Qələvi proteazla əldə edilən çay xərçəngi qabığı protein hidrolizatı (alkaline-protease-derived crayfish shell protein hydrolysate, ACSP), çay xərçəngi qabığı zülallarının qələvi proteazla fermentativ parçalanması nəticəsində yaranan qarışıq peptid hidrolizatıdır. Tədqiqatçılar əvvəlcə papain, qələvi proteaz, neytral proteaz, tripsin və pepsindən istifadə etməklə beş müxtəlif çay xərçəngi qabığı protein hidrolizatı hazırlamış; onları antioksidant və antiinflamatuvar xüsusiyyətlər baxımından skrininqdən keçirmiş; önə çıxan ACSP və NCSP-ni LPS ilə stimullaşdırılmış IEC-6 bağırsaq epitel hüceyrələrində araşdırmış və ümumi hüceyrə səviyyəsində ən güclü təsiri göstərən ACSP-ni DSS ilə kəskin kolit yaradılmış siçan modelində qiymətləndirmişdir. Son mərhələdə ACSP-nin peptid tərkibi LC–MS/MS ilə xarakterizə edilmişdir.

İlkin skrininqdə ACSP-nin DPPH və ABTS•⁺ radikalları üçün IC₅₀ göstəriciləri müvafiq olaraq 0,888 ± 0,004 və 0,853 ± 0,003 mg/mL olmuşdur. ACSP həmçinin beş hidrolizat arasında ən yüksək hidroksil radikalını süpürmə aktivliyini %29,525 ± 0,499 və ən yüksək superoksid anion radikalını süpürmə aktivliyini %47,310 ± 1,351 olaraq göstərmişdir. Neytral proteaz hidrolizatı NCSP isə ABTS•⁺ IC₅₀ göstəricisi və FRAP reduksiya qabiliyyəti baxımından bəzi ölçmələrdə ACSP-dən daha güclü nəticə vermişdir. Buna görə ilk mərhələ tək bir testin nəticəsinə deyil, müxtəlif antioksidant və antiinflamatuvar göstəricilərin birlikdə qiymətləndirilməsinə əsaslanır.

LPS ilə stimullaşdırılmış IEC-6 hüceyrələrində ACSP və NCSP proinflamatuvar iNOS, IL-1β, IL-6 və TNF-α dəyişikliklərini azaldarkən antiinflamatuvar IL-10 istiqamətindəki cavabı artırmışdır; ACSP ümumilikdə daha güclü təsir göstərmişdir. Siçan təcrübəsində bədən çəkisinə görə 100, 200 və 400 mg/kg dozalarında verilən ACSP, DSS-nin yaratdığı çəki itkisini, xəstəlik aktivliyini, kolonun qısalmasını, histoloji zədələnməni və qədəh hüceyrələrinin itkisini doza ilə əlaqəli şəkildə yüngülləşdirmişdir. Yüksək dozalı ACSP qrupunda 14-cü gün xəstəlik aktivliyi indeksi 3,60 ± 0,55 olduğu halda DSS model qrupunda 9,40 ± 1,14 olmuşdur; histoloji skor isə müvafiq olaraq 4,80 ± 0,40 və 10,40 ± 0,80 olaraq bildirilmişdir.

ACSP eyni zamanda proinflamatuvar sitokinləri, miyeloperoksidaza aktivliyini və azot oksidi səviyyələrini azaltmış; superoksid dismutaza və katalaza aktivliklərinin bərpası və ZO-1, claudin-1 və occludin kimi sıx birləşmə zülallarının yenidən artması ilə əlaqələndirilmişdir. LC–MS/MS analizi ACSP daxilində 516 peptid ardıcıllığı müəyyən etmişdir. Bununla belə, bu tədqiqat insanlarda kolit müalicəsinin effektivliyini və ya təhlükəsizliyini göstərmir. Nəticələr hüceyrə sistemi və qısamüddətli siçan modeli səviyyəsindədir; mədə-bağırsaq stabilliyi, bağırsaqdan sorulma, farmakokinetika, sistemik məruz qalma, uzunmüddətli təhlükəsizlik, allergenlik və klinik effektivlik qiymətləndirilməmişdir.

Tədqiqatın əsas problemi

İnflamatuvar bağırsaq xəstəlikləri; xoralı kolit və Crohn xəstəliyi kimi xroniki inflamatuvar pozğunluqları əhatə edir. Xəstəlik prosesində genetik meyillilik, ətraf mühit amilləri, bağırsaq mikrobiotasındakı pozulma, oksidativ stress və həddindən artıq immun aktivləşmə kimi çoxsaylı komponentlər birlikdə rol oynaya bilər. Tədqiqat müəllifləri mövcud farmakoloji müalicələrin mühüm olmasına baxmayaraq yan təsirlər, ikincili cavab itkisi, xərc və selikli qişanın sağalmasının hər xəstədə tam olmaması kimi məhdudiyyətlərə malik ola biləcəyini qeyd edərək qida mənşəli bioloji aktiv peptidləri araşdırılmağa dəyər sahə kimi qiymətləndirirlər.

Tədqiqatın ikinci problemi resurs istifadəsi ilə bağlıdır. Xərçəng (Procambarus clarkii) emalı sənayesində qabıqlar böyük miqdarda yan məhsul yaradır. Mənbəyə görə qabıq hissəsi ümumi çay xərçəngi biokütləsinin təxminən %60–70-ni təşkil edə və təxminən %20–30 xitin ilə %20–40 protein ehtiva edə bilər. Buna baxmayaraq, bu materialın yüksək əlavə dəyərli istifadəsi məhduddur. Buna görə tədqiqat həm bağırsaq sağlamlığına yönəlmiş bioloji aktivliyi, həm də dəniz/akvatik qida emalı yan məhsulunun dəyərləndirilməsini eyni eksperimental çərçivədə nəzərdən keçirir.

Protein hidrolizatı nədir?

Protein hidrolizatı böyük protein molekullarının fermentlər vasitəsilə daha kiçik peptidlərə və peptid fraqmentlərinə parçalanması ilə əldə edilən qarışıqdır. Proteazın hansı peptid rabitələrini üstünlük verərək kəsməsi yaranan peptidlərin uzunluğunu, amin turşusu ardıcıllıqlarını və nəticə etibarilə fiziki-kimyəvi xüsusiyyətlərini dəyişdirə bilər. Buna görə eyni çay xərçəngi qabığı zülalı müxtəlif proteazlarla parçalandıqda bioloji aktivliyi fərqli hidrolizatlar yarana bilər.

Bu tədqiqatın əsas eksperimental məntiqi məhz budur: eyni əsas protein mənbəyi beş müxtəlif proteazla hidroliz edilmiş, yaranan məhsullar müqayisə edilmiş və ən güclü ümumi bioloji aktivliyə malik namizəd daha ileri eksperimental mərhələlərə keçirilmişdir.

Xərçəng qabığı hidrolizatları necə hazırlandı?

Xərçəng qabıqları kiçik hissələrə bölünmüş, qurudulmuş, mexaniki olaraq üyüdülmüş və 60 mesh ələkdən keçirilmişdir. Qabıq tozu əvvəlcə 1:10 (w/v) nisbətində neft efiri ilə qarışdırılaraq otaq temperaturunda 6 saat maqnit qarışdırmaya məruz qoyulmuş və yağ tərkibli həlledici filtrasiya ilə uzaqlaşdırılmışdır.

Yağsızlaşdırılmış material daha sonra 1 M HCl ilə 1:10 (w/v) nisbətində 2 saat dekalifikasiya edilmişdir. Qarışıq 5000×g-də 20 dəqiqə sentrifuqalaşdırılmış, supernatant uzaqlaşdırılmış və bərk qalıq qurudularaq dekalifikasiya olunmuş çay xərçəngi qabığı tozu əldə edilmişdir.

Hidroliz mərhələsində qabıq tozu distillə edilmiş suda 1:25 (w/v) nisbətində dispersiya edilmiş və beş müxtəlif proteaz üçün müəyyən edilmiş şəraitdə 6 saat hidroliz olunmuşdur. Reaksiyanın sonunda fermentlər 95 °C-də 15 dəqiqə saxlanılaraq inaktivləşdirilmiş; məhsul 0,45 µm filtrdən keçirilmiş, filtrat liyofilizasiya edilmiş və 4 °C-də saxlanılmışdır.

Mənbə həmçinin metod bölməsində hidrolizatların 4 °C-də 0, 7, 15 və 30 günlük saxlanmadan sonra antioksidant və antiinflamatuvar testlərin təkrarlanması ilə funksional stabilliyinin qiymətləndirildiyini bildirir. Bununla belə, əsas məqalənin nəticələr bölməsində bu saxlanma seriyasına aid ətraflı kəmiyyət nəticələri ayrıca əsas nəticə dəsti kimi təqdim edilməmişdir; buna görə Verianla mətnində mənbədə olmayan stabillik rəqəmləri yaradılmamışdır.

ACSP Niyə Beş Hidrolizat Arasından İrəli Təcrübələrə Keçirildi?

ACSP bütün antioksidant testlərdə təkbaşına birinci olmasa da, radikal süpürmə, SOD/CAT cavabı, NO buraxılması və albumin denaturasiyası testlərində güclü və balanslı profil göstərmiş; ACSP və NCSP ilkin hüceyrə mərhələsinə seçilmiş və LPS ilə stimullaşdırılmış IEC-6 hüceyrələrində ACSP ümumilikdə daha güclü antiinflamatuvar cavab verdiyi üçün siçan modelində ACSP qiymətləndirilmişdir.

Beş hidrolizatın antioksidant skrininqi

DPPH və ABTS testlərində IC₅₀ göstəricisinin daha aşağı olması, %50 radikal süpürmə səviyyəsinə daha aşağı hidrolizat konsentrasiyasında çatıldığını və beləliklə daha güclü aktivliyi ifadə edir. FRAP və birbaşa süpürmə faizlərində isə daha yüksək göstərici daha güclü antioksidant cavab deməkdir. Buna görə Cədvəl 2 tək bir “qalib” testdən deyil, müxtəlif redoks xüsusiyyətlərini ölçən çoxsaylı metriklərdən ibarətdir.

Mənbə Şəkil 1-də ACSP-nin SOD aktivliyini təxminən %25, CAT aktivliyini %18-dən çox artırdığı və PCSP ilə PECSP ilə müqayisədə bu artımların əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olduğu bildirilir. Hüceyrəsiz sistemdə ACSP, SNP mənşəli NO buraxılmasını %20-dən çox basdırmış və istiliklə induksiya olunmuş albumin denaturasiyasında %12,21 ilə ən yüksək inhibisiyanı göstərmişdir.

Albumin denaturasiyasının basdırılması və hüceyrəsiz NO testi antiinflamatuvar potensial üçün skrininq göstəriciləridir. Bunlar təkbaşına canlı orqanizmdə inflamasiya yollarının birbaşa tənzimləndiyini sübut etmir. Müəlliflər də müzakirə bölməsində hüceyrəsiz test nəticələrinin makrofaq mənşəli mediatorların birbaşa modulyasiyasını göstərmədiyini xüsusi olaraq qeyd edirlər.

DPPH radikal süpürmə tənliyi

DPPH süpürmə aktivliyi (%) = [A₀ − (A₁ − A₂)] / A₀ × 100

Burada A₀, metanol + DPPH ehtiva edən kontrolun absorbansıdır; A₁, nümunə + DPPH qarışığının absorbansıdır; A₂ isə nümunə + metanol ehtiva edən nümunə blankının absorbansıdır. Nümunənin rənginin və ya öz optik xüsusiyyətlərinin DPPH siqnalına töhfəsini A₂ ilə düzəltmək həqiqi radikal süpürmə təsirini daha düzgün ayırmağa kömək edir.

Hidrolizatlar 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 və 1,0 mg/mL konsentrasiyalarında araşdırılmış və DPPH ölçümü 517 nm-də aparılmışdır. IC₅₀, %50 süpürmə aktivliyi təmin edən hidrolizat konsentrasiyası kimi müəyyən edilmişdir.

ABTS•⁺ testi

ABTS•⁺ testində hidrolizatlar yenə 0,2–1,0 mg/mL aralığında qiymətləndirilmişdir. ABTS radikal kationu 7 mM ABTS ilə 2,45 mM kalium persulfatın 1:1 həcm nisbətində qarışdırılması və qarışığın otaq temperaturunda qaranlıqda 16–24 saat saxlanması ilə hazırlanmışdır. İşçi məhlul 734 nm-də 0,70 ± 0,02 absorbansa qədər durulaşdırılmış; nümunə ilə 6 dəqiqə inkubasiyadan sonra ölçmə aparılmışdır.

ABTS•⁺ süpürmə aktivliyi (%) = (A₀ − A₁) / A₀ × 100

A₀ blank kontrolun, A₁ isə test nümunəsinin absorbansıdır.

FRAP və digər radikal testləri

FRAP testi ferrik dəmirin reduksiya qabiliyyətini qiymətləndirir və nəticələr quru nümunə başına µmol Fe(II) ekvivalenti kimi ifadə edilmişdir. Tədqiqatçılar 100–1000 µM FeSO₄ standartlarından y = 0,2638x + 0,0651 və R² = 0,9992 kalibrasiya əyrisi yaratmışdır.

Hidroksil radikal testində nümunə 1 mg/mL konsentrasiyasında istifadə edilmiş və süpürmə faizi belə hesablanmışdır:

•OH süpürmə aktivliyi (%) = [(A₀ − A) / A₀] × 100

Superoksid anion testində isə katexol autooksidləşməsi izlənmiş və hesablama:

O₂•⁻ süpürmə aktivliyi (%) = [1 − (ΔA_s − ΔA_b) / ΔA₀] × 100

şəklində aparılmışdır. ΔA_s, ΔA_b və ΔA₀ müvafiq olaraq nümunə, nümunə blankı və su kontrolunda 0 ilə 5 dəqiqə arasındakı absorbans dəyişikliklərini ifadə edir.

NO buraxılmasının və albumin denaturasiyasının inhibisiyası

SNP mənşəli NO buraxılması hüceyrəsiz sistemdə Griess reaksiyası ilə qiymətləndirilmişdir:

NO buraxılması inhibisiyası (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

Albumin denaturasiyası testində %1 BSA ehtiva edən qarışıq 37 °C-də 15 dəqiqə saxlanılmış və sonra 90 °C-də 20 dəqiqə qızdırılmışdır. Bulanıqlıq 660 nm-də ölçülmüş və inhibisiya:

Denaturasiya inhibisiyası (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

formulu ilə hesablanmışdır.

IEC-6 hüceyrə modeli necə quruldu?

IEC-6 hüceyrələri %10 fetal iribuynuzlu serum, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin və 0,1 IU/mL insulin ehtiva edən DMEM mühitində 37 °C və %5 CO₂ şəraitində kultivasiya edilmişdir.

Canlılıq zaman sırası üçün hüceyrələr 96 quyulu plitələrdə 1 × 10⁵ hüceyrə/mL sıxlığında hazırlanmış və ACSP və ya NCSP-nin 0,1–2,0 mg/mL konsentrasiyaları ilə 48 saata qədər müalicə edilmişdir. CCK-8 ölçmələri 0, 12, 24, 36 və 48-ci saatlarda aparılmışdır. ACSP-də ən böyük canlılıq artımı 36-cı saatda 0,05 mg/mL səviyyəsində; NCSP-də isə 36-cı saatda 0,25 mg/mL səviyyəsində müşahidə edilmişdir.

İnflamasiya təcrübəsində hüceyrələr 12 quyulu plitələrdə 3 × 10⁵ hüceyrə/quyu sıxlığında 12 saat kultivasiya edilmiş, 0,1 mg/mL LPS ilə 4 saat stimullaşdırılmış və daha sonra 0,025–0,5 mg/mL ACSP və ya NCSP ilə 24 saat müalicə edilmişdir.

LPS tətbiqi iNOS, IL-1β, IL-6 və TNF-α kimi proinflamatuvar genlərin ekspressiyasını artırarkən IL-10-u azaltmışdır. Hər iki hidrolizat bu dəyişikliklərə əks istiqamətdə təsir göstərmiş, lakin ACSP ümumilikdə NCSP-dən daha güclü cavab vermişdir. Kultur supernatantındakı ELISA nəticələrində də IL-1β, IL-6 və TNF-α azalarkən IL-10 artmışdır.

qPCR-də 2^−ΔΔCt metodu hansı məqsədlə istifadə edildi?

Tədqiqatda iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 və occludin genlərinin nisbi mRNA ekspressiyası qPCR ilə ölçülmüş və GAPDH endogen referans gen kimi istifadə edilmişdir. 2^−ΔΔCt metodu hədəf gen siqnalını əvvəlcə referans genə görə normallaşdırır, sonra təcrübə qrupundakı dəyişikliyi müqayisə qrupuna nisbətən nisbi şəkildə ifadə edir. Bu metod mütləq molekul sayını deyil, normallaşdırılmış nisbi ekspressiya dəyişikliyini verir.

Siçan Təcrübəsində ACSP Necə Sınaqdan Keçirildi?

Otuz erkək C57BL/6 siçan təsadüfi şəkildə altı qrupa bölünmüşdür; kontrol istisna olmaqla bütün qruplar 7 gün ərzində içməli suda %3 DSS almış, sonra DSS dayandırılmış və növbəti 7 gün ərzində model qrupuna PBS, müsbət kontrol qrupuna 200 mg/kg mesalazin, ACSP qruplarına isə 100, 200 və ya 400 mg/kg ACSP gündə bir dəfə oral qavajla verilmişdir.

Xəstəlik aktivliyi indeksi necə hesablandı?

Siçanlarda kolitin şiddəti bədən çəkisi itkisi, nəcis konsistensiyası və makroskopik rektal qanaxma olmaqla üç komponent üzrə qiymətləndirilmişdir. Hər komponent 0–4 arasında ballanmışdır.

DAI = bədən çəkisi itkisi balı + nəcis konsistensiyası balı + rektal qanaxma balı

Buna görə daha yüksək DAI daha ağır klinik xəstəlik əlamətlərini, daha aşağı DAI isə daha yüngül əlamətlərin cəmini ifadə edir. Tədqiqatçılar qiymətləndirmələri qrup təyinatına kor personal ilə aparmışdır.

Orqan indeksi

Dalaq və timus üçün istifadə edilən orqan indeksi belə hesablanmışdır:

Orqan indeksi = orqan çəkisi / bədən çəkisi

Bu nisbət orqan çəkisinin heyvanın ümumi bədən ölçüsündən asılılığını azaltmaqla qruplar arasında müqayisəyə kömək edir.

ACSP xəstəlik əlamətlərinə necə təsir etdi?

DSS tətbiqi çəki itkisi, ishal və qanlı nəcis ilə xarakterizə olunan kəskin kolit mənzərəsi yaratmışdır. İki istiqamətli təkrarlanan ölçmələr ANOVA-sında müalicə qrupu, zaman və qrup × zaman qarşılıqlı təsirinin həm DAI, həm də nisbi bədən çəkisində əhəmiyyətli olduğu bildirilmişdir; bütün bu təsirlər üçün p < 0,0001-dir.

ACSP qruplarında DAI göstəriciləri model qrupundan əhəmiyyətli dərəcədə aşağı olmuşdur və mənbə bu dəyişikliyi doza ilə əlaqəli kimi təsvir edir. ACSP həmçinin DSS ilə əlaqəli dalağın böyüməsini və dalaq/bədən çəkisi nisbətindəki artımı azaltmışdır. Kolonun qısalması da doza artdıqca daha çox düzəlmişdir.

Histopatologiya nə göstərdi?

Mənbə Şəkil 4-də real H&E və AB-PAS histologiya görüntüləri mövcuddur. Model qrupunda selikli qişa xorasiyası, kript strukturunun pozulması, sıx inflamatuvar infiltrasiya və epitel eroziyası müşahidə edilmişdir. ACSP müalicəsi ilə kript arxitekturası daha yaxşı qorunmuş, xoralaşma və inflamatuvar infiltrasiya azalmışdır. AB-PAS boyaması qədəh hüceyrələrinin bərpasını göstərmişdir.

Bu histoloji görüntülər birbaşa mikroskopik sübut olduğuna görə Verianla daxilində sintetik mikroskopiya görüntüsü yaradılmamışdır. Əvəzində mənbədə verilən kəmiyyət histologiya nəticələri qorunmuşdur.

Model qrupunda qədəh hüceyrələri 26,0 ± 2,77 hüceyrə/kript göstəricisindən 3,3 ± 1,73-ə enmişdir. Yüksək dozalı ACSP qrupunda bu say 16,4 ± 1,69-a yüksəlmişdir. Histoloji zədələnmə skoru kontrol qrupundakı 0,5 ± 0,2 göstəricisindən model qrupunda 10,4 ± 0,8-ə qalxmış, yüksək dozalı ACSP ilə 4,8 ± 0,4-ə enmişdir.

İnflamatuvar sitokinlər və oksidativ stress

Siçan kolon toxumasında ACSP, model qrupu ilə müqayisədə IL-1β, IL-6 və TNF-α mRNA ekspressiyasını mənbədə bildirilən nəticələrə görə %38–82; həmin sitokinlərin protein konsentrasiyalarını isə %35–87 azaltmışdır. Təsir doza asılı tendensiya göstərmişdir.

Yüksək dozalı ACSP qrupunda IL-10 mRNA səviyyəsi model qrupunun 5,8 qatına, IL-10 protein səviyyəsi isə 1,67 qatına çatmışdır. DSS, SOD və CAT aktivliklərini azaldarkən MPO aktivliyini artırmış; ACSP antioksidant ferment aktivliklərini bərpa etmiş və MPO-nu azaltmışdır. Yüksək dozalı ACSP kolon NO səviyyəsini model qrupu ilə müqayisədə %80-dən çox azaltmışdır.

Bağırsaq baryeri: ZO-1, claudin-1 və occludin

Bağırsaq epiteli yalnız fiziki divar deyil. Qonşu epitel hüceyrələri arasındakı sıx birləşmə kompleksləri bağırsaq lümenindəki maddələrin nəzarətsiz şəkildə toxumaya keçməsini məhdudlaşdıran mühüm baryer yaradır. Tədqiqat bu struktur üçün ZO-1, claudin-1 və occludin zülallarını araşdırmışdır.

DSS bu üç zülalın mRNA səviyyələrini nəzərəçarpacaq dərəcədə azaltmışdır. ACSP onların ekspressiyasını doza asılı şəkildə artırmışdır. ZO-1 mRNA və protein səviyyəsi model qrupu ilə müqayisədə %70-dən çox artmış; immunoflüoressensiya analizində ACSP ilə müalicə edilən qrupdakı ZO-1 flüoressensiya intensivliyi model qrupunun 8,9 qatına çatmışdır. Claudin-1 və occludin üçün də eyni istiqamətli nəticələr bildirilmişdir.

Western blot və immunoflüoressensiya görüntüləri bu baryer zülallarının artımını və epitel membranı boyunca paylanmasının bərpasını dəstəkləyir. Lakin real immunoflüoressensiya və Western blot görüntüləri eksperimental sübut xarakteri daşıdığı üçün Verianla tərəfindən süni şəkildə yenidən yaradılmamışdır.

ACSP hansı peptidləri ehtiva edir?

LC–MS/MS ilə ACSP daxilində 516 peptid ardıcıllığı müəyyən edilmişdir. Peptidlərin uzunluğu 3–26 amin turşusu arasında dəyişmişdir. Ardıcıllıq sayına əsasən peptidlərin %54,37-si 500–1000 Da, %41,94-ü 1000–2000 Da, %2,14-ü 500 Da və ya daha aşağı, %1,55-i isə 2000–3000 Da aralığındadır. Beləliklə, 1 kDa və ya daha aşağı molekulyar kütləyə malik ardıcıllıqlar ümumi sayın %56,51-ni təşkil edir.

Ən yüksək etibarlı peptid ardıcıllığı təyinatları

Buradakı −10lgP skoru peptidin miqdarını və ya bioloji aktivliyinin böyüklüyünü göstərmir. Mənbə xüsusi olaraq daha yüksək skorun verilənlər bazası əsaslı ardıcıllıq təyinatına dair daha yüksək identifikasiya etibarı ifadə etdiyini bildirir.

Peptid identifikasiyasında xam LC–MS/MS məlumatları UniProtKB Procambarus clarkii protein verilənlər bazasına qarşı PEAKS Studio 11.5 ilə axtarılmışdır. Prekursor kütlə toleransı 10 ppm, fraqment toleransı 0,02 Da olaraq təyin edilmişdir. Peptid uzunluğu axtarış zamanı 3–45 amin turşusu ilə məhdudlaşdırılmış; N-terminal asetilləşmə (+42,01 Da) və histidin/triptofan oksidləşməsi (+15,99 Da) dəyişən modifikasiya kimi müəyyən edilmişdir.

İdentifikasiyalar PEAKS −10lgP ≥ 37,04 həddində filtrlənmişdir. Yanlış kəşf nisbəti peptid-spektr uyğunluğu səviyyəsində %1,0, peptid ardıcıllığı səviyyəsində %1,4 olaraq bildirilmişdir. Bu keyfiyyətə nəzarət “516 peptid” sayının yalnız xam spektr sayımı olmadığını; müəyyən edilmiş etibar hədlərini keçən ardıcıllıq təyinatlarını təmsil etdiyini anlamaq baxımından vacibdir.

Təklif olunan mexanizmlər nə dərəcədə qətidir?

Müəlliflər ACSP-dəki aromatik və redoks-aktiv amin turşusu qalıqlarının elektron və ya hidrogen atomu verərək reaktiv oksigen növlərini məhdudlaşdıra biləcəyini müzakirə edirlər. Oksidativ stressin azalmasının redoksa həssas MAPK və NF-κB siqnalını zəiflədə biləcəyi; bununla da inflamatuvar mediatorların azalmasına və ZO-1, claudin-1 ilə occludin kimi baryer zülallarının bərpasına uyğun mühit yarada biləcəyi irəli sürülür.

Bundan əlavə, AMPK–MLCK–MLC oxu və Nrf2–Keap1 kimi yollar mümkün izahlar arasında müzakirə edilmişdir. Lakin tədqiqatda bu yolların birbaşa aktivləşməsi və ya inhibisiyası hədəflənmiş bağlanma təcrübələri, spesifik inhibitorlar, genetik susdurma və ya yolak pozma təcrübələri ilə göstərilməmişdir. Tədqiqatçılar bu mexanizmləri hipotez kimi təqdim edir və hədəflənmiş doğrulama təcrübələrinə ehtiyac olduğunu açıq şəkildə bildirirlər.

ACSP İnsanlarda Kolit Müalicəsi Kimi İstifadə Oluna Bilərmi?

Bu tədqiqat buna cavab vermir. ACSP-nin antioksidant və antiinflamatuvar təsirləri hüceyrələrdə və DSS ilə yaradılmış kəskin siçan koliti modelində göstərilmişdir; insanlarda doza, sorulma, metabolizm, effektivlik, təhlükəsizlik, allergenlik və ya mövcud müalicələrlə qarşılıqlı təsir araşdırılmamışdır və tədqiqat ACSP-ni klinik müalicə kimi təsdiqləmir.

Niyə siçan modelindəki nəticə birbaşa insana köçürülə bilməz?

DSS modeli bağırsaq epitelinə kimyəvi zədə verərək kəskin kolitə bənzər inflamasiya yaradır və eksperimental bağırsaq inflamasyasını araşdırmaq üçün geniş istifadə olunan heyvan modelidir. Bununla belə, insan xoralı koliti və Crohn xəstəliyi daha mürəkkəb, xroniki və heterogen xəstəliklərdir. Genetik quruluş, mikrobiota, immun sistem, ətraf mühit amilləri, xəstəliyin müddəti və istifadə edilən dərmanlar kimi çoxsaylı dəyişənlər insan xəstəliyində birlikdə rol oynayır.

Buna görə siçanlarda 400 mg/kg ACSP-nin təsirli olması, insanlar üçün eyni dozanın və ya birbaşa çevrilmiş hər hansı dozanın təsirli və ya təhlükəsiz olduğunu göstərmir. Tədqiqatın öz məhdudiyyətləri arasında farmakokinetika, sistemik məruz qalma, mədə-bağırsaq stabilliyi, sorulma, geniş təhlükəsizlik və klinik tədqiqatların olmaması yer alır.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Tədqiqatın eksperimental mərhələləri

1. Xərçəng qabığı yağdan və mineral strukturlardan təmizləndi.
2. Beş müxtəlif proteazla PCSP, ACSP, NCSP, TCSP və PECSP istehsal edildi.
3. Beş hidrolizat antioksidant və hüceyrəsiz antiinflamatuvar testlərlə skrininqdən keçirildi.
4. ACSP və NCSP IEC-6 hüceyrələrində canlılıq və LPS mənşəli inflamasiya baxımından qiymətləndirildi.
5. Ümumilikdə daha güclü hüceyrə təsiri göstərən ACSP, DSS ilə yaradılmış kəskin kolit siçan modelinə keçirildi.
6. Siçanlarda xəstəlik aktivliyi, bədən çəkisi, kolon uzunluğu, immun orqanlar, histologiya, qədəh hüceyrələri, sitokinlər, oksidativ stress və sıx birləşmə zülalları ölçüldü.
7. ACSP-dəki peptidlər LC–MS/MS ilə müəyyən edildi və protein mənbələri ilə uyğunlaşdırıldı.

Heyvan təcrübəsinin nümunə quruluşu

Ümumilikdə 30 erkək C57BL/6 siçan istifadə edilmişdir. Siçanlar 6 həftəlik və 20 ± 1 g çəkidə olmuşdur. Üç günlük adaptasiyadan sonra təsadüfi say proseduru ilə altı qrupa, hər qrupda beş heyvan olmaqla bölünmüşdür. Tədqiqatçılar nümunə ölçüsünün təcrübədən əvvəl güc analizi ilə müəyyən edildiyini və fərziyyələrin Əlavə Metodlarda verildiyini bildirirlər. Yekun analizdən heç bir heyvan və ya məlumat nöqtəsi çıxarılmamışdır.

Korlaşdırma

Bədən çəkisi, nəcis xüsusiyyətləri və ümumi klinik vəziyyət hər gün eyni vaxtda qrup bölgüsündən xəbərsiz personal tərəfindən qiymətləndirilmişdir. Toxuma analizləri də məlumat analizi tamamlanana qədər kodlaşdırılmış nümunələr üzərində aparılmışdır. Bu yanaşma müşahidəçinin hansı nümunənin hansı müalicə qrupundan gəldiyini bilməsinin ölçməyə təsirini azaltmağı hədəfləyir.

Histologiya

Distal kolon toxuması %4 paraformaldehiddə fiksasiya edilmiş, parafinə yerləşdirilmiş və 5 µm qalınlıqda kəsilmişdir. Hematoksilin-eozin boyaması inflamatuvar infiltrasiya, kript zədələnməsi və təsirlənmiş sahə əsasında histoloji zədələnmənin qiymətləndirilməsində istifadə edilmişdir. Qədəh hüceyrələri Alcian blue–periodic acid–Schiff (AB-PAS) boyaması ilə müəyyən edilmişdir.

ELISA və gen ekspressiyası

IEC-6 kultur supernatantında və kolon homogenatlarında TNF-α, IL-1β, IL-6 və IL-10 ELISA kitləri ilə ölçülmüşdür. qPCR analizində iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 və occludin araşdırılmış, GAPDH referans gen kimi istifadə edilmişdir.

Western blot və immunoflüoressensiya

Kolon toxumasında ZO-1, claudin-1 və occludin zülalları Western blot ilə qiymətləndirilmişdir. Bərabər miqdarda protein %12,5 SDS-PAGE ilə ayrılmış, PVDF membrana köçürülmüş və uyğun birincili anticisimlərlə inkubasiya edilmişdir. Siqnallar GAPDH-yə normallaşdırılmış və kontrol qrupu ilə müqayisədə nisbi şəkildə ifadə edilmişdir.

İmmunoflüoressensiya analizində 5 µm kolon kəsiklərində ZO-1, claudin-1 və occludin boyaması aparılmış, nüvələr DAPI ilə əks boyanmış və flüoressensiya intensivliyi ImageJ 1.8.0 ilə kəmiyyətləşdirilmişdir. Western blot üçün hər qrupdan müxtəlif siçanlara aid üç müstəqil kolon nümunəsi istifadə edilmiş; texniki ölçmələr müstəqil bioloji təkrar kimi sayılmamışdır.

LC–MS/MS cihaz və analiz şəraiti

ACSP peptidləri EASY-nLC 1000 sistemi ilə əlaqəli QE kütlə spektrometrində araşdırılmışdır. ACSP %0,1 formik turşuda həll edilmiş, 14.000×g-də 20 dəqiqə və 4 °C-də sentrifuqalaşdırılmışdır. 1 mg/mL konsentrasiyadakı supernatantdan 3 µL, PepMap RSLC C18 kolonuna 250 nL/dəqiqə axın sürəti ilə yeridilmişdir.

Xam məlumatlar PEAKS Studio 11.5, build 20230821 ilə UniProtKB Procambarus clarkii verilənlər bazasına qarşı axtarılmışdır. Ferment spesifikliyi “None”, həzm forması “unspecific” seçilmiş, ən çox üç missed cleavage icazə verilmiş və axtarış peptid uzunluğu 3–45 amin turşusu olaraq təyin edilmişdir.

Statistik analiz

Məlumatlar GraphPad Prism 8 ilə analiz edilmiş və orta ± standart sapma kimi təqdim edilmişdir. Parametrik testlərdən əvvəl model qalıqlarının normallığı Shapiro–Wilk, qruplar arasındakı dispersiya homogenliyi Levene testi ilə qiymətləndirilmişdir.

Zamana bağlı DAI və nisbi bədən çəkisi, müalicə qrupunun qruplararası faktor, zamanın qrupdaxili faktor və siçanın təkrarlanan ölçmə vahidi olduğu iki istiqamətli qarışıq dizaynlı təkrarlanan ölçmələr ANOVA-sı ilə analiz edilmişdir. Qrup × zaman qarşılıqlı təsiri əhəmiyyətli olduqda təcrübənin sonunda DSS model qrupuna qarşı əvvəlcədən müəyyən edilmiş müqayisələr üçün Dunnett çoxsaylı müqayisə testi istifadə edilmişdir.

Təcrübənin sonunda bir dəfə ölçülən sonlanımlar normal paylanma və dispersiya homogenliyi fərziyyələri ödənildikdə bir istiqamətli ANOVA və ardından Tukey çoxsaylı müqayisə testi ilə analiz edilmişdir. Bütün testlər iki istiqamətlidir və p < 0,05 statistik əhəmiyyət həddi kimi istifadə edilmişdir.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• Proteaz seçimi eyni çay xərçəngi qabığı protein mənbəyindən əldə edilən hidrolizatların ölçülən bioloji aktivliklərini dəyişdirmişdir.
• ACSP və NCSP ilkin antioksidant/antiinflamatuvar skrininqdə ən güclü ümumi namizədlər arasında yer almışdır.
• ACSP, LPS ilə stimullaşdırılmış IEC-6 hüceyrələrində inflamatuvar markerləri ümumilikdə NCSP-dən daha güclü şəkildə tənzimləmişdir.
• DSS siçan modelində ACSP 100–400 mg/kg doza aralığında xəstəliklə əlaqəli çoxsaylı göstəricilərdə doza ilə əlaqəli yaxşılaşmalarla əlaqələndirilmişdir.
• Yüksək dozalı ACSP, DAI, kolon qısalması, histoloji skor və qədəh hüceyrəsi itkisi baxımından model qrupundan daha yaxşı nəticə göstərmişdir.
• ACSP tətbiqi proinflamatuvar sitokinlərin azalması, IL-10 artımı, antioksidant ferment aktivliklərinin bərpası, MPO və NO-nun azalması ilə əlaqəlidir.
• ZO-1, claudin-1 və occludin nəticələri, ACSP tətbiqinin siçan modelində epitel baryerinin daha yaxşı qorunması ilə əlaqəli olduğunu dəstəkləyir.
• LC–MS/MS, ACSP-nin 516 müəyyən edilmiş peptid ardıcıllığı ehtiva edən qarışıq hidrolizat olduğunu göstərmişdir.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

• ACSP-nin insanlarda xoralı kolit və ya Crohn xəstəliyini müalicə etdiyi göstərilməmişdir.
• Siçanlarda istifadə edilən 100–400 mg/kg dozaların insanlar üçün uyğun doza olduğu göstərilməmişdir.
• 516 peptiddən hansının və ya hansılarının bioloji təsirdən məsul olduğu müəyyən edilməmişdir.
• Peptidlərin bağırsaqda həzmə davamlılığı birbaşa ölçülməmişdir.
• Bağırsaq keçiriciliyi, epitel transportu, sistemik dövriyyəyə keçid və farmakokinetika qiymətləndirilməmişdir.
• NF-κB, MAPK, Nrf2–Keap1 və ya AMPK–MLCK–MLC yollarının ACSP tərəfindən birbaşa hədəfləndiyi eksperimental olaraq sübut edilməmişdir.
• Uzunmüddətli toksiklik, geniş təhlükəsizlik və allergenlik qiymətləndirilməmişdir.
• Klinik tədqiqat aparılmamışdır.

Tədqiqatın güclü tərəfi və əsas məhdudiyyəti

Tədqiqatın mühüm güclü tərəflərindən biri tək bir test nəticəsinə əsaslanmamasıdır. Tədqiqatçılar fermentativ skrininqi kimyəvi antioksidant testləri, hüceyrə modeli, siçan modeli, histologiya, biokimyəvi markerlər, gen ekspressiyası, protein analizi və peptidomik xarakterizasiya ilə birləşdirən mərhələli eksperimental dizayn qurmuşdur.

Bununla yanaşı, əsas məhdudiyyət ACSP-nin tək bir saf molekul deyil, 516 müəyyən edilmiş ardıcıllıq ehtiva edən qarışıq hidrolizat olmasıdır. Buna görə hansı peptidlərin hansı hədəfə hansı bağlanma və ya siqnal mexanizmi ilə təsir göstərdiyi həll edilməmişdir. Bundan əlavə, heyvan təcrübəsi qısamüddətli kəskin DSS modelidir; xroniki insan inflamatuvar bağırsaq xəstəliyinin bütün biologiyasını təmsil etmir.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal tədqiqat: Anti-Inflammatory Protein Hydrolysate Screened from Crayfish Shells Attenuates Colitis by Oxidative Stress Suppression, Inflammation Reduction and Barrier Reconstruction

Müəlliflər: Lei Dong; Hao Wang; Yongmin Wu; Jinyang Peng; Shaohao Lai; Zexin Zhao; Yongqi Yin; Jun Cai.

Corresponding author: Jun Cai.

Qurumlar: School of Life and Health Sciences, Hubei University of Technology, Wuhan, China; College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou, China.

Jurnal: Foods.

Nəşriyyat: MDPI, Basel, Switzerland.

Cild / nömrə / məqalə nömrəsi: 15(19), 3389.

DOI: 10.3390/foods15193389.

Məqalə növü: Article; eksperimental preklinik tədqiqat.

Received: Version of Record PDF-də 14 Avqust 2026.

Revised: Version of Record PDF-də 18 Sentyabr 2026.

Accepted: Version of Record PDF-də 20 Sentyabr 2026.

Published: Version of Record PDF və əsas məqalə qeydində 23 Sentyabr 2026.

Metadata qeydi: MDPI-nin ayrıca Version Notes ekranı təqdimetmə, reviziya, qəbul və nəşr tarixlərini Version of Record PDF ilə müqayisədə bir gün daha erkən göstərir. Elmi mənbə kimliyində Version of Record PDF tarixləri əsas götürülmüşdür.

Resenziya statusu: Foods, MDPI tərəfindən nəşr olunan beynəlxalq resenziyalı açıq girişli jurnaldır. Məqalənin akademik redaktoru Ronaldo Vagner Thomatieli-Santos olaraq göstərilmişdir.

Lisenziya: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Maliyyələşdirmə: National Natural Science Foundation of China, layihə 32302019; Research Fund for Key R&D Projects in Hubei Province, layihə 2022BBA0053.

Etika komitəsi: Hubei University of Technology Animal Ethics Committee; protokol HBUT20250021; təsdiq tarixi 25 İyun 2025.

Məlumatlandırılmış razılıq: Tətbiq olunmur.

Məlumatların əlçatanlığı: Tədqiqatın orijinal töhfələri məqalə və əlavə materiallarda təqdim olunur; əlavə suallar corresponding author-a yönləndirilə bilər.

Maraq toqquşması: Müəlliflər maraq toqquşmasının olmadığını bəyan etmişdir.

Müəllif töhfələri: Konseptuallaşdırma: L.D., H.W., Y.W.; metodologiya: L.D., J.P.; proqram təminatı: S.L.; doğrulama: L.D., H.W., Y.W.; formal analiz: S.L.; tədqiqat: J.P., S.L.; resurslar: J.C., Z.Z.; məlumat kurasiyası: J.P.; vizuallaşdırma: L.D., H.W.; məsləhət/superviziya: J.C., Z.Z.; layihə idarəçiliyi: L.D., J.C., Z.Z.; maliyyələşdirmənin əldə edilməsi: J.C., Z.Z.; ilkin qaralama: L.D.; nəzərdən keçirmə və redaktə: J.C., Z.Z., Y.Y.

Əlavə materiallar: ACSP total ion chromatogramı; LC–MS/MS keyfiyyətə nəzarət qrafikləri; annotasiya edilmiş MS/MS spektrləri; DAI ballama meyarları; kolon histoloji zədələnmə meyarları; primer ardıcıllıqları; LC elusiya qradiyenti; LC–MS/MS axtarış parametrləri; peptid identifikasiya nəticələri və a priori nümunə ölçüsü hesablamasının fərziyyələri.

Əsas elmi sərhəd: Bu tədqiqat insanlarda müalicə sınağı deyil. ACSP-nin insanlarda oral bioəlçatanlığı, bağırsaq sorulması, farmakokinetikası, effektiv dozası, uzunmüddətli təhlükəsizliyi, allergenliyi və klinik faydası müəyyən edilməmişdir.

Mexanizm sərhədi: Tədqiqatda ölçülən sitokin, oksidativ stress və baryer zülallarındakı dəyişikliklər ACSP ilə uyğundur; lakin NF-κB/MAPK, Nrf2–Keap1 və AMPK–MLCK–MLC kimi təklif olunan yollar birbaşa hədəf doğrulama təcrübələri ilə sübut edilməmişdir.