Diaphragma Juglandis Fructus (DJF) ni tishu ya septamu inayotenganisha sehemu za kokwa ndani ya tunda la walnut na mara nyingi hubaki kama bidhaa ya pembeni. Katika utafiti huu, AED (aqueous extract of Diaphragma Juglandis Fructus), yaani ekstrakti ya maji ya septamu ya walnut iliyotayarishwa kutoka DJF kwa kutumia maji, ilichunguzwa kwa athari zake zinazohusiana na uvimbe, kizuizi cha epitheliamu ya utumbo na mabadiliko ya kimetaboliki. Utafiti huu si jaribio la matibabu ya ulcerative colitis kwa binadamu. Ni utafiti wa kabla ya kliniki unaochanganya seli za macrophage za panya RAW264.7 zilizochochewa kwa LPS, modeli ya panya ya colitis kali iliyosababishwa kwa DSS, transcriptomics, metabolomics, uchanganuzi wa mtandao, molecular docking na uigaji wa molecular dynamics.

Katika modeli ya seli, AED ilipunguza uzalishaji wa IL-6, IL-1β na TNF-α unaohusishwa na mwitikio wa uvimbe uliosababishwa na LPS; ilipunguza ongezeko la iNOS na COX-2 na kushusha viwango vya JAK1 na STAT3 vilivyofosforilishwa. Hata hivyo, watafiti hawasemi kwamba njia ya JAK1/STAT3 imethibitishwa kisababishi. Kwa kuwa utafiti huu haukufanya jaribio la uzuiaji wa JAK1/STAT3 au rescue, uhusiano uliobainika unapaswa kufasiriwa kama uhusiano unaolingana na mekanizimu, si uthibitisho wa usababishi.

Katika jaribio la panya, panya 50 madume aina ya C57BL/6 waligawanywa katika makundi matano: udhibiti wenye afya, %3 DSS, 300 mg/kg sulfasalazine, 600 mg/kg AED ya dozi ya juu na 200 mg/kg AED ya dozi ya chini. DSS ilitolewa kwenye maji ya kunywa kwa siku saba, huku AED au sulfasalazine ikitolewa mara moja kwa siku kwa oral gavage. Katika kundi la AED la dozi ya juu, iliripotiwa kupungua kwa upotevu wa uzito wa mwili, kuzuia kwa sehemu ufupishaji wa koloni, kupungua kwa uharibifu wa kihistolojia na kupungua kwa kiwango cha uelezaji wa jeni zinazohusiana na uvimbe. Pia kulionekana kuboreka kwa muundo wa rangi ya immunohistochemistry wa protini za tight junction kama ZO-1, occludin na claudin-1 ikilinganishwa na kundi la DSS.

Katika uchanganuzi wa omics, matumizi ya AED yalihusishwa na mabadiliko katika umetaboli wa taurine–hypotaurine, njia zinazohusiana na arginine, umetaboli wa lipid na michakato mingine ya kimetaboliki. Network pharmacology na modeli za kikokotozi ziliibua ACE na von Willebrand factor (VWF) kama miongoni mwa malengo yanayowezekana. Hata hivyo, ACE na VWF si mekanizimu zilizothibitishwa kwa majaribio ya biokemia ya uthibitishaji wa lengo katika utafiti huu; kama waandishi wanavyosema, ni malengo tarajiwa yanayohitaji kuthibitishwa kwa majaribio katika siku zijazo.

Kikomo muhimu zaidi cha tafsiri ya utafiti huu ni hiki: AED ilihusishwa na uboreshaji wa baadhi ya viashiria vya uvimbe, histolojia, kizuizi na umetaboli vinavyohusiana na colitis katika modeli za seli na panya; lakini matokeo haya hayathibitishi kwamba AED hutibu ulcerative colitis kwa binadamu, inaweza kuchukua nafasi ya dawa au ni salama kwa matumizi ya muda mrefu.

1. Septamu ya walnut ni nini?

Ganda gumu la walnut linapofunguliwa, kuna kizigeu chembamba cha ndani chenye umbo la utando wa mbao kinachotenganisha sehemu za kokwa. Katika fasihi ya kisayansi muundo huu huitwa Diaphragma Juglandis Fructus. DJF iliyotumika katika utafiti huu ilitokana na Juglans regia L.

Katika mnyororo wa chakula na uchakataji wa walnut, DJF mara nyingi inaweza kuchukuliwa kuwa bidhaa ya pembeni yenye thamani ndogo. Mbinu ya utafiti ilikuwa kutoa vipengele vinavyoyeyuka kwenye maji kutoka kwa bidhaa hii ya pembeni na kuchunguza sifa zake za kibaiolojia.

2. AED ni nini hasa?

AED ni kifupi cha Kiingereza cha aqueous extract of Diaphragma Juglandis Fructus. Kwa Kiswahili inaweza kuelezwa kama “ekstrakti ya maji ya DJF” au “ekstrakti ya maji ya septamu ya walnut”.

AED si molekuli moja safi ya kemikali. Ni ekstrakti changamano iliyo na zaidi ya kiambato kimoja cha kemikali kinachoyeyuka kwenye maji au kuingia kwenye suluhisho chini ya masharti ya uchimbaji. Kwa hiyo, ili kuhusisha athari ya kibaiolojia ya AED na molekuli moja, utenganishaji wa kiwanja na majaribio ya uthibitishaji wa lengo yanahitajika.

3. Ekstrakti iliandaliwa vipi?

Watafiti waligeuza 1000 g ya DJF iliyokaushwa kuwa unga laini na kutumia 10 L ya maji yaliyodistiliwa. Uwiano wa kigumu/kimiminika uliwekwa kuwa 1:10 (w/v).

1. 1000 g ya DJF iliyokaushwa ilisagwa.
2. 10 L ya maji yaliyodistiliwa yaliongezwa.
3. Suspension ilichanganywa katika 25 °C kwa 2 saa.
4. Kisha reflux extraction ilifanywa katika 100 °C kwa 1 saa.
5. Vitu visivyoyeyuka vilitenganishwa kwa vacuum filtration.
6. Filtrate ilikolezwa hadi takriban 200 mL katika 40 °C chini ya shinikizo la chini.
7. Centrifugation ilifanywa.
8. Sampuli iligandishwa haraka katika −70 °C kwa 6 saa.
9. Ilifanyiwa lyophilization katika −50 °C kwa 48 saa.
10. AED kavu ilihifadhiwa katika vyombo vya amber visivyopitisha hewa katika 4 °C.

Uzalishaji wa uchimbaji uliopatikana katika utafiti uliripotiwa kuwa takriban %9. Asilimia hii haimaanishi kwamba nyenzo yote kavu ya mwanzo ilikuwa kiwanja hai; inaonyesha tu kiasi cha ekstrakti kavu kilichopatikana baada ya taratibu zilizotumika za uchimbaji na ukaushaji.

4. Wasifu wa kemikali ulichunguzwaje?

Muundo wa kemikali wa AED ulichunguzwa kwa mbinu zinazotegemea mass spectrometry. Sehemu za mbinu na matokeo za utafiti zinataja uchanganuzi wa marker kwa UPLC-MS/MS na uchanganuzi wa wasifu wa kemikali usiolengwa kwa LC-QTOF-MS.

Katika chanzo, viwanja 31 viliwekewa alama kwa makadirio ndani ya kiwango cha uaminifu cha MSI 2–3. “Uwekaji alama wa makadirio” unapaswa kueleweka kuwa sifa za spectral za kiwanja zinaendana na utambulisho fulani wa kemikali, lakini si viwanja vyote vina kiwango sawa cha uthibitishaji wa kimuundo.

Miongoni mwa viwanja vilivyotajwa kama mifano katika chanzo ni:

• quercitrin,
• C17-sphinganine,
• 6-methoxyflavonol,
• succinic acid,
• catechin

. Orodha hii haimaanishi kwamba muundo wote wa kemikali wa AED unajumuisha molekuli hizi tano pekee.

5. Kwa nini seli RAW264.7 zilitumika?

RAW264.7 ni mstari wa seli za macrophage wenye asili ya panya. Macrophage ni seli zinazohusika katika uzalishaji na udhibiti wa ishara za uvimbe katika mfumo wa kinga.

Katika utafiti, seli RAW264.7 zilichochewa kwa lipopolysaccharide (LPS). LPS ni sehemu muhimu ya utando wa nje wa bakteria Gram-negative na hutumiwa sana katika mazingira ya maabara kusababisha mwitikio mkubwa wa uvimbe katika macrophage.

Kwa hiyo, modeli hii si “seli ya utumbo ya mgonjwa wa ulcerative colitis”. Ni modeli iliyorahisishwa ya macrophage inayotumika kuchunguza signalizeni ya uvimbe katika mazingira ya seli yanayodhibitiwa.

6. Jaribio la uhai wa seli

Seli RAW264.7 zilipandikizwa kwenye sahani zenye visima 96 kwa msongamano wa \(7 \times 10^3\) seli kwa kila kisima. Kwa AED, viwango vya 0.1, 0.5, 1, 5, 10 na 50 µg/mL vilitathminiwa kwa 24 saa.

Uhai wa seli ulitathminiwa kwa jaribio la CCK-8 na kipimo cha absorbance katika 450 nm. Maandishi makuu ya matokeo yanaripoti kwamba AED haikuonyesha cytotoxicity katika viwango vilivyo chini ya 10 µg/mL. Majaribio makuu yaliyofuata ya uvimbe yalilenga hasa viwango vya 1, 5 na 10 µg/mL.

7. Kwa nini NO, IL-6, IL-1β na TNF-α zilipimwa?

Nitric oxide (NO) ni molekuli ndogo ya ishara inayoweza kuzalishwa kwa wingi kupitia kimeng’enya iNOS wakati wa uvimbe. Katika utafiti, NO haikutathminiwa moja kwa moja kama gesi, bali kupitia nitrite kwenye supernatant ya utamaduni kwa mbinu ya Griess.

IL-6, IL-1β na TNF-α ni cytokine muhimu za mwitikio wa uvimbe. Viwango vyake kwenye supernatant ya utamaduni wa seli vilipimwa kwa ELISA.

Baada ya seli kufanyiwa matibabu ya awali kwa AED kwa 1 saa, zilichochewa kwa 100 ng/mL LPS kwa 24 saa. LPS iliongeza uzalishaji wa cytokine, huku AED ikipunguza ongezeko hilo katika utafiti wa chanzo.

8. iNOS na COX-2 ni nini?

iNOS ni inducible nitric oxide synthase. Chini ya vichocheo vya uvimbe inaweza kuchangia uzalishaji mkubwa wa NO.

COX-2 ni kimeng’enya cyclooxygenase-2 na kinaweza kuongezeka wakati wa uvimbe kwa kuhusiana na usanisi wa prostanoid.

Katika utafiti, uchanganuzi wa Western blot ulionyesha kwamba LPS iliongeza viwango vya protini iNOS na COX-2; matumizi ya AED yalipunguza ongezeko hili lililosababishwa na LPS.

9. Njia ya signalizeni ya JAK1/STAT3 ni nini?

JAK1 ni Janus kinase 1; STAT3 ni protini ya ishara inayoitwa signal transducer and activator of transcription 3. Uamilishaji wa protini za JAK unaweza kusaidia fosforilesheni ya protini fulani za STAT; protini za STAT zilizofosforilishwa zinaweza baadaye kushiriki katika michakato ya signalizeni inayodhibiti uelezaji wa jeni.

Katika utafiti, JAK1 na STAT3 jumla pamoja na aina zake zilizofosforilishwa zilichunguzwa kando. LPS iliongeza viwango vya p-JAK1 na p-STAT3, huku ongezeko la aina hiyo halikuripotiwa wazi kwa JAK1 na STAT3 jumla.

AED ilipunguza uwiano wa p-JAK1/JAK1 na p-STAT3/STAT3 ikilinganishwa na kundi la LPS. Ukandamizaji ulioonekana zaidi uliripotiwa katika chanzo karibu na 5 µg/mL.

Je, JAK1/STAT3 ndiyo sababu iliyothibitishwa ya athari ya AED kwenye colitis?

Hapana. Utafiti unaonyesha uhusiano wa kimajaribio kati ya fosforilesheni ya JAK1/STAT3 na matumizi ya AED; lakini kwa sababu watafiti hawakufanya uzuiaji maalum wa njia au majaribio ya rescue, hawakuthibitisha kwamba JAK1/STAT3 ndiyo mekanizimu ya lazima ya kisababishi ya athari ya AED. Kwa hiyo kauli sahihi ni “athari ya AED ilihusishwa na kupungua kwa signalizeni ya JAK1/STAT3”.

10. Modeli ya panya ya DSS ni nini?

Dextran sulfate sodium (DSS) ni wakala wa kemikali unaotumiwa kuunda modeli ya colitis kali kwa wanyama wa majaribio kwa kusababisha uharibifu wa epitheliamu ya koloni na uvimbe.

Modeli ya DSS haizalishi upya biolojia yote ya ulcerative colitis ya binadamu. Ni modeli ya kimajaribio inayotumika kuchunguza baadhi ya sifa za uvimbe, epitheliamu na histopatholojia za ugonjwa wa binadamu.

11. Muundo wa jaribio la panya

Jumla ya panya 50 madume aina ya C57BL/6 wenye umri wa wiki 6–8 na uzito wa 18–20 g waliingizwa katika utafiti. Panya waligawanywa kwa nasibu katika makundi matano na kila kundi lilikuwa na panya 10.

DSS ilitolewa kwenye maji ya kunywa kwa siku saba; SASP au AED ilitolewa mara moja kwa siku kwa oral gavage. Panya 10 katika kila kundi waliwekwa katika vizimba viwili tofauti, panya 5 kwa kila kizimba.

Utafiti unasema kwamba tathmini ya matokeo na uchanganuzi wa data ulifanywa kwa kiwango kikubwa iwezekanavyo bila kujua mgawanyo wa makundi. Hakukuwa na tukio lisilotarajiwa la madhara wakati wa jaribio, na hakuna mnyama aliyehitaji euthanasia ya mapema.

12. DAI ni nini?

Disease Activity Index (DAI) ni mbinu ya tathmini inayotumia kwa pamoja viashiria kama upotevu wa uzito wa mwili, uthabiti wa kinyesi na damu kwenye kinyesi ili kufuatilia ukali wa ugonjwa katika jaribio la colitis ya DSS.

Katika chanzo, upotevu wa uzito wa mwili ulipewa alama kama ifuatavyo:

• 0: hakuna upotevu,
• 1: %1–5,
• 2: %5–10,
• 3: %10–20,
• 4: zaidi ya %20.

Uthabiti wa kinyesi:

• 0: kawaida,
• 1: laini,
• 2: kuharisha.

Damu kwenye kinyesi:

• 0: hakuna,
• 1: kiwango cha athari ndogo,
• 2: wastani,
• 3: kali.

Hata hivyo, kuna jambo muhimu sana la kimajaribio hapa. Ingawa uzito wa mwili ulipimwa kwa kila panya mmoja mmoja, uthabiti wa kinyesi na damu kwenye kinyesi vilitathminiwa katika kiwango cha kizimba kwa sababu kinyesi hakikuweza kuhusishwa na panya mmoja mmoja. Kwa hiyo, katika uchanganuzi wa DAI kitengo cha majaribio si panya bali kizimba, na kuna tu n = 2 vizimba kwa kila kundi.

Maelezo ya Kielelezo 2 katika chanzo yanawasilisha matokeo ya DAI kama “descriptive”, yaani ya kimaelezo. Kwa hiyo si sahihi kutafsiri mkunjo wa DAI kama ushahidi thabiti wa takwimu wa kila mnyama mmoja mmoja.

13. Nini kilibainika kwa panya?

Katika kundi la DSS, upotevu unaoendelea wa uzito wa mwili ulionekana katika kipindi chote cha jaribio. Matumizi ya AED na sulfasalazine yalihusishwa katika utafiti wa chanzo na kupungua kwa upotevu wa uzito kutoka siku ya 4 hadi siku ya 7.

DSS pia ilisababisha kufupika kwa koloni. Katika makundi ya matibabu, kufupika kwa koloni kulizuiliwa kwa sehemu na ulinzi ulioonekana zaidi uliripotiwa katika kundi la AED la dozi ya 600 mg/kg.

Katika tathmini ya histolojia, edema ya mucosa, kuvurugika kwa usanifu wa crypt na infiltration ya seli za uvimbe vilionekana katika kundi la DSS. Katika makundi ya AED na sulfasalazine, infiltration ya uvimbe ilipungua na muundo wa mucosa uliripotiwa kuhifadhiwa vizuri zaidi kuliko katika kundi la DSS.

Kwa kuwa matokeo haya ya histolojia yanategemea picha halisi za tishu, “picha ya histolojia” bandia haikuundwa ndani ya Verianla.

14. Jeni za uvimbe katika tishu ya koloni

Viwango vya mRNA vya iNOS, IL-6, IL-1β na TNF-α katika tishu ya koloni vilipimwa kwa RT-qPCR. DSS iliongeza viwango vya transcript hizi nne ikilinganishwa na kundi la udhibiti.

Matumizi ya SASP na AED yalipunguza ongezeko lililosababishwa na DSS; chanzo kinaripoti kuwa ukandamizaji ulioonekana zaidi ulikuwa katika kundi la AED la dozi ya juu.

RT-qPCR hupima kiwango cha mRNA cha jeni. Kupungua kwa mRNA hakuhakikishi peke yake kwamba protini inayohusika pia itapungua kwa uwiano sawa; michakato kama udhibiti baada ya transcription na uharibifu wa protini pia inaweza kuathiri matokeo.

15. Kwa nini ZO-1, occludin na claudin-1 ni muhimu?

Tight junctions kati ya seli za epitheliamu ya utumbo ni sehemu muhimu za muundo wa kizuizi unaopunguza upitaji kati ya seli.

Katika utafiti, protini tatu za junction zilitathminiwa kwa immunohistochemistry:

• ZO-1: protini ya adaptor inayohusika katika upangaji wa junction complex pamoja na cytoskeleton ya ndani ya seli na protini za utando,
• Occludin: mojawapo ya vipengele vya transmembrane vya tight junction,
• Claudin-1: protini ya familia ya claudin inayochangia uamuzi wa sifa za kizuizi cha paracellular.

Ikilinganishwa na kundi la DSS, ongezeko la nguvu na mwendelezo wa rangi katika maeneo ya junction liliripotiwa katika makundi ya SASP na AED.

Kuna kikomo muhimu cha kipimo hapa: ingawa chanzo kinawasilisha tathmini za wastani wa optical density kutoka picha za immunohistochemistry, kinaeleza wazi kwamba hakikutumia vipimo hivyo kama kipimo cha moja kwa moja cha mkusanyiko kamili wa protini. Kwa hiyo, haiwezekani kuhitimisha kwamba “kiasi cha protini kiliongezeka kwa kiasi fulani mahsusi”.

Je, athari ya AED katika utafiti huu ni uthibitisho wa matibabu ya ulcerative colitis kwa binadamu?

Hapana. Utafiti unatoa ushahidi wa kabla ya kliniki kutoka kwa seli RAW264.7 na modeli ya panya ya colitis iliyosababishwa na DSS. Mwitikio wa kliniki, kiwango cha remission, dozi salama, mwingiliano wa dawa, bioavailability ya njia ya chakula au usalama wa muda mrefu haukutathminiwa kwa wagonjwa wa binadamu. Matokeo hayawezi kuhamishwa moja kwa moja kuwa matibabu ya binadamu.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

16. Uchanganuzi wa transcriptomics

RNA ilitenganishwa kutoka tishu ya distal colon, na ubora wa RNA ulithibitishwa katika kiwango cha A260/280 = 1.9–2.1. Maktaba za Poly(A)+ zilitayarishwa na paired-end sequencing ya base pair 150 ilifanywa kwenye jukwaa la Illumina NovaSeq.

Sequencing reads zilipitishwa kwenye kichujio cha ubora na kuoanisha na genome ya panya GRCm39, toleo la Ensembl 104 kwa STAR v2.7.10a.

Hesabu za jeni zilitengenezwa kwa featureCounts v2.0.3, na differential gene expression ilichanganuliwa kwa DESeq2.

17. Log2 fold change ni nini?

Fold change huonyesha uwiano wa uelezaji wa jeni kati ya hali mbili. Uwasilishaji wa logarithmic hasa huruhusu ongezeko na upungufu kulinganishwa kwa kiwango kilichosawazishwa zaidi.

Kwa mfano:

• log2 FC = +1 → takriban ongezeko mara 2,
• log2 FC = −1 → takriban kupungua hadi nusu,
• log2 FC = 0 → hakuna mabadiliko katika uwiano

ndivyo inavyomaanisha.

Katika sehemu ya mbinu ya chanzo, kwa jeni zilizoelezwa tofauti, vigezo vifuatavyo vilitolewa:

\[ |\log_2 FC| \geq 1.5 \]

na

\[ p_{\mathrm{adjusted}} < 0.05 \]

.

Hata hivyo, katika maelezo ya Kielelezo 5 cha chanzo, ufafanuzi wa DEG umeandikwa kama |\(\log_2\)(fold change)| ≥ 1.0 na adjusted p < 0.05. Vigezo hivi viwili vinatofautiana ndani ya chanzo. Verianla haibadilishi tofauti hii kimyakimya kuwa thamani moja.

18. Kwa nini adjusted p value na FDR hutumiwa?

Wakati maelfu ya jeni yanajaribiwa kwa wakati mmoja, kutumia p < 0.05 pekee kunaweza kutoa jeni nyingi zinazoonekana kuwa muhimu kwa bahati. Kwa hiyo, watafiti walidhibiti kiwango cha ugunduzi wa uongo, yaani false discovery rate (FDR), kwa mbinu ya Benjamini–Hochberg.

Katika chanzo, FDR < 0.05 ilitumika kwa differential gene analysis na q < 0.05 kwa functional enrichment analyses.

Chanzo pia kinatoa %95 confidence interval ya log2 fold change kwa muundo ufuatao:

\[ 95\%\,GA = \log_2 FC \pm 1.96 \times SE \]

Hapa SE ni standard error. Kigezo cha 1.96 hutumiwa kuunda takriban %95 two-sided confidence interval chini ya normal approximation iliyotumika.

19. Matokeo ya transcriptomics

Mfiduo wa DSS ulihusishwa na jumla ya jeni 125 zilizoelezwa tofauti ikilinganishwa na kundi la udhibiti:

• jeni 51 ziliongezwa uelezaji,
• jeni 74 zilipunguzwa uelezaji.

Katika ulinganisho mwingine wa transcriptomics unaohusiana na HAED, jumla ya 563 DEG ziliripotiwa:

• 294 ziliongezwa uelezaji,
• 269 zilipunguzwa uelezaji.

Kwa kuwa namna maandishi ya chanzo yanavyoeleza kundi la rejea la ulinganisho huu wa pili na uwasilishaji wa “subsequent AED treatment” katika Kielelezo 5 havijawekwa chini ya lebo moja iliyo wazi kabisa, Verianla haiweki upya idadi ya 563 kwa jina mahususi la ulinganisho ambalo halipo kwenye chanzo.

Functional enrichment analyses ziliibua mada zinazohusiana na uvimbe, extracellular matrix na michakato ya usafirishaji. Mabadiliko katika transcript zinazohusiana na matrix remodeling kama LOX, P4HA1, MMP2 na MMP9 yaliripotiwa.

20. Malengo tarajiwa yalibainishwaje?

Watafiti waliunganisha matokeo ya transcriptomics na makadirio ya malengo ya molekuli ndogo zilizobainishwa katika AED.

Hifadhidata za PharmMapper, SwissTargetPrediction na SEA zilitumika; malengo yaliyoungwa mkono na angalau vyanzo viwili vya utabiri yalihifadhiwa.

Katika ujumuishaji huu, jeni 553 zinazokadiriwa kuingiliana na AED zilibainishwa na 22 kati yake ziliingiliana na seti ya DEG iliyoongezwa uelezaji inayohusiana na AED.

Katika uchanganuzi wa protein–protein interaction network, ACE, APOB, IGF1 na VWF zilikuwa miongoni mwa nodi zenye muunganisho mkubwa.

Hata hivyo, kuwa “na muunganisho mkubwa kwenye mtandao” hakuthibitishi kwamba molekuli hiyo ndiyo lengo la lazima linalobeba athari ya kibaiolojia ya AED.

21. ACE na VWF zina maana gani?

ACE, angiotensin-converting enzyme, ni kimeng’enya kinachohusika katika uchakataji wa peptidi mbalimbali.

VWF, von Willebrand factor, ni glycoprotein kubwa inayohusiana hasa na hemostasis na biolojia ya mishipa.

Katika utafiti huu, ACE na VWF hazijathibitishwa kwa majaribio ya moja kwa moja ya biokemia ya uthibitishaji wa lengo. Zilichaguliwa kama malengo tarajiwa yanayohitaji kuchunguzwa zaidi kutokana na uchanganuzi wa mtandao, utabiri wa lengo unaotegemea fasihi na molecular docking.

22. Molecular docking ilifanywaje?

Kwa ACE, muundo wa kioo PDB: 3L3N, na kwa VWF, PDB: 3HXQ ulitumika. Miundo ya protini ilitayarishwa kwa UCSF Chimera v1.17; vipengele visivyo vya protini viliondolewa na hidrojeni zikaongezwa.

Miundo ya ligand ilichukuliwa kutoka PubChem, ikawekwa sawa kwa MMFF94 na kubadilishwa kuwa fomati ya PDBQT kwa Open Babel v3.1.1.

Docking ilifanywa kwa AutoDock 4.2.6. Kwa kila ligand, mizunguko 50 ya docking ilifanywa kwa kutumia Lamarckian Genetic Algorithm, na konformeshoni yenye nishati ya kufungamana iliyokadiriwa kuwa ya chini zaidi ilichaguliwa kwa uchanganuzi wa mwingiliano.

Kwa baadhi ya jozi za ligand–lengo, docking score iliyokokotolewa iliripotiwa kuwa chini ya −10 kcal/mol.

Lancerotoxin A na C17-Sphinganine zilichaguliwa kama viwanja wakilishi kwa uonyeshaji wa kina wa mwingiliano wao na ACE.

Docking score si experimental binding constant. Score iliyo hasi zaidi inaonyesha kwamba modeli iliyotumika ilikadiria pose iliyo nafuu zaidi katika energy function yake; haiwezi kuthibitisha peke yake kufungamana halisi ndani ya seli.

23. Uigaji wa molecular dynamics

Uigaji wa molecular dynamics ulifanywa kwa kutumia GROMACS v2023.2.

RMSD husaidia kutathmini kupotoka kwa jumla kwa jiometri ya muundo kutoka konformeshoni ya rejea.

RMSF hutathmini jinsi mabaki binafsi ya amino asidi yanavyosogea wakati wote wa uigaji.

Rg au radius of gyration ni kipimo kinachohusiana na jinsi muundo wa molekuli ulivyo kompakt kuhusiana na kituo chake cha uzito.

Hydrogen bond occupancy huonyesha ni sehemu gani ya trajectory inayokidhi kigezo fulani cha hydrogen bond.

Kompleksi za ACE–Lancerotoxin A na ACE–C17-Sphinganine zilibaki kuhusiana na ACE katika uigaji wa 200 ns. Chanzo kinaripoti kwamba kompleksi ya Lancerotoxin A ilionyesha mabadiliko madogo ya kimuundo na hydrogen bonds zilizodumu zaidi ikilinganishwa na kompleksi ya C17-Sphinganine.

Hii haimaanishi kwamba Lancerotoxin A imehakikishwa kuzuia ACE katika kiumbe hai. Inaeleza tabia ya molekuli iliyokokotolewa chini ya miundo ya kuanzia na force field ya uigaji.

24. MM/PBSA na alanine scanning

Katika chanzo, mbinu ya MM/PBSA ilitumika kutathmini vipengele vya nishati vya kikokotozi vya mwingiliano wa ligand–protini kutoka trajectories za molecular dynamics.

Kifupi MM/PBSA kwa ujumla humaanisha mbinu ya Molecular Mechanics / Poisson–Boltzmann Surface Area.

Katika alanine scanning ya kikokotozi, minyororo ya upande ya baadhi ya amino asidi hubadilishwa kuwa alanine ndani ya modeli na mabadiliko yaliyokadiriwa ya nishati ya kufungamana huchunguzwa. Lengo ni kubaini mabaki ya “hot-spot” ambayo yanaweza kuchangia zaidi katika kufungamana.

Katika chanzo, mabaki ya pamoja ya hot-spot yanayotarajiwa kwa kompleksi mbili yaliripotiwa kuwa:

• Trp357,
• Ser355,
• Val518,
• Glu143

. Miongoni mwa haya, Trp357 iliripotiwa kuonyesha athari kubwa zaidi iliyokadiriwa ya kupunguza uthabiti baada ya alanine substitution.

Kwa kuwa mabaki haya hayajathibitishwa kwa experimental mutagenesis, hayapaswi kuwasilishwa kama “sehemu mahususi za kufungamana za ACE kwa AED”.

25. Uchanganuzi wa metabolomics

Untargeted LC-MS metabolomics ilifanywa kwenye sampuli za koloni. Sampuli za quality control zilidungwa kwa vipindi vya kawaida; vipengele vyenye QC relative standard deviation zaidi ya %30 au vilivyobainishwa katika sampuli za blank viliondolewa.

Data:

1. ilinormalishwa,
2. ikafanyiwa mabadiliko ya \(\log_2\),
3. Pareto scaling ikatumika.

Katika chanzo, mbinu ya q < 0.05 iliyosahihishwa kwa FDR inaelezwa kwa uteuzi wa differential metabolites, huku katika sehemu ya matokeo seti ya metabolite 39 pia ikiripotiwa kwa vigezo vya VIP > 1 na p < 0.05.

26. Tofauti kati ya PCA na PLS-DA

PCA, principal component analysis, ni mbinu isiyosimamiwa ya kupunguza vipimo inayofupisha mielekeo mikubwa ya utofauti katika data bila kulazimisha matumizi ya lebo za makundi.

PLS-DA, partial least squares discriminant analysis, ni mbinu inayosimamiwa inayotumia lebo za madaraja zinazojulikana kusisitiza utengano kati ya makundi.

Katika utafiti, kwenye mchoro wa PCA makundi ya DSS na udhibiti yalitengana; kundi la AED lilionyesha nafasi ya kati ya makundi hayo mawili. PLS-DA pia ilitenganisha wasifu wa kimetaboliki wa DSS na udhibiti.

Kwa sababu PLS-DA ni mbinu inayosimamiwa, kuonekana kwa utengano mzuri kwenye modeli hakumaanishi peke yake uhakika wa kibaiolojia. Kwa hiyo chanzo kinasema kwamba uthabiti wa modeli ulitathminiwa kwa cross-validation na permutation test.

27. Matokeo ya metabolomics

Jumla ya metabolite 39 zilikidhi vigezo vya uchunguzi na 36 kati yake zilionyesha muundo wa mwelekeo wa “chini–juu–chini” au “juu–chini–juu” katika mpangilio wa Udhibiti–DSS–AED.

Miongoni mwa njia zilizojitokeza katika KEGG enrichment analysis ni:

• umetaboli wa taurine–hypotaurine,
• umetaboli wa arginine–proline,
• biosynthesis ya steroid hormones,
• umetaboli wa glutathione,
• umetaboli wa nitrojeni

.

Hypotaurine ilipungua katika kundi la DSS na kuongezeka baada ya AED. Kuongezeka kwa spermine kulikoonekana katika kundi la DSS kulipungua katika kundi la AED.

Mabadiliko ya mwelekeo yanayohusiana na AED pia yaliripotiwa katika ether glycerophospholipids mbalimbali, aina za LPI/LPC, phytosphingosine, derivatives za eicosanoid na steroid hormones.

Matokeo haya yanaonyesha kwamba njia za kimetaboliki zinahusishwa na athari ya AED; hayathibitishi peke yake kwamba metabolite fulani ndiyo sababu ya athari ya kinga ya AED.

28. Mtandao wa korelesheni ya jeni–metabolite

Katika utafiti, mtandao wa korelesheni wa sehemu mbili usio na mwelekeo uliundwa ili kuhusisha data za transcriptome na metabolome za kundi la DSS.

Ili kuunda edge kati ya jeni na metabolite:

\[ |\rho| > 0.7 \]

na

\[ p < 0.05 \]

vigezo vilitumika.

Hapa \(\rho\) ni Spearman rank correlation coefficient.

Mtandao ulioundwa ulikuwa na:

• nodi 48,
• edges 63

na %65 ya miunganisho ilikuwa korelesheni chanya.

29. Hub centrality score

Katika chanzo, centrality ya nodi iliunganishwa kwa formula ifuatayo:

\[ H=C_D+C_B \]

Hapa:

• \(H\): combined hub centrality score,
• \(C_D\): degree centrality,
• \(C_B\): betweenness centrality

zimefafanuliwa.

Degree centrality inahusiana na idadi ya miunganisho imara ya nodi kwenye mtandao; betweenness centrality inahusiana na kiwango ambacho nodi iko kama kiunganishi cha kati kwenye njia kati ya nodi nyingine.

Nodi zenye thamani za \(H\) zilizo juu ya mpaka wa percentile wa %70 wa nodi zote zilifafanuliwa kama “hub”.

L-hydroxyproline na dehydroepiandrosterone (DHEA) ziliripotiwa kama metabolic hubs muhimu; Creb3l3 kama nodi ya jeni yenye centrality kubwa zaidi.

Centrality haimaanishi ulazima wa kibaiolojia. Nodi ya mtandao kuwa na centrality kubwa haithibitishi peke yake kwamba ndiyo sababu ya moja kwa moja ya ugonjwa au lengo la matibabu.

30. Uchanganuzi wa multi-omics unaotegemea SVD

Watafiti walitumia singular value decomposition (SVD) kuchunguza mifumo ya pamoja ya utofauti wa kiwango cha juu kati ya transcriptome na metabolome.

Kwa metabolite 50 za kwanza zilizochaguliwa kutoka metabolome kulingana na VIP score:

\[ \log_2(x+1) \]

transformation ilitumika.

Lengo la kihisabati la kuongeza \(+1\) ni kuzuia logarithm kutokuwa na maana kwa thamani za sifuri.

Sifa za metabolite kisha zilinormalishwa kwa z-score kwa kila sifa. Vivyo hivyo, DEG 50 za kwanza zilizochaguliwa kutoka transcriptome zilinormalishwa.

Kila moja ya matrix mbili ilikuwa na ukubwa wa:

\[ 5\ \text{örnek} \times 50\ \text{özellik} \]

.

Ziliunganishwa kwa mlalo kuunda:

\[ 5 \times 100 \]

integrated matrix.

Uwakilishi wa kihisabati wa kufundishia wa SVD ya kawaida si matokeo mapya ya utafiti bali msingi wa mbinu:

\[ X \approx U\Sigma V^T \]

Hapa \(X\) inawakilisha integrated data matrix, \(U\) components katika sample space, \(\Sigma\) singular values na \(V^T\) miundo ya mchango wa vipengele kwenye components.

Katika utafiti, kwa scikit-learn TruncatedSVD:

• n_components = 3,
• random_state = 42

ilitumika.

Factor 2 ilieleza %48.7 ya utofauti wote. Slc9a3 (NHE3) na Retnlb zilionyesha loading values za juu na kubadilika pamoja na long-chain polyunsaturated fatty acids, ikiwemo DHA.

Kwa kuwa integrated matrix ya uchanganuzi huu wa SVD ilitegemea sampuli tano tu, matokeo yanapaswa kufasiriwa si kama modeli ya idadi kubwa ya watu bali kama muundo wa pamoja wa utofauti wa uchunguzi.

31. Uchanganuzi wa takwimu

Uchanganuzi mkuu wa takwimu ulifanywa kwa GraphPad Prism 9.5.1.

Katika chanzo, zilitumika:

• jaribio la Shapiro–Wilk kwa ukaguzi wa normal distribution,
• jaribio la Levene kwa homogeneity ya variance,
• one-way ANOVA kwa ulinganisho wa makundi mengi,
• Tukey post hoc test katika homogeneous variance,
• Dunnett T3 test katika unequal variance,
• two-way repeated-measures ANOVA katika tathmini ya uzito wa mwili yenye kipengele cha muda

.

Kiwango cha umuhimu cha pande mbili kiliwekwa kuwa p < 0.05.

Ingawa sehemu ya mbinu pia inataja repeated-measures ANOVA kwa DAI, kwa sababu kitengo cha majaribio ni kizimba na kuna tu n = 2 vizimba/kundi, Kielelezo 2 cha chanzo kinawasilisha DAI kama ya kimaelezo. Kwa hiyo, katika tathmini ya Verianla hakuna dai kali la inferential kwa DAI.

32. Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• AED inahusishwa na kupungua kwa uzalishaji wa cytokine za pro-inflammatory katika seli RAW264.7 zilizochochewa kwa LPS.
• AED inahusishwa na kupungua kwa ongezeko la iNOS na COX-2 katika modeli ya seli.
• AED inahusishwa na kupungua kwa uwiano wa p-JAK1/JAK1 na p-STAT3/STAT3.
• 600 na 200 mg/kg AED zilihusishwa na uboreshaji wa baadhi ya viashiria vya kliniki na histolojia vinavyohusiana na colitis katika modeli ya panya ya DSS.
• Katika kundi la AED la dozi ya juu, urefu wa koloni uliripotiwa kuhifadhiwa vizuri zaidi kuliko katika kundi la DSS.
• Ongezeko la mRNA ya iNOS, IL-6, IL-1β na TNF-α katika tishu ya koloni lilipungua kwa AED.
• Uboreshaji ulionekana katika muundo wa immunohistochemistry wa ZO-1, occludin na claudin-1 katika maeneo ya junction.
• Matokeo ya transcriptomics na metabolomics yalionyesha kwamba matumizi ya AED yaliambatana na mabadiliko yanayohusiana na njia za uvimbe, usafirishaji na kimetaboliki.
• Njia za kimetaboliki za taurine–hypotaurine na zinazohusiana na arginine ziliibuka kama maeneo muhimu ya mekanizimu tarajiwa.
• ACE na VWF zilitambuliwa kama malengo tarajiwa kwa uchanganuzi wa kikokotozi.
• Lancerotoxin A na C17-Sphinganine zilichunguzwa kwa kina kwa mbinu za kikokotozi kuhusu mwingiliano wao unaowezekana na ACE.

33. Matokeo yasiyoungwa mkono na utafiti

• Haijaonyeshwa kwamba AED hutibu ulcerative colitis kwa binadamu.
• Haijaonyeshwa kwamba AED inaweza kutumika badala ya dawa za kuandikiwa.
• Haiwezi kusemwa kwamba dozi za panya za 200 au 600 mg/kg ni dozi za binadamu.
• Haijathibitishwa kwamba njia ya JAK1/STAT3 ndiyo mekanizimu ya moja kwa moja ya kisababishi ya athari ya AED.
• Haijathibitishwa kwamba ACE au VWF ni lengo la moja kwa moja la kibaiolojia lililothibitishwa la AED.
• Matokeo ya docking au MD hayathibitishi peke yake kufungamana halisi ndani ya seli.
• Korelesheni za metabolomics hazithibitishi kwamba metabolite ndiyo sababu ya moja kwa moja ya athari ya kinga.
• Utafiti haukufanya sequencing ya microbiota ya utumbo moja kwa moja.
• Intestinal permeability haikupimwa kwa jaribio la moja kwa moja la functional permeability.
• Kwa kuwa panya madume pekee walitumiwa, tofauti za kibaiolojia za jinsia ya kike/kiume hazikutathminiwa.
• Matumizi ya muda mrefu na toxicity havikutathminiwa.
• Bioavailability na pharmacokinetics kwa binadamu havikupimwa.

34. Nguvu ya kisayansi ya utafiti

Mojawapo ya nguvu muhimu za utafiti ni kwamba haukutegemea kipimo kimoja cha kibaiolojia. Utamaduni wa seli, fenotipu ya mnyama, histolojia, uelezaji wa jeni, immunohistochemistry, transcriptomics, metabolomics, uchanganuzi wa mtandao na uchanganuzi wa muundo wa kikokotozi vilishughulikiwa ndani ya mfumo mmoja wa utafiti.

Mbinu hii ya tabaka nyingi husaidia kuona kama jambo moja la kibaiolojia linaungwa mkono katika viwango tofauti vya kipimo.

Hata hivyo, tabaka tofauti za data kuonekana katika mwelekeo mmoja hakutengenezi usababishi moja kwa moja. Hasa kwa matokeo ya njia, metabolite na malengo tarajiwa, majaribio ya functional intervention yanahitajika.

35. Nini kinahitajika katika tafiti zijazo?

Waandishi wanapendekeza kutumia modeli zenye maana zaidi ya kliniki katika siku zijazo. Mifano iliyotolewa ni humanized animal models na intestinal organoids.

Zaidi ya hayo, zitahitajika:

• majaribio ya inhibition/rescue kwa JAK1/STAT3 na njia nyingine tarajiwa,
• uthibitishaji wa moja kwa moja wa lengo kwa ACE na VWF,
• utenganishaji wa viwanja hai,
• tathmini ya matumizi ya muda mrefu na usalama,
• uchunguzi wa tabia ndani ya food matrix,
• tafiti za pharmacokinetics na bioavailability kabla ya kuhamia kwa binadamu,
• tafiti za kliniki zinazofaa

.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Kichwa asili: Walnut Septum-Derived Aqueous Extract Alleviates Colitis Through Modulation of Gut Metabolism and Inflammatory Signaling

Waandishi: Beier Jiang, Yu Wan, Lina Liu, Jiajun Cheng, Tianjiao Min, Xinlong Gao, Zicheng Yu, Li Ma na Ying He.

Mchango sawa: Beier Jiang na Yu Wan.

Waandishi wa mawasiliano: Li Ma na Ying He.

Taasisi: Navy Medical Centre, Naval Medical University, Shanghai 200433, China; College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China.

Jarida: Foods.

Mchapishaji: MDPI.

Rekodi ya bibliografia: Foods 2026, 15(11), 1866.

DOI: 10.3390/foods15111866.

Tarehe ya kuwasilisha: 10 Machi 2026.

Tarehe ya marekebisho: 30 Aprili 2026.

Tarehe ya kukubaliwa: 18 Mei 2026.

Tarehe ya kuchapishwa: 25 Mei 2026.

Kiungo rasmi: https://doi.org/10.3390/foods15111866

Aina ya chanzo: Makala asili ya utafiti iliyochapishwa katika jarida la kisayansi lililopitiwa na wenzao; utafiti wa kabla ya kliniki unaochanganya uchanganuzi wa seli, wanyama na ukokotozi.

Hali ya preprint: Chanzo kilichotolewa ni makala iliyochapishwa ya Version of Record. Hakuna toleo tofauti la preprint lililotajwa ndani ya PDF ya chanzo.

Leseni: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Ufadhili: National Natural Science Foundation of China, nambari ya mradi 82504587.

Idhini ya kimaadili: Majaribio ya wanyama yaliidhinishwa na PLA Naval Medical Center Animal Experiments Committee. Nambari ya idhini ni 2025H007.

Mshiriki wa binadamu: Hakuna; informed consent haitumiki.

Upatikanaji wa data: Waandishi wamesema kwamba michango asili inapatikana ndani ya makala na nyenzo za ziada, na maombi ya taarifa zaidi yanaweza kuelekezwa kwa waandishi wa mawasiliano.

Mgongano wa maslahi: Waandishi hawakuripoti mgongano wa maslahi.

Michango ya waandishi: Beier Jiang, Ying He na Lina Liu walichangia uundaji wa dhana na muundo wa utafiti; Yu Wan na Jiajun Cheng katika uchanganuzi na tafsiri ya data za majaribio; Tianjiao Min, Zicheng Yu na Xinlong Gao katika majaribio ya kibaiolojia na uchanganuzi wa data. Beier Jiang na Yu Wan waliandika rasimu ya kwanza; Li Ma na Ying He walifanya mapitio muhimu ya kisayansi ya maudhui.

Kauli muhimu ya modeli ndani ya chanzo: Katika muhtasari wa makala, kauli ya 10 µg/mL AED inaonekana kimakosa ndani ya sentensi ya modeli ya panya ya DSS. Sehemu za mbinu na matokeo zinaonyesha wazi kwamba kiwango cha 10 µg/mL kinahusu jaribio la seli RAW264.7; dozi za panya ni 200 na 600 mg/kg. Katika maelezo ya Verianla, mpangilio wa majaribio katika sehemu za mbinu na matokeo ndio uliotumika kama msingi.

Maelezo ya kigezo cha transcriptomics: Katika sehemu ya mbinu kigezo cha DEG kimeandikwa kama |log2 FC| ≥ 1.5 na adjusted p < 0.05, huku katika maelezo ya Kielelezo 5 kikiwa |log2(fold change)| ≥ 1.0 na adjusted p < 0.05. Tofauti hii ya ndani ya chanzo haijaonyeshwa kana kwamba imetatuliwa.

Maelezo ya DAI: Kwa sababu uthabiti wa kinyesi na damu kwenye kinyesi havikuweza kuhusishwa na kila mnyama mmoja mmoja, kitengo cha majaribio cha DAI ni kizimba na kuna vizimba viwili tu kwa kila kundi. Maelezo ya Kielelezo 2 cha chanzo yanawasilisha DAI kwa njia ya kimaelezo.

Maelezo ya protini za tight junction: ZO-1, occludin na claudin-1 zilitathminiwa kwa immunohistochemistry na kulikuwa na ulinganisho wa mean optical density kwenye picha. Hata hivyo, waandishi wa chanzo wanasisitiza kwamba absolute protein expression haikupimwa kwa kiasi. Kwa hiyo, matokeo ya IHC hayajawasilishwa moja kwa moja kama kiasi kamili cha protini.

Maelezo ya usababishi: Kwa kuwa uzuiaji wa njia ya JAK1/STAT3 au jaribio la rescue halikufanywa, haijaonyeshwa kwamba njia hii ndiyo sababu ya moja kwa moja ya athari ya AED. Uhusiano wa transcriptome–metabolome pia hauwezi kuthibitisha peke yake mhimili wa kisababishi wa metabolism–JAK1/STAT3–barrier.

Maelezo ya ACE/VWF: ACE na VWF ni malengo ya awali ya kuteuliwa yaliyotokana na uchanganuzi wa mtandao na computational screening. Hakukuwa na experimental functional target validation.

Maelezo ya ulinganifu wa marejeo ya chanzo: Katika sehemu ya majadiliano ya PDF, vichwa vya bibliografia vya baadhi ya marejeo yenye nambari havilingani kwa namna inayoonekana na sentensi zinazozunguka. Kwa mfano, rekodi 53 inahusu cerebral palsy, rekodi 54 inahusu upasuaji wa transposition of the great arteries. Maandishi ya Verianla hayajazalisha dai jipya la mekanizimu kwa kutegemea kutolingana huku kwa bibliografia.