Diaphragma Juglandis Fructus (DJF), qoz meyvəsinin daxilində ləpə bölmələrini bir-birindən ayıran və çox vaxt yan məhsul kimi qalan septum toxumasıdır. Bu tədqiqatda DJF-dən su ilə hazırlanmış AED (aqueous extract of Diaphragma Juglandis Fructus), yəni qoz septumunun sulu ekstraktı; iltihab, bağırsaq epitel baryeri və metabolik dəyişikliklərlə əlaqəli təsirləri baxımından araşdırılmışdır. Tədqiqat insanlarda aparılmış xoralı kolit müalicə sınağı deyil. Tədqiqat; LPS ilə stimullaşdırılmış RAW264.7 siçan makrofaq hüceyrələrini, DSS ilə yaradılmış kəskin kolit siçan modelini, transkriptomikanı, metabolomikanı, şəbəkə analizini, molekulyar docking və molekulyar dinamika simulyasiyalarını birləşdirən preklinik araşdırmadır.

Hüceyrə modelində AED, LPS-in yaratdığı iltihabi cavabla əlaqəli IL-6, IL-1β və TNF-α istehsalını azaltmış; iNOS və COX-2 artımını zəiflətmiş və fosforilləşmiş JAK1 ilə STAT3 səviyyələrini aşağı salmışdır. Bununla belə, tədqiqatçılar JAK1/STAT3 yolunun səbəb-nəticə baxımından sübut edildiyini demirlər. Bu tədqiqatda JAK1/STAT3 inhibisiyası və ya rescue təcrübəsi aparılmadığı üçün müşahidə olunan əlaqə səbəbiyyət deyil, mexanizmlə uyğun əlaqə kimi şərh edilməlidir.

Siçan təcrübəsində 50 erkək C57BL/6 siçan beş qrupa bölünmüşdür: sağlam nəzarət, %3 DSS, 300 mg/kg sulfasalazin, 600 mg/kg yüksək doza AED və 200 mg/kg aşağı doza AED. DSS yeddi gün ərzində içməli suya verilmiş, AED və ya sulfasalazin isə gündə bir dəfə oral qavajla tətbiq edilmişdir. Yüksək doza AED qrupunda bədən çəkisi itkisinin azalması, kolonun qısalmasının qismən qarşısının alınması, histoloji zədənin yüngülləşməsi və iltihabla əlaqəli genlərin daha aşağı səviyyədə ifadə olunması bildirilmişdir. ZO-1, occludin və claudin-1 kimi sıx birləşmə zülallarının immunohistokimyəvi boyanma nümunəsində də DSS qrupu ilə müqayisədə yaxşılaşma müşahidə edilmişdir.

Omik analizlərdə AED tətbiqi; taurin–hipotaurin metabolizması, argininlə əlaqəli yollar, lipid metabolizması və digər metabolik proseslərdə dəyişikliklərlə əlaqələndirilmişdir. Şəbəkə farmakologiyası və hesablama modelləşdirməsi ACE ilə von Willebrand faktorunu (VWF) mümkün hədəflər sırasında önə çıxarmışdır. Lakin ACE və VWF bu tədqiqatda biokimyəvi hədəf doğrulama təcrübələri ilə sübut edilmiş mexanizmlər deyil; müəlliflərin də qeyd etdiyi kimi, gələcəkdə eksperimental olaraq doğrulanmalı namizəd hədəflərdir.

Tədqiqatın ən mühüm şərh sərhədi budur: AED hüceyrə və siçan modellərində kolitlə əlaqəli bəzi iltihabi, histoloji, baryer və metabolik göstəricilərdə yaxşılaşma ilə əlaqəli tapılmışdır; lakin bu nəticələr AED-nin insanlarda xoralı koliti müalicə etdiyini, dərmanları əvəz edə biləcəyini və ya uzunmüddətli istifadəsinin təhlükəsiz olduğunu sübut etmir.

1. Qoz septumu nədir?

Qoz meyvəsinin sərt qabığı açıldıqda ləpənin paylarını bir-birindən ayıran nazik, odunsu pərdəvari daxili arakəsmə görünür. Elmi ədəbiyyatda bu struktur Diaphragma Juglandis Fructus adlandırılır. Tədqiqatda istifadə olunan DJF Juglans regia L. mənşəlidir.

DJF qida və qoz emalı zəncirində çox vaxt aşağı dəyərli yan məhsul kimi qiymətləndirilə bilər. Tədqiqatın yanaşması bu yan məhsuldan suda həll olan komponentləri çıxarıb onların bioloji xüsusiyyətlərini araşdırmaqdır.

2. AED dəqiq olaraq nədir?

AED, ingiliscə aqueous extract of Diaphragma Juglandis Fructus ifadəsinin qısaltmasıdır. Azərbaycanca “DJF sulu ekstraktı” və ya “qoz septumu sulu ekstraktı” kimi ifadə edilə bilər.

AED tək bir saf kimyəvi molekul deyil. O, birdən çox suda həll ola bilən və ya ekstraksiya şəraitində məhlula keçən kimyəvi komponenti ehtiva edən mürəkkəb ekstraktdır. Buna görə AED-nin bioloji təsirini tək bir molekula bağlamaq üçün əlavə olaraq birləşmələrin izolyasiyası və hədəfin doğrulanması təcrübələri tələb olunur.

3. Ekstrakt necə hazırlanmışdır?

Tədqiqatçılar 1000 g qurudulmuş DJF materialını incə toz halına gətirmiş və 10 L distillə edilmiş sudan istifadə etmişlər. Bərk/maye nisbəti 1:10 (w/v) olaraq müəyyən edilmişdir.

1. 1000 g qurudulmuş DJF üyüdülmüşdür.
2. 10 L distillə edilmiş su əlavə edilmişdir.
3. Suspenziya 25 °C-də 2 saat qarışdırılmışdır.
4. Daha sonra 100 °C-də 1 saat reflüks ekstraksiyası aparılmışdır.
5. Həll olmayan maddələr vakuum filtrasiyası ilə ayrılmışdır.
6. Filtrat 40 °C-də aşağı təzyiq altında təxminən 200 mL-ə qədər qatılaşdırılmışdır.
7. Sentrifuqalama aparılmışdır.
8. Nümunə −70 °C-də 6 saat sürətlə dondurulmuşdur.
9. −50 °C-də 48 saat liyofilizasiya edilmişdir.
10. Quru AED hava keçirməyən kəhrəba rəngli qablarda 4 °C-də saxlanmışdır.

Tədqiqatda əldə edilən ekstraksiya çıxımı təxminən %9 olaraq bildirilmişdir. Bu nisbət başlanğıcdakı quru materialın hamısının aktiv birləşmə olması demək deyil; yalnız istifadə olunan ekstraksiya və qurutma prosedurundan sonra əldə edilən quru ekstraktın miqdarını ifadə edir.

4. Kimyəvi profil necə araşdırılmışdır?

AED-nin kimyəvi tərkibi kütlə spektrometriyasına əsaslanan üsullarla araşdırılmışdır. Tədqiqatın metod və nəticə bölmələrində UPLC-MS/MS ilə marker analizi və LC-QTOF-MS ilə hədəfsiz kimyəvi profilləşdirmədən bəhs olunur.

Mənbədə 31 birləşmə MSI etibar səviyyəsi 2–3 çərçivəsində putativ olaraq annotasiya edilmişdir. “Putativ annotasiya” birləşmənin spektral xüsusiyyətlərinin müəyyən kimyəvi kimliklə uyğun olduğunu, lakin bütün birləşmələrin eyni səviyyədə qəti struktur doğrulamasına malik olmadığını ifadə edir.

Mənbədə nümunə kimi göstərilən birləşmələr arasında:

• quercitrin,
• C17-sphinganine,
• 6-methoxyflavonol,
• succinic acid,
• catechin

yer alır. Bu siyahı AED-nin bütün kimyəvi tərkibinin yalnız bu beş molekuldan ibarət olduğu mənasına gəlmir.

5. RAW264.7 hüceyrələri niyə istifadə edilmişdir?

RAW264.7 siçan mənşəli makrofaq hüceyrə xəttidir. Makrofaqlar immun sistemdə iltihabi siqnalların istehsalı və tənzimlənməsində iştirak edən hüceyrələrdir.

Tədqiqatda RAW264.7 hüceyrələri lipopolisaxarid (LPS) ilə stimullaşdırılmışdır. LPS Gram-mənfi bakteriyaların xarici membranının mühüm komponentidir və laboratoriya şəraitində makrofaqlarda güclü iltihabi cavab yaratmaq üçün geniş istifadə olunur.

Beləliklə, bu model “xoralı kolit xəstəsinin bağırsaq hüceyrəsi” deyil. Nəzarət olunan hüceyrə mühitində iltihabi siqnallaşmanın araşdırıldığı sadələşdirilmiş makrofaq modelidir.

6. Hüceyrə canlılığı təcrübəsi

RAW264.7 hüceyrələri hər quyuya \(7 \times 10^3\) hüceyrə sıxlığında 96 quyulu lövhələrə əkilmişdir. AED üçün 0.1, 0.5, 1, 5, 10 və 50 µg/mL konsentrasiyaları 24 saat ərzində qiymətləndirilmişdir.

Hüceyrə canlılığı CCK-8 testi və 450 nm absorbans ölçümü ilə araşdırılmışdır. Əsas nəticə mətni AED-nin 10 µg/mL-dən aşağı konsentrasiyalarda sitotoksiklik göstərmədiyini bildirir. Sonrakı əsas iltihab təcrübələri xüsusilə 1, 5 və 10 µg/mL konsentrasiyalarına yönəlmişdir.

7. NO, IL-6, IL-1β və TNF-α niyə ölçülmüşdür?

Azot oksidi (NO), iltihab zamanı iNOS fermenti vasitəsilə yüksək miqdarda istehsal oluna bilən kiçik siqnal molekuludur. Tədqiqatda NO birbaşa qaz kimi deyil, kultur supernatantındakı nitrit vasitəsilə Griess üsulu ilə qiymətləndirilmişdir.

IL-6, IL-1β və TNF-α isə iltihabi cavabın mühüm sitokinləridir. Hüceyrə kulturu supernatantındakı konsentrasiyaları ELISA ilə ölçülmüşdür.

Hüceyrələr AED ilə 1 saat ilkin işləmədən sonra 100 ng/mL LPS ilə 24 saat stimullaşdırılmışdır. LPS sitokin istehsalını artırarkən, AED mənbə tədqiqatda bu artımı azaltmışdır.

8. iNOS və COX-2 nədir?

iNOS, induksiya olunan azot oksid sintazıdır. İltihabi stimullar altında yüksək səviyyədə NO sintezinə töhfə verə bilər.

COX-2, siklooksigenaza-2 fermentidir və iltihab zamanı prostanoid sintezi ilə əlaqəli olaraq arta bilər.

Tədqiqatda Western blot analizi LPS-in iNOS və COX-2 zülal səviyyələrini artırdığını; AED tətbiqinin isə LPS-dən qaynaqlanan bu artımı azaltdığını göstərmişdir.

9. JAK1/STAT3 siqnal yolu nədir?

JAK1, Janus kinase 1; STAT3 isə signal transducer and activator of transcription 3 adlanan siqnal zülalıdır. JAK zülallarının aktivləşməsi müəyyən STAT zülallarının fosforilləşməsini dəstəkləyə bilər; fosforilləşmiş STAT zülalları daha sonra gen ifadəsini tənzimləyən siqnal proseslərində iştirak edə bilər.

Tədqiqatda ümumi JAK1 və STAT3 ilə onların fosforilləşmiş formaları ayrı-ayrılıqda araşdırılmışdır. LPS p-JAK1 və p-STAT3 səviyyələrini artırarkən, ümumi JAK1 və STAT3 səviyyələrində eyni növdə aydın artım bildirilməmişdir.

AED p-JAK1/JAK1 və p-STAT3/STAT3 nisbətlərini LPS qrupu ilə müqayisədə azaltmışdır. Ən nəzərəçarpan zəifləmə mənbədə 5 µg/mL ətrafında bildirilmişdir.

JAK1/STAT3, AED-nin kolit üzərində təsirinin sübut olunmuş səbəbidirmi?

Xeyr. Tədqiqat JAK1/STAT3 fosforilləşməsi ilə AED tətbiqi arasında eksperimental əlaqə göstərir; lakin tədqiqatçılar yol-spesifik inhibisiya və ya rescue təcrübələri aparmadıqları üçün JAK1/STAT3-ün AED təsirinin zəruri səbəb mexanizmi olduğunu sübut etməmişlər. Buna görə düzgün ifadə “AED təsiri JAK1/STAT3 siqnalındakı azalma ilə əlaqəli idi” şəklindədir.

10. DSS siçan modeli nədir?

Dekstran sulfat natrium (DSS), təcrübə heyvanlarında kolon epitel zədələnməsi və iltihab yaradaraq kəskin kolit modeli əmələ gətirmək üçün istifadə olunan kimyəvi agentdir.

DSS modeli insan xoralı kolitinin bütün biologiyasını təkrar yaratmır. İnsan xəstəliyinin müəyyən iltihabi, epitel və histopatoloji xüsusiyyətlərini araşdırmaq üçün istifadə olunan eksperimental modeldir.

11. Siçan təcrübəsinin dizaynı

Tədqiqata 6–8 həftəlik, 18–20 g çəkidə cəmi 50 erkək C57BL/6 siçan daxil edilmişdir. Siçanlar təsadüfi olaraq beş qrupa bölünmüş və hər qrupda 10 siçan olmuşdur.

DSS içməli suda yeddi gün verilmiş; SASP və ya AED gündə bir dəfə oral qavajla tətbiq edilmişdir. Hər qrupdakı 10 siçan iki ayrı qəfəsdə, hər qəfəsdə 5 siçan olmaqla saxlanmışdır.

Tədqiqatda nəticələrin qiymətləndirilməsi və məlumat analizinin qrup təyinatına mümkün qədər kor şəkildə aparıldığı bildirilmişdir. Təcrübə zamanı gözlənilməz mənfi hadisə baş verməmiş və heç bir heyvana erkən evtanaziya tələb olunmamışdır.

12. DAI nədir?

Disease Activity Index (DAI), DSS kolit təcrübəsində xəstəlik ağırlığını izləmək üçün bədən çəkisi itkisi, nəcis konsistensiyası və nəcisdə qan kimi göstəriciləri birlikdə istifadə edən qiymətləndirmə yanaşmasıdır.

Mənbədə bədən çəkisi itkisi belə ballandırılmışdır:

• 0: itki yoxdur,
• 1: %1–5,
• 2: %5–10,
• 3: %10–20,
• 4: %20-dən çox.

Nəcis konsistensiyası:

• 0: normal,
• 1: yumşaq,
• 2: ishal.

Nəcisdə qan:

• 0: yoxdur,
• 1: iz səviyyəsində,
• 2: orta,
• 3: şiddətli.

Lakin burada çox mühüm eksperimental detal var. Bədən çəkisi hər siçan üçün ayrıca ölçülsə də, nəcis konsistensiyası və nəcisdə qan nəcisin ayrı-ayrı siçanlara aid edilə bilməməsi səbəbindən qəfəs səviyyəsində qiymətləndirilmişdir. Buna görə DAI analizində eksperimental vahid siçan deyil, qəfəsdir və hər qrup üçün yalnız n = 2 qəfəs mövcuddur.

Mənbənin Şəkil 2 izahı DAI nəticələrini “descriptive”, yəni təsviri olaraq təqdim edir. Buna görə DAI əyrisini güclü fərdi-heyvan statistik sübutu kimi şərh etmək düzgün deyil.

13. Siçanlarda nə müşahidə edilmişdir?

DSS qrupunda təcrübə boyunca proqressiv bədən çəkisi itkisi müşahidə edilmişdir. AED və sulfasalazin tətbiqləri mənbə tədqiqatda 4. gündən 7. günə qədər çəki itkisinin azalması ilə əlaqələndirilmişdir.

DSS həmçinin kolonun qısalmasına səbəb olmuşdur. Müalicə qruplarında kolon qısalmasının qismən qarşısının alındığı və ən nəzərəçarpan qorunmanın 600 mg/kg yüksək doza AED qrupunda olduğu bildirilmişdir.

Histoloji qiymətləndirmədə DSS qrupunda selikli qişa ödemi, kript arxitekturasının pozulması və iltihabi hüceyrə infiltrasiyası müşahidə edilmişdir. AED və sulfasalazin qruplarında iltihabi infiltrasiyanın azaldığı və selikli qişa quruluşunun DSS qrupu ilə müqayisədə daha yaxşı qorunduğu bildirilmişdir.

Bu histoloji nəticələr real toxuma görüntülərinə əsaslandığından Verianla daxilində süni “histologiya fotoşəkli” yaradılmamışdır.

14. Kolon toxumasında iltihabi genlər

Kolon toxumasında iNOS, IL-6, IL-1β və TNF-α mRNA səviyyələri RT-qPCR ilə ölçülmüşdür. DSS bu dörd transkriptin səviyyəsini nəzarət qrupu ilə müqayisədə artırmışdır.

SASP və AED tətbiqi DSS-dən qaynaqlanan artımı azaltmış; mənbədə ən nəzərəçarpan zəifləmənin yüksək doza AED qrupunda görüldüyü bildirilmişdir.

RT-qPCR genin mRNA səviyyəsini ölçür. mRNA-nın azalması müvafiq zülalın da eyni nisbətdə azalacağını təkbaşına təmin etmir; transkripsiyadan sonrakı tənzimlənmə və zülal parçalanması kimi proseslər də təsir göstərə bilər.

15. ZO-1, occludin və claudin-1 niyə vacibdir?

Bağırsaq epitel hüceyrələri arasındakı sıx birləşmələr (tight junctions), hüceyrələrarası keçidi məhdudlaşdıran baryer strukturunun mühüm hissələridir.

Tədqiqatda üç birləşmə zülalı immunohistokimya ilə qiymətləndirilmişdir:

• ZO-1: birləşmə kompleksinin hüceyrədaxili skelet və membran zülalları ilə təşkilində rol oynayan adaptor zülal,
• Occludin: sıx birləşmənin transmembran komponentlərindən biri,
• Claudin-1: parasellulyar baryer xüsusiyyətlərinin müəyyənləşdirilməsinə töhfə verən claudin ailəsi zülalı.

DSS qrupu ilə müqayisədə SASP və AED qruplarında birləşmə sahələrində boyanma intensivliyinin və davamlılığının artdığı bildirilmişdir.

Burada mühüm ölçmə sərhədi var: mənbə immunohistokimyəvi görüntülərdən orta optik sıxlıq qiymətləndirmələri təqdim etsə də, bunlardan birbaşa mütləq zülal konsentrasiyası ölçümü kimi istifadə etmədiyini açıq şəkildə bildirir. Buna görə “zülal miqdarı dəqiq olaraq bu qədər artdı” nəticəsi çıxarıla bilməz.

AED-nin bu tədqiqatdakı təsiri insanlarda xoralı kolit müalicəsinin sübutudurmu?

Xeyr. Tədqiqat RAW264.7 hüceyrələrindən və DSS ilə yaradılmış siçan kolit modelindən əldə olunan preklinik sübut təqdim edir. İnsan xəstələrdə klinik cavab, remissiya nisbəti, təhlükəsiz doza, dərman qarşılıqlı təsiri, gastrointestinal biomənimsənilmə və ya uzunmüddətli təhlükəsizlik qiymətləndirilməmişdir. Nəticələr birbaşa insan müalicəsinə köçürülə bilməz.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

16. Transkriptomik analiz

Distal kolon toxumasından RNA izolyasiya edilmiş, RNA keyfiyyəti A260/280 = 1.9–2.1 aralığında təsdiqlənmişdir. Poly(A)+ kitabxanaları hazırlanmış və Illumina NovaSeq platformasında 150 baz cütlük paired-end sekvensləmə aparılmışdır.

Sekvensləmə oxunuşları keyfiyyət filtrindən keçirilmiş və siçan genomu GRCm39, Ensembl 104 versiyasına STAR v2.7.10a ilə hizalanmışdır.

Gen sayımları featureCounts v2.0.3 ilə yaradılmış, diferensial gen ifadəsi DESeq2 ilə analiz edilmişdir.

17. Log2 fold change nədir?

Fold change, bir genin iki şərait arasındakı ifadə nisbətini göstərir. Loqarifmik təqdimat xüsusilə artım və azalmaların daha balanslı miqyasda müqayisəsini təmin edir.

Məsələn:

• log2 FC = +1 → təxminən 2 dəfə artım,
• log2 FC = −1 → təxminən yarıya enmə,
• log2 FC = 0 → nisbət baxımından dəyişiklik yoxdur

mənasına gəlir.

Mənbənin metod bölməsində diferensial ifadə olunan genlər üçün:

\[ |\log_2 FC| \geq 1.5 \]

və

\[ p_{\mathrm{adjusted}} < 0.05 \]

hədləri verilmişdir.

Lakin mənbə Şəkil 5 izahında DEG tərifi |\(\log_2\)(fold change)| ≥ 1.0 və adjusted p < 0.05 olaraq yazılmışdır. Bu iki hədd mənbə daxilində fərqlidir. Verianla bu fərqi səssizcə vahid dəyərə çevirmir.

18. Düzəldilmiş p dəyəri və FDR niyə istifadə olunur?

Minlərlə gen eyni vaxtda sınaqdan keçirildikdə yalnız p < 0.05 istifadə olunarsa, təsadüfən əhəmiyyətli görünən çoxlu sayda gen əldə edilə bilər. Buna görə tədqiqatçılar Benjamini–Hochberg üsulu ilə yanlış kəşf nisbətini, yəni false discovery rate (FDR) nəzarətdə saxlamışlar.

Mənbədə diferensial gen analizi üçün FDR < 0.05 və funksional zənginləşdirmə analizləri üçün q < 0.05 istifadə edilmişdir.

Mənbə həmçinin log2 fold change üçün %95 etibar intervalını aşağıdakı quruluşla verir:

\[ 95\%\,GA = \log_2 FC \pm 1.96 \times SE \]

Burada SE standart xətadır. 1.96 əmsalı istifadə olunan normal yaxınlaşma altında təxminən %95-lik iki tərəfli etibar intervalı yaratmaq üçün istifadə olunur.

19. Transkriptomik nəticələr

DSS təsiri nəzarət qrupu ilə müqayisədə ümumilikdə 125 diferensial gen ilə əlaqələndirilmişdir:

• 51 gen yuxarı tənzimlənmiş,
• 74 gen aşağı tənzimlənmişdir.

HAED ilə əlaqəli digər transkriptomik müqayisədə ümumilikdə 563 DEG bildirilmişdir:

• 294 yuxarı tənzimlənmiş,
• 269 aşağı tənzimlənmişdir.

Mənbə mətnində bu ikinci müqayisənin istinad qrupunun ifadə edilməsi ilə Şəkil 5-in “subsequent AED treatment” təqdimatı tam aydın vahid etiket altında verilmədiyinə görə Verianla 563 sayını mənbədə olmayan dəqiq müqayisə adı ilə yenidən etiketləmir.

Funksional zənginləşdirmə analizləri iltihab, hüceyrədənkənar matriks və daşınma prosesləri ilə əlaqəli mövzuları önə çıxarmışdır. LOX, P4HA1, MMP2 və MMP9 kimi matriksin yenidən qurulması ilə əlaqəli transkriptlərdə dəyişikliklər bildirilmişdir.

20. Namizəd hədəflər necə müəyyən edilmişdir?

Tədqiqatçılar transkriptomik nəticələri AED-də aşkar edilən kiçik molekullara dair hədəf proqnozları ilə birləşdirmişlər.

PharmMapper, SwissTargetPrediction və SEA məlumat bazalarından istifadə edilmiş; ən azı iki proqnoz mənbəyi tərəfindən dəstəklənən hədəflər saxlanmışdır.

Bu inteqrasiyada 553 putativ AED-qarşılıqlı təsirli gen müəyyən edilmiş və onların 22-si AED ilə əlaqəli yuxarı tənzimlənmiş DEG dəsti ilə kəsişmişdir.

Zülal–zülal qarşılıqlı təsir şəbəkəsi analizində ACE, APOB, IGF1 və VWF yüksək əlaqəli düyünlər arasında olmuşdur.

Lakin “şəbəkədə yüksək əlaqəli” olmaq molekulun həqiqətən AED-nin bioloji təsirini daşıyan zəruri hədəf olduğunu sübut etmir.

21. ACE və VWF nə deməkdir?

ACE, angiotensin-converting enzyme, müxtəlif peptidlərin işlənməsində iştirak edən fermentdir.

VWF, von Willebrand factor, xüsusilə hemostaz və damar biologiyası ilə əlaqəli böyük qlikoproteindir.

Bu tədqiqatda ACE və VWF birbaşa biokimyəvi hədəf doğrulama təcrübələri ilə sübut edilməmişdir. Şəbəkə analizi, ədəbiyyata əsaslanan hədəf proqnozu və molekulyar docking nəticəsində araşdırılmalı namizəd hədəflər kimi seçilmişdir.

22. Molekulyar docking necə aparılmışdır?

ACE üçün PDB: 3L3N, VWF üçün PDB: 3HXQ kristal strukturlarından istifadə edilmişdir. Zülal strukturları UCSF Chimera v1.17 ilə hazırlanmış; zülal olmayan komponentlər çıxarılmış və hidrogenlər əlavə edilmişdir.

Ligand strukturları PubChem-dən alınmış, MMFF94 ilə optimallaşdırılmış və Open Babel v3.1.1 ilə PDBQT formatına çevrilmişdir.

Docking AutoDock 4.2.6 ilə həyata keçirilmişdir. Hər ligand üçün Lamarckian Genetic Algorithm istifadə edilərək 50 docking işə salınması aparılmış və ən aşağı proqnozlaşdırılan bağlanma enerjisinə malik konformasiya qarşılıqlı təsir analizi üçün seçilmişdir.

Bəzi ligand–hədəf cütlərində hesablanan docking skorunun −10 kcal/mol-dən aşağı olduğu bildirilmişdir.

Lancerotoxin A və C17-Sphinganine, ACE ilə qarşılıqlı təsirlərinin ətraflı vizuallaşdırılması üçün təmsilçi birləşmələr kimi seçilmişdir.

Docking skoru eksperimental bağlanma sabiti deyil. Daha mənfi skor istifadə olunan modelin enerji funksiyasında daha əlverişli pozanın proqnozlaşdırıldığını göstərir; real hüceyrə hədəfinə bağlanmanı təkbaşına sübut etmir.

23. Molekulyar dinamika simulyasiyası

Molekulyar dinamika simulyasiyaları GROMACS v2023.2 istifadə olunmaqla aparılmışdır.

RMSD, strukturun istinad konformasiyasından ümumi həndəsi sapmasını qiymətləndirməyə kömək edir.

RMSF, ayrı-ayrı amin turşusu qalıqlarının simulyasiya boyunca nə qədər hərəkətli olduğunu qiymətləndirir.

Rg və ya radius of gyration, molekulyar strukturun kütlə mərkəzinə görə nə qədər kompakt paylandığı ilə əlaqəli ölçüdür.

Hidrogen rabitəsi doluluğu, müəyyən hidrogen rabitəsi meyarının trayektoriyanın nə qədərində ödənildiyini ifadə edir.

ACE–Lancerotoxin A və ACE–C17-Sphinganine kompleksləri 200 ns simulyasiyada ACE ilə əlaqəli qalmışdır. Mənbə Lancerotoxin A kompleksinin C17-Sphinganine kompleksi ilə müqayisədə daha aşağı struktur dalğalanması və daha davamlı hidrogen rabitələri göstərdiyini bildirir.

Bu, Lancerotoxin A-nın canlı orqanizmdə ACE-ni təsdiqlənmiş şəkildə inhibə etdiyi anlamına gəlmir. Bu, simulyasiyanın başlanğıc strukturları və qüvvə sahəsi altında hesablanan molekulyar davranışı ifadə edir.

24. MM/PBSA və alanin skanlanması

Mənbədə MM/PBSA yanaşması molekulyar dinamika trayektoriyalarından ligand–zülal qarşılıqlı təsirinin hesablama enerji komponentlərini qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir.

MM/PBSA qısaltması ümumiyyətlə Molecular Mechanics / Poisson–Boltzmann Surface Area yanaşmasını ifadə edir.

Hesablama alanin skanlanmasında müəyyən amin turşusu yan zəncirləri model daxilində alaninlə əvəz edilərək bağlanma enerjisində proqnozlaşdırılan dəyişiklik araşdırılır. Məqsəd bağlanmaya daha çox töhfə verə biləcək “hot-spot” qalıqları müəyyən etməkdir.

Mənbədə iki kompleks üçün ortaq namizəd hot-spot qalıqlar kimi:

• Trp357,
• Ser355,
• Val518,
• Glu143

bildirilmişdir. Bunların arasında Trp357-nin alanin əvəzlənməsindən sonra ən böyük proqnozlaşdırılan destabilizasiya təsirini göstərdiyi qeyd edilmişdir.

Bu qalıqlar eksperimental mutagenezlə doğrulanmadığı üçün “ACE-nin AED üçün qəti bağlanma nöqtələri” kimi təqdim edilməməlidir.

25. Metabolomik analiz

Kolon nümunələrində hədəfsiz LC-MS metabolomik analizi aparılmışdır. Keyfiyyətə nəzarət nümunələri müntəzəm intervallarla inyeksiya edilmiş; QC nisbi standart sapması %30-dan yüksək olan və ya blank nümunələrdə aşkar edilən xüsusiyyətlər çıxarılmışdır.

Məlumatlar:

1. normallaşdırılmış,
2. \(\log_2\) çevrilməsinə məruz qoyulmuş,
3. Pareto miqyaslaması tətbiq edilmişdir.

Mənbədə diferensial metabolit seçimi üçün FDR-düzəldilmiş q < 0.05 yanaşması izah olunarkən, nəticələr bölməsində əlavə olaraq VIP > 1 və p < 0.05 meyarları ilə 39 metabolitlik dəst bildirilmişdir.

26. PCA ilə PLS-DA arasındakı fərq

PCA, principal component analysis, qrup etiketlərini məcburi şəkildə istifadə etmədən məlumatdakı ən böyük variasiya istiqamətlərini ümumiləşdirən nəzarətsiz ölçü azaltma üsuludur.

PLS-DA, partial least squares discriminant analysis, məlum sinif etiketlərindən istifadə edərək qruplar arasındakı fərqlənməni önə çıxaran nəzarətli üsuldur.

Tədqiqatda PCA qrafikində DSS ilə nəzarət qrupları ayrılmış; AED qrupu bu iki qrup arasında aralıq mövqe göstərmişdir. PLS-DA da DSS və nəzarət metabolik profillərini ayırmışdır.

PLS-DA nəzarətli olduğuna görə modelin vizual olaraq yaxşı ayrılma göstərməsi təkbaşına bioloji dəqiqlik demək deyil. Mənbə buna görə çarpaz doğrulama və permutasiya testi ilə modelin dayanıqlığını qiymətləndirdiyini bildirir.

27. Metabolomik nəticələr

Cəmi 39 metabolit skrininq meyarlarını ödəmiş və onların 36-sı Nəzarət–DSS–AED ardıcıllığında “aşağı–yüksək–aşağı” və ya “yüksək–aşağı–yüksək” istiqamətli nümunə göstərmişdir.

KEGG zənginləşdirmə analizində önə çıxan yollar arasında:

• taurin–hipotaurin metabolizması,
• arginin–prolin metabolizması,
• steroid hormon biosintezi,
• qlutation metabolizması,
• azot metabolizması

yer almışdır.

Hipotaurin DSS qrupunda azalmış və AED-dən sonra yüksəlmişdir. Spermin-də DSS qrupunda görülən yüksəlmə AED qrupunda zəifləmişdir.

Müxtəlif efir qliserofosfolipidlərində, LPI/LPC növlərində, phytosphingosine, eikosanoid törəmələrində və steroid hormonlarında da AED ilə əlaqəli istiqamətli dəyişikliklər bildirilmişdir.

Bu nəticələr metabolik yolların AED təsiri ilə əlaqəli olduğunu göstərir; təkbaşına müəyyən metabolitin AED-nin qoruyucu təsirinin səbəbi olduğunu sübut etmir.

28. Gen–metabolit korrelyasiya şəbəkəsi

Tədqiqatda DSS qrupunun transkriptom və metabolom məlumatlarını əlaqələndirmək məqsədilə iki hissəli, istiqamətsiz korrelyasiya şəbəkəsi qurulmuşdur.

Gen ilə metabolit arasında kənar yaratmaq üçün:

\[ |\rho| > 0.7 \]

və

\[ p < 0.05 \]

şərtlərindən istifadə edilmişdir.

Buradakı \(\rho\), Spearman sıra korrelyasiya əmsalıdır.

Yaradılan şəbəkə:

• 48 düyün,
• 63 kənar

ehtiva etmiş və əlaqələrin %65-i müsbət korrelyasiyalardan ibarət olmuşdur.

29. Hub centrality skoru

Mənbədə düyün mərkəziliyi aşağıdakı düsturla birləşdirilmişdir:

\[ H=C_D+C_B \]

Burada:

• \(H\): birləşdirilmiş hub centrality skoru,
• \(C_D\): degree centrality,
• \(C_B\): betweenness centrality

kimi təyin edilmişdir.

Degree centrality, düyünün şəbəkədə neçə güclü əlaqəyə malik olması ilə; betweenness centrality isə şəbəkədəki digər düyünlər arasındakı yollar üzərində nə dərəcədə ara əlaqə mövqeyində olması ilə əlaqəlidir.

\(H\) dəyərləri bütün düyünlərin %70-lik persentil həddindən yuxarı olan düyünlər “hub” kimi təyin edilmişdir.

L-hydroxyproline və dehydroepiandrosterone (DHEA) mühüm metabolik hub-lar; Creb3l3 isə ən mərkəzi gen düyünü kimi bildirilmişdir.

Mərkəzilik bioloji zərurət demək deyil. Şəbəkə düyününün yüksək mərkəzilik göstərməsi onun xəstəliyin qəti səbəbi və ya müalicə hədəfi olduğunu təkbaşına sübut etmir.

30. SVD əsaslı çox-omik analiz

Tədqiqatçılar transkriptom ilə metabolom arasındakı daha yüksək səviyyəli ortaq variasiya nümunələrini araşdırmaq üçün singular value decomposition (SVD) istifadə etmişlər.

Metabolomdan VIP skoruna görə seçilmiş ilk 50 metabolit üçün:

\[ \log_2(x+1) \]

çevrilməsi tətbiq edilmişdir.

\(+1\) əlavə edilməsinin riyazi məqsədi sıfır dəyərlərdə loqarifmin təyin olunmamasının qarşısını almaqdır.

Metabolit xüsusiyyətləri daha sonra hər xüsusiyyət üçün z-score ilə normallaşdırılmışdır. Eyni qaydada transkriptomdan seçilmiş ilk 50 DEG normallaşdırılmışdır.

İki matrisin hər biri:

\[ 5\ \text{örnek} \times 50\ \text{özellik} \]

ölçüsündədir.

Bunlar üfüqi şəkildə birləşdirilərək:

\[ 5 \times 100 \]

ölçülü inteqrə olunmuş matris yaradılmışdır.

Standart SVD-nin öyrədici riyazi təsviri tədqiqatın yeni nəticəsi deyil, metodun əsasını təşkil edir:

\[ X \approx U\Sigma V^T \]

Burada \(X\) inteqrə olunmuş məlumat matrisini, \(U\) nümunə məkanındakı komponentləri, \(\Sigma\) təkil dəyərləri və \(V^T\) xüsusiyyətlərin komponentlərə töhfə strukturlarını təmsil edir.

Tədqiqatda scikit-learn TruncatedSVD ilə:

• n_components = 3,
• random_state = 42

istifadə edilmişdir.

Factor 2 ümumi variasiyanın %48.7-sini izah etmişdir. Slc9a3 (NHE3) və Retnlb yüksək yüklənmə dəyərləri göstərmiş və DHA daxil olmaqla uzun zəncirli çox doymamış yağ turşuları ilə birlikdə dəyişiklik göstərmişdir.

Bu SVD analizinin inteqrə matrisi yalnız beş nümunəyə əsaslandığı üçün nəticələr geniş populyasiya modeli kimi deyil, kəşfiyyat xarakterli ortaq variasiya strukturu kimi şərh edilməlidir.

31. Statistik analiz

Əsas statistik analizlər GraphPad Prism 9.5.1 ilə aparılmışdır.

Mənbədə:

• normal paylanmanın yoxlanması üçün Shapiro–Wilk testi,
• dispersiya homogenliyi üçün Levene testi,
• çoxsaylı qrup müqayisələri üçün one-way ANOVA,
• homogen dispersiyada Tukey post hoc testi,
• bərabər olmayan dispersiyada Dunnett T3 testi,
• zamana bağlı bədən çəkisi qiymətləndirilməsində two-way repeated-measures ANOVA

istifadə edildiyi bildirilmişdir.

İki tərəfli əhəmiyyət sərhədi p < 0.05 olaraq müəyyən edilmişdir.

Metod bölməsində DAI üçün də repeated-measures ANOVA-dan bəhs edilsə də, eksperimental vahidin qəfəs olması və yalnız n = 2 qəfəs/qrup mövcudluğu səbəbindən mənbə Şəkil 2 DAI-ni təsviri olaraq təqdim edir. Buna görə Verianla qiymətləndirməsində DAI üçün güclü inferensial iddia irəli sürülmür.

32. Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• AED, LPS ilə stimullaşdırılmış RAW264.7 hüceyrələrində proiltihabi sitokin istehsalının azalması ilə əlaqəlidir.
• AED hüceyrə modelində iNOS və COX-2 artımının azalması ilə əlaqəlidir.
• AED, p-JAK1/JAK1 və p-STAT3/STAT3 nisbətlərinin azalması ilə əlaqəlidir.
• 600 və 200 mg/kg AED, DSS siçan modelində kolitlə əlaqəli bəzi klinik və histoloji göstəricilərin yaxşılaşması ilə əlaqələndirilmişdir.
• Yüksək doza AED qrupunda kolon uzunluğunun DSS qrupu ilə müqayisədə daha yaxşı qorunduğu bildirilmişdir.
• Kolon toxumasında iNOS, IL-6, IL-1β və TNF-α mRNA artımları AED ilə azalmışdır.
• ZO-1, occludin və claudin-1-in immunohistokimyəvi birləşmə nümunəsində yaxşılaşma müşahidə edilmişdir.
• Transkriptomik və metabolomik nəticələr AED tətbiqinin iltihabi, daşıma və metabolik yollarla əlaqəli dəyişikliklərlə müşayiət olunduğunu göstərmişdir.
• Taurin–hipotaurin və argininlə əlaqəli metabolik yollar mühüm namizəd mexanizm sahələri kimi önə çıxmışdır.
• ACE və VWF hesablama analizi üçün namizəd hədəflər kimi müəyyən edilmişdir.
• Lancerotoxin A və C17-Sphinganine, ACE ilə potensial qarşılıqlı təsir baxımından hesablama üsulları ilə ətraflı araşdırılmışdır.

33. Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

• AED-nin insanlarda xoralı koliti müalicə etdiyi göstərilməmişdir.
• AED-nin reseptli dərmanların əvəzinə istifadə edilə biləcəyi göstərilməmişdir.
• 200 və ya 600 mg/kg siçan dozalarının insan dozası olduğu deyilə bilməz.
• JAK1/STAT3 yolunun AED təsirinin qəti səbəb mexanizmi olduğu sübut edilməmişdir.
• ACE və ya VWF-nin AED-nin doğrulanmış birbaşa bioloji hədəfi olduğu sübut edilməmişdir.
• Docking və ya MD nəticələri hüceyrə daxilində real bağlanmanı təkbaşına təsdiqləmir.
• Metabolomik korrelyasiyalar metabolitlərin qoruyucu təsirin birbaşa səbəbi olduğunu sübut etmir.
• Tədqiqat bağırsaq mikrobiotasını birbaşa sekvensləşdirməmişdir.
• İntestinal keçiricilik birbaşa funksional permeabilik testi ilə ölçülməmişdir.
• Yalnız erkək siçanlar istifadə edildiyi üçün qadın/kişi bioloji fərqləri qiymətləndirilməmişdir.
• Uzunmüddətli istifadə və toksiklik qiymətləndirilməmişdir.
• İnsan biomənimsənilməsi və farmakokinetikası ölçülməmişdir.

34. Tədqiqatın güclü elmi tərəfi

Tədqiqatın mühüm cəhətlərindən biri onun tək bioloji ölçüyə əsaslanmamasıdır. Hüceyrə kulturu, heyvan fenotipi, histologiya, gen ifadəsi, immunohistokimya, transkriptomika, metabolomika, şəbəkə analizi və hesablama struktur analizi eyni tədqiqat çərçivəsində nəzərdən keçirilmişdir.

Bu çoxqatlı yanaşma eyni bioloji hadisənin müxtəlif ölçmə səviyyələrində dəstəklənib-dəstəklənmədiyini görməyə kömək edir.

Lakin müxtəlif məlumat qatlarının eyni istiqamətdə görünməsi avtomatik olaraq səbəbiyyət yaratmır. Xüsusilə yol, metabolit və namizəd hədəf nəticələrində funksional müdaxilə təcrübələri tələb olunur.

35. Gələcək tədqiqatlarda nə tələb olunur?

Müəlliflər gələcəkdə klinik baxımdan daha mənalı modellərdən istifadə etməyi təklif edirlər. Buna humanizə edilmiş heyvan modelləri və bağırsaq orqanoidləri nümunə göstərilmişdir.

Bundan əlavə:

• JAK1/STAT3 və digər namizəd yollar üçün inhibisiya/rescue təcrübələri,
• ACE və VWF üçün birbaşa hədəf doğrulaması,
• aktiv birləşmələrin ayrılması,
• uzunmüddətli istifadə və təhlükəsizliyin qiymətləndirilməsi,
• qida matriksi daxilində davranışın araşdırılması,
• insanlara keçiddən əvvəl farmakokinetika və biomənimsənilmə tədqiqatları,
• uyğun klinik tədqiqatlar

tələb olunacaqdır.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal başlıq: Walnut Septum-Derived Aqueous Extract Alleviates Colitis Through Modulation of Gut Metabolism and Inflammatory Signaling

Müəlliflər: Beier Jiang, Yu Wan, Lina Liu, Jiajun Cheng, Tianjiao Min, Xinlong Gao, Zicheng Yu, Li Ma və Ying He.

Bərabər töhfə: Beier Jiang və Yu Wan.

Məsul müəlliflər: Li Ma və Ying He.

Qurumlar: Navy Medical Centre, Naval Medical University, Shanghai 200433, China; College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China.

Jurnal: Foods.

Nəşriyyat: MDPI.

Biblioqrafik qeyd: Foods 2026, 15(11), 1866.

DOI: 10.3390/foods15111866.

Təqdim tarixi: 10 Mart 2026.

Reviziya tarixi: 30 Aprel 2026.

Qəbul tarixi: 18 May 2026.

Nəşr tarixi: 25 May 2026.

Rəsmi keçid: https://doi.org/10.3390/foods15111866

Mənbə növü: Resenziyalı elmi jurnalda dərc edilmiş orijinal tədqiqat məqaləsi; hüceyrə, heyvan və hesablama analizlərini birləşdirən preklinik tədqiqat.

Preprint statusu: Təqdim olunan mənbə dərc edilmiş Version of Record məqaləsidir. Mənbə PDF daxilində əlavə preprint versiyası göstərilməmişdir.

Lisenziya: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Maliyyələşdirmə: National Natural Science Foundation of China, layihə nömrəsi 82504587.

Etik təsdiq: Heyvan təcrübələri PLA Naval Medical Center Animal Experiments Committee tərəfindən təsdiqlənmişdir. Təsdiq nömrəsi 2025H007-dir.

İnsan iştirakçı: Yoxdur; informed consent tətbiq edilə bilən deyil.

Məlumat əlçatanlığı: Müəlliflər orijinal töhfələrin məqalə və əlavə materiallar daxilində olduğunu, əlavə məlumat sorğularının məsul müəlliflərə yönəldilə biləcəyini bildirmişlər.

Maraq toqquşması: Müəlliflər maraq toqquşması bildirməmişlər.

Müəllif töhfələri: Beier Jiang, Ying He və Lina Liu tədqiqatın konseptuallaşdırılması və dizaynına; Yu Wan və Jiajun Cheng eksperimental məlumatların analizi və şərhinə; Tianjiao Min, Zicheng Yu və Xinlong Gao bioloji təcrübələrə və məlumat analizinə töhfə vermişlər. Beier Jiang və Yu Wan ilkin layihəni yazmış; Li Ma və Ying He elmi məzmun baxımından tənqidi reviziya aparmışdır.

Mühüm mənbədaxili model ifadəsi: Məqalənin xülasəsində 10 µg/mL AED ifadəsi səhvən DSS siçan modeli cümləsinin daxilində görünür. Metod və nəticə bölmələri 10 µg/mL səviyyəsinin RAW264.7 hüceyrə təcrübəsinə aid olduğunu; siçan dozalarının 200 və 600 mg/kg olduğunu aydın göstərir. Verianla izahında metod və nəticə bölmələrindəki eksperimental quruluş əsas götürülmüşdür.

Transkriptomik hədd qeydi: Metod bölməsində DEG meyarı |log2 FC| ≥ 1.5 və adjusted p < 0.05, Şəkil 5 izahında isə |log2(fold change)| ≥ 1.0 və adjusted p < 0.05 olaraq yazılmışdır. Bu mənbədaxili fərq aradan qaldırılmış kimi göstərilməmişdir.

DAI qeydi: Nəcis konsistensiyası və nəcisdə qan ayrı-ayrı heyvanlara aid edilə bilmədiyinə görə DAI-nin eksperimental vahidi qəfəsdir və yalnız iki qəfəs/qrup mövcuddur. Mənbənin Şəkil 2 izahı DAI-ni təsviri olaraq təqdim edir.

Sıx birləşmə zülalları qeydi: ZO-1, occludin və claudin-1 immunohistokimya ilə qiymətləndirilmiş və görüntülərdə orta optik sıxlıq müqayisələri aparılmışdır. Bununla belə, mənbə müəllifləri mütləq zülal ifadəsinin kəmiyyətcə ölçülmədiyini xüsusilə qeyd edirlər. Buna görə IHC nəticəsi birbaşa mütləq zülal miqdarı kimi təqdim edilməmişdir.

Səbəbiyyət qeydi: JAK1/STAT3 yol inhibisiyası və ya rescue təcrübəsi aparılmadığı üçün bu yolun AED təsirinin qəti səbəbi olduğu göstərilməmişdir. Transkriptom–metabolom əlaqələri də səbəbli metabolizm–JAK1/STAT3–baryer oxunu təkbaşına sübut etmir.

ACE/VWF qeydi: ACE və VWF şəbəkə analizi və hesablama skrininqində ortaya çıxan ilkin namizəd hədəflərdir. Eksperimental funksional hədəf doğrulaması aparılmamışdır.

Mənbə istinad uyğunluğu qeydi: PDF-in müzakirə bölməsində istifadə olunan bəzi nömrələnmiş istinadların biblioqrafik başlıqları müvafiq ətraf cümlələrlə görünən şəkildə uyğun gəlmir. Məsələn, 53 nömrəli qeyd cerebral palsy, 54 nömrəli qeyd böyük arteriya transpozisiyası cərrahiyyəsi haqqındadır. Verianla mətni bu görünən biblioqrafik uyğunsuzluqlara əsaslanaraq yeni mexanizm iddiası yaratmamışdır.