Ishqoriy proteaza yordamida olingan daryo qisqichbaqasi qobig‘i oqsil gidrolizati (alkaline-protease-derived crayfish shell protein hydrolysate, ACSP), daryo qisqichbaqasi qobig‘i oqsillarining ishqoriy proteaza bilan fermentativ parchalanishi natijasida hosil bo‘ladigan aralash peptid gidrolizatidir. Tadqiqotchilar avval papain, ishqoriy proteaza, neytral proteaza, tripsin va pepsindan foydalanib besh xil daryo qisqichbaqasi qobig‘i oqsil gidrolizatini tayyorlagan; ularni antioksidant va yallig‘lanishga qarshi xususiyatlari bo‘yicha skriningdan o‘tkazgan; ajralib turgan ACSP va NCSP ni LPS bilan qo‘zg‘atilgan IEC-6 ichak epiteliy hujayralarida tekshirgan va umumiy hujayraviy ta’siri eng kuchli bo‘lgan ACSP ni DSS yordamida o‘tkir kolit chaqirilgan sichqon modelida baholagan. Yakuniy bosqichda ACSP ning peptid tarkibi LC–MS/MS yordamida tavsiflangan.

Dastlabki skriningda ACSP ning DPPH va ABTS•⁺ radikallari uchun IC₅₀ qiymatlari mos ravishda 0,888 ± 0,004 va 0,853 ± 0,003 mg/mL deb topilgan. ACSP shuningdek besh gidrolizat orasida eng yuqori gidroksil radikalini tutib qolish faolligini %29,525 ± 0,499 va eng yuqori superoksid anion radikalini tutib qolish faolligini %47,310 ± 1,351 ko‘rsatgan. Neytral proteaza gidrolizati NCSP esa ABTS•⁺ IC₅₀ qiymati va FRAP qaytarish qobiliyati bo‘yicha ayrim o‘lchovlarda ACSP dan kuchliroq natija bergan. Shu sababli dastlabki bosqich bitta test natijasiga emas, turli antioksidant va yallig‘lanishga qarshi ko‘rsatkichlarni birgalikda baholashga asoslangan.

LPS bilan qo‘zg‘atilgan IEC-6 hujayralarida ACSP va NCSP proyallig‘lanish iNOS, IL-1β, IL-6 va TNF-α o‘zgarishlarini kamaytirgan, yallig‘lanishga qarshi IL-10 yo‘nalishidagi javobni esa oshirgan; ACSP umuman olganda kuchliroq ta’sir ko‘rsatgan. Sichqon tajribasida tana vazniga nisbatan 100, 200 va 400 mg/kg dozada berilgan ACSP DSS sabab bo‘lgan vazn yo‘qotilishi, kasallik faolligi, yo‘g‘on ichakning qisqarishi, gistologik shikastlanish va bokalsimon hujayralar yo‘qolishini dozaga bog‘liq tarzda yengillashtirgan. Yuqori dozali ACSP guruhida 14-kun kasallik faolligi indeksi 3,60 ± 0,55 bo‘lgan, DSS model guruhida esa 9,40 ± 1,14; gistologik ball mos ravishda 4,80 ± 0,40 va 10,40 ± 0,80 deb qayd etilgan.

ACSP, shuningdek, proyallig‘lanish sitokinlari, miyeloperoksidaza faolligi va azot oksidi darajalarini kamaytirgan; superoksid dismutaza va katalaza faolliklarining tiklanishi hamda ZO-1, claudin-1 va occludin kabi zich birikma oqsillarining qayta ortishi bilan bog‘langan. LC–MS/MS tahlili ACSP tarkibida 516 ta peptid ketma-ketligini aniqlagan. Biroq ushbu tadqiqot odamlarda kolitni davolash samaradorligi yoki xavfsizligini ko‘rsatmaydi. Natijalar hujayra tizimi va qisqa muddatli sichqon modeli darajasidadir; gastrointestinal barqarorlik, ichakdan so‘rilish, farmakokinetika, tizimli ekspozitsiya, uzoq muddatli xavfsizlik, allergenlik va klinik samaradorlik baholanmagan.

Tadqiqotning asosiy muammosi

Yallig‘lanishli ichak kasalliklari; yarali kolit va Crohn kasalligi kabi surunkali yallig‘lanish buzilishlarini qamrab oladi. Kasallik jarayonida genetik moyillik, atrof-muhit omillari, ichak mikrobiotasining buzilishi, oksidativ stress va haddan tashqari immun faollashuv kabi ko‘plab tarkibiy qismlar birgalikda rol o‘ynashi mumkin. Tadqiqot mualliflari mavjud farmakologik davolashlar muhim bo‘lsa-da, nojo‘ya ta’sirlar, ikkilamchi javobning yo‘qolishi, xarajat va shilliq qavatning har bir bemorda to‘liq bitmasligi kabi cheklovlarga ega bo‘lishi mumkinligini ta’kidlab, oziq-ovqat manbali biologik faol peptidlarni tadqiq etishga arziydigan yo‘nalish sifatida ko‘radilar.

Tadqiqotning ikkinchi muammosi resurslardan foydalanish bilan bog‘liq. Qisqichbaqa (Procambarus clarkii) qayta ishlash sanoatida qobiqlar katta miqdorda yon mahsulot hosil qiladi. Manbaga ko‘ra, qobiq qismi umumiy daryo qisqichbaqasi biomassasining taxminan %60–70 ini tashkil qilishi va taxminan %20–30 xitin hamda %20–40 oqsilni o‘z ichiga olishi mumkin. Shunga qaramay, ushbu materialdan yuqori qo‘shimcha qiymatli foydalanish cheklangan. Shu bois tadqiqot bir xil eksperimental doirada ham ichak salomatligiga qaratilgan biologik faollikni, ham dengiz/akvatik oziq-ovqatni qayta ishlash yon mahsulotidan foydalanishni ko‘rib chiqadi.

