Bu çalışma, iki Afrika meyve yarasası türünün Ebola virüsü GP glikoproteini veya Nipah virüsü G glikoproteinini eksprese eden rekombinant aşılarla karşılaştığında oluşturduğu antikor ve gen ifadesi yanıtlarını inceleyen deneysel bir in vivo bağışıklık çalışmasıdır. Araştırmacılar Eidolon helvum ve Epomophorus gambianus türlerini karşılaştırmış; antikor bağlanmasını Luminex xMAP tabanlı multipleks mikroküre immünoassayıyla, antikorların işlevsel nötralizasyon kapasitesini psödotip virüs nötralizasyon testiyle ve Ei. helvum'daki moleküler yanıtı RNA dizileme tabanlı transkriptomik analizle değerlendirmiştir. Nipah aşısı çoğu yarasada belirgin anti-Nipah-G antikor yanıtı oluştururken, Ebola GP'ye karşı belirgin bağlanma yanıtı yalnız Ep. gambianus'ta gözlenmiştir. Buna karşılık Ei. helvum'da Ebola aşısı güçlü bir serolojik artış oluşturmamasına rağmen ISGylation, T-hücresi farklılaşması ve ilişkili bağışıklık yollarında belirgin gen ifadesi değişiklikleri görülmüştür. Bulgular türlere ve antijenlere göre farklı bağışıklık yanıtları olabileceğini göstermektedir; ancak küçük örneklem, Ep. gambianus'taki yüksek hayvan kaybı, tek PBS transkriptomik kontrolü ve çalışmanın canlı virüs enfeksiyonu yerine aşı antijenlerini kullanması nedeniyle sonuçlar gerçek Ebola veya Nipah enfeksiyonunun doğrudan karşılığı olarak yorumlanamaz.

Araştırmanın temel problemi, yaban hayatı sürveyansında yarasalardaki virüse özgü antikorların sıklıkla geçmiş viral maruziyetin göstergesi olarak kullanılması fakat farklı yarasa türlerinde bu antikorların ne kadar hızlı oluştuğunun, ne kadar işlevsel olduğunun ve aynı antijene karşı farklı türlerin aynı şekilde yanıt verip vermediğinin yeterince bilinmemesidir. Bu belirsizlik, yalnız serolojik pozitifliğe dayanarak bir yarasanın belirli bir virüsle enfekte olduğunu, virüsü taşıdığını veya bulaştırabildiğini söylemeyi güçleştirir.

Çalışmanın en öğretici sonuçlarından biri, antijene bağlanan antikor ile virüsü nötralize eden antikorun aynı şey olmadığını göstermesidir. Ebola aşısı uygulanan Ep. gambianus bireylerinde Ebola GP'ye karşı yüksek bağlanma sinyalleri ölçülmesine rağmen test edilen serumlar Ebola psödotip virüsünü deneyin en düşük serum dilüsyonunda bile nötralize etmemiştir. Dolayısıyla yüksek serolojik sinyal tek başına koruyucu veya nötralize edici bağışıklık anlamına gelmemektedir.

Araştırma neden yapılmıştır?

Yarasalar çeşitli zoonotik virüslerle ilişkilendirilmektedir ve sahada virüsün kendisini saptamak çoğu zaman zor olduğu için antikor ölçümü yaygın bir epidemiyolojik araçtır. Ancak bir serum örneğinde belirli bir viral proteine bağlanan antikor saptanması; enfeksiyonun ne zaman gerçekleştiğini, antikorun ne kadar süre kaldığını, antikorun virüsü etkisizleştirebildiğini veya yarasanın virüs için gerçek bir rezervuar olduğunu tek başına göstermez. Araştırmacılar bu nedenle kontrollü bir deney ortamında, belirli viral antijenlere maruz kalındığında iki farklı Afrika meyve yarasası türünün nasıl antikor ve gen ifadesi yanıtları geliştirdiğini görmek istemiştir.

Çalışmada iki tür seçilmiştir. Eidolon helvum, saman renkli Afrika meyve yarasası olarak bilinen ve henipavirüslerle ilişkisi güçlü biçimde belgelenmiş bir türdür. Epomophorus gambianus ise Gambiya apoletli meyve yarasasıdır ve filovirüslerle olası ilişkisi nedeniyle araştırmaya dahil edilmiştir. İki türün coğrafi dağılımları kısmen örtüşmesine rağmen sahadaki serolojik çalışmalar farklı virüs gruplarına karşı farklı antikor örüntüleri bildirmiştir. Araştırma bu gözlemlerin altında türlere özgü bağışıklık farklılıklarının bulunup bulunmadığını sınamaya çalışmaktadır.

Bu Çalışmada Rekombinant Aşılar Neden Canlı Ebola veya Nipah Virüsü Yerine Kullanıldı?

Rekombinant aşılar, canlı Ebola veya Nipah virüsüyle deney yapmanın gerektirdiği yüksek biyogüvenlik koşullarına başvurmadan yarasaların bu virüslerin temel yüzey antijenlerine karşı bağışıklık yanıtını kontrollü biçimde uyarmak için kullanılmıştır. Bu yaklaşım antijen maruziyetini incelemeye izin verir; ancak gerçek virüsün hücreye girişi, çoğalması, dokularda yayılması ve hastalık oluşturması gibi süreçleri içermez ve dolayısıyla gerçek enfeksiyonun tam bir modeli değildir.

ChAdOx1 ve MVA ne anlama gelir?

ChAdOx1, şempanze adenovirüsünden geliştirilmiş rekombinant bir viral vektördür. Buradaki görevi Ebola veya Nipah virüsünün kendisini taşımak değil, seçilen viral glikoproteinin genetik bilgisini konak hücrelere ulaştırmaktır. Hücreler bu proteini ürettiğinde bağışıklık sistemi yabancı antijeni tanıyabilir ve antikor ile hücresel yanıt geliştirebilir.

MVA, Modified Vaccinia Ankara'nın kısaltmasıdır ve farklı bir viral vektör olarak güçlendirici dozda kullanılmıştır. Ebola grubunda ilk doz ChAdOx1-Ebola GP ve dört hafta sonraki güçlendirici doz MVA-Ebola GP biçimindedir. Nipah grubunda ise ilk ChAdOx1 vektörü Nipah G antijenini taşımış, fakat teknik hazırlama sorunları nedeniyle dört hafta sonraki MVA güçlendiricisi Nipah antijenini taşımamıştır. Bu farklılık özellikle dört haftadan sonraki iki aşı grubunun doğrudan moleküler karşılaştırmasını zorlaştırdığı için transkriptomik analiz ilk dozdan sonraki ilk dört haftayla sınırlandırılmıştır.

Prime-boost stratejisi nedir?

Prime-boost yaklaşımında ilk doz bağışıklık sistemini hedef antijenle ilk kez karşılaştırarak yanıtı başlatır; daha sonraki güçlendirici doz aynı hedefe yönelik bağışıklık yanıtını yeniden uyarır. Bu çalışmada ilk enjeksiyon 0. haftada, ikinci enjeksiyon 4. haftada yapılmıştır. Kan örnekleri haftalık olarak toplanmış ve deney yaklaşık sekiz hafta sürmüştür.

Çalışmaya kaç yarasa dahil edildi?

Yarasalar Haziran 2017'de Accra, Gana'daki doğal tüneklerden yakalanmıştır. Toplam 75 yarasa yakalanmış, yavrular ve dişiler serbest bırakılmıştır. İlk aşamada 27 yetişkin erkek Ei. helvum ve 33 yetişkin erkek Ep. gambianus tutulmuş; sağlık ve davranış gözleminden sonra nihai deney grubuna 19 Ei. helvum ve 14 Ep. gambianus alınmıştır. Yalnız erkeklerin seçilmesi yaş ve gebelik gibi fizyolojik değişkenleri azaltmayı amaçlamıştır; bunun karşılığında çalışma sonuçlarının dişi yarasalara doğrudan genellenememesi önemli bir sınırlılıktır.

Ep. gambianus esaret koşullarına beklenmedik biçimde kötü uyum sağlamıştır. Hayvanlar üç deney grubunda da kaybedilmiş; dört birey ikinci enjeksiyona kadar, yalnız üç birey sekiz haftalık deneyin sonuna kadar yaşamıştır. Kaynak çalışma bu kayıpları aşı enjeksiyonlarıyla ilişkilendirmemektedir. Bu durum örneklem büyüklüğünü ciddi biçimde azaltmış, olası sağkalım yanlılığı yaratmış ve araştırmacıların Ep. gambianus verilerine istatistiksel test uygulamamasına neden olmuştur.

Seroloji neyi ölçüyor?

Seroloji, serumdaki antikorların araştırılmasıdır. Araştırmacılar Luminex xMAP tabanlı multipleks mikroküre immünoassayı, yani MIA kullandılar. Farklı viral proteinler farklı mikrokürelere bağlanır; serumdaki antikorlar kendi tanıdıkları antijenlere bağlandığında floresan sinyali oluşur. Sonuç MFI, median fluorescence intensity, yani medyan floresans yoğunluğu olarak kaydedilir.

MFI doğrudan “şu kadar miligram antikor vardır” biçiminde mutlak bir antikor konsantrasyonu değildir. Kullanılan deney sistemi içinde antijene bağlanan antikor sinyalinin göreli ölçüsüdür. Bu nedenle yüksek MFI, daha güçlü antijen bağlanmasıyla uyumludur; fakat antikorun mutlaka virüsü nötralize ettiği anlamına gelmez.

Panelde sekiz rekombinant viral glikoprotein antijeni bulunmuştur: Cedar virüsü F ve G, Hendra virüsü F ve G, Nipah virüsü F ve G, Ebola virüsü GP ve Marburg virüsü GP. Pozitif kontrollerde Ebola GP için 5D2, Marburg için 2B8, Hendra/Nipah G için 102.4 ve Cedar için 14F3 monoklonal antikorlarının seri dilüsyonları kullanılmıştır. Negatif kontrol kuyularında serum bulunmamıştır.

Toplam 413 serum örneği MIA ile duplikat olarak test edilmiştir. On üç ölçüm başarısız olmuş; 100'den az mikroküre veren 12 örnek kalite kontrolünden sonra çıkarılmıştır. MFI verileri \(\log_{10}\) dönüşümüne tabi tutulmuştur. Duplikatlar arasında 0,5 log birimden fazla fark gösteren az sayıdaki örnek işaretlenmiş ancak otomatik olarak dışlanmamıştır.

Logaritmik MFI değişimi nasıl okunmalıdır?

Aşağıdaki ifade çalışmanın yeni bir denklemi değildir; makalede kullanılan log-dönüşümlü MFI değişiminin matematiksel anlamını açıklamak için verilmiştir:

\[ \Delta \log_{10}(\mathrm{MFI})= \log_{10}(\mathrm{MFI}_{final})- \log_{10}(\mathrm{MFI}_{initial}) \]

Burada \(\mathrm{MFI}_{initial}\) başlangıçtaki, \(\mathrm{MFI}_{final}\) daha sonraki zaman noktasındaki floresans yoğunluğudur. Logaritma kullanıldığı için değişimler çarpımsal ölçekte okunur. Örneğin 1,0 \(\log_{10}\) birim artış matematiksel olarak MFI'nin başlangıca göre 10 katına karşılık gelir. Bu, antikor konsantrasyonunun mutlaka tam 10 kat arttığı anlamına gelmez; MFI deney sisteminin göreli floresans ölçüsüdür.

MFI ve Nötralizasyon Testi Aynı Şeyi mi Ölçer?

Hayır. MFI testi antikorların belirli bir viral antijene bağlanmasını ölçerken nötralizasyon testi bu serumun viral giriş mekanizmasını işlevsel olarak engelleyip engelleyemediğini değerlendirir. Bir antikor viral proteine güçlü biçimde bağlanabilir fakat virüsün hücreye girişini durdurmayan bir epitopu tanıyabilir; bu nedenle yüksek MFI ile yüksek nötralizasyon kapasitesi zorunlu olarak aynı sonuç değildir.

Psödotip virüs nedir?

Psödotip virüs, araştırılan virüsün giriş proteinini yüzeyinde taşıyan fakat araştırmanın hedefindeki tam patojenik virüsün kendisi olmayan laboratuvar test sistemidir. Bu çalışmada ikinci nesil, üç plazmitli lentiviral sistem kullanılmış ve farklı filovirüs veya henipavirüs glikoproteinlerini taşıyan psödotipler üretilmiştir. Böylece serumun özellikle viral giriş proteinini hedefleyen nötralizasyon kapasitesi ölçülebilmiştir.

Serumlar üç katlık seri dilüsyonlarla 1:50 ile 1:12.150 arasında hazırlanmıştır. Psödotip virüs 100 × TCID50 düzeyinde serumla bir saat 37 °C'de inkübe edilmiş, ardından ilgili hücre hattından \(2\times10^4\) hücre eklenmiş ve 48 saatlik inkübasyon sonrasında lusiferaz sinyali ölçülmüştür.

TCID50, bir hücre kültürü sisteminde örneklerin yüzde 50'sinde enfeksiyon oluşturabilen dozun deneysel ölçüsüdür. IC50 ise burada serumun psödotip virüs sinyalini yüzde 50 baskılayabildiği dilüsyonu ifade eder. Daha yüksek nötralize edici titre, serumun daha fazla seyreltilmiş halde bile etkinliğini sürdürebildiğini gösterir.

Nipah aşısına verilen antikor yanıtı

Ei. helvum Nipah aşı grubunda bir birey dışında anti-Nipah-G bağlanma sinyali yükselmiştir. Ebola ve PBS grupları kontrol olarak birleştirildiğinde, ilk ve son örnek arasındaki anti-Nipah-G değişimi Nipah grubunda anlamlı biçimde daha yüksektir: Wilcoxon sıra toplam testi için \(W=76\), \(p=0{,}0026\).

İkinci enjeksiyondan önce bile fark belirgindir. İlk örnek ile güçlendirici öncesindeki son örnek arasında medyan değişim Nipah grubunda +1,0 \(\log_{10}\) MFI birimi, Ebola grubunda −0,5 ve PBS grubunda 0,0 olarak raporlanmıştır. Bu karşılaştırmada \(W=77\) ve \(p=0{,}0018\)'dir.

Tüm zaman serisini kullanan doğrusal karma etkili modelde aşı grubu ve zaman sabit etkiler, bireysel yarasa kimliği rastgele etki olarak ele alınmıştır. Grup × zaman etkileşimi \(p<10^{-4}\) ile Nipah aşısının zaman içindeki etkisini desteklemiştir. Rastgele birey etkisinin kullanılması, aynı yarasadan haftalar boyunca alınan ölçümlerin birbirinden tamamen bağımsız ölçümler olmadığını modele dahil etmek için önemlidir.

Başlangıçtaki Nipah-G MFI düzeyi ile deney boyunca görülen değişim arasında negatif korelasyon bulunmuştur. Tüm Ei. helvum bireylerinde Pearson \(r=-0{,}65\), %95 güven aralığı \([-0{,}85,-0{,}28]\); yalnız Nipah aşı grubunda \(r=-0{,}90\), %95 güven aralığı \([-0{,}98,-0{,}44]\) olarak bildirilmiştir. Bu ilişki, başlangıçta daha yüksek sinyale sahip bireylerin daha küçük net artış göstermesiyle uyumludur; korelasyon tek başına bunun nedenini açıklamaz.

Nipah nötralizasyon analizinde 14 son dönem serum örneği kullanılmıştır. MIA ölçümü ile psödotip nötralizasyon sonucu arasında güçlü pozitif ilişki saptanmıştır: Spearman \(\rho=0{,}82\), \(p=0{,}0003\), \(n=14\). Çalışmanın örnekleminde MFI değeri yaklaşık 200 birimin üzerinde bulunan serumlarda nötralize edici aktivite görülmüştür. Araştırmacılar ayrıca önceki bir çalışmada Ei. helvum Nipah-G serolojisi için ROC analizine dayalı 500 MFI eşiğinin önerildiğini belirtmektedir. Dolayısıyla 200 ve 500 MFI değerleri aynı amaçla oluşturulmuş evrensel eşikler olarak değerlendirilmemelidir.

Deney sonunda Nipah aşı grubunda nötralizasyon testi yapılan sekiz yarasanın tamamında saptanabilir nötralize edici antikor bulunmuştur.

Ebola aşısına verilen antikor yanıtı

Eidolon helvum'da Ebola aşısından sonra anti-Ebola-GP antikor bağlanmasında tutarlı bir artış gözlenmemiştir. Buna karşılık ilk Ebola aşısından sonra en az bir hafta yaşayan dört Ep. gambianus bireyinde Ebola GP MFI değerlerinde büyük artışlar görülmüştür. Ancak hayvan sayısı çok küçük olduğu için bu türde istatistiksel test yapılmamıştır.

Çalışmanın bu noktadaki en önemli ayrımı nötralizasyon deneyidir. Deneyin son gününde alınan 15 serum örneği Ebola GP taşıyan lentiviral psödotiple test edilmiştir. Bunlar Ebola grubundaki sekiz Ei. helvum, PBS grubundaki dört Ei. helvum ve çalışmayı tamamlayan üç Ep. gambianus serumunu kapsamıştır. Hiçbir örnek en düşük 1:50 serum dilüsyonunda Ebola psödotipini nötralize etmemiştir.

Araştırmacılar Ebola GP1 proteininin yoğun glikozillenmiş müsin bölgesinin antikor bağlanmasını etkileyebileceği ihtimalini de incelemiş ve müsin bölgesi çıkarılmış Ebola GP1 psödotipiyle testi tekrarlamıştır. Buna rağmen serumların hiçbiri 1:50 dilüsyonda nötralizasyon göstermemiştir.

Bu sonuç, özellikle Ep. gambianus'ta ölçülen yüksek Ebola-GP bağlanma sinyalinin otomatik olarak nötralize edici antikor anlamına gelmediğini göstermektedir. Yazarlar bu antikorların nötralizasyon sağlamayan GP epitoplarını tanıyor olabileceğini tartışmaktadır. Antikorların fagositoz veya doğal öldürücü hücre aktivasyonu gibi Fc aracılı başka işlevlere sahip olup olmadığı bu deneyde test edilmemiştir.

Aşı vektörünün hücrelere girememesi bir açıklama olabilir mi?

Araştırmacılar her iki aşı vektörünün de Ei. helvum ve Ep. gambianus hücrelerini in vitro floresans enfeksiyon deneyinde bilinen duyarlı insan hücrelerine benzer verimlilikte enfekte edebildiğini doğrulamıştır. Dolayısıyla Ei. helvum'da Ebola GP'ye karşı belirgin serum antikoru oluşmamasını yalnızca adenoviral vektörün bu türün hücrelerine girememesiyle açıklamak çalışma verileriyle desteklenmemektedir.

Transkriptomik analiz neyi araştırıyor?

Transkriptom, belirli bir hücre veya dokuda belirli bir anda ifade edilen RNA moleküllerinin bütünüdür. Bir genin DNA'da bulunması ile o genin o anda ne kadar aktif olduğu farklı şeylerdir. RNA dizileme, hangi genlerden ne kadar RNA üretildiğini yaklaşık olarak nicelendirerek bağışıklık sisteminin hangi moleküler programlarının uyarıldığını araştırmaya imkân verir.

Transkriptomik analiz yalnız Ei. helvum üzerinde yapılmıştır. Başlangıçta Ebola aşı grubundan 8, Nipah grubundan 3 ve PBS grubundan 2 bireyin kan örnekleri seçilmiştir. Kontrol bireylerinden birinin yüksek başlangıç antikor profili ve aykırı transkriptomik davranışı nedeniyle diferansiyel gen ifadesi analizinden çıkarılması sonucunda grup karşılaştırmaları yalnız bir PBS kontrolüne dayanmıştır. Bu durum sonuçların istatistiksel gücünü önemli ölçüde sınırlar.

Nipah grubunun 4. haftadaki MVA güçlendiricisi Nipah antijeni taşımadığı için gruplar arasında anlamlı karşılaştırmayı korumak amacıyla transkriptomik değerlendirme yalnız ilk ChAdOx1 dozundan sonraki ilk dört hafta üzerinden yürütülmüştür.

RNA dizileme nasıl yapılmıştır?

RNA, 150 µl tam kandan RNAzol BD yöntemiyle izole edilmiştir. Kaynak çalışma küçük örnek hacmine uyarlanmış protokolü ayrıntılı olarak vermektedir: 300 µl RNAzol BD, 4,05 µl asetik asit, 450 µl lizat, 22,5 µl 1-bromo-3-kloropropan, 78,75 µl izopropanol ve 60–120 µl %75 etanol kullanılmış; ilgili aşamada 225 µl süpernatant işlenmiştir.

RNA miktarı NanoDrop 2000 ile, RNA bütünlüğü Agilent 2100 Bioanalyzer ile değerlendirilmiştir. Örnekler Illumina platformunda 150 baz çifti uzunlukta paired-end olarak dizilenmiştir. Örnek başına ham okuma sayısı ortalama \(26{,}25 \pm 3{,}02\) milyon olarak raporlanmıştır.

Kalite kontrolü FastQC v0.11.4 ile yapılmış, düşük kaliteli diziler BBTools paketindeki bbduk.sh ile kırpılmıştır. Aşırı temsil edilen diziler ve adaptörler çıkarılmıştır. Kan transkriptlerinin yaklaşık %75'i hemoglobine eşleştiği için bunlar veri kümesinden uzaklaştırılmıştır. Okumaların soldaki ilk 10 bazı çıkarılmış; iki uç, ortalama Phred kalite puanı en az 10 olacak şekilde kırpılmış ve 25 bazdan kısa okumalar atılmıştır. Bu işlemlerden sonra örnek başına ortalama \(6{,}82 \pm 3{,}08\) milyon okuma kalmıştır.

Kalite filtreli okumalar araştırma grubu tarafından oluşturulan Ei. helvum taslak genomuna STAR v2.7.3a ile, --quantMode GeneCounts seçeneği kullanılarak hizalanmıştır. Kırpılmış okumaların %76–88'i genomda tekil bir konuma eşleşmiştir.

İkinci haftadaki PBS örneğinin RNA kalitesi düşük olduğu için o haftada PBS ile aşı grupları arasında diferansiyel ifade karşılaştırması yapılamamıştır.

Diferansiyel gen ifadesi nedir?

Bir genin aşı grubunda kontrol grubuna göre daha yüksek veya daha düşük düzeyde ifade edilmesine diferansiyel gen ifadesi denir. Analiz DESeq2 v1.36.0 ile yapılmış ve çoklu hipotez testlerinden doğan yanlış pozitifleri sınırlandırmak için Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı, yani FDR düzeltmesi uygulanmıştır. \(FDR<0{,}05\) olan genler diferansiyel olarak ifade edilen gen, yani DEG kabul edilmiştir.

Diferansiyel ifade sıklıkla \(\log_2\) kat değişimiyle gösterilir. Aşağıdaki ifade öğretici matematiksel açılımdır:

\[ \log_2 FC=\log_2\left(\frac{\mathrm{ifade}_{tedavi}} {\mathrm{ifade}_{karşılaştırma}}\right) \]

\(\log_2 FC=1\) matematiksel olarak iki kat, \(\log_2 FC=-1\) yarı düzey, \(\log_2 FC=2\) dört kat ifade oranına karşılık gelir. Ancak büyük bir kat değişimi tek başına biyolojik önem kanıtı değildir; örneklem büyüklüğü, varyans ve çoklu test düzeltmesi de değerlendirilmelidir.

ISGylation Nedir ve Bu Çalışmada Neden Önemlidir?

ISGylation, interferonla uyarılan ISG15 adlı ubiquitin-benzeri proteinin başka proteinlere enzimatik olarak bağlandığı hücresel bir düzenleme sürecidir. Çalışmada Ebola ve Nipah aşı grupları karşılaştırıldığında UBA7, ISG15, HERC5 ve USP18 gibi ISGylation ile ilişkili genlerin ifadeleri farklı bulunmuş; bu nedenle yolak, iki viral glikoproteine karşı oluşan farklı moleküler bağışıklık yanıtlarını anlamada merkezi bulgulardan biri olmuştur.

Kaynak çalışmada tarif edilen temel ISGylation zincirinde ISG15 önce E1 enzimi UBA7 tarafından aktive edilir, ardından E2 enzimi UBE2L6'ya aktarılır ve E3 enzimi HERC5 aracılığıyla hedef proteine bağlanır. Çalışmanın birinci hafta Ebola-Nipah doğrudan karşılaştırmasında UBA7 en güçlü diferansiyel genlerden biri olmuş; ISG15, HERC5 ve USP18 de anlamlı farklılık göstermiştir. Bu dört genin ifade düzeyi Ebola aşı grubunda Nipah grubuna göre daha düşük bulunmuştur. Ancak Ebola grubu PBS kontrolüyle karşılaştırıldığında aynı zaman noktasında bu genlerin tamamı anlamlı biçimde düşük değildir; kaynakta yalnız UBA7'nin anlamlı biçimde aşağı regüle edildiği belirtilmektedir. Bu ayrım önemlidir.

ISGylation çoğu bağlamda tip I interferonla ilişkili antiviral yanıtlarla bağlantılıdır. Fakat bu deneyde canlı virüs çoğalması bulunmadığından, gözlenen ISGylation ilişkili değişiklikler viral replikasyonun kanıtı değildir. Yazarlar bunları ChAdOx1 aşı vektörü ve taşınan Nipah-G veya Ebola-GP antijenlerine karşı oluşan bağışıklık aktivasyonu bağlamında yorumlamaktadır.

GO ve KEGG analizleri ne yapar?

Tek tek yüzlerce genin listesini yorumlamak zordur. Gene Ontology, yani GO analizi, diferansiyel genlerin belirli biyolojik süreçlerde beklenenden daha fazla temsil edilip edilmediğini araştırır. KEGG ise hücresel ve moleküler yolakların organize edilmiş veri tabanıdır. Burada WebGestalt 2019 kullanılarak DEG listelerinde belirli biyolojik süreç ve KEGG yolaklarının aşırı temsil edilip edilmediği incelenmiştir.

Nipah aşı grubunun PBS ile karşılaştırılmasında aşırı temsil edilen KEGG yolu veya biyolojik süreç saptanmamıştır. Ebola aşı grubunda ise lökosit farklılaşmasıyla ilişkili çeşitli GO terimleri; Th1 ve Th2 hücre farklılaşması, Notch sinyallemesi ve JAK/STAT kaskadı gibi bağışıklık sisteminin önemli düzenleyici yollarıyla ilişkili sinyaller bulunmuştur.

Ancak araştırmacılar sitokin transkriptlerinin sınırlı saptanması nedeniyle hangi T-yardımcı hücre alt tipinin baskın olduğunu belirleyememiştir. Bu nedenle “Ebola antijenine karşı antikor oluşmadı çünkü bağışıklık sistemi hücresel yanıta kaydı” şeklinde kesin bir mekanizma çalışma tarafından kanıtlanmamıştır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Hayvanların barındırılması ve örnekleme

Deneye alınan yarasalar 80 × 80 × 80 cm kafeslerde, aynı türe ait en fazla beş bireylik gruplar halinde tutulmuştur. Kafesler yaklaşık 2 m aralıkla yerleştirilmiş ve idrar, salgı, yiyecek veya su yoluyla doğrudan dolaylı teması azaltmak için metal bariyerlerle ayrılmıştır. Hayvanlara mango, papaya ve muz gibi doğranmış karışık meyveler ve serbest su verilmiş; günlük olarak yenilenmiştir.

Yarasalar deney öncesinde 8–10 gün veteriner gözetiminde tutulmuş, deney boyunca stres, kilo kaybı ve yaralanma açısından izlenmiştir.

İlk kan örneği aşılamadan önce 0,5 ml olarak alınmıştır. İlk enjeksiyon kas içine yaklaşık \(10^7\) IU ChAdOx1 veya 0,25 ml PBS biçiminde uygulanmıştır. Dört hafta sonra yaklaşık \(10^7\) pfu MVA veya PBS uygulanmıştır. Haftalık kan örneklerinin hacmi 0,3 ml'dir. Sekizinci haftada kalan hayvanlar intravenöz ketamin/medetomidin aşırı dozu ile ötanazi edilmiş ve beyin, karaciğer, dalak, böbrek ve mümkün olduğunda lenf düğümü örnekleri toplanmıştır.

Serum örnekleri olası patojenleri inaktive etmek amacıyla 56 °C'de 30 dakika ısıtılmış ve örnekler −80 °C'de saklanmıştır.

Serolojik ana sonuçlar

Transkriptomik veri işleme özeti

Diferansiyel gen ifadesinin sayısal sonuçları

PBS kontrolüyle her zaman noktası ayrı ayrı karşılaştırıldığında Ebola aşı grubunda diferansiyel olarak ifade edilen gen sayısı 261 ile 789 arasında değişmiş, ortalama \(506 \pm 266{,}0\) olmuştur. Nipah aşı grubunda ise sayı yalnız 3 ile 28 arasında değişmiş ve ortalama \(16{,}3 \pm 12{,}6\) olarak raporlanmıştır.

Nipah grubunda en az bir zaman noktasında diferansiyel olarak ifade edilen toplam 38 genin 30'u Ebola grubunda da en az bir zaman noktasında diferansiyel olarak ifade edilmiştir. Tüm analizler birlikte değerlendirildiğinde Ebola grubuna özgü 968, Nipah grubuna özgü 8 DEG bildirilmiştir.

Ebola ve Nipah aşı grupları doğrudan karşılaştırıldığında ilk dört haftadaki DEG sayısı 185 ile 788 arasında değişmiş, ortalama \(405 \pm 282\) olmuştur. En yüksek DEG sayıları ilk ve dördüncü haftalarda görülmüştür.

T-hücresi farklılaşması ve JAK/STAT sonuçları

Ebola aşı grubunun PBS ile karşılaştırılmasında T-yardımcı hücre farklılaşmasıyla ilişkili GO terimleri aşırı temsil edilmiştir. Th1 ve Th2 farklılaşmasıyla bağlantılı genlerin yanı sıra Notch ve JAK/STAT sinyal yolları da öne çıkmıştır.

Th1 hücreleri genel olarak hücre içi patojenlere yönelik bağışıklık yanıtlarıyla; Th2 hücreleri ise B-hücresi aktivasyonu ve humoral yanıtlarla ilişkilendirilmektedir. Bununla birlikte çalışmada ilgili sitokin RNA'larının sınırlı saptanması nedeniyle Ebola aşısına maruz kalan Ei. helvum'da Th1 veya Th2 yönünde baskın bir yanıt olduğu belirlenememiştir.

Bu yüzden serolojik anti-Ebola yanıtının görülmemesini “bağışıklık tamamen hücresel kola kaydı” biçiminde açıklamak kaynak tarafından desteklenmemektedir.

ISGylation yolundaki sonuçların ayrıntısı

Ebola ve Nipah aşı gruplarının ilk hafta doğrudan karşılaştırmasında en güçlü DEG UBA7 olmuştur. ISG15, HERC5 ve USP18 de iki grup arasında diferansiyel ifade göstermiştir. UBA7, ISG15, HERC5 ve USP18'in ifade düzeyleri Ebola grubunda Nipah grubuna göre daha düşük bulunmuştur.

Burada iki farklı karşılaştırmayı birbirine karıştırmamak gerekir. “Ebola grubunda Nipah grubuna göre daha düşük” sonucu, otomatik olarak “Ebola grubunda kontrolün altında” demek değildir. PBS ile karşılaştırıldığında birinci haftada bu dört genden yalnız UBA7'nin Ebola grubunda anlamlı biçimde aşağı regüle olduğu raporlanmıştır.

Eidolon helvum ile Epomophorus gambianus Aynı Antijenlere Aynı Yanıtı Verdi mi?

Hayır. Nipah G antijenine karşı her iki türde de belirgin antikor yanıtları görülebilirken, Ebola GP antijenine karşı güçlü bağlanma yanıtı yalnız az sayıdaki hayatta kalan Epomophorus gambianus bireyinde görülmüş, Eidolon helvum'da ise tutarlı bir anti-Ebola-GP serum antikoru artışı saptanmamıştır. Bununla birlikte Ei. helvum'daki transkriptomik yanıt Ebola aşısına karşı çok sayıda gen ve bağışıklık yolunun değiştiğini göstermiştir; dolayısıyla “antikor artışı yok = bağışıklık yanıtı yok” sonucu çıkarılamaz.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• Nipah G antijenini taşıyan aşı, özellikle Ei. helvum'da belirgin ve istatistiksel olarak desteklenen anti-Nipah-G antikor artışı oluşturmuştur.
• Nipah-G MIA sinyali ile psödotip nötralizasyon aktivitesi arasında incelenen örneklerde güçlü ilişki bulunmuştur.
• Ep. gambianus'ta Ebola GP'ye bağlanan antikor sinyali artmıştır; ancak bu sonuç çok küçük hayvan sayısına dayanmaktadır.
• Ebola GP'ye bağlanan serum antikorları test edilen koşullarda Ebola psödotipini nötralize etmemiştir.
• Ei. helvum'da Ebola aşısı belirgin serum antikoru artışı oluşturmamasına rağmen geniş bir transkriptomik yanıtla ilişkilendirilmiştir.
• Ebola ve Nipah aşı grupları arasında ISGylation, tip I interferon yanıtı, virüse yanıt ve T-hücresi seçimiyle ilişkili gen ve yolaklarda farklılıklar görülmüştür.
• Yarasa türlerinin aynı viral antijenlere bağışıklık yanıtı verme biçimleri birbirinden farklı olabilir.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

Çalışma Eidolon helvum veya Epomophorus gambianus'un doğal ortamda Ebola ya da Nipah virüsünü hangi sıklıkta taşıdığını ölçmemiştir. Aşıya yanıt vermek doğal rezervuar statüsünü kanıtlamaz. Serumda antikor saptanması aktif enfeksiyon, canlı virüs saçılımı veya bulaştırıcılık anlamına gelmez.

Deney canlı Ebola veya Nipah virüsü kullanmadığı için gerçek enfeksiyon sırasında viral çoğalma, doku tropizmi, hastalık gelişimi veya virüs saçılımı hakkında doğrudan sonuç üretmez.

Ep. gambianus'ta Ebola GP'ye bağlanan antikorların koruyucu olduğu gösterilmemiştir. Aksine kullanılan psödotip nötralizasyon deneyinde nötralizasyon saptanmamıştır. Bununla birlikte çalışma nötralize etmeyen antikorların diğer bağışıklık işlevlerini doğrudan test etmemiştir.

Ei. helvum'daki geniş Ebola aşısı transkriptomik yanıtı, bu türün gerçek Ebola enfeksiyonuna aynı biçimde yanıt vereceğinin kanıtı değildir. Aşı vektörü ve antijen sunumu ile canlı viral enfeksiyon biyolojik olarak aynı süreç değildir.

Çalışma yalnız yetişkin erkek yarasaları içerdiği için dişilerde, yavrularda veya farklı yaş gruplarında aynı sonuçların ortaya çıkacağını göstermemektedir.

Başlıca sınırlılıklar

En büyük sınırlılık Ep. gambianus bireylerinin hızla kaybedilmesidir. Başlangıçta 14 birey olmasına rağmen yