-и калон бошад тағйирпазирии бештарро нишон медиҳад. SD мустақиман confidence interval ё андозаи таъсири биологӣ нест.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

• NSC697923 ва UBE2N siRNA метавонанд экспрессияи DR5-ро дар ҳуҷайраҳои саратонии таҳқиқшуда зиёд кунанд.
• Боздории UBE2N убиквитиншавии K63-пайвастаи DR5-ро кам карда, устувории сафедаи DR5-ро зиёд мекунад.
• Убиквитиншавии K48-пайвастаи DR5 бо NSC697923 ба ҳамин шакл кам намешавад.
• UBE2N ва DR5 дар як комплекси сафедагӣ муайян шудаанд.
• Боздории UBE2N DR5 mRNA-ро низ зиёд мекунад.
• CHOP дар болоравии транскрипсионии DR5 аз NSC697923 нақши функсионалӣ дорад.
• Боздории UBE2N сатҳи ROS-ро зиёд мекунад ва ROS scavengerҳо афзоиши CHOP/DR5 ва TRAIL sensitization-ро бозмедоранд.
• DR5 knockdown апоптози NSC697923+TRAIL-ро кам мекунад; DR5 ҷузъи функсионалии ҷавоби комбинация мебошад.
• Дар ҳуҷайраҳои PC3 ва ACHN низ боздории UBE2N бо афзоиши DR5 ва ҳассосият ба TRAIL алоқаманд аст.
• Дар ҳуҷайраҳои муқаррарии EA.hy926-и санҷидашуда комбинация ҷавоби назарраси апоптотикӣ ба вуҷуд наовард.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

• Нишон дода нашудааст, ки комбинацияи NSC697923+TRAIL дар одамон табобати самараноки саратон аст.
• Дар таҷрибаҳои худи ин мақола mouse xenograft ё модели дигари in vivo-и варам вуҷуд надорад.
• Нишон дода нашудааст, ки ҳамаи ҳуҷайраҳои муқаррарии инсон ба комбинация муқовимат доранд; танҳо ҳуҷайраҳои EA.hy926 санҷида шудаанд.
• Манбаи дақиқи ҳуҷайравии ROS муайян нашудааст.
• Лигазаи махсуси E3, ки бо UBE2N дар DR5 якҷоя кор мекунад, муайян нашудааст.
• Ҳал нашудааст, ки убиквитиншавии K63-пайваста DR5-ро ба кадом роҳи дақиқи trafficking/degradation мефиристад.
• Нишон дода нашудааст, ки афзоиши CHOP ҳатман аз ҷониби классикии ER-stress pathway ба вуҷуд меояд.
• Нишон дода нашудааст, ки камшавии c-FLIP аз NSC697923 ба UBE2N вобаста аст; натиҷаи siRNA дастгирӣ мекунад, ки ин таъсир off-target аст.
• Натиҷаҳои p<0.05 маънои самаранокии клиникӣ, фоидаи бемор ё амниятро надоранд.

Ҷиҳатҳои қавии таҳқиқот

Яке аз ҷиҳатҳои қавитарини таҳқиқот муқоиса кардани натиҷаи ингибитори фармакологӣ бо UBE2N siRNA мебошад. Бо ин роҳ аз нисбат додани ҳамаи таъсирҳои молекулаи хурд ба UBE2N худкорона пешгирӣ шуда, таъсири off-target ба монанди камшавии c-FLIP ҷудо карда шудааст.

Ҷиҳати қавии дуюм ин аст, ки афзоиши DR5 ҳам дар сатҳи транскрипсия ва ҳам дар сатҳи устувории сафеда таҳқиқ шудааст. Таҷрибаҳои qPCR, promoter-luciferase, CHOP siRNA, CHX chase, immunoprecipitation ва linkage-specific ubiquitination қабатҳои гуногуни танзими як сафедаро таҳқиқ кардаанд.

Ҷиҳати қавии сеюм ин аст, ки барои ROS танҳо ченкунии флуоресценсия анҷом дода нашуда, бо NAC ва GEE равиши функсионалии rescue/inhibition истифода шудааст.

Ҷиҳати қавии чорум ин аст, ки апоптоз бо нишондиҳандаҳои мустақили sub-G1, морфология, DAPI, фрагментатсияи DNA, фаъолияти caspase-3, PARP cleavage ва таҷрибаи z-VAD санҷида шудааст.

Маҳдудиятҳои асосӣ

Маҳдудияти аввал: Таҳқиқот дар сатҳи фарҳанги ҳуҷайраи in vitro аст. Фармакокинетика, микро муҳити варам, системаи масуният, токсикияти системавӣ ва тақсимшавии дору дар сатҳи организм бо ин таҷрибаҳо арзёбӣ карда намешаванд.

Маҳдудияти дуюм: Муқоисаи амнияти ҳуҷайраи муқаррарӣ танҳо бо модели ҳуҷайраи эндотелиалии рагии EA.hy926 гузаронида шудааст. Ҳуҷайраҳои муқаррарии узвҳои дигар таҳқиқ нашудаанд.

Маҳдудияти сеюм: Пас аз боздории UBE2N манбаи дақиқи ROS маълум нест.

Маҳдудияти чорум: Лигазаи махсуси E3, ки DR5-ро ҳамроҳи UBE2N убиквитин мекунад, ва роҳи дақиқи trafficking/turnover пас аз убиквитиншавии K63-пайваста ҳал нашудаанд.

Маҳдудияти панҷум: Баъзе назоратҳои механистӣ вобаста ба TUDCA/4-PBA, γH2AX, c-Cbl, MitoTEMPO ва ингибиторҳои NOX ҳамчун “data not shown” гузориш шудаанд ва маълумоти хоми миқдории онҳо дар мақола нишон дода нашудааст.

Маҳдудияти шашум: Ҳарчанд ҳамаи таҷрибаҳо triplicate гузаронида шудаанд, таҳқиқот намунаи васеътари биологӣ, тасдиқи мустақили лабораторӣ, confidence interval ё таҳлили effect-size пешниҳод намекунад.

Маҳдудияти ҳафтум: Дида шудани он ки таъсири NSC697923 ба c-FLIP off-target аст, нишон медиҳад, ки молекулаи хурд метавонад ба ҳадафҳои биологии берун аз UBE2N низ таъсир дошта бошад.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Унвони аслӣ: Inhibition of UBE2N enhances TRAIL-mediated apoptosis through upregulation of DR5 in cancer cells.

Муаллифон ва тартиб: Yu Jin Jeong, Seon Min Woo, Seung Un Seo, So Rae Song, Taeg Kyu Kwon.

Саҳми баробар: Дар манбаъ изҳороти саҳми баробар/муаллифи якуми баробар дида намешавад.

Муаллифи масъул: Taeg Kyu Kwon.

Муассиса 1: Department of Immunology, School of Medicine, Keimyung University, Daegu 42601, South Korea.

Муассиса 2: Center for Forensic Pharmaceutical Science, Keimyung University, Daegu 42601, South Korea.

Маҷалла: International Journal of Medical Sciences.

Нашриёт/platform: Ivyspring International Publisher / International Journal of Medical Sciences.

Ҷилд / шумора / саҳифаҳо: 23(8), 2647-2656.

DOI: 10.7150/ijms.130235.

Санаи қабул барои баррасӣ: 19 Декабр 2025.

Санаи қабул: 23 Июн 2026.

Санаи нашр: 13 Июл 2026.

Навъи манбаъ: Research Paper / Journal Article-и баррасишуда.

Вазъи preprint: Манбаъ preprint нест; мақолаи нашршудаи маҷалла аст.

Литсензия: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Навъи илмии таҳқиқот: Таҳқиқоти фарҳанги ҳуҷайраи in vitro ва механизми молекулавӣ.

Дахолати инсон/ҳайвон: Дар ин мақола табобати бемор ё дахолати нави ҳайвони таҷрибавӣ гузориш нашудааст. Хатҳои ҳуҷайравии таъсисёфтаи пайдоиши инсон истифода шудаанд.

Ҳуҷайраҳои саратон: Caki ва ACHN renal carcinoma, HCT116 colon cancer ва PC3 prostate cancer.

Ҳуҷайраи муқоисавии муқаррарӣ: Модели EA.hy926 human normal vascular endothelial cell.

Дахолати асосии фармакологӣ: Ингибитори UBE2N — NSC697923.

Тасдиқи генетикӣ: UBE2N siRNA; инчунин барои зарурати механистӣ DR5 siRNA ва CHOP siRNA.

Шарти асосии комбинация: Дар таҷрибаҳои асосии марбут, аз ҷумла Caki, 6 µM NSC697923 ва 50 ng/mL TRAIL, асосан 24 соат; дар Figure 1-и манбаъ инчунин 4 µM NSC697923 истифода шудааст.

Усулҳои апоптоз: sub-G1 flow cytometry, морфологияи ҳуҷайра, рангкунии ядроии DAPI, DNA fragmentation assay, caspase-3/DEVDase assay, PARP cleavage ва дахолати z-VAD-fmk.

Усулҳои сафеда: Western blotting, immunoprecipitation, ubiquitination assay, CHX protein-stability assay ва таҳлили linkage-specific HA-K48-Ub/HA-K63-Ub.

Усулҳои транскрипсия: qRT-PCR, ҳисоби нисбии экспрессияи 2^-ΔΔCt, DR5 promoter luciferase assay ва CHOP-binding-site mutant promoter.

Таҳлили ROS: 20 µM H2DCF-DA ва BD Accuri C6 flow cytometer; NAC ва GEE ҳамчун назоратҳои функсионалии ROS.

Омор: Таҷрибаҳо triplicate; mean±SD; one-way ANOVA; Student-Newman-Keuls post-hoc comparison; SPSS version 26.0; ҳадди аҳамият p<0.05 дар Figure-ҳо.

Маблағгузорӣ: National Research Foundation of Korea grant RS-2024-00348057, ки аз ҷониби Korean Government (MSIP) маблағгузорӣ шудааст.

Саҳми муаллифон: Conceptualization: T.K.K. ва S.M.W.; Investigation: Y.J.J.; Validation: S.U.S. ва S.R.S.; Formal analysis: Y.J.J. ва S.M.W.; Writing-original draft: Y.J.J. ва T.K.K.; Writing-review and editing: S.M.W. ва T.K.K.; Supervision: T.K.K.; Project administration: T.K.K.; Funding acquisition: T.K.K.

Дастрасии маълумот: Гуфта шудааст, ки маълумоти истифодашуда дар таҳқиқот бо дархости асоснок аз corresponding author дастрас аст.

Бархӯрди манфиатҳо: Муаллифон изҳор кардаанд, ки competing interest вуҷуд надорад.

Ёддошти имлоии дохили манбаъ: Дар як ҷумлаи бахши натиҷаҳо номи ингибитор ҳамчун “NSC67923” омадааст. Дар қисми боқимондаи мақола, Figure-ҳо ва тавсифҳои асосии таҷрибавӣ номи canonical NSC697923 аст; матни Verianla ин фарқи имлоии дохили манбаъро ҳамчун номи илмии молекула такрор накардааст.

Ёддошти истиноди дохили манбаъ: Манбаъе, ки дар ҷумлаи равишҳои табобати TRAIL дар Introduction ҳамчун [8] дода шудааст, дар рӯйхати библиография ҳамчун таҳқиқот дар бораи контрасептивҳои даҳонӣ ва тромбоэмболияи мағзӣ пайдо мешавад ва ба контексти тавсифшудаи TRAIL мувофиқат намекунад. Ин мувофиқатнакардани библиографӣ аз ҷониби Verianla ҳамчун асоси илмӣ истифода нашудааст.

Ҳудуди муҳими K63: Манбаъ кам шудани убиквитиншавии K63-пайвастаи DR5-ро нишон медиҳад; чӣ гуна ин ба механизми дақиқи endosomal/lysosomal ё turnover-и дигар табдил меёбад, муайян нашудааст.

Ҳудуди муҳими ROS: Зарурати афзоиши ROS дар механизм бо дахолати antioxidant дастгирӣ шудааст; манбаи дақиқи ҳуҷайравии ROS муайян нашудааст.

Ҳудуди муҳими клиникӣ: Ин таҳқиқот танҳо дар сатҳи фарҳанги ҳуҷайра аст. Самаранокӣ ё амнияти табобат дар одамон нишон дода нашудааст.