Oqsil gidrolizati nima?

Oqsil gidrolizati katta oqsil molekulalarining fermentlar yordamida kichikroq peptidlar va peptid bo‘laklariga parchalanishi natijasida olinadigan aralashmadir. Proteazaning qaysi peptid bog‘larini afzal kesishi hosil bo‘lgan peptidlarning uzunligi, aminokislota ketma-ketligi va shunga mos ravishda fizik-kimyoviy xususiyatlarini o‘zgartirishi mumkin. Shu sababli bir xil daryo qisqichbaqasi qobig‘i oqsili turli proteazalar bilan parchalansa, biologik faolligi turlicha gidrolizatlar hosil bo‘lishi mumkin.

Ushbu tadqiqotning asosiy eksperimental mantiqi aynan shundan iborat: bir xil asosiy oqsil manbai besh xil proteaza bilan gidrolizlangan, hosil bo‘lgan mahsulotlar taqqoslangan va umumiy biologik faolligi eng kuchli nomzod keyingi tajriba bosqichlariga o‘tkazilgan.

Qisqichbaqa qobig‘i gidrolizatlari qanday tayyorlandi?

Qisqichbaqa qobiqlari mayda bo‘laklarga ajratilgan, quritilgan, mexanik ravishda maydalangan va 60 mesh elakdan o‘tkazilgan. Qobiq kukuni avval 1:10 (w/v) nisbatda petroleum efiri bilan aralashtirilib, xona haroratida 6 soat magnitli aralashtirishga qo‘yilgan va yog‘ni o‘z ichiga olgan erituvchi filtrlash yo‘li bilan olib tashlangan.

Yog‘sizlantirilgan material keyin 1 M HCl bilan 1:10 (w/v) nisbatda 2 soat davomida dekalsifikatsiya qilingan. Aralashma 5000×g da 20 daqiqa sentrifugalangan, supernatant olib tashlangan va qattiq qoldiq quritilib dekalsifikatsiyalangan daryo qisqichbaqasi qobig‘i kukuni olingan.

Gidroliz bosqichida qobiq kukuni distillangan suvda 1:25 (w/v) nisbatda dispersiyalangan va besh xil proteaza uchun belgilangan sharoitlarda 6 soat gidroliz qilingan. Reaksiya oxirida fermentlar 95 °C da 15 daqiqa ushlab inaktivatsiya qilingan; mahsulot 0,45 µm filtrdan o‘tkazilgan, filtrat liyofilizatsiya qilingan va 4 °C da saqlangan.

Manbada, shuningdek, gidrolizatlar 4 °C da 0, 7, 15 va 30 kun saqlangandan keyin antioksidant va yallig‘lanishga qarshi testlar takrorlanib, ularning funksional barqarorligi baholangani usullar bo‘limida ko‘rsatiladi. Biroq asosiy maqolaning natijalar bo‘limida ushbu saqlash qatoriga oid batafsil miqdoriy natijalar alohida asosiy natijalar to‘plami sifatida taqdim etilmagan; shu sababli Verianla matnida manbada bo‘lmagan barqarorlik raqamlari yaratilmagan.

Nega ACSP Besh Gidrolizat Orasidan Keyingi Tajribalarga Olib O‘tildi?

ACSP barcha antioksidant testlarda yakka holda birinchi bo‘lmagan bo‘lsa-da, radikallarni tutib qolish, SOD/CAT javobi, NO ajralishi va albumin denaturatsiyasi testlarida kuchli hamda muvozanatli profil ko‘rsatgan; ACSP va NCSP birinchi hujayraviy bosqichga tanlangan va LPS bilan qo‘zg‘atilgan IEC-6 hujayralarida ACSP umuman olganda kuchliroq yallig‘lanishga qarshi javob bergani sababli sichqon modelida ACSP baholangan.

Besh gidrolizatning antioksidant skriningi

DPPH va ABTS testlarida IC₅₀ qiymatining pastroq bo‘lishi %50 radikal tutib qolish darajasiga pastroq gidrolizat konsentratsiyasida erishilganini va shu sababli kuchliroq faollikni anglatadi. FRAP va to‘g‘ridan-to‘g‘ri tutib qolish foizlarida esa yuqoriroq qiymat kuchliroq antioksidant javobni bildiradi. Demak, 2-jadval bitta “g‘olib” testdan emas, turli redoks xususiyatlarini o‘lchaydigan bir nechta metrikadan tashkil topgan.

Manbaning 1-rasmida ACSP SOD faolligini taxminan %25, CAT faolligini esa %18 dan ko‘proq oshirgani va bu o‘sishlar PCSP hamda PECSP ga nisbatan sezilarli darajada yuqori bo‘lgani qayd etiladi. Hujayrasiz tizimda ACSP SNP manbali NO ajralishini %20 dan ko‘proq bostirgan va issiqlik bilan induksiya qilingan albumin denaturatsiyasida %12,21 bilan eng yuqori ingibitsiyani ko‘rsatgan.

Albumin denaturatsiyasini bostirish va hujayrasiz NO testi yallig‘lanishga qarshi potensial uchun skrining ko‘rsatkichlaridir. Ular o‘z-o‘zidan tirik organizmda yallig‘lanish yo‘llari to‘g‘ridan-to‘g‘ri boshqarilishini isbotlamaydi. Mualliflar ham muhokama bo‘limida hujayrasiz test natijalari makrofag manbali mediatorlarning bevosita modulyatsiyasini ko‘rsatmasligini alohida ta’kidlaydi.

DPPH radikal tutib qolish tenglamasi

DPPH tutib qolish faolligi (%) = [A₀ − (A₁ − A₂)] / A₀ × 100

Bu yerda A₀ metanol + DPPH bo‘lgan nazoratning absorbansidir; A₁ namuna + DPPH aralashmasining absorbansidir; A₂ esa namuna + metanol bo‘lgan namuna blankining absorbansidir. Namuna rangining yoki uning o‘z optik xususiyatlarining DPPH signaliga qo‘shadigan hissasini A₂ bilan tuzatish haqiqiy radikal tutib qolish ta’sirini aniqroq ajratishga yordam beradi.

Gidrolizatlar 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 va 1,0 mg/mL konsentratsiyalarda tekshirilgan va DPPH o‘lchovi 517 nm da amalga oshirilgan. IC₅₀, %50 tutib qolish faolligini ta’minlaydigan gidrolizat konsentratsiyasi sifatida ta’riflangan.

ABTS•⁺ testi

ABTS•⁺ testida gidrolizatlar yana 0,2–1,0 mg/mL oralig‘ida baholangan. ABTS radikal kationi 7 mM ABTS bilan 2,45 mM kaliy persulfatni 1:1 hajm nisbatida aralashtirish va aralashmani xona haroratida qorong‘ida 16–24 soat saqlash orqali tayyorlangan. Ishchi eritma 734 nm da 0,70 ± 0,02 absorbansgacha suyultirilgan; namuna bilan 6 daqiqa inkubatsiyadan so‘ng o‘lchov bajarilgan.

ABTS•⁺ tutib qolish faolligi (%) = (A₀ − A₁) / A₀ × 100

A₀ blank nazoratning, A₁ esa test namunasining absorbansidir.

FRAP va boshqa radikal testlari

FRAP testi ferrik temirning qaytarilish qobiliyatini baholaydi va natijalar quruq namuna uchun µmol Fe(II) ekvivalenti sifatida ifodalangan. Tadqiqotchilar 100–1000 µM FeSO₄ standartlaridan y = 0,2638x + 0,0651 va R² = 0,9992 kalibratsiya egri chizig‘ini yaratgan.

Gidroksil radikali testida namuna 1 mg/mL konsentratsiyada ishlatilgan va tutib qolish foizi quyidagicha hisoblangan:

•OH tutib qolish faolligi (%) = [(A₀ − A) / A₀] × 100

Superoksid anion testida esa katexol autooksidlanishi kuzatilgan va hisoblash:

O₂•⁻ tutib qolish faolligi (%) = [1 − (ΔA_s − ΔA_b) / ΔA₀] × 100

ko‘rinishida bajarilgan. ΔA_s, ΔA_b va ΔA₀ mos ravishda namuna, namuna blanki va suv nazoratida 0 bilan 5 daqiqa oralig‘idagi absorbans o‘zgarishlarini ifodalaydi.

NO ajralishi va albumin denaturatsiyasining ingibitsiyasi

SNP manbali NO ajralishi hujayrasiz tizimda Griess reaksiyasi bilan baholangan:

NO ajralishini ingibitsiyalash (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

Albumin denaturatsiyasi testida %1 BSA bo‘lgan aralashma 37 °C da 15 daqiqa saqlangan va keyin 90 °C da 20 daqiqa qizdirilgan. Loyqalik 660 nm da o‘lchangan va ingibitsiya:

Denaturatsiyani ingibitsiyalash (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

formulasi bilan hisoblangan.

IEC-6 hujayra modeli qanday qurildi?

IEC-6 hujayralari %10 fetal qoramol zardobi, 100 U/mL penitsillin, 100 µg/mL streptomitsin va 0,1 IU/mL insulin bo‘lgan DMEM muhitida 37 °C va %5 CO₂ sharoitida kultivatsiya qilingan.

Yashovchanlik vaqt qatori uchun hujayralar 96 quduqchali plastinkalarda 1 × 10⁵ hujayra/mL zichlikda tayyorlangan va ACSP yoki NCSP ning 0,1–2,0 mg/mL konsentratsiyalari bilan 48 soatgacha ishlov berilgan. CCK-8 o‘lchovlari 0, 12, 24, 36 va 48-soatlarda bajarilgan. ACSP da eng katta yashovchanlik o‘sishi 36-soatda 0,05 mg/mL darajasida; NCSP da esa 36-soatda 0,25 mg/mL darajasida kuzatilgan.

Yallig‘lanish tajribasida hujayralar 12 quduqchali plastinkalarda 3 × 10⁵ hujayra/quduq zichlikda 12 soat kultivatsiya qilingan, 0,1 mg/mL LPS bilan 4 soat qo‘zg‘atilgan va keyin 0,025–0,5 mg/mL ACSP yoki NCSP bilan 24 soat ishlov berilgan.

LPS qo‘llanishi iNOS, IL-1β, IL-6 va TNF-α kabi proyallig‘lanish genlarining ekspressiyasini oshirgan, IL-10 ni esa kamaytirgan. Har ikki gidrolizat bu o‘zgarishlarga teskari yo‘nalishda ta’sir qilgan, biroq ACSP umuman NCSP dan kuchliroq javob ko‘rsatgan. Kultur supernatantidagi ELISA natijalarida ham IL-1β, IL-6 va TNF-α kamaygan, IL-10 esa oshgan.

qPCR da 2^−ΔΔCt usuli nima maqsadda ishlatildi?

Tadqiqotda iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 va occludin genlarining nisbiy mRNA ekspressiyasi qPCR orqali o‘lchangan va GAPDH endogen referens gen sifatida ishlatilgan. 2^−ΔΔCt usuli nishon gen signalini avval referens genga nisbatan normallashtiradi, so‘ng tajriba guruhidagi o‘zgarishni taqqoslash guruhiga nisbatan nisbiy tarzda ifodalaydi. Bu usul mutlaq molekulalar sonini emas, normallashtirilgan nisbiy ekspressiya o‘zgarishini beradi.

Sichqon Tajribasida ACSP Qanday Sinovdan O‘tkazildi?

O‘ttizta erkak C57BL/6 sichqon tasodifiy ravishda olti guruhga taqsimlangan; nazoratdan tashqari barcha guruhlar 7 kun davomida ichimlik suvda %3 DSS olgan, so‘ng DSS to‘xtatilgan va keyingi 7 kun davomida model guruhiga PBS, musbat nazorat guruhiga 200 mg/kg mesalazin, ACSP guruhlariga esa 100, 200 yoki 400 mg/kg ACSP kuniga bir marta og‘iz orqali gavage yo‘li bilan berilgan.

Kasallik faolligi indeksi qanday hisoblandi?

Sichqonlarda kolit og‘irligi tana vazni yo‘qotilishi, najas konsistensiyasi va makroskopik rektal qon ketishi kabi uch tarkibiy qism bo‘yicha baholangan. Har bir tarkibiy qism 0–4 oralig‘ida ballangan.

DAI = tana vazni yo‘qotilishi bali + najas konsistensiyasi bali + rektal qon ketishi bali

Shu sababli yuqoriroq DAI og‘irroq klinik kasallik belgilarini, pastroq DAI esa yengilroq belgilar yig‘indisini ifodalaydi. Tadqiqotchilar baholashlarni guruh taqsimotidan bexabar xodimlar bilan amalga oshirgan.

Organ indeksi

Taloq va timus uchun ishlatilgan organ indeksi quyidagicha hisoblangan:

Organ indeksi = organ vazni / tana vazni

Bu nisbat organ vaznini hayvonning umumiy tana kattaligidan nisbatan mustaqil qilib, guruhlar o‘rtasida taqqoslashga yordam beradi.

ACSP kasallik belgilariga qanday ta’sir qildi?

DSS qo‘llanishi vazn yo‘qotilishi, diareya va qonli najas bilan tavsiflangan o‘tkir kolit manzarasini yuzaga keltirgan. Ikki yo‘nalishli takroriy o‘lchovlar ANOVA sida davolash guruhi, vaqt va guruh × vaqt o‘zaro ta’siri ham DAI, ham nisbiy tana vaznida sezilarli ekanligi qayd etilgan; barcha ushbu ta’sirlar uchun p < 0,0001.

ACSP guruhlarida DAI qiymatlari model guruhidan sezilarli darajada past bo‘lgan va manba bu o‘zgarishni dozaga bog‘liq deb ta’riflaydi. ACSP, shuningdek, DSS bilan bog‘liq taloq kattalashishini va taloq/tana vazni nisbatining oshishini kamaytirgan. Yo‘g‘on ichak qisqarishi ham doza ortishi bilan ko‘proq tuzatilgan.

Gistopatologiya nimani ko‘rsatdi?

Manbaning 4-rasmida haqiqiy H&E va AB-PAS gistologik tasvirlari mavjud. Model guruhida shilliq qavat yaralanishi, kript tuzilishining buzilishi, kuchli yallig‘lanish infiltratsiyasi va epiteliy eroziyasi kuzatilgan. ACSP bilan davolashda kript arxitekturasi yaxshiroq saqlangan, yaralanish va yallig‘lanish infiltratsiyasi kamaygan. AB-PAS bo‘yash bokalsimon hujayralarning tiklanishini ko‘rsatgan.

Bu gistologik tasvirlar bevosita mikroskopik dalil bo‘lgani uchun Verianla da sintetik mikroskopiya tasviri yaratilmagan. Buning o‘rniga manbada keltirilgan miqdoriy gistologik natijalar saqlangan.

Model guruhida bokalsimon hujayralar 26,0 ± 2,77 hujayra/kript qiymatidan 3,3 ± 1,73 gacha kamaygan. Yuqori dozali ACSP guruhida bu son 16,4 ± 1,69 gacha ko‘tarilgan. Gistologik shikastlanish bali nazorat guruhidagi 0,5 ± 0,2 dan model guruhida 10,4 ± 0,8 gacha oshgan va yuqori dozali ACSP bilan 4,8 ± 0,4 gacha pasaygan.

Yallig‘lanish sitokinlari va oksidativ stress

Sichqon yo‘g‘on ichak to‘qimasida ACSP, manbada qayd etilgan natijalarga ko‘ra model guruhiga nisbatan IL-1β, IL-6 va TNF-α mRNA ekspressiyasini %38–82; ayni sitokinlarning oqsil konsentratsiyalarini esa %35–87 kamaytirgan. Ta’sir dozaga bog‘liq tendensiya ko‘rsatgan.

Yuqori dozali ACSP guruhida IL-10 mRNA darajasi model guruhining 5,8 baravariga, IL-10 oqsil darajasi esa 1,67 baravariga yetgan. DSS SOD va CAT faolliklarini pasaytirgan, MPO faolligini esa oshirgan; ACSP antioksidant fermentlar faolligini tiklagan va MPO ni kamaytirgan. Yuqori dozali ACSP yo‘g‘on ichakdagi NO darajasini model guruhiga nisbatan %80 dan ko‘proq kamaytirgan.

Ichak baryeri: ZO-1, claudin-1 va occludin

Ichak epiteliyi faqat jismoniy devor emas. Qo‘shni epiteliy hujayralari orasidagi zich birikma komplekslari ichak lumenidagi moddalarning nazoratsiz ravishda to‘qimaga o‘tishini cheklaydigan muhim baryer hosil qiladi. Tadqiqot ushbu tuzilma uchun ZO-1, claudin-1 va occludin oqsillarini tekshirgan.

DSS ushbu uch oqsilning mRNA darajalarini sezilarli ravishda kamaytirgan. ACSP ularning ekspressiyasini dozaga bog‘liq tarzda oshirgan. ZO-1 mRNA va oqsil darajasi model guruhiga nisbatan %70 dan ko‘proq oshgan; immunoflyuorestsensiya tahlilida ACSP bilan davolangan guruhdagi ZO-1 flyuorestsensiya intensivligi model guruhining 8,9 baravariga yetgan. Claudin-1 va occludin uchun ham shunga o‘xshash yo‘nalishdagi natijalar qayd etilgan.

Western blot va immunoflyuorestsensiya tasvirlari ushbu baryer oqsillarining ortishi va epiteliy membranasi bo‘ylab tarqalishining tiklanishini qo‘llab-quvvatlaydi. Biroq haqiqiy immunoflyuorestsensiya va Western blot tasvirlari eksperimental dalil bo‘lgani uchun Verianla tomonidan sun’iy ravishda qayta yaratilmagan.

ACSP qaysi peptidlarni o‘z ichiga oladi?

LC–MS/MS yordamida ACSP tarkibida 516 ta peptid ketma-ketligi aniqlangan. Peptidlarning uzunligi 3–26 aminokislota oralig‘ida bo‘lgan. Ketma-ketliklar soni asosida peptidlarning %54,37 i 500–1000 Da, %41,94 i 1000–2000 Da, %2,14 i 500 Da yoki undan past va %1,55 i 2000–3000 Da oralig‘idadir. Shunday qilib, 1 kDa yoki undan past molekulyar massaga ega ketma-ketliklar umumiy sonning %56,51 ini tashkil etadi.

Eng yuqori ishonchli peptid ketma-ketligi tayinlari

Bu yerdagi −10lgP bali peptid miqdorini yoki biologik faollik kattaligini ko‘rsatmaydi. Manbada yuqoriroq ball ma’lumotlar bazasiga asoslangan ketma-ketlik tayinining yuqoriroq identifikatsiya ishonchini anglatishi alohida qayd etilgan.

Peptidlarni identifikatsiyalashda xom LC–MS/MS ma’lumotlari UniProtKB Procambarus clarkii oqsil ma’lumotlar bazasiga qarshi PEAKS Studio 11.5 yordamida qidirilgan. Prekursor massa tolerantligi 10 ppm, fragment tolerantligi 0,02 Da qilib belgilangan. Qidiruv vaqtida peptid uzunligi 3–45 aminokislota bilan cheklangan; N-terminal atsetillanish (+42,01 Da) hamda gistidin/triptofan oksidlanishi (+15,99 Da) o‘zgaruvchan modifikatsiya sifatida belgilangan.

Identifikatsiyalar PEAKS −10lgP ≥ 37,04 chegarasida filtrlangan. Noto‘g‘ri kashf etish darajasi peptid-spektr mosligi darajasida %1,0, peptid ketma-ketligi darajasida %1,4 deb qayd etilgan. Ushbu sifat nazorati “516 peptid” soni faqat xom spektrlarni sanash emasligini; belgilangan ishonch chegaralaridan o‘tgan ketma-ketlik tayinlarini anglatishini tushunish uchun muhimdir.

Taklif qilingan mexanizmlar qanchalik aniq?

Mualliflar ACSP dagi aromatik va redoks-faol aminokislota qoldiqlari elektron yoki vodorod atomini berib reaktiv kislorod turlarini cheklashi mumkinligini muhokama qiladilar. Oksidativ stressning kamayishi redoksga sezgir MAPK va NF-κB signalini susaytirishi; shu orqali yallig‘lanish mediatorlarining kamayishiga hamda ZO-1, claudin-1 va occludin kabi baryer oqsillarining tiklanishi uchun qulay muhit yaratishi mumkinligi ilgari suriladi.

Bundan tashqari, AMPK–MLCK–MLC o‘qi va Nrf2–Keap1 kabi yo‘llar mumkin bo‘lgan tushuntirishlar qatorida muhokama qilingan. Ammo tadqiqotda ushbu yo‘llarning bevosita faollashuvi yoki ingibitsiyasi maqsadli bog‘lanish tajribalari, maxsus ingibitorlar, genetik susaytirish yoki yo‘lni buzish tajribalari bilan ko‘rsatilmagan. Tadqiqotchilar bu mexanizmlarni gipoteza sifatida taqdim etadi va maqsadli tasdiqlash tajribalari zarurligini ochiq aytadi.

ACSP Odamlarda Kolitni Davolash Sifatida Ishlatilishi Mumkinmi?

Ushbu tadqiqot bunga javob bermaydi. ACSP ning antioksidant va yallig‘lanishga qarshi ta’sirlari hujayralarda va DSS yordamida hosil qilingan o‘tkir sichqon koliti modelida ko‘rsatilgan; odamlarda doza, so‘rilish, metabolizm, samaradorlik, xavfsizlik, allergenlik yoki mavjud davolashlar bilan o‘zaro ta’sir o‘rganilmagan va tadqiqot ACSP ni klinik davolash sifatida tasdiqlamaydi.

Nega sichqon modelidagi natijani bevosita odamga ko‘chirish mumkin emas?

DSS modeli ichak epiteliyiga kimyoviy shikast yetkazib, o‘tkir kolitga o‘xshash yallig‘lanish hosil qiladi va eksperimental ichak yallig‘lanishini o‘rganishda keng qo‘llaniladigan hayvon modelidir. Biroq odamlardagi yarali kolit va Crohn kasalligi ancha murakkab, surunkali va geterogen kasalliklardir. Genetik tuzilish, mikrobiota, immun tizim, atrof-muhit omillari, kasallik davomiyligi va qo‘llanadigan dorilar kabi ko‘plab o‘zgaruvchilar inson kasalligida birgalikda rol o‘ynaydi.

Shu sababli sichqonlarda 400 mg/kg ACSP samarali bo‘lishi odamlarda ayni doza yoki bevosita o‘girilgan boshqa doza samarali yoki xavfsiz bo‘lishini ko‘rsatmaydi. Tadqiqotning o‘z cheklovlari qatoriga farmakokinetika, tizimli ekspozitsiya, gastrointestinal barqarorlik, so‘rilish, keng qamrovli xavfsizlik va klinik tadqiqotlarning yo‘qligi kiradi.

Tadqiqot Usuli va Natijalari

Tadqiqotning eksperimental qatlamlari

1. Qisqichbaqa qobig‘i yog‘ va mineral tuzilmalardan tozalandi.
2. Besh xil proteaza bilan PCSP, ACSP, NCSP, TCSP va PECSP ishlab chiqarildi.
3. Besh gidrolizat antioksidant va hujayrasiz yallig‘lanishga qarshi testlar bilan skrining qilindi.
4. ACSP va NCSP IEC-6 hujayralarida yashovchanlik va LPS keltirib chiqargan yallig‘lanish nuqtai nazaridan baholandi.
5. Umuman kuchliroq hujayraviy ta’sir ko‘rsatgan ACSP DSS bilan hosil qilingan o‘tkir kolit sichqon modeliga o‘tkazildi.
6. Sichqonlarda kasallik faolligi, tana vazni, yo‘g‘on ichak uzunligi, immun organlar, gistologiya, bokalsimon hujayralar, sitokinlar, oksidativ stress va zich birikma oqsillari o‘lchandi.
7. ACSP tarkibidagi peptidlar LC–MS/MS bilan aniqlandi va oqsil manbalari bilan moslashtirildi.

Hayvon tajribasining namuna tuzilishi

Jami 30 ta erkak C57BL/6 sichqon ishlatilgan. Sichqonlar 6 haftalik va 20 ± 1 g vaznda bo‘lgan. Uch kunlik moslashuvdan so‘ng tasodifiy son prosedurasi bilan olti guruhga, har guruhga beshtadan hayvon taqsimlangan. Tadqiqotchilar namuna hajmi tajribadan oldingi quvvat tahlili bilan aniqlanganini va farazlar Qo‘shimcha Usullarda berilganini bildiradi. Yakuniy tahlildan birorta hayvon yoki ma’lumot nuqtasi chiqarib tashlanmagan.

Ko‘r usul

Tana vazni, najas xususiyatlari va umumiy klinik holat har kuni bir xil vaqtda guruh taqsimotidan bexabar xodimlar tomonidan baholangan. To‘qima tahlillari ham ma’lumotlar tahlili tugaguncha kodlangan namunalar bilan bajarilgan. Bu yondashuv kuzatuvchining namuna qaysi davolash guruhidan ekanini bilishi o‘lchovga ta’sirini kamaytirishni maqsad qiladi.

Gistologiya

Distal yo‘g‘on ichak to‘qimasi %4 paraformaldehidda fiksatsiya qilingan, parafinga joylangan va 5 µm qalinlikda kesilgan. Gematoksilin-eozin bo‘yash yallig‘lanish infiltratsiyasi, kript shikastlanishi va ta’sirlangan maydon asosida gistologik shikastni baholashda ishlatilgan. Bokalsimon hujayralar Alcian blue–periodic acid–Schiff (AB-PAS) bo‘yog‘i bilan aniqlangan.

ELISA va gen ekspressiyasi

IEC-6 kultur supernatanti va yo‘g‘on ichak gomogenatlarida TNF-α, IL-1β, IL-6 va IL-10 ELISA to‘plamlari bilan o‘lchangan. qPCR tahlilida iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 va occludin tekshirilgan, GAPDH referens gen sifatida ishlatilgan.

Western blot va immunoflyuorestsensiya

Yo‘g‘on ichak to‘qimasida ZO-1, claudin-1 va occludin oqsillari Western blot bilan baholangan. Teng miqdordagi oqsil %12,5 SDS-PAGE bilan ajratilgan, PVDF membranaga o‘tkazilgan va tegishli birlamchi antitanalar bilan inkubatsiya qilingan. Signallar GAPDH ga normallashtirilgan va nazorat guruhiga nisbatan ifodalangan.

Immunoflyuorestsensiya tahlilida 5 µm yo‘g‘on ichak kesimlarida ZO-1, claudin-1 va occludin bo‘yalgan, yadrolar DAPI bilan qarshi bo‘yalgan va flyuorestsensiya intensivligi ImageJ 1.8.0 yordamida miqdoriylashtirilgan. Western blot uchun har bir guruhdan turli sichqonlarga tegishli uchta mustaqil yo‘g‘on ichak namunasi ishlatilgan; texnik o‘lchovlar mustaqil biologik takror sifatida hisoblanmagan.

LC–MS/MS qurilma va tahlil sharoitlari

ACSP peptidlari EASY-nLC 1000 tizimiga ulangan QE massa spektrometrida tekshirilgan. ACSP %0,1 chumoli kislotasida eritilgan, 14.000×g da 20 daqiqa va 4 °C da sentrifugalangan. 1 mg/mL konsentratsiyadagi supernatantdan 3 µL, PepMap RSLC C18 koloniga 250 nL/daqiqa oqim tezligida yuborilgan.

Xom ma’lumotlar PEAKS Studio 11.5, build 20230821 yordamida UniProtKB Procambarus clarkii ma’lumotlar bazasiga qarshi qidirilgan. Ferment spetsifikligi “None”, hazm turi “unspecific” tanlangan, ko‘pi bilan uch missed cleavage ga ruxsat berilgan va qidiruv peptid uzunligi 3–45 aminokislota qilib belgilangan.

Statistik tahlil

Ma’lumotlar GraphPad Prism 8 yordamida tahlil qilingan va o‘rtacha ± standart og‘ish ko‘rinishida taqdim etilgan. Parametrik testlardan oldin model qoldiqlarining normalligi Shapiro–Wilk, guruhlar o‘rtasidagi dispersiya bir xilligi Levene testi bilan baholangan.

Vaqtga bog‘liq DAI va nisbiy tana vazni, davolash guruhi guruhlararo omil, vaqt guruh ichidagi omil va sichqon takroriy o‘lchov birligi bo‘lgan ikki yo‘nalishli aralash dizaynli takroriy o‘lchovlar ANOVA si bilan tahlil qilingan. Guruh × vaqt o‘zaro ta’siri sezilarli bo‘lganda tajriba oxirida DSS model guruhiga qarshi oldindan belgilangan taqqoslashlar uchun Dunnett ko‘p taqqoslash testi ishlatilgan.

Tajriba oxirida bir marta o‘lchangan natijalar normal taqsimot va dispersiya bir xilligi farazlari bajarilganda bir yo‘nalishli ANOVA, keyin esa Tukey ko‘p taqqoslash testi bilan tahlil qilingan. Barcha testlar ikki tomonlama bo‘lib, p < 0,05 statistik ahamiyatlilik chegarasi sifatida ishlatilgan.

Tadqiqot qo‘llab-quvvatlaydigan natijalar

• Proteaza tanlovi bir xil daryo qisqichbaqasi qobig‘i oqsil manbasidan olingan gidrolizatlarning o‘lchangan biologik faolliklarini o‘zgartirgan.
• ACSP va NCSP dastlabki antioksidant/yallig‘lanishga qarshi skriningda eng kuchli umumiy nomzodlar qatorida bo‘lgan.
• ACSP LPS bilan qo‘zg‘atilgan IEC-6 hujayralaridagi yallig‘lanish markerlarini umuman NCSP dan kuchliroq tartibga solgan.
• DSS sichqon modelida ACSP 100–400 mg/kg doza oralig‘ida kasallik bilan bog‘liq ko‘plab ko‘rsatkichlarda dozaga bog‘liq yaxshilanishlar bilan bog‘langan.
• Yuqori dozali ACSP DAI, yo‘g‘on ichak qisqarishi, gistologik ball va bokalsimon hujayra yo‘qolishi bo‘yicha model guruhidan yaxshiroq natija ko‘rsatgan.
• ACSP qo‘llanishi proyallig‘lanish sitokinlarining kamayishi, IL-10 ortishi, antioksidant ferment faolliklarining tiklanishi, MPO va NO kamayishi bilan bog‘liq.
• ZO-1, claudin-1 va occludin natijalari ACSP qo‘llanishi sichqon modelida epiteliy baryerining yaxshiroq saqlanishi bilan bog‘liqligini qo‘llab-quvvatlaydi.
• LC–MS/MS ACSP 516 ta aniqlangan peptid ketma-ketligini o‘z ichiga oladigan aralash gidrolizat ekanini ko‘rsatgan.

Tadqiqot qo‘llab-quvvatlamaydigan natijalar

• ACSP odamlarda yarali kolit yoki Crohn kasalligini davolashi ko‘rsatilmagan.
• Sichqonlarda ishlatilgan 100–400 mg/kg dozalar odamlar uchun mos doza ekani ko‘rsatilmagan.
• 516 ta peptiddan qaysi biri yoki qaysilari biologik ta’sir uchun mas’ul ekani aniqlanmagan.
• Peptidlarning ichakda hazmga chidamliligi bevosita o‘lchanmagan.
• Ichak o‘tkazuvchanligi, epiteliy transporti, tizimli qon aylanishiga o‘tish va farmakokinetika baholanmagan.
• NF-κB, MAPK, Nrf2–Keap1 yoki AMPK–MLCK–MLC yo‘llari ACSP tomonidan bevosita nishonga olinishi eksperimental ravishda isbotlanmagan.
• Uzoq muddatli toksiklik, keng qamrovli xavfsizlik va allergenlik baholanmagan.
• Klinik tadqiqot o‘tkazilmagan.

Tadqiqotning kuchli tomoni va asosiy cheklovi

Tadqiqotning muhim kuchli jihatlaridan biri bitta test natijasiga tayanmasligidir. Tadqiqotchilar fermentativ skriningni kimyoviy antioksidant testlar, hujayra modeli, sichqon modeli, gistologiya, biokimyoviy markerlar, gen ekspressiyasi, oqsil tahlili va peptidomik tavsiflash bilan bog‘laydigan bosqichma-bosqich eksperimental dizayn yaratgan.

Biroq asosiy cheklov ACSP bitta sof molekula emas, balki 516 ta aniqlangan ketma-ketlikni o‘z ichiga oladigan aralash gidrolizat ekanidir. Shu sababli qaysi peptidlar qaysi nishonga qanday bog‘lanish yoki signal mexanizmi orqali ta’sir ko‘rsatishi aniqlanmagan. Bundan tashqari, hayvon tajribasi qisqa muddatli o‘tkir DSS modelidir; u insondagi surunkali yallig‘lanishli ichak kasalligining barcha biologiyasini ifodalamaydi.

Manba va Usul Haqida Izoh

Asl tadqiqot: Anti-Inflammatory Protein Hydrolysate Screened from Crayfish Shells Attenuates Colitis by Oxidative Stress Suppression, Inflammation Reduction and Barrier Reconstruction

Mualliflar: Lei Dong; Hao Wang; Yongmin Wu; Jinyang Peng; Shaohao Lai; Zexin Zhao; Yongqi Yin; Jun Cai.

Corresponding author: Jun Cai.

Muassasalar: School of Life and Health Sciences, Hubei University of Technology, Wuhan, China; College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou, China.

Jurnal: Foods.

Nashriyot: MDPI, Basel, Switzerland.

Jild / son / maqola raqami: 15(19), 3389.

DOI: 10.3390/foods15193389.

Maqola turi: Article; eksperimental preklinik tadqiqot.

Received: Version of Record PDF da 14 Avgust 2026.

Revised: Version of Record PDF da 18 Sentabr 2026.

Accepted: Version of Record PDF da 20 Sentabr 2026.

Published: Version of Record PDF va asosiy maqola qaydida 23 Sentabr 2026.

Metadata izohi: MDPI ning alohida Version Notes sahifasi topshirish, qayta ko‘rib chiqish, qabul qilish va nashr sanalarini Version of Record PDF ga nisbatan bir kun oldinroq ko‘rsatadi. Ilmiy manba identifikatsiyasida Version of Record PDF sanalari asos qilib olingan.

Taqriz holati: Foods, MDPI tomonidan nashr qilinadigan xalqaro taqrizli ochiq kirish jurnalidir. Maqolaning akademik muharriri Ronaldo Vagner Thomatieli-Santos deb ko‘rsatilgan.

Litsenziya: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Moliyalashtirish: National Natural Science Foundation of China, loyiha 32302019; Research Fund for Key R&D Projects in Hubei Province, loyiha 2022BBA0053.

Etika qo‘mitasi: Hubei University of Technology Animal Ethics Committee; protokol HBUT20250021; tasdiqlash sanasi 25 Iyun 2025.

Ma’lumotli rozilik: Qo‘llanilmaydi.

Ma’lumotlarning mavjudligi: Tadqiqotning original hissalari maqola va qo‘shimcha materiallarda taqdim etilgan; qo‘shimcha savollar corresponding author ga yo‘naltirilishi mumkin.

Manfaatlar to‘qnashuvi: Mualliflar manfaatlar to‘qnashuvi yo‘qligini bildirgan.

Muallif hissalari: Konseptuallashtirish: L.D., H.W., Y.W.; metodologiya: L.D., J.P.; dasturiy ta’minot: S.L.; tasdiqlash: L.D., H.W., Y.W.; formal tahlil: S.L.; tadqiqot: J.P., S.L.; resurslar: J.C., Z.Z.; ma’lumotlarni kuratsiya qilish: J.P.; vizuallashtirish: L.D., H.W.; maslahat/superviziya: J.C., Z.Z.; loyiha boshqaruvi: L.D., J.C., Z.Z.; moliyalashtirishni jalb qilish: J.C., Z.Z.; dastlabki qoralama: L.D.; ko‘rib chiqish va tahrirlash: J.C., Z.Z., Y.Y.

Qo‘shimcha materiallar: ACSP total ion chromatogrami; LC–MS/MS sifat nazorati grafiklari; izohlangan MS/MS spektrlari; DAI ballash mezonlari; yo‘g‘on ichak gistologik shikast mezonlari; primer ketma-ketliklari; LC elyutsiya gradienti; LC–MS/MS qidiruv parametrlari; peptid identifikatsiya natijalari va a priori namuna hajmini hisoblash farazlari.

Asosiy ilmiy chegara: Ushbu tadqiqot odamlarda davolash sinovi emas. ACSP ning odamlarda og‘iz orqali biokirishuvchanligi, ichakdan so‘rilishi, farmakokinetikasi, samarali dozasi, uzoq muddatli xavfsizligi, allergenligi va klinik foydasi aniqlanmagan.

Mexanizm chegarasi: Tadqiqotda o‘lchangan sitokin, oksidativ stress va baryer oqsillaridagi o‘zgarishlar ACSP bilan mos keladi; biroq NF-κB/MAPK, Nrf2–Keap1 va AMPK–MLCK–MLC kabi taklif qilingan yo‘llar bevosita nishonni tasdiqlash tajribalari bilan isbotlanmagan.