Utafiti huu ni utafiti wa majaribio wa kinga wa in vivo unaochunguza mwitikio wa kingamwili na usemi wa jeni unaotokea katika spishi mbili za popo wa matunda wa Afrika wanapokabiliwa na chanjo rekombinanti zinazoonyesha glikoproteini GP ya virusi vya Ebola au glikoproteini G ya virusi vya Nipah. Watafiti walilinganisha spishi za Eidolon helvum na Epomophorus gambianus; wakatathmini kufungamana kwa kingamwili kwa immunoassay ya mikrosfera nyingi inayotegemea Luminex xMAP, uwezo wa kingamwili wa kufanya neutralization kwa kipimo cha neutralization cha virusi vya pseudotype, na mwitikio wa molekuli katika Ei. helvum kwa uchambuzi wa transcriptomics unaotegemea upangaji wa RNA. Chanjo ya Nipah ilizalisha mwitikio dhahiri wa kingamwili za anti-Nipah-G katika popo wengi, wakati mwitikio dhahiri wa kufungamana dhidi ya Ebola GP ulionekana tu katika Ep. gambianus. Kwa upande mwingine, katika Ei. helvum, ingawa chanjo ya Ebola haikusababisha ongezeko kubwa la serolojia, mabadiliko dhahiri ya usemi wa jeni yalionekana katika ISGylation, utofautishaji wa T-cell na njia husika za kinga. Matokeo yanaonyesha kuwa mwitikio wa kinga unaweza kutofautiana kulingana na spishi na antijeni; hata hivyo, kutokana na sampuli ndogo, upotevu mkubwa wa wanyama katika Ep. gambianus, udhibiti mmoja tu wa transcriptomics wa PBS, na matumizi ya antijeni za chanjo badala ya maambukizi ya virusi hai, matokeo haya hayawezi kutafsiriwa kuwa sawa moja kwa moja na maambukizi halisi ya Ebola au Nipah.

Tatizo kuu la utafiti ni kwamba katika ufuatiliaji wa wanyamapori, kingamwili maalum dhidi ya virusi katika popo mara nyingi hutumiwa kama kiashirio cha mfiduo wa awali wa virusi, lakini haijulikani vya kutosha kingamwili hizi hutokea kwa kasi gani katika spishi tofauti za popo, zina uwezo gani wa kiutendaji, na kama spishi tofauti hujibu kwa namna ileile dhidi ya antijeni ileile. Kutokuwa na uhakika huku hufanya iwe vigumu kusema, kwa kutegemea tu serolojia chanya, kwamba popo ameambukizwa virusi fulani, anavibeba au anaweza kuvieneza.

Moja ya matokeo yenye kufundisha zaidi ya utafiti ni kuonyesha kwamba kingamwili inayofungamana na antijeni si kitu kilekile na kingamwili inayoneutralize virusi. Ingawa ishara kubwa za kufungamana dhidi ya Ebola GP zilipimwa katika wanyama wa Ep. gambianus waliopokea chanjo ya Ebola, sera zilizojaribiwa hazikuneutralize virusi vya pseudotype vya Ebola hata katika dilution ya chini kabisa ya serum katika jaribio. Kwa hiyo, ishara kubwa ya serolojia peke yake haimaanishi kinga ya ulinzi au ya neutralization.

Kwa nini utafiti ulifanywa?

Popo huhusishwa na virusi mbalimbali vya zoonosis, na kwa kuwa kugundua virusi vyenyewe katika mazingira ya uwanjani mara nyingi ni vigumu, upimaji wa kingamwili ni zana ya epidemiolojia inayotumiwa sana. Hata hivyo, kugunduliwa kwa kingamwili inayofungamana na protini fulani ya virusi katika sampuli ya serum hakuonyeshi peke yake maambukizi yalitokea lini, kingamwili inadumu kwa muda gani, kama kingamwili inaweza kuvifanya virusi visiwe na madhara, au kama popo ni reservoir halisi ya virusi. Kwa sababu hiyo watafiti walitaka kuona, katika mazingira ya majaribio yaliyodhibitiwa, jinsi spishi mbili tofauti za popo wa matunda wa Afrika zinavyokuza mwitikio wa kingamwili na usemi wa jeni zinapokabiliwa na antijeni maalum za virusi.

Spishi mbili zilichaguliwa katika utafiti. Eidolon helvum, inayojulikana kama popo wa matunda wa Afrika mwenye rangi ya majani makavu, ni spishi ambayo uhusiano wake na henipavirus umeandikwa vizuri. Epomophorus gambianus ni popo wa matunda wa Gambia mwenye epaulette na alijumuishwa katika utafiti kwa sababu ya uwezekano wa uhusiano wake na filovirus. Ingawa usambazaji wa kijiografia wa spishi hizi mbili unaingiliana kwa sehemu, tafiti za serolojia za uwanjani zimeripoti mifumo tofauti ya kingamwili dhidi ya makundi tofauti ya virusi. Utafiti unajaribu kupima kama tofauti za kinga maalum kwa spishi zinaweza kuwa msingi wa uchunguzi huu.

Kwa Nini Chanjo Rekombinanti Zilitumiwa Badala ya Virusi Hai vya Ebola au Nipah Katika Utafiti Huu?

Chanjo rekombinanti zilitumiwa kuchochea kwa njia iliyodhibitiwa mwitikio wa kinga wa popo dhidi ya antijeni kuu za uso za virusi hivi bila kutumia hali za juu za biosafety zinazohitajika kufanya majaribio kwa virusi hai vya Ebola au Nipah. Mbinu hii inaruhusu kuchunguza mfiduo wa antijeni; lakini haijumuishi michakato kama kuingia kwa virusi halisi ndani ya seli, kuongezeka, kusambaa katika tishu na kusababisha ugonjwa, na kwa hiyo si modeli kamili ya maambukizi halisi.

ChAdOx1 na MVA zinamaanisha nini?

ChAdOx1 ni vector rekombinanti ya virusi iliyotengenezwa kutoka adenovirus ya sokwe. Kazi yake hapa si kubeba virusi vya Ebola au Nipah vyenyewe, bali kupeleka taarifa za kijenetiki za glikoproteini iliyochaguliwa ya virusi kwenye seli za mwenyeji. Seli zinapotengeneza protini hiyo, mfumo wa kinga unaweza kuitambua antijeni hiyo ya kigeni na kuendeleza mwitikio wa kingamwili na wa seli.

MVA ni kifupi cha Modified Vaccinia Ankara na ilitumika kama vector nyingine ya virusi katika dozi ya nyongeza. Katika kundi la Ebola, dozi ya kwanza ilikuwa ChAdOx1-Ebola GP na dozi ya nyongeza baada ya wiki nne ilikuwa MVA-Ebola GP. Katika kundi la Nipah, vector ya kwanza ya ChAdOx1 ilibeba antijeni ya Nipah G, lakini kutokana na matatizo ya kiufundi ya maandalizi, nyongeza ya MVA baada ya wiki nne haikubeba antijeni ya Nipah. Kwa kuwa tofauti hii ilifanya iwe vigumu kulinganisha moja kwa moja kwa kiwango cha molekuli makundi hayo mawili ya chanjo baada ya wiki nne, uchambuzi wa transcriptomics uliwekewa kikomo kwenye wiki nne za kwanza baada ya dozi ya kwanza.

Mkakati wa prime-boost ni nini?

Katika mbinu ya prime-boost, dozi ya kwanza huanzisha mwitikio kwa kukutanisha mfumo wa kinga na antijeni lengwa kwa mara ya kwanza; dozi ya nyongeza inayofuata huchochea tena mwitikio wa kinga unaolenga shabaha hiyo hiyo. Katika utafiti huu sindano ya kwanza ilitolewa katika wiki ya 0 na ya pili katika wiki ya 4. Sampuli za damu zilikusanywa kila wiki na jaribio liliendelea kwa takribani wiki nane.

Ni popo wangapi walijumuishwa katika utafiti?

Popo walikamatwa mwezi Juni 2017 kutoka maeneo ya asili ya kujisitiri huko Accra, Ghana. Jumla ya popo 75 walikamatwa, na watoto pamoja na majike wakaachiliwa. Katika hatua ya kwanza, madume wazima 27 wa Ei. helvum na madume wazima 33 wa Ep. gambianus walihifadhiwa; baada ya ufuatiliaji wa afya na tabia, kundi la mwisho la majaribio lilijumuisha 19 Ei. helvum na 14 Ep. gambianus. Kuchagua madume pekee kulilenga kupunguza vigezo vya kifizikia kama umri na ujauzito; kwa upande mwingine, kutoweza kujumlisha moja kwa moja matokeo ya utafiti kwa popo majike ni kizuizi muhimu.

Ep. gambianus walizoea hali za kufungwa vibaya kuliko ilivyotarajiwa. Wanyama walipotea katika makundi yote matatu ya majaribio; wanne walifika hadi sindano ya pili, na watatu tu waliishi hadi mwisho wa jaribio la wiki nane. Utafiti chanzo hauhusishi upotevu huu na sindano za chanjo. Hali hii ilipunguza sana ukubwa wa sampuli, ikasababisha uwezekano wa survival bias, na kusababisha watafiti kutotumia vipimo vya takwimu kwenye data za Ep. gambianus.

Serolojia inapima nini?

Serolojia ni uchunguzi wa kingamwili katika serum. Watafiti walitumia immunoassay ya mikrosfera nyingi inayotegemea Luminex xMAP, yaani MIA. Protini tofauti za virusi hufunganishwa kwenye mikrosfera tofauti; kingamwili katika serum zinapofungamana na antijeni wanazozitambua, ishara ya fluorescence hutokea. Matokeo huandikwa kama MFI, median fluorescence intensity, yaani nguvu ya fluorescence ya median.

MFI si mkusanyiko wa kingamwili wa moja kwa moja kwa maana ya “kuna miligramu kadhaa za kingamwili”. Ni kipimo cha kulinganisha cha ishara ya kingamwili inayofungamana na antijeni ndani ya mfumo wa jaribio uliotumiwa. Kwa hiyo MFI kubwa inaendana na kufungamana zaidi na antijeni; lakini haimaanishi lazima kingamwili ina uwezo wa kuneutralize virusi.

Paneli ilikuwa na antijeni nane za glikoproteini za virusi rekombinanti: F na G za virusi vya Cedar, F na G za virusi vya Hendra, F na G za virusi vya Nipah, GP ya virusi vya Ebola na GP ya virusi vya Marburg. Katika vidhibiti chanya, dilutions za mfululizo za kingamwili monoclonal 5D2 kwa Ebola GP, 2B8 kwa Marburg, 102.4 kwa Hendra/Nipah G na 14F3 kwa Cedar zilitumiwa. Visima vya udhibiti hasi havikuwa na serum.

Jumla ya sampuli 413 za serum zilijaribiwa kwa MIA kwa duplikati. Vipimo kumi na tatu vilishindwa; sampuli 12 zilizotoa mikrosfera chini ya 100 zilitolewa baada ya udhibiti wa ubora. Data za MFI zilifanyiwa ubadilishaji wa \(\log_{10}\). Sampuli chache zilizoonyesha tofauti ya zaidi ya 0,5 log unit kati ya duplikati ziliwekewa alama lakini hazikuondolewa moja kwa moja.

Mabadiliko ya logarithmic ya MFI yanapaswa kusomwaje?

Usemi ufuatao si mlinganyo mpya wa utafiti; umetolewa ili kufafanua maana ya kihisabati ya mabadiliko ya MFI yaliyobadilishwa kwa log yaliyotumiwa katika makala:

\[ \Delta \log_{10}(\mathrm{MFI})= \log_{10}(\mathrm{MFI}_{final})- \log_{10}(\mathrm{MFI}_{initial}) \]

Hapa \(\mathrm{MFI}_{initial}\) ni nguvu ya fluorescence mwanzoni, na \(\mathrm{MFI}_{final}\) ni katika muda wa baadaye. Kwa sababu logarithm imetumiwa, mabadiliko husomwa kwa skeli ya kuzidisha. Kwa mfano, ongezeko la 1,0 \(\log_{10}\) unit kihisabati linalingana na MFI kuwa mara 10 ya mwanzo. Hii haimaanishi lazima mkusanyiko wa kingamwili umeongezeka hasa mara 10; MFI ni kipimo cha fluorescence cha kulinganisha cha mfumo wa jaribio.

Je, MFI na Kipimo cha Neutralization Vinapima Kitu Kilekile?

Hapana. Kipimo cha MFI hupima kufungamana kwa kingamwili na antijeni fulani ya virusi, wakati kipimo cha neutralization hutathmini kama serum hiyo inaweza kuzuia kwa utendaji mekanizimu ya virusi kuingia kwenye seli. Kingamwili inaweza kufungamana kwa nguvu na protini ya virusi lakini ikatambua epitope ambayo haisimamishi virusi kuingia kwenye seli; kwa hiyo MFI kubwa na uwezo mkubwa wa neutralization si lazima vitoe matokeo yale yale.

Virusi vya pseudotype ni nini?

Virusi vya pseudotype ni mfumo wa majaribio wa maabara unaobeba protini ya kuingia ya virusi vinavyotafitiwa kwenye uso wake lakini si virusi kamili vya pathogenic vinavyolengwa na utafiti. Katika utafiti huu, mfumo wa lentivirus wa kizazi cha pili wenye plasmid tatu ulitumiwa na pseudotype zenye glikoproteini tofauti za filovirus au henipavirus zilitengenezwa. Hivyo uwezo wa serum wa neutralization unaolenga hasa protini ya kuingia ya virusi uliweza kupimwa.

Serum ziliandaliwa kwa dilutions za mfululizo za mara tatu kati ya 1:50 na 1:12.150. Virusi vya pseudotype katika kiwango cha 100 × TCID50 viliwekwa na serum kwa saa moja katika 37 °C, kisha \(2\times10^4\) seli kutoka cell line husika zikaongezwa na ishara ya luciferase ikapimwa baada ya incubation ya saa 48.

TCID50 ni kipimo cha majaribio cha dozi inayoweza kusababisha maambukizi katika asilimia 50 ya sampuli kwenye mfumo wa culture ya seli. IC50 hapa ina maana ya dilution ambayo serum inaweza kupunguza ishara ya virusi vya pseudotype kwa asilimia 50. Titer ya juu ya neutralization inaonyesha kuwa serum inaweza kudumisha ufanisi wake hata ikiwa imepunguzwa zaidi.

Mwitikio wa kingamwili kwa chanjo ya Nipah

Katika kundi la chanjo ya Nipah la Ei. helvum, ishara ya kufungamana ya anti-Nipah-G iliongezeka isipokuwa kwa mnyama mmoja. Makundi ya Ebola na PBS yalipounganishwa kama udhibiti, mabadiliko ya anti-Nipah-G kati ya sampuli ya kwanza na ya mwisho yalikuwa makubwa kwa kiasi kikubwa katika kundi la Nipah: kwa kipimo cha Wilcoxon rank sum \(W=76\), \(p=0{,}0026\).

Tofauti ilikuwa dhahiri hata kabla ya sindano ya pili. Mabadiliko ya median kati ya sampuli ya kwanza na sampuli ya mwisho kabla ya nyongeza yaliripotiwa kuwa +1,0 \(\log_{10}\) MFI unit katika kundi la Nipah, −0,5 katika kundi la Ebola na 0,0 katika kundi la PBS. Katika ulinganisho huu \(W=77\) na \(p=0{,}0018\).

Katika linear mixed-effects model iliyotumia time series nzima, kundi la chanjo na muda vilichukuliwa kama fixed effects na utambulisho wa popo binafsi kama random effect. Mwingiliano wa kundi × muda uliunga mkono athari ya chanjo ya Nipah katika muda kwa \(p<10^{-4}\). Kutumia random individual effect ni muhimu ili kuingiza katika modeli ukweli kwamba vipimo vilivyopatikana kutoka kwa popo yuleyule kwa wiki kadhaa haviko huru kabisa kutoka kwa kila kimoja.

Uhusiano hasi ulipatikana kati ya kiwango cha Nipah-G MFI cha awali na mabadiliko yaliyoonekana katika kipindi cha jaribio. Kwa wanyama wote wa Ei. helvum, Pearson \(r=-0{,}65\), %95 confidence interval \([-0{,}85,-0{,}28]\); katika kundi la chanjo ya Nipah pekee \(r=-0{,}90\), %95 confidence interval \([-0{,}98,-0{,}44]\) iliripotiwa. Uhusiano huu unaendana na wanyama waliokuwa na ishara kubwa mwanzoni kuonyesha ongezeko dogo zaidi la jumla; correlation pekee haielezi sababu yake.

Katika uchambuzi wa neutralization wa Nipah, sampuli 14 za serum za mwisho zilitumiwa. Uhusiano chanya wenye nguvu ulipatikana kati ya kipimo cha MIA na matokeo ya neutralization ya pseudotype: Spearman \(\rho=0{,}82\), \(p=0{,}0003\), \(n=14\). Katika sampuli ya utafiti, shughuli ya neutralization ilionekana katika sera zilizokuwa na MFI ya takribani zaidi ya 200 units. Watafiti pia wanaeleza kwamba katika utafiti wa awali threshold ya 500 MFI inayotegemea uchambuzi wa ROC ilipendekezwa kwa serolojia ya Nipah-G katika Ei. helvum. Kwa hiyo thamani za 200 na 500 MFI hazipaswi kuchukuliwa kama threshold za ulimwengu wote zilizoundwa kwa lengo moja.

Mwishoni mwa jaribio, kingamwili za neutralization zinazoweza kugunduliwa zilipatikana katika popo wote wanane wa kundi la chanjo ya Nipah waliofanyiwa kipimo cha neutralization.

Mwitikio wa kingamwili kwa chanjo ya Ebola

Katika Eidolon helvum, ongezeko thabiti la kufungamana kwa kingamwili za anti-Ebola-GP halikuonekana baada ya chanjo ya Ebola. Kwa upande mwingine, ongezeko kubwa la MFI ya Ebola GP lilionekana katika wanyama wanne wa Ep. gambianus walioishi angalau wiki moja baada ya chanjo ya kwanza ya Ebola. Hata hivyo, kwa sababu idadi ya wanyama ilikuwa ndogo sana, kipimo cha takwimu hakikufanywa katika spishi hii.

Tofauti muhimu zaidi katika hatua hii ya utafiti ni jaribio la neutralization. Sampuli 15 za serum zilizochukuliwa siku ya mwisho ya jaribio zilijaribiwa kwa pseudotype ya lentivirus iliyobeba Ebola GP. Hizi zilijumuisha serum za Ei. helvum nane katika kundi la Ebola, Ei. helvum wanne katika kundi la PBS na Ep. gambianus watatu waliokamilisha utafiti. Hakuna sampuli iliyoneutralize pseudotype ya Ebola katika dilution ya chini kabisa ya serum ya 1:50.

Watafiti pia walichunguza uwezekano kwamba eneo la mucin lililoglycosylated sana katika protini ya Ebola GP1 linaweza kuathiri kufungamana kwa kingamwili na wakarudia kipimo kwa pseudotype ya Ebola GP1 ambayo eneo la mucin lilikuwa limeondolewa. Licha ya hayo, hakuna serum iliyoonyesha neutralization katika dilution ya 1:50.

Matokeo haya yanaonyesha kwamba hasa ishara kubwa ya kufungamana ya Ebola-GP iliyopimwa katika Ep. gambianus haimaanishi moja kwa moja kingamwili ya neutralization. Waandishi wanajadili kwamba kingamwili hizi zinaweza kutambua epitope za GP ambazo hazitoi neutralization. Ikiwa kingamwili hizi zina kazi nyingine zinazopatanishwa na Fc, kama phagocytosis au activation ya natural killer cells, haikujaribiwa katika jaribio hili.

Je, kushindwa kwa vector ya chanjo kuingia kwenye seli kunaweza kuwa maelezo?

Watafiti walithibitisha kwamba vector zote mbili za chanjo zinaweza kuambukiza seli za Ei. helvum na Ep. gambianus katika jaribio la fluorescence la maambukizi ya in vitro kwa ufanisi unaofanana na seli za binadamu zinazojulikana kuwa nyeti. Kwa hiyo, kueleza kutokuwepo kwa kingamwili dhahiri ya serum dhidi ya Ebola GP katika Ei. helvum kwa sababu tu vector ya adenovirus haiwezi kuingia katika seli za spishi hii hakuungwi mkono na data za utafiti.

Uchambuzi wa transcriptomics unachunguza nini?

Transcriptome ni jumla ya molekuli za RNA zinazoonyeshwa katika seli au tishu fulani wakati fulani. Kuwepo kwa jeni katika DNA na kiwango ambacho jeni hiyo inafanya kazi wakati huo ni mambo tofauti. RNA sequencing huruhusu kukadiria kwa kiasi ni RNA kiasi gani kinatengenezwa kutoka kwa jeni gani, na hivyo kuchunguza programu zipi za molekuli za mfumo wa kinga zimechochewa.

Uchambuzi wa transcriptomics ulifanywa tu katika Ei. helvum. Mwanzoni, sampuli za damu kutoka kwa wanyama 8 wa kundi la chanjo ya Ebola, 3 wa kundi la Nipah na 2 wa kundi la PBS zilichaguliwa. Baada ya mmoja wa wanyama wa udhibiti kuondolewa kutoka uchambuzi wa differential gene expression kwa sababu ya profile ya juu ya kingamwili mwanzoni na tabia ya transcriptomics iliyokuwa outlier, ulinganisho wa makundi ulitegemea udhibiti mmoja tu wa PBS. Hali hii inapunguza sana nguvu ya takwimu ya matokeo.

Kwa kuwa nyongeza ya MVA katika wiki ya 4 ya kundi la Nipah haikubeba antijeni ya Nipah, tathmini ya transcriptomics ilifanywa tu katika wiki nne za kwanza baada ya dozi ya kwanza ya ChAdOx1 ili kuhifadhi ulinganisho wenye maana kati ya makundi.

RNA sequencing ilifanywaje?

RNA ilitengwa kutoka 150 µl ya damu nzima kwa njia ya RNAzol BD. Utafiti chanzo unaeleza kwa undani protocol iliyobadilishwa kwa kiasi kidogo cha sampuli: 300 µl RNAzol BD, 4,05 µl acetic acid, 450 µl lysate, 22,5 µl 1-bromo-3-chloropropane, 78,75 µl isopropanol na 60–120 µl %75 ethanol zilitumiwa; katika hatua husika 225 µl supernatant ilichakatwa.

Kiasi cha RNA kilitathminiwa kwa NanoDrop 2000 na uadilifu wa RNA kwa Agilent 2100 Bioanalyzer. Sampuli zilisekwenziwa kwenye jukwaa la Illumina kwa paired-end yenye urefu wa 150 base pairs. Idadi ya raw reads kwa sampuli iliripotiwa kuwa wastani wa \(26{,}25 \pm 3{,}02\) million.

Udhibiti wa ubora ulifanywa kwa FastQC v0.11.4, na sequences za ubora wa chini zilikatwa kwa bbduk.sh katika kifurushi cha BBTools. Sequences zilizowakilishwa kupita kiasi na adapters ziliondolewa. Kwa kuwa takribani %75 ya transcripts za damu zililingana na hemoglobin, zilitolewa katika dataset. Base 10 za kwanza upande wa kushoto wa reads ziliondolewa; ncha zote mbili zilikatwa ili wastani wa Phred quality score uwe angalau 10, na reads fupi kuliko base 25 zilitupwa. Baada ya hatua hizi, wastani wa \(6{,}82 \pm 3{,}08\) million reads kwa sampuli ulibaki.

Reads zilizopita quality filtering zili-aligniwa na draft genome ya Ei. helvum iliyotengenezwa na kikundi cha utafiti kwa STAR v2.7.3a, kwa kutumia chaguo la --quantMode GeneCounts. %76–88 ya reads zilizokatwa zililingana na eneo moja la kipekee katika genome.

Kwa kuwa ubora wa RNA wa sampuli ya PBS ya wiki ya pili ulikuwa mdogo, differential expression comparison kati ya PBS na makundi ya chanjo haikuweza kufanywa katika wiki hiyo.

Differential gene expression ni nini?

Jeni kuonyeshwa kwa kiwango cha juu au cha chini katika kundi la chanjo ikilinganishwa na kundi la udhibiti huitwa differential gene expression. Uchambuzi ulifanywa kwa DESeq2 v1.36.0 na marekebisho ya Benjamini-Hochberg false discovery rate, yaani FDR, yalitumika kupunguza false positives zinazotokana na multiple hypothesis testing. Jeni zenye \(FDR<0{,}05\) zilikubaliwa kuwa differentially expressed genes, yaani DEG.

Differential expression mara nyingi huonyeshwa kwa \(\log_2\) fold change. Usemi ufuatao ni ufafanuzi wa kihisabati kwa madhumuni ya kueleza:

\[ \log_2 FC=\log_2\left(\frac{\mathrm{ifade}_{tedavi}} {\mathrm{ifade}_{karşılaştırma}}\right) \]

\(\log_2 FC=1\) kihisabati ni mara mbili, \(\log_2 FC=-1\) ni nusu ya kiwango, na \(\log_2 FC=2\) ni uwiano wa usemi wa mara nne. Hata hivyo, fold change kubwa peke yake si ushahidi wa umuhimu wa kibiolojia; ukubwa wa sampuli, variance na multiple-testing correction pia vinapaswa kutathminiwa.

ISGylation ni Nini na Kwa Nini ni Muhimu Katika Utafiti Huu?

ISGylation ni mchakato wa udhibiti wa seli ambapo protini inayofanana na ubiquitin iitwayo ISG15, inayochochewa na interferon, huunganishwa kwa njia ya enzymatic na protini nyingine. Katika utafiti, wakati makundi ya chanjo ya Ebola na Nipah yalilinganishwa, usemi wa jeni zinazohusiana na ISGylation kama UBA7, ISG15, HERC5 na USP18 ulitofautiana; hivyo njia hii ikawa moja ya matokeo ya msingi katika kuelewa tofauti za mwitikio wa kinga wa molekuli kwa glikoproteini hizi mbili za virusi.

Katika mnyororo mkuu wa ISGylation ulioelezwa katika utafiti chanzo, ISG15 kwanza huamilishwa na enzyme ya E1 UBA7, kisha huhamishwa kwenda kwa enzyme ya E2 UBE2L6 na kuunganishwa na protini lengwa kupitia enzyme ya E3 HERC5. Katika ulinganisho wa moja kwa moja wa Ebola-Nipah wa wiki ya kwanza, UBA7 ilikuwa mojawapo ya jeni zenye tofauti kubwa zaidi; ISG15, HERC5 na USP18 pia zilionyesha tofauti muhimu. Viwango vya usemi wa jeni hizi nne vilikuwa chini katika kundi la chanjo ya Ebola kuliko kundi la Nipah. Hata hivyo, kundi la Ebola lilipolinganishwa na udhibiti wa PBS, si jeni hizi zote zilizokuwa chini kwa kiasi kikubwa katika muda huo; chanzo kinasema UBA7 pekee ndiyo ilikuwa downregulated kwa kiasi kikubwa. Tofauti hii ni muhimu.

ISGylation kwa kawaida huhusishwa na mwitikio wa antiviral unaohusiana na type I interferon. Lakini kwa kuwa hakukuwa na replication ya virusi hai katika jaribio hili, mabadiliko yanayohusiana na ISGylation yaliyoonekana si ushahidi wa viral replication. Waandishi wanayatafsiri katika muktadha wa activation ya kinga dhidi ya vector ya chanjo ya ChAdOx1 na antijeni za Nipah-G au Ebola-GP zinazobebwa.

Uchambuzi wa GO na KEGG hufanya nini?

Ni vigumu kutafsiri orodha ya mamia ya jeni moja moja. Gene Ontology, yaani uchambuzi wa GO, huchunguza kama jeni zenye differential expression zimewakilishwa zaidi ya inavyotarajiwa katika michakato fulani ya kibiolojia. KEGG ni database iliyopangwa ya njia za seli na molekuli. Hapa WebGestalt 2019 ilitumiwa kuchunguza kama michakato fulani ya kibiolojia na njia za KEGG zimewakilishwa kupita kiasi katika orodha za DEG.

Katika ulinganisho wa kundi la chanjo ya Nipah dhidi ya PBS, hakuna njia ya KEGG au mchakato wa kibiolojia uliowakilishwa kupita kiasi uliogunduliwa. Katika kundi la chanjo ya Ebola, istilahi mbalimbali za GO zinazohusiana na utofautishaji wa leukocyte; pamoja na ishara zinazohusiana na njia muhimu za udhibiti wa kinga kama utofautishaji wa seli za Th1 na Th2, Notch signalling na JAK/STAT cascade ziligunduliwa.

Hata hivyo, kwa sababu transcripts za cytokine ziligunduliwa kwa kiwango kidogo, watafiti hawakuweza kubainisha ni T-helper cell subtype ipi ilikuwa kubwa zaidi. Kwa hiyo, utafiti haujathibitisha mekanizimu ya uhakika kwamba “kingamwili haikutokea dhidi ya antijeni ya Ebola kwa sababu mfumo wa kinga ulihamia kwenye mwitikio wa seli”.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Utunzaji wa wanyama na uchukuaji wa sampuli

Popo walioingizwa kwenye jaribio waliwekwa katika vizimba vya 80 × 80 × 80 cm, katika makundi ya hadi wanyama watano wa spishi moja. Vizimba viliwekwa kwa umbali wa takribani 2 m na kutenganishwa kwa vizuizi vya chuma ili kupunguza mawasiliano ya moja kwa moja na yasiyo ya moja kwa moja kupitia mkojo, majimaji, chakula au maji. Wanyama walipewa mchanganyiko wa matunda yaliyokatwa kama mango, papai na ndizi pamoja na maji ya kunywa bila kizuizi; vilibadilishwa kila siku.

Popo waliwekwa chini ya uangalizi wa daktari wa mifugo kwa siku 8–10 kabla ya jaribio na kufuatiliwa kwa stress, kupungua uzito na majeraha wakati wote wa jaribio.

Sampuli ya kwanza ya damu ilichukuliwa kabla ya chanjo kwa kiasi cha 0,5 ml. Sindano ya kwanza ilitolewa intramuscular kama takribani \(10^7\) IU ChAdOx1 au 0,25 ml PBS. Wiki nne baadaye takribani \(10^7\) pfu MVA au PBS ilitolewa. Kiasi cha sampuli za damu za kila wiki kilikuwa 0,3 ml. Katika wiki ya nane, wanyama waliobaki walifanyiwa euthanasia kwa overdose ya ketamine/medetomidine ya intravenous, na sampuli za ubongo, ini, wengu, figo na inapowezekana lymph node zilikusanywa.

Sampuli za serum zilipashwa joto kwa 56 °C kwa dakika 30 ili ku-inactivate pathogens zinazowezekana, na sampuli zilihifadhiwa katika −80 °C.

Matokeo makuu ya serolojia

Muhtasari wa uchakataji wa data za transcriptomics

Matokeo ya namba ya differential gene expression

Kila muda ulipolinganishwa kando na udhibiti wa PBS, idadi ya jeni zenye differential expression katika kundi la chanjo ya Ebola ilitofautiana kati ya 261 na 789, kwa wastani wa \(506 \pm 266{,}0\). Katika kundi la chanjo ya Nipah, idadi hiyo ilitofautiana tu kati ya 3 na 28 na kuripotiwa kuwa wastani wa \(16{,}3 \pm 12{,}6\).

Kati ya jeni 38 za jumla zilizokuwa na differential expression katika angalau muda mmoja katika kundi la Nipah, 30 pia zilikuwa na differential expression katika angalau muda mmoja katika kundi la Ebola. Uchambuzi wote ulipotathminiwa pamoja, DEG 968 maalum kwa kundi la Ebola na DEG 8 maalum kwa kundi la Nipah ziliripotiwa.

Makundi ya chanjo ya Ebola na Nipah yalipolinganishwa moja kwa moja, idadi ya DEG katika wiki nne za kwanza ilitofautiana kati ya 185 na 788, kwa wastani wa \(405 \pm 282\). Idadi kubwa zaidi za DEG zilionekana katika wiki ya kwanza na ya nne.

Utofautishaji wa T-cell na matokeo ya JAK/STAT

Katika ulinganisho wa kundi la chanjo ya Ebola dhidi ya PBS, istilahi za GO zinazohusiana na utofautishaji wa T-helper cells ziliwakilishwa kupita kiasi. Pamoja na jeni zinazohusiana na utofautishaji wa Th1 na Th2, njia za Notch na JAK/STAT signalling pia zilijitokeza.

Kwa ujumla, seli za Th1 huhusishwa na mwitikio wa kinga dhidi ya pathogens za ndani ya seli; seli za Th2 huhusishwa na activation ya B-cell na mwitikio wa humoral. Hata hivyo, kwa sababu RNA za cytokine husika ziligunduliwa kwa kiwango kidogo, haikuwezekana kubainisha mwitikio mkuu wa Th1 au Th2 katika Ei. helvum waliokabiliwa na chanjo ya Ebola.

Kwa hiyo, kueleza kutokuwepo kwa mwitikio wa serolojia wa anti-Ebola kwa kusema “kinga ilihamia kabisa kwenye upande wa cellular” hakuungwi mkono na chanzo.

Maelezo ya matokeo katika njia ya ISGylation

Katika ulinganisho wa moja kwa moja wa wiki ya kwanza kati ya makundi ya chanjo ya Ebola na Nipah, DEG yenye nguvu zaidi ilikuwa UBA7. ISG15, HERC5 na USP18 pia zilionyesha differential expression kati ya makundi hayo mawili. Viwango vya usemi wa UBA7, ISG15, HERC5 na USP18 vilikuwa chini katika kundi la Ebola kuliko kundi la Nipah.

Ni muhimu kutokuchanganya ulinganisho huu miwili tofauti. Matokeo kwamba “ni chini katika kundi la Ebola kuliko kundi la Nipah” hayamaanishi moja kwa moja kwamba “ni chini ya udhibiti katika kundi la Ebola”. Ikilinganishwa na PBS katika wiki ya kwanza, ni UBA7 pekee kati ya jeni hizi nne iliyoripotiwa kuwa downregulated kwa kiasi kikubwa katika kundi la Ebola.

Je, Eidolon helvum na Epomophorus gambianus Zilijibu Vivyo Hivyo kwa Antijeni Zilezile?

Hapana. Ingawa mwitikio dhahiri wa kingamwili dhidi ya antijeni ya Nipah G uliweza kuonekana katika spishi zote mbili, mwitikio mkubwa wa kufungamana dhidi ya Ebola GP ulionekana tu katika idadi ndogo ya Epomophorus gambianus waliobaki hai, na hakuna ongezeko thabiti la kingamwili za serum za anti-Ebola-GP lililogunduliwa katika Eidolon helvum. Hata hivyo, mwitikio wa transcriptomics katika Ei. helvum ulionyesha kwamba jeni nyingi na njia nyingi za kinga zilibadilika dhidi ya chanjo ya Ebola; hivyo hitimisho kwamba “hakuna ongezeko la kingamwili = hakuna mwitikio wa kinga” haliwezi kutolewa.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• Chanjo iliyobeba antijeni ya Nipah G ilisababisha ongezeko dhahiri na linaloungwa mkono na takwimu la kingamwili za anti-Nipah-G, hasa katika Ei. helvum.
• Uhusiano wenye nguvu ulipatikana katika sampuli zilizochunguzwa kati ya ishara ya Nipah-G MIA na shughuli ya neutralization ya pseudotype.
• Ishara ya kingamwili inayofungamana na Ebola GP iliongezeka katika Ep. gambianus; hata hivyo, matokeo haya yanategemea idadi ndogo sana ya wanyama.
• Kingamwili za serum zinazofungamana na Ebola GP hazikuneutralize pseudotype ya Ebola katika hali zilizojaribiwa.
• Katika Ei. helvum, chanjo ya Ebola ilihusishwa na mwitikio mpana wa transcriptomics licha ya kutosababisha ongezeko dhahiri la kingamwili za serum.
• Tofauti zilionekana kati ya makundi ya chanjo ya Ebola na Nipah katika jeni na njia zinazohusiana na ISGylation, mwitikio wa type I interferon, mwitikio dhidi ya virusi na uteuzi wa T-cell.
• Spishi za popo zinaweza kutofautiana katika jinsi zinavyojibu kinga dhidi ya antijeni zilezile za virusi.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono

Utafiti haukupima ni mara ngapi Eidolon helvum au Epomophorus gambianus hubeba virusi vya Ebola au Nipah katika mazingira ya asili. Kujibu chanjo hakuthibitishi hadhi ya natural reservoir. Kugunduliwa kwa kingamwili katika serum hakumaanishi maambukizi hai, kumwaga virusi hai au uwezo wa kuambukiza.

Kwa kuwa jaribio halikutumia virusi hai vya Ebola au Nipah, halitoi matokeo ya moja kwa moja kuhusu kuongezeka kwa virusi, tissue tropism, maendeleo ya ugonjwa au virus shedding wakati wa maambukizi halisi.

Haijaonyeshwa kwamba kingamwili zinazofungamana na Ebola GP katika Ep. gambianus ni za kinga. Kinyume chake, neutralization haikugunduliwa katika jaribio la pseudotype neutralization lililotumiwa. Hata hivyo, utafiti haukujaribu moja kwa moja kazi nyingine za kinga za kingamwili ambazo hazineutralize.

Mwitikio mpana wa transcriptomics wa chanjo ya Ebola katika Ei. helvum si ushahidi kwamba spishi hii itajibu kwa namna hiyo hiyo dhidi ya maambukizi halisi ya Ebola. Vector ya chanjo na uwasilishaji wa antijeni si mchakato uleule wa kibiolojia na maambukizi ya virusi hai.

Kwa kuwa utafiti ulijumuisha popo madume wazima pekee, hauonyeshi kwamba matokeo yale yale yatatokea kwa majike, watoto au makundi mengine ya umri.

Vikwazo vikuu

Kizuizi kikubwa zaidi ni kupotea kwa haraka kwa wanyama wa Ep. gambianus. Ingawa kulikuwa na wanyama 14 mwanzoni, wanne tu walifikia sindano ya pili na watatu tu walifikia mwisho wa jaribio. Hali hii ilipunguza nguvu ya takwimu na pia ikasababisha survival bias ambapo wanyama waliofika mwisho wa jaribio huenda hawakuwakilisha spishi nzima.

Hakuna data ya Ep. gambianus katika uchambuzi wa transcriptomics. Aidha, baada ya sampuli za udhibiti kuondolewa kutokana na ubora na profile ya kingamwili ya awali, differential expression analyses zilitegemea mnyama mmoja tu wa udhibiti wa PBS. Watafiti wanaeleza wazi kwamba ulinganisho huu wa pande mbili ni matokeo ya awali.

Kwa kuwa takribani %75 ya transcripts za damu zililingana na hemoglobin, inawezekana baadhi ya jeni zenye usemi wa kiwango cha chini hazikugunduliwa.

Historia ya maambukizi ya asili ya popo haijulikani. Haikuwezekana kuondoa kwa uhakika maambukizi hai ya henipavirus; kwa hiyo haiwezi kuondolewa kabisa kwamba baadhi ya mabadiliko ya kingamwili yalihusiana na mfiduo wa asili ndani ya vizimba. Ongezeko la anti-Nipah-G lililoonekana mwisho wa jaribio katika popo mmoja wa kundi la PBS lilijadiliwa kama mfano wa hali hii.

Kutokuwepo kwa serum ya udhibiti chanya kutoka kwa popo wanaojulikana kwa uhakika kuwa wameambukizwa Ebola kunazuia kalibresheni sahihi ya sensitivity na specificity ya vipimo vya serolojia vya Ebola.

Katika kundi la Nipah, dozi ya pili ya MVA kutobeba antijeni lengwa ya Nipah kulifanya regimen mbili za chanjo kutokuwa sawa baada ya wiki ya 4. Kwa hiyo kutopanua ulinganisho wa usemi wa jeni hadi baada ya dozi ya nyongeza lilikuwa uamuzi sahihi wa kimetodolojia lakini uliopunguza upeo.

Maana ya kisayansi ya matokeo

Picha kuu inayoonyeshwa na utafiti ni kwamba kinga ya antiviral katika popo haiwezi kutafsiriwa tu kama “kingamwili ipo/haipo”. Ei. helvum inaweza kuonyesha mwitikio mkubwa wa kingamwili za serum na neutralization dhidi ya antijeni ya Nipah, lakini haikuzalisha kingamwili dhahiri za serum dhidi ya Ebola GP, huku bado ikionyesha mabadiliko ya molekuli katika mamia ya jeni na njia mbalimbali za kinga. Ep. gambianus kwa upande mwingine ilitoa mwitikio dhahiri wa kufungamana dhidi ya Ebola GP katika idadi ndogo ya wanyama walioweza kuchunguzwa, lakini hii haikuonekana katika kipimo cha neutralization cha serum.

Tofauti hizi zinaonyesha kwamba wakati wa kutafsiri matokeo ya ufuatiliaji wa serolojia katika popo wa porini, spishi, antijeni ya virusi inayolengwa na kipimo kilichotumiwa vinapaswa kutathminiwa pamoja. Haiwezi kudhaniwa kwamba thamani ileile ya MFI ina maana ileile ya kibiolojia katika spishi tofauti; kufungamana na antijeni, neutralization na mwitikio wa seli/transcriptomics ni tabaka tofauti za kipimo.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Utafiti asili: Serological and transcriptomic response of African fruit bats to immune challenge with recombinant vaccines expressing Ebola or Nipah virus antigens.

Waandishi: Elinor Jax; Romain Garnier; Georgia Tsagkogeorga; Hubert Buczkowski; Louise Gibson; Pius Benia; Richard Suu-Ire; Vera M. Warmuth; Sylvester Languon; Osbourne Quaye; Lianying Yan; Christopher C. Broder; Stephen J. Rossiter; Edward Wright; Sarah C. Gilbert; Teresa Lambe; James L. N. Wood; Andrew A. Cunningham; Olivier Restif.

Mwandishi wa mawasiliano: Olivier Restif. Chanzo hakionyeshi alama ya uandishi mwenza wa kwanza au mchango sawa.

Taasisi: University of Cambridge Department of Veterinary Medicine; Queen Mary University of London School of Biological and Behavioural Sciences; University of Sussex Viral Pseudotype Unit; Zoological Society of London Institute of Zoology; University of Ghana School of Veterinary Medicine; University of Ghana Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology na West African Centre for Cell Biology of Infectious Pathogens; Ludwig-Maximilians-Universität München Biozentrum Martinsried; Uniformed Services University Department of Microbiology and Immunology; Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine; University of Oxford Pandemic Sciences Institute; Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute; Oxford Vaccine Group.

Jarida: Royal Society Open Science. Mchapishaji: The Royal Society. Juzuu: 13. Toleo: 10. Nambari ya makala: 252189. Tarehe ya kuchapishwa: 7 Oktoba 2026. DOI: 10.1098/rsos.252189. Tarehe ya kupokelewa: 11 Novemba 2025. Tarehe ya kukubaliwa: 8 Juni 2026.

Aina ya chanzo na peer review: Ni makala ya utafiti iliyopitiwa na wataalamu. Leseni: Creative Commons Attribution 4.0, CC BY 4.0.

Aina ya utafiti: Uchocheaji wa kinga wa majaribio wa in vivo kwa kutumia vector rekombinanti za virusi katika popo wa matunda wa Afrika madume wazima waliokamatwa porini; uchambuzi wa kingamwili za serum; kipimo cha neutralization cha lentiviral pseudotype; uchambuzi wa transcriptomics wa RNA-seq ya damu nzima katika spishi moja na majaribio ya ziada ya udhibiti wa seli ya in vitro.

Kikomo muhimu cha kimetodolojia: Hakukuwa na maambukizi ya virusi hai vya Ebola au Nipah katika jaribio. Vector za chanjo zinaonyesha antijeni za Ebola GP au Nipah G. Kwa hiyo, matokeo hayapaswi kusawazishwa na pathogenesis ya maambukizi ya virusi, uwezo wa kuambukiza au uwezo wa kuwa natural reservoir.

Ruhusa za kimaadili: Zoological Society of London, mradi WLE719, 26 Mei 2017; Ghana Council for Scientific Industrial Research, RPN 001/CSIR-IRB/2017, 22 Juni 2017.

Upatikanaji wa data: Raw mRNA-seq data zimehifadhiwa katika NCBI Sequence Read Archive kwa accession number PRJNA1054324. Draft genome ya Ei. helvum na annotation iliyotengenezwa katika utafiti imeshirikiwa chini ya Figshare DOI 10.6084/m9.figshare.29117609.v2; datasets za S1–S3 na R code zilizotumiwa kuzalisha upya uchambuzi mkuu wa serolojia na differential expression zimeshirikiwa chini ya Figshare DOI 10.6084/m9.figshare.29126510.v2. Mkusanyiko wa supplementary material umeonyeshwa kama DOI 10.6084/m9.figshare.c.8655631.

Mgongano wa maslahi: Waandishi wameripoti kwamba hakuna competing interests.

Ufadhili: Utafiti uliungwa mkono na Deutsche Forschungsgemeinschaft research fellowship 438001934 kwa Elinor Jax; Royal Society GCRF CH160115 kwa Olivier Restif; MRC MR/P025226/1 kwa James L. N. Wood, Andrew A. Cunningham na Osbourne Quaye; AXA Research Fund Junior Fellowship kwa Romain Garnier; ALBORADA Trust; Research England na NIH AI054715 kwa Christopher C. Broder.

Tamko la AI la waandishi: Katika makala chanzo, waandishi wameripoti kwamba hawakutumia teknolojia zinazosaidiwa na akili bandia katika kuandaa makala.

Muhtasari wa michango ya waandishi: Elinor Jax formal analysis, mbinu, visualization na rasimu ya kwanza; Romain Garnier conceptualization na utafiti; Georgia Tsagkogeorga formal analysis na utafiti; Hubert Buczkowski mbinu na utafiti; Louise Gibson data curation, mbinu na project management; Pius Benia utafiti; Richard Suu-Ire utafiti na project management; Vera M. Warmuth formal analysis; Sylvester Languon utafiti; Osbourne Quaye project management na supervision; Lianying Yan mbinu; Christopher C. Broder ufadhili, mbinu na resources; Stephen J. Rossiter conceptualization na supervision; Edward Wright utafiti na mbinu; Sarah C. Gilbert na Teresa Lambe mbinu na resources; James L. N. Wood na Andrew A. Cunningham conceptualization, ufadhili, project management na supervision; Olivier Restif conceptualization, formal analysis, mbinu, project management, visualization na rasimu ya kwanza. Makala ilichapishwa baada ya idhini ya mwisho ya waandishi wote.