Hidrolisati ya protini ya ganda la kamba wa maji baridi iliyopatikana kwa protease ya alkali (alkaline-protease-derived crayfish shell protein hydrolysate, ACSP) ni hidrolisati mchanganyiko ya peptidi inayotokana na uvunjaji wa kienzimu wa protini za ganda la kamba wa maji baridi kwa kutumia protease ya alkali. Watafiti kwanza walitayarisha hidrolisati tano tofauti za protini ya ganda la kamba wa maji baridi kwa kutumia papain, protease ya alkali, protease ya upande wowote, trypsin na pepsin; wakazichunguza kwa sifa za kiantioksidanti na kupunguza uchochezi; wakachunguza ACSP na NCSP zilizojitokeza zaidi katika seli za epitheliamu ya utumbo IEC-6 zilizochochewa na LPS; kisha wakatathmini ACSP, iliyotoa athari ya jumla ya seli iliyo nguvu zaidi, katika modeli ya panya ya koliti kali iliyosababishwa na DSS. Katika hatua ya mwisho, muundo wa peptidi wa ACSP ulitambuliwa kwa LC–MS/MS.

Katika uchunguzi wa awali, kwa radikali za DPPH na ABTS•⁺, thamani za IC₅₀ za ACSP zilikuwa 0,888 ± 0,004 na 0,853 ± 0,003 mg/mL mtawalia. ACSP pia ilionyesha shughuli ya juu zaidi ya kuondoa radikali ya hidroksili kati ya hidrolisati tano, %29,525 ± 0,499, na shughuli ya juu zaidi ya kuondoa radikali ya anioni ya superoxide, %47,310 ± 1,351. Hidrolisati ya protease ya upande wowote NCSP, hata hivyo, ilitoa matokeo yenye nguvu zaidi kuliko ACSP katika baadhi ya vipimo kuhusu thamani ya ABTS•⁺ IC₅₀ na uwezo wa upunguzaji wa FRAP. Kwa hiyo, hatua ya kwanza haikutegemea matokeo ya kipimo kimoja, bali tathmini ya pamoja ya viashiria mbalimbali vya kiantioksidanti na kupunguza uchochezi.

Katika seli za IEC-6 zilizochochewa na LPS, ACSP na NCSP zilipunguza mabadiliko ya viashiria vinavyochochea uchochezi iNOS, IL-1β, IL-6 na TNF-α huku zikiongeza mwitikio unaoelekea IL-10 ya kupunguza uchochezi; kwa ujumla ACSP ilionyesha athari yenye nguvu zaidi. Katika jaribio la panya, ACSP iliyotolewa kwa dozi za 100, 200 na 400 mg/kg ya uzito wa mwili ilipunguza kwa namna inayohusiana na dozi kupungua kwa uzito, shughuli ya ugonjwa, kufupika kwa koloni, uharibifu wa kihistolojia na upotevu wa seli za goblet uliosababishwa na DSS. Katika kundi la ACSP la dozi ya juu, fahirisi ya shughuli ya ugonjwa siku ya 14 ilikuwa 3,60 ± 0,55, ilhali katika kundi la modeli ya DSS ilikuwa 9,40 ± 1,14; alama ya kihistolojia iliripotiwa kuwa 4,80 ± 0,40 na 10,40 ± 0,80 mtawalia.

ACSP pia ilipunguza sitokini zinazochochea uchochezi, shughuli ya myeloperoxidase na viwango vya oksidi nitriki; na ilihusishwa na kurejea kwa shughuli za superoxide dismutase na catalase pamoja na kuongezeka tena kwa protini za miunganisho mikaza kama ZO-1, claudin-1 na occludin. Uchambuzi wa LC–MS/MS ulitambua mfuatano 516 wa peptidi ndani ya ACSP. Hata hivyo, utafiti huu hauonyeshi ufanisi au usalama wa matibabu ya koliti kwa binadamu. Matokeo yako katika kiwango cha mfumo wa seli na modeli ya panya ya muda mfupi; uthabiti katika njia ya chakula, ufyonzwaji kutoka utumbo, farmakokinetiki, mfiduo wa kimfumo, usalama wa muda mrefu, uwezekano wa mzio na ufanisi wa kliniki havijatathminiwa.

Tatizo kuu la utafiti

Magonjwa ya uchochezi wa utumbo yanajumuisha matatizo sugu ya uchochezi kama koliti yenye vidonda na ugonjwa wa Crohn. Katika mchakato wa ugonjwa, vipengele vingi kama mwelekeo wa kijenetiki, sababu za mazingira, kuvurugika kwa mikrobiota ya utumbo, msongo wa kioksidishaji na uanzishaji kupita kiasi wa kinga vinaweza kushiriki kwa pamoja. Waandishi wa utafiti wanaeleza kuwa, ingawa matibabu ya kifamasia yaliyopo ni muhimu, yanaweza kuwa na mipaka kama madhara, kupotea kwa mwitikio wa pili, gharama na kutokukamilika kwa uponaji wa mukosa kwa kila mgonjwa; kwa hiyo wanachukulia peptidi hai kibayolojia zinazotokana na chakula kuwa eneo linalostahili kuchunguzwa.

Tatizo la pili la utafiti linahusiana na matumizi ya rasilimali. Katika sekta ya usindikaji wa kamba wa maji baridi (Procambarus clarkii), maganda hutengeneza kiasi kikubwa cha bidhaa pembeni. Kulingana na chanzo, sehemu ya ganda inaweza kuwa takribani %60–70 ya biomasi yote ya kamba wa maji baridi na inaweza kuwa na takribani %20–30 chitini na %20–40 protini. Hata hivyo, matumizi ya nyenzo hii yenye thamani ya juu bado ni machache. Kwa hiyo utafiti unachunguza katika mfumo mmoja wa majaribio shughuli ya kibayolojia inayolenga afya ya utumbo na pia matumizi yenye thamani ya bidhaa pembeni ya usindikaji wa chakula cha baharini/majini.

Hidrolisati ya protini ni nini?

Hidrolisati ya protini ni mchanganyiko unaopatikana wakati molekuli kubwa za protini zinagawanywa na enzimu kuwa peptidi ndogo na vipande vya peptidi. Ni vifungo gani vya peptidi ambavyo protease hupendelea kukata vinaweza kubadilisha urefu wa peptidi zinazozalishwa, mfuatano wa amino asidi na hivyo sifa zao za kifizikia-kikemia. Kwa hiyo, protini ileile ya ganda la kamba wa maji baridi inapovunjwa na protease tofauti, hidrolisati zenye shughuli tofauti za kibayolojia zinaweza kutokea.

Huu ndio hasa mantiki kuu ya majaribio ya utafiti huu: chanzo kilekile cha msingi cha protini kilihidrolishwa kwa protease tano tofauti, bidhaa zilizopatikana zikalinganishwa, na mgombea mwenye shughuli ya jumla ya kibayolojia iliyo nguvu zaidi akapelekwa katika hatua za juu zaidi za majaribio.

Hidrolisati za ganda la kamba wa maji baridi zilitayarishwaje?

Maganda ya kamba wa maji baridi yalikatwa vipande vidogo, yakakaushwa, yakasagwa kwa mitambo na kupitishwa kwenye kichujio cha 60 mesh. Unga wa ganda ulianza kuchanganywa na petroleum ether kwa uwiano wa 1:10 (w/v), ukachanganywa kwa sumaku kwa saa 6 katika joto la kawaida, na kiyeyushi kilichokuwa na mafuta kikaondolewa kwa uchujaji.

Nyenzo iliyoondolewa mafuta kisha ilidekalasifiwa kwa 1 M HCl kwa uwiano wa 1:10 (w/v) kwa saa 2. Mchanganyiko ulisentrifugwa katika 5000×g kwa dakika 20, supernatant ikaondolewa, na mabaki magumu yakakaushwa ili kupata unga wa ganda la kamba wa maji baridi uliodekalasifiwa.

Katika hatua ya hidrolisisi, unga wa ganda ulitawanywa katika maji yaliyodistiliwa kwa uwiano wa 1:25 (w/v) na kuhidrolishwa kwa saa 6 chini ya masharti yaliyowekwa kwa kila moja ya protease tano. Mwishoni mwa mwitikio, enzimu zililemazwa kwa kushikiliwa katika 95 °C kwa dakika 15; bidhaa ikapitishwa kwenye kichujio cha 0,45 µm, filtrate ikalyophilishwa na kuhifadhiwa katika 4 °C.

Chanzo pia kinaeleza katika sehemu ya mbinu kwamba uthabiti wa kiutendaji wa hidrolisati ulitathminiwa kwa kurudia majaribio ya kiantioksidanti na kupunguza uchochezi baada ya kuhifadhiwa katika 4 °C kwa siku 0, 7, 15 na 30. Hata hivyo, katika sehemu kuu ya matokeo ya makala, matokeo ya kina ya kiasi ya mfululizo huu wa uhifadhi hayakuwasilishwa kama seti tofauti kuu ya matokeo; kwa hiyo, katika maandishi ya Verianla hakuna namba za uthabiti zisizokuwapo katika chanzo zilizotungwa.

Kwa Nini ACSP Ilichaguliwa Kati ya Hidrolisati Tano kwa Majaribio ya Juu Zaidi?

Ingawa ACSP haikuwa ya kwanza peke yake katika majaribio yote ya kiantioksidanti, ilionyesha wasifu wenye nguvu na uwiano katika kuondoa radikali, mwitikio wa SOD/CAT, kutolewa kwa NO na majaribio ya denaturization ya albumin; ACSP na NCSP zilichaguliwa kwa hatua ya kwanza ya seli, na kwa kuwa ACSP kwa ujumla ilitoa mwitikio wenye nguvu zaidi wa kupunguza uchochezi katika seli za IEC-6 zilizochochewa na LPS, ACSP ilitathminiwa katika modeli ya panya.

Uchunguzi wa kiantioksidanti wa hidrolisati tano

Katika majaribio ya DPPH na ABTS, thamani ya chini ya IC₅₀ ina maana kuwa kiwango cha %50 cha kuondoa radikali kilifikiwa kwa mkusanyiko mdogo wa hidrolisati na hivyo inaonyesha shughuli yenye nguvu zaidi. Katika FRAP na asilimia za kuondoa moja kwa moja, thamani ya juu ina maana ya mwitikio wenye nguvu zaidi wa kiantioksidanti. Kwa hiyo, Jedwali 2 halina kipimo kimoja “kilichoshinda”, bali vipimo vingi vinavyopima sifa tofauti za redoksi.

Katika Kielelezo 1 cha chanzo, ACSP iliripotiwa kuongeza shughuli ya SOD kwa takribani %25 na shughuli ya CAT kwa zaidi ya %18, na ongezeko hili lilikuwa kubwa kwa kiasi muhimu ikilinganishwa na PCSP na PECSP. Katika mfumo usio na seli, ACSP ilikandamiza kutolewa kwa NO kulikosababishwa na SNP kwa zaidi ya %20 na ilionyesha uzuiaji wa juu zaidi wa %12,21 katika denaturization ya albumin iliyosababishwa na joto.

Kuzuia denaturization ya albumin na kipimo cha NO kisicho na seli ni viashiria vya uchunguzi wa uwezekano wa kupunguza uchochezi. Haviwezi peke yake kuthibitisha kwamba njia za uchochezi zimedhibitiwa moja kwa moja katika kiumbe hai. Waandishi pia wanasisitiza katika sehemu ya majadiliano kwamba matokeo ya majaribio yasiyo na seli hayaonyeshi urekebishaji wa moja kwa moja wa wapatanishi wanaotokana na macrophage.

Mlinganyo wa kuondoa radikali ya DPPH

Shughuli ya kuondoa DPPH (%) = [A₀ − (A₁ − A₂)] / A₀ × 100

Hapa A₀ ni absorbansi ya kidhibiti chenye methanoli + DPPH; A₁ ni absorbansi ya mchanganyiko wa sampuli + DPPH; na A₂ ni absorbansi ya blanki ya sampuli yenye sampuli + methanoli. Kurekebisha mchango wa rangi ya sampuli au sifa zake za kioptiki kwenye ishara ya DPPH kwa kutumia A₂ husaidia kutenganisha kwa usahihi zaidi athari halisi ya kuondoa radikali.

Hidrolisati zilichunguzwa katika viwango vya 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 na 1,0 mg/mL, na kipimo cha DPPH kilifanywa katika 517 nm. IC₅₀ ilifafanuliwa kama mkusanyiko wa hidrolisati unaotoa shughuli ya %50 ya kuondoa radikali.

Kipimo cha ABTS•⁺

Katika kipimo cha ABTS•⁺, hidrolisati zilitathminiwa tena katika safu ya 0,2–1,0 mg/mL. Kationi ya radikali ya ABTS ilitayarishwa kwa kuchanganya 7 mM ABTS na 2,45 mM potassium persulfate kwa uwiano wa ujazo wa 1:1 na kuacha mchanganyiko katika giza kwa saa 16–24 katika joto la kawaida. Suluhisho la kazi lilipunguzwa hadi absorbansi ya 0,70 ± 0,02 katika 734 nm; kipimo kikafanywa baada ya dakika 6 za incubation na sampuli.

Shughuli ya kuondoa ABTS•⁺ (%) = (A₀ − A₁) / A₀ × 100

A₀ ni absorbansi ya blanki ya kidhibiti, na A₁ ni absorbansi ya sampuli ya majaribio.

FRAP na majaribio mengine ya radikali

Kipimo cha FRAP hutathmini uwezo wa kupunguza chuma cha ferric, na matokeo yalionyeshwa kama µmol Fe(II) sawa kwa sampuli kavu. Watafiti walitengeneza, kutoka viwango vya 100–1000 µM FeSO₄, mkunjo wa kalibresheni wa y = 0,2638x + 0,0651 na R² = 0,9992.

Katika kipimo cha radikali ya hidroksili, sampuli ilitumika katika mkusanyiko wa 1 mg/mL na asilimia ya kuondoa ilihesabiwa kama ifuatavyo:

Shughuli ya kuondoa •OH (%) = [(A₀ − A) / A₀] × 100

Katika kipimo cha anioni ya superoxide, uoksidishaji binafsi wa catechol ulifuatiliwa na hesabu ilikuwa:

Shughuli ya kuondoa O₂•⁻ (%) = [1 − (ΔA_s − ΔA_b) / ΔA₀] × 100

ΔA_s, ΔA_b na ΔA₀ huwakilisha mtawalia mabadiliko ya absorbansi kati ya dakika 0 na 5 katika sampuli, blanki ya sampuli na kidhibiti cha maji.

Kuzuia kutolewa kwa NO na denaturization ya albumin

Kutolewa kwa NO kulikosababishwa na SNP kulitathminiwa katika mfumo usio na seli kwa mmenyuko wa Griess:

Uzuiaji wa kutolewa kwa NO (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

Katika kipimo cha denaturization ya albumin, mchanganyiko wenye %1 BSA uliwekwa katika 37 °C kwa dakika 15 na kisha ukapashwa katika 90 °C kwa dakika 20. Ukungu ulipimwa katika 660 nm na uzuiaji ukahesabiwa kwa:

Uzuiaji wa denaturization (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

formula hiyo.

Modeli ya seli ya IEC-6 iliundwaje?

Seli za IEC-6 zilikuzwa katika mazingira ya DMEM yenye %10 fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin na 0,1 IU/mL insulin katika 37 °C na %5 CO₂.

Kwa mfululizo wa muda wa uhai wa seli, seli ziliandaliwa katika sahani zenye visima 96 kwa msongamano wa 1 × 10⁵ seli/mL na kutibiwa hadi saa 48 kwa viwango vya 0,1–2,0 mg/mL vya ACSP au NCSP. Vipimo vya CCK-8 vilifanywa katika saa 0, 12, 24, 36 na 48. Kwa ACSP, ongezeko kubwa zaidi la uhai lilionekana katika saa ya 36 katika kiwango cha 0,05 mg/mL; kwa NCSP, katika saa ya 36 katika 0,25 mg/mL.

Katika jaribio la uchochezi, seli zilikuzwa kwa saa 12 katika sahani zenye visima 12 kwa msongamano wa 3 × 10⁵ seli/kisima, zikachochewa kwa 0,1 mg/mL LPS kwa saa 4, kisha zikatibiwa kwa 0,025–0,5 mg/mL ACSP au NCSP kwa saa 24.

Matumizi ya LPS yaliongeza uonyeshaji wa jeni zinazochochea uchochezi kama iNOS, IL-1β, IL-6 na TNF-α huku yakipunguza IL-10. Hidrolisati zote mbili zilibadili mabadiliko haya katika mwelekeo wa kinyume, lakini ACSP kwa ujumla ilitoa mwitikio wenye nguvu zaidi kuliko NCSP. Katika matokeo ya ELISA ya supernatant ya kultur, IL-1β, IL-6 na TNF-α pia zilipungua huku IL-10 ikiongezeka.

Mbinu ya 2^−ΔΔCt ilitumika kwa lengo gani katika qPCR?

Katika utafiti, uonyeshaji wa jamaa wa mRNA wa jeni iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 na occludin ulipimwa kwa qPCR, na GAPDH ilitumika kama jeni rejea ya ndani. Mbinu ya 2^−ΔΔCt kwanza hurekebisha ishara ya jeni lengwa dhidi ya jeni rejea, kisha huonyesha mabadiliko katika kundi la majaribio kwa kulinganisha na kundi la marejeo. Mbinu hii haitoi idadi kamili ya molekuli, bali mabadiliko ya uonyeshaji wa jamaa yaliyosawazishwa.

ACSP Ilijaribiwaje Katika Jaribio la Panya?

Panya dume thelathini wa C57BL/6 waligawanywa kwa nasibu katika makundi sita; isipokuwa kundi la udhibiti, makundi yote yalipokea %3 DSS katika maji ya kunywa kwa siku 7, kisha DSS ikasitishwa na kwa siku 7 zilizofuata kundi la modeli likapokea PBS, kundi la udhibiti chanya likapokea 200 mg/kg mesalazine, na makundi ya ACSP yakapokea 100, 200 au 400 mg/kg ACSP mara moja kwa siku kwa gavage ya mdomo.

Fahirisi ya shughuli ya ugonjwa ilihesabiwaje?

Ukali wa koliti kwa panya ulitathminiwa kwa vipengele vitatu: kupungua kwa uzito wa mwili, uthabiti wa kinyesi na kutokwa damu kwa rektamu kunakoonekana kwa macho. Kila kipengele kilipewa alama 0–4.

DAI = alama ya kupungua kwa uzito wa mwili + alama ya uthabiti wa kinyesi + alama ya kutokwa damu kwa rektamu

Kwa hiyo DAI ya juu huwakilisha dalili kali zaidi za ugonjwa wa kliniki, na DAI ya chini huwakilisha jumla ya dalili nyepesi zaidi. Watafiti walifanya tathmini kwa wafanyakazi ambao hawakujua mgao wa makundi.

Fahirisi ya kiungo

Fahirisi ya kiungo iliyotumiwa kwa wengu na thymus ilihesabiwa kama ifuatavyo:

Fahirisi ya kiungo = uzito wa kiungo / uzito wa mwili

Uwiano huu husaidia kulinganisha makundi kwa kupunguza utegemezi wa uzito wa kiungo kwa ukubwa wa jumla wa mwili wa mnyama.

ACSP iliathirije dalili za ugonjwa?

Matumizi ya DSS yalizalisha picha ya koliti kali yenye kupungua kwa uzito, kuharisha na kinyesi chenye damu. Katika ANOVA ya vipimo vinavyorudiwa yenye mwelekeo miwili, iliripotiwa kuwa kundi la matibabu, muda na mwingiliano wa kundi × muda vilikuwa muhimu kwa DAI na uzito wa mwili wa jamaa; kwa athari zote hizi p < 0,0001.

Thamani za DAI katika makundi ya ACSP zilikuwa chini kwa kiasi muhimu kuliko kundi la modeli, na chanzo kinaeleza mabadiliko haya kuwa yanayohusiana na dozi. ACSP pia ilipunguza kuongezeka kwa wengu kulikohusiana na DSS na ongezeko la uwiano wa wengu/uzito wa mwili. Kufupika kwa koloni pia kulirekebishwa zaidi kadiri dozi ilivyoongezeka.

Histopatholojia ilionyesha nini?

Katika Kielelezo 4 cha chanzo kuna picha halisi za histolojia za H&E na AB-PAS. Katika kundi la modeli kulionekana vidonda vya mukosa, kuvurugika kwa muundo wa crypt, uingizaji mkubwa wa seli za uchochezi na mmomonyoko wa epitheliamu. Kwa matibabu ya ACSP, usanifu wa crypt ulilindwa vizuri zaidi, vidonda na uingizaji wa uchochezi ukapungua. Upakaji wa AB-PAS ulionyesha kurejea kwa seli za goblet.

Kwa kuwa picha hizi za histolojia ni ushahidi wa moja kwa moja wa mikroskopi, picha ya mikroskopi ya kutengenezwa haikutolewa ndani ya Verianla. Badala yake, matokeo ya kiasi ya histolojia yaliyotolewa katika chanzo yamehifadhiwa.

Katika kundi la modeli, seli za goblet zilipungua kutoka 26,0 ± 2,77 seli/crypt hadi 3,3 ± 1,73. Katika kundi la ACSP la dozi ya juu, idadi hii iliongezeka hadi 16,4 ± 1,69. Alama ya uharibifu wa histolojia ilipanda kutoka 0,5 ± 0,2 katika kundi la udhibiti hadi 10,4 ± 0,8 katika kundi la modeli, na kushuka hadi 4,8 ± 0,4 kwa ACSP ya dozi ya juu.

Sitokini za uchochezi na msongo wa kioksidishaji

Katika tishu za koloni za panya, ACSP ilipunguza uonyeshaji wa mRNA wa IL-1β, IL-6 na TNF-α kwa %38–82 ikilinganishwa na kundi la modeli kulingana na matokeo yaliyotolewa katika chanzo; na ilipunguza viwango vya protini vya sitokini hizo kwa %35–87. Athari ilionyesha mwelekeo unaotegemea dozi.

Katika kundi la ACSP la dozi ya juu, kiwango cha IL-10 mRNA kilifikia mara 5,8 ya kundi la modeli, na kiwango cha protini ya IL-10 mara 1,67. DSS ilipunguza shughuli za SOD na CAT huku ikiongeza shughuli ya MPO; ACSP ilirejesha shughuli za enzimu za kiantioksidanti na kupunguza MPO. ACSP ya dozi ya juu ilipunguza kiwango cha NO katika koloni kwa zaidi ya %80 ikilinganishwa na kundi la modeli.

Kizuizi cha utumbo: ZO-1, claudin-1 na occludin

Epitheliamu ya utumbo si ukuta wa kimwili pekee. Miungano mikaza kati ya seli jirani za epitheliamu huunda kizuizi muhimu kinachopunguza kupita bila udhibiti kwa vitu vilivyo katika lumen ya utumbo kwenda kwenye tishu. Utafiti ulichunguza protini za ZO-1, claudin-1 na occludin kwa ajili ya muundo huu.

DSS ilipunguza kwa kiasi kikubwa viwango vya mRNA vya protini hizi tatu. ACSP iliongeza uonyeshaji wake kwa namna inayotegemea dozi. Kiwango cha mRNA na protini ya ZO-1 kiliongezeka kwa zaidi ya %70 ikilinganishwa na kundi la modeli; katika uchambuzi wa immunofluorescence, nguvu ya fluorescence ya ZO-1 katika kundi lililotibiwa kwa ACSP ilifikia mara 8,9 ya kundi la modeli. Matokeo ya mwelekeo sawa yaliripotiwa kwa Claudin-1 na occludin.

Picha za Western blot na immunofluorescence zinaunga mkono ongezeko la protini hizi za kizuizi na kurejea kwa usambazaji wake kwenye utando wa epitheliamu. Hata hivyo, kwa kuwa picha halisi za immunofluorescence na Western blot ni ushahidi wa majaribio, hazikujengwa upya kwa njia bandia na Verianla.

ACSP ina peptidi zipi?

Kwa LC–MS/MS, mifuatano 516 ya peptidi ilitambuliwa ndani ya ACSP. Urefu wa peptidi ulitofautiana kati ya amino asidi 3–26. Kwa msingi wa idadi ya mifuatano, %54,37 ya peptidi ilikuwa katika 500–1000 Da, %41,94 katika 1000–2000 Da, %2,14 katika 500 Da au chini, na %1,55 katika 2000–3000 Da. Hivyo, mifuatano yenye uzito wa molekuli wa 1 kDa au chini iliwakilisha %56,51 ya jumla.

Ugawaji wa mifuatano ya peptidi wenye uhakika wa juu zaidi

Alama ya −10lgP hapa haionyeshi kiasi cha peptidi au ukubwa wa shughuli yake ya kibayolojia. Chanzo kinaeleza wazi kuwa alama ya juu huwakilisha uhakika wa juu zaidi wa utambulisho kwa ugawaji wa mfuatano unaotegemea hifadhidata.

Katika utambuzi wa peptidi, data ghafi za LC–MS/MS zilitafutwa kwa PEAKS Studio 11.5 dhidi ya hifadhidata ya protini ya UniProtKB Procambarus clarkii. Uvumilivu wa uzito wa precursor uliwekwa 10 ppm na uvumilivu wa fragment 0,02 Da. Wakati wa utafutaji, urefu wa peptidi ulipunguzwa kwa amino asidi 3–45; asetilishaji wa N-terminal (+42,01 Da) na uoksidishaji wa histidine/tryptophan (+15,99 Da) vilifafanuliwa kama marekebisho yanayobadilika.

Utambulisho ulichujwa katika kizingiti cha PEAKS −10lgP ≥ 37,04. Kiwango cha ugunduzi wa uongo kiliripotiwa kuwa %1,0 katika kiwango cha ulinganifu wa peptidi-spectrum na %1,4 katika kiwango cha mfuatano wa peptidi. Udhibiti huu wa ubora ni muhimu kwa kuelewa kwamba idadi ya “peptidi 516” si hesabu tu ya spectra ghafi; bali inawakilisha ugawaji wa mifuatano iliyopita vizingiti vya uhakika vilivyowekwa.

Mbinu zinazopendekezwa zina uhakika kiasi gani?

Waandishi wanajadili kwamba mabaki ya amino asidi yenye kunukia na yenye shughuli ya redoksi katika ACSP yanaweza kupunguza aina tendaji za oksijeni kwa kutoa elektroni au atomi ya hidrojeni. Inapendekezwa kuwa kupungua kwa msongo wa kioksidishaji kunaweza kudhoofisha ishara za MAPK na NF-κB zinazohisi redoksi; na kwa hivyo kuunda mazingira yanayofaa kwa kupungua kwa wapatanishi wa uchochezi na kurejea kwa protini za kizuizi kama ZO-1, claudin-1 na occludin.

Pia, mhimili wa AMPK–MLCK–MLC na njia kama Nrf2–Keap1 zimejadiliwa kama maelezo yanayowezekana. Hata hivyo, uanzishaji au uzuiaji wa moja kwa moja wa njia hizi haukuonyeshwa katika utafiti kwa majaribio maalumu ya kufungamana, vizuizi mahususi, kunyamazisha jeni au majaribio ya kuvuruga njia. Watafiti wanawasilisha mbinu hizi kama nadharia tete na wanaeleza wazi haja ya majaribio maalumu ya uthibitishaji.

Je, ACSP Inaweza Kutumika Kama Matibabu ya Koliti kwa Binadamu?

Utafiti huu haujibu swali hilo. Athari za kiantioksidanti na kupunguza uchochezi za ACSP zimeonyeshwa katika seli na katika modeli ya panya ya koliti kali iliyosababishwa na DSS; dozi, ufyonzwaji, umetaboli, ufanisi, usalama, uwezekano wa mzio au mwingiliano na matibabu yaliyopo havijachunguzwa kwa binadamu, na utafiti hauithibitishi ACSP kama tiba ya kliniki.

Kwa nini matokeo ya modeli ya panya hayawezi kuhamishwa moja kwa moja kwa binadamu?

Modeli ya DSS husababisha uchochezi unaofanana na koliti kali kwa kuharibu epitheliamu ya utumbo kwa kemikali, na ni modeli ya wanyama inayotumiwa sana kuchunguza uchochezi wa utumbo wa majaribio. Hata hivyo, koliti yenye vidonda na ugonjwa wa Crohn kwa binadamu ni magonjwa magumu zaidi, sugu na yenye utofauti mkubwa. Muundo wa kijenetiki, mikrobiota, mfumo wa kinga, sababu za mazingira, muda wa ugonjwa na dawa zinazotumiwa ni miongoni mwa vigezo vingi vinavyoshiriki kwa pamoja katika ugonjwa wa binadamu.

Kwa hiyo, ukweli kwamba 400 mg/kg ACSP ilikuwa na athari kwa panya hauonyeshi kuwa dozi hiyo hiyo au dozi yoyote iliyobadilishwa moja kwa moja itakuwa na ufanisi au salama kwa binadamu. Miongoni mwa mipaka ya utafiti wenyewe ni kutokuwepo kwa farmakokinetiki, mfiduo wa kimfumo, uthabiti katika njia ya chakula, ufyonzwaji, tathmini pana ya usalama na majaribio ya kliniki.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Tabaka za majaribio ya utafiti

1. Ganda la kamba wa maji baridi liliondolewa mafuta na muundo wa madini.
2. PCSP, ACSP, NCSP, TCSP na PECSP zilitengenezwa kwa protease tano tofauti.
3. Hidrolisati tano zilichunguzwa kwa majaribio ya kiantioksidanti na kupunguza uchochezi yasiyo na seli.
4. ACSP na NCSP zilitathminiwa katika seli za IEC-6 kwa uhai wa seli na uchochezi uliosababishwa na LPS.
5. ACSP, ambayo kwa ujumla ilionyesha athari yenye nguvu zaidi ya seli, ilipelekwa katika modeli ya panya ya koliti kali iliyosababishwa na DSS.
6. Kwa panya, shughuli ya ugonjwa, uzito wa mwili, urefu wa koloni, viungo vya kinga, histolojia, seli za goblet, sitokini, msongo wa kioksidishaji na protini za miunganisho mikaza zilipimwa.
7. Peptidi ndani ya ACSP zilitambuliwa kwa LC–MS/MS na kulinganishwa na vyanzo vya protini.

Muundo wa sampuli ya jaribio la wanyama

Jumla ya panya dume 30 wa C57BL/6 walitumika. Panya walikuwa na umri wa wiki 6 na uzito wa 20 ± 1 g. Baada ya siku tatu za kuzoea mazingira, waligawanywa kwa utaratibu wa namba nasibu katika makundi sita, wanyama watano kwa kila kundi. Watafiti wanaeleza kuwa ukubwa wa sampuli uliamuliwa kwa uchambuzi wa nguvu kabla ya jaribio na mawazo yaliwasilishwa katika Mbinu za Ziada. Hakuna mnyama au nukta ya data iliyoondolewa katika uchambuzi wa mwisho.

Upofushaji

Uzito wa mwili, sifa za kinyesi na hali ya jumla ya kliniki zilitathminiwa kila siku kwa wakati uleule na wafanyakazi ambao hawakujua mgao wa makundi. Uchambuzi wa tishu pia ulifanywa kwenye sampuli zilizowekewa misimbo hadi uchambuzi wa data ulipokamilika. Njia hii inalenga kupunguza athari ya kujua kwa mchunguzi sampuli ilitoka katika kundi gani la matibabu juu ya vipimo.

Histolojia

Tishu ya sehemu ya mwisho ya koloni ilifiksishwa katika %4 paraformaldehyde, ikaingizwa katika parafini na kukatwa kwa unene wa 5 µm. Upakaji wa hematoxylin-eosin ulitumika kutathmini uharibifu wa histolojia kupitia uingizaji wa uchochezi, uharibifu wa crypt na eneo lililoathirika. Seli za goblet zilitambuliwa kwa upakaji wa Alcian blue–periodic acid–Schiff (AB-PAS).

ELISA na uonyeshaji wa jeni

TNF-α, IL-1β, IL-6 na IL-10 zilipimwa kwa vifaa vya ELISA katika supernatant ya kultur ya IEC-6 na homogenati za koloni. Katika uchambuzi wa qPCR, iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 na occludin zilichunguzwa, na GAPDH ilitumika kama jeni rejea.

Western blot na immunofluorescence

Protini za ZO-1, claudin-1 na occludin katika tishu za koloni zilitathminiwa kwa Western blot. Kiasi sawa cha protini kilitenganishwa kwa %12,5 SDS-PAGE, kikahamishwa kwenye utando wa PVDF na kuwekewa incubation na kingamwili za msingi zinazohusika. Ishara zilirekebishwa dhidi ya GAPDH na kuonyeshwa kwa kulinganisha na kundi la udhibiti.

Katika uchambuzi wa immunofluorescence, sehemu za koloni za 5 µm zilipakwa ZO-1, claudin-1 na occludin, viini vikapakwa kwa DAPI kama rangi ya kinyume, na nguvu ya fluorescence ikahesabiwa kwa ImageJ 1.8.0. Kwa Western blot, sampuli tatu huru za koloni kutoka kwa panya tofauti katika kila kundi zilitumika; vipimo vya kiufundi havikuhesabiwa kama marudio huru ya kibayolojia.

Kifaa na masharti ya uchambuzi wa LC–MS/MS

Peptidi za ACSP zilichunguzwa katika spektromita ya wingi ya QE iliyounganishwa na mfumo wa EASY-nLC 1000. ACSP iliyeyushwa katika %0,1 formic acid, ikasentrifugwa katika 14.000×g kwa dakika 20 na 4 °C. Kutoka supernatant yenye mkusanyiko wa 1 mg/mL, 3 µL iliingizwa katika safu ya PepMap RSLC C18 kwa kiwango cha mtiririko wa 250 nL/dakika.

Data ghafi zilitafutwa kwa PEAKS Studio 11.5, build 20230821 dhidi ya hifadhidata ya UniProtKB Procambarus clarkii. Umahususi wa enzimu ulichaguliwa kuwa “None”, aina ya digestion “unspecific”, hadi missed cleavage tatu ziliruhusiwa, na urefu wa peptidi katika utafutaji uliwekwa amino asidi 3–45.

Uchambuzi wa takwimu

Data zilichambuliwa kwa GraphPad Prism 8 na kuwasilishwa kama wastani ± mkengeuko wa kawaida. Kabla ya majaribio ya kiparametriki, unormali wa mabaki ya modeli ulitathminiwa kwa Shapiro–Wilk na usawa wa variansi kati ya makundi kwa kipimo cha Levene.

DAI inayotegemea muda na uzito wa mwili wa jamaa vilichambuliwa kwa ANOVA ya mwelekeo miwili ya vipimo vinavyorudiwa yenye muundo mchanganyiko, ambapo kundi la matibabu lilikuwa kipengele cha kati ya makundi, muda kipengele cha ndani ya kundi, na panya kitengo cha kipimo kinachorudiwa. Wakati mwingiliano wa kundi × muda ulikuwa muhimu, kipimo cha Dunnett cha ulinganisho mwingi kilitumika kwa ulinganisho uliopangwa mapema dhidi ya kundi la modeli ya DSS mwishoni mwa jaribio.

Matokeo yaliyopimwa mara moja mwishoni mwa jaribio yalichambuliwa kwa ANOVA ya mwelekeo mmoja na kisha kipimo cha Tukey cha ulinganisho mwingi pale ambapo mawazo ya usambazaji wa kawaida na usawa wa variansi yalitimizwa. Vipimo vyote vilikuwa vya pande mbili na p < 0,05 ilitumika kama kikomo cha umuhimu wa kitakwimu.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• Uchaguzi wa protease ulibadilisha shughuli za kibayolojia zilizopimwa za hidrolisati zilizotokana na chanzo kilekile cha protini ya ganda la kamba wa maji baridi.
• ACSP na NCSP zilikuwa miongoni mwa wagombea wenye nguvu zaidi kwa ujumla katika uchunguzi wa awali wa kiantioksidanti/kupunguza uchochezi.
• ACSP kwa ujumla ilidhibiti viashiria vya uchochezi katika seli za IEC-6 zilizochochewa na LPS kwa nguvu zaidi kuliko NCSP.
• Katika modeli ya panya ya DSS, ACSP katika safu ya dozi ya 100–400 mg/kg ilihusishwa na maboresho yanayohusiana na dozi katika viashiria vingi vinavyohusiana na ugonjwa.
• ACSP ya dozi ya juu ilitoa matokeo bora kuliko kundi la modeli kuhusu DAI, kufupika kwa koloni, alama ya histolojia na upotevu wa seli za goblet.
• Matumizi ya ACSP yanahusishwa na kupungua kwa sitokini zinazochochea uchochezi, kuongezeka kwa IL-10, kurejea kwa shughuli za enzimu za kiantioksidanti, na kupungua kwa MPO na NO.
• Matokeo ya ZO-1, claudin-1 na occludin yanaunga mkono kwamba matumizi ya ACSP katika modeli ya panya yanahusishwa na uhifadhi bora wa kizuizi cha epitheliamu.
• LC–MS/MS ilionyesha kwamba ACSP ni hidrolisati mchanganyiko yenye mifuatano 516 ya peptidi iliyotambuliwa.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono

• Haijaonyeshwa kwamba ACSP hutibu koliti yenye vidonda au ugonjwa wa Crohn kwa binadamu.
• Haijaonyeshwa kwamba dozi za 100–400 mg/kg zilizotumiwa kwa panya ni dozi zinazofaa kwa binadamu.
• Haijabainishwa ni peptidi ipi au zipi kati ya 516 zinawajibika kwa athari ya kibayolojia.
• Ustahimilivu wa peptidi dhidi ya mmeng'enyo katika utumbo haujapimwa moja kwa moja.
• Upenyezaji wa utumbo, usafirishaji wa epitheliamu, kuingia katika mzunguko wa kimfumo na farmakokinetiki havijatathminiwa.
• Haijathibitishwa kwa majaribio kwamba njia za NF-κB, MAPK, Nrf2–Keap1 au AMPK–MLCK–MLC zinalengwa moja kwa moja na ACSP.
• Sumu ya muda mrefu, usalama mpana na uwezekano wa mzio havijatathminiwa.
• Hakuna jaribio la kliniki lililofanywa.

Nguvu ya utafiti na kikomo chake kikuu

Moja ya nguvu muhimu za utafiti ni kwamba hautegemei matokeo ya kipimo kimoja. Watafiti waliunda muundo wa majaribio wa hatua kwa hatua unaounganisha skriningi ya kienzimu na majaribio ya kemikali ya kiantioksidanti, modeli ya seli, modeli ya panya, histolojia, viashiria vya biokemia, uonyeshaji wa jeni, uchambuzi wa protini na utambuzi wa peptidomu.

Kwa upande mwingine, kikomo kikuu ni kwamba ACSP si molekuli moja safi, bali hidrolisati mchanganyiko yenye mifuatano 516 iliyotambuliwa. Kwa hiyo, haijatatuliwa ni peptidi zipi huathiri shabaha zipi kupitia utaratibu gani wa kufungamana au ishara. Aidha, jaribio la wanyama ni modeli ya DSS ya muda mfupi na kali; haliwakilishi biolojia yote ya ugonjwa sugu wa uchochezi wa utumbo kwa binadamu.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Utafiti asili: Anti-Inflammatory Protein Hydrolysate Screened from Crayfish Shells Attenuates Colitis by Oxidative Stress Suppression, Inflammation Reduction and Barrier Reconstruction

Waandishi: Lei Dong; Hao Wang; Yongmin Wu; Jinyang Peng; Shaohao Lai; Zexin Zhao; Yongqi Yin; Jun Cai.

Corresponding author: Jun Cai.

Taasisi: School of Life and Health Sciences, Hubei University of Technology, Wuhan, China; College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou, China.

Jarida: Foods.

Mchapishaji: MDPI, Basel, Switzerland.

Juzuu / toleo / namba ya makala: 15(19), 3389.

DOI: 10.3390/foods15193389.

Aina ya makala: Article; utafiti wa majaribio wa kabla ya kliniki.

Received: Katika Version of Record PDF tarehe 14 Agosti 2026.

Revised: Katika Version of Record PDF tarehe 18 Septemba 2026.

Accepted: Katika Version of Record PDF tarehe 20 Septemba 2026.

Published: Katika Version of Record PDF na rekodi kuu ya makala tarehe 23 Septemba 2026.

Maelezo ya metadata: Skrini tofauti ya Version Notes ya MDPI inaonyesha tarehe za uwasilishaji, marekebisho, kukubaliwa na kuchapishwa kuwa siku moja mapema kuliko Version of Record PDF. Kwa utambulisho wa kisayansi wa chanzo, tarehe za Version of Record PDF zimetumika kama msingi.

Hali ya uhakiki: Foods ni jarida la kimataifa lenye uhakiki wa kitaalamu na ufikiaji wazi linalochapishwa na MDPI. Mhariri wa kitaaluma wa makala ametajwa kuwa Ronaldo Vagner Thomatieli-Santos.

Leseni: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Ufadhili: National Natural Science Foundation of China, mradi 32302019; Research Fund for Key R&D Projects in Hubei Province, mradi 2022BBA0053.

Kamati ya maadili: Hubei University of Technology Animal Ethics Committee; itifaki HBUT20250021; tarehe ya idhini 25 Juni 2025.

Ridhaa iliyoarifiwa: Haitumiki.

Upatikanaji wa data: Michango asili ya utafiti imewasilishwa ndani ya makala na nyenzo za ziada; maswali ya ziada yanaweza kuelekezwa kwa corresponding author.

Mgongano wa maslahi: Waandishi wametangaza kuwa hakuna mgongano wa maslahi.

Michango ya waandishi: Uundaji wa dhana: L.D., H.W., Y.W.; metodolojia: L.D., J.P.; programu: S.L.; uthibitishaji: L.D., H.W., Y.W.; uchambuzi rasmi: S.L.; utafiti: J.P., S.L.; rasilimali: J.C., Z.Z.; uratibu wa data: J.P.; uonyeshaji: L.D., H.W.; ushauri/usimamizi: J.C., Z.Z.; usimamizi wa mradi: L.D., J.C., Z.Z.; upatikanaji wa ufadhili: J.C., Z.Z.; rasimu ya kwanza: L.D.; mapitio na uhariri: J.C., Z.Z., Y.Y.

Nyenzo za ziada: chromatogram ya total ion ya ACSP; grafu za udhibiti wa ubora wa LC–MS/MS; spectra za MS/MS zilizoelezewa; vigezo vya alama za DAI; vigezo vya uharibifu wa histolojia ya koloni; mifuatano ya primer; gradient ya elution ya LC; vigezo vya utafutaji wa LC–MS/MS; matokeo ya utambuzi wa peptidi na mawazo ya hesabu ya a priori ya ukubwa wa sampuli.

Kikomo kikuu cha kisayansi: Utafiti huu si jaribio la matibabu kwa binadamu. Upatikanaji wa kibiolojia wa ACSP kwa njia ya mdomo kwa binadamu, ufyonzwaji wa utumbo, farmakokinetiki, dozi yenye ufanisi, usalama wa muda mrefu, uwezekano wa mzio na manufaa ya kliniki havijabainishwa.

Kikomo cha utaratibu: Mabadiliko yaliyopimwa katika sitokini, msongo wa kioksidishaji na protini za kizuizi yanaendana na ACSP; hata hivyo, njia zilizopendekezwa kama NF-κB/MAPK, Nrf2–Keap1 na AMPK–MLCK–MLC hazijathibitishwa kwa majaribio ya moja kwa moja ya uthibitishaji wa shabaha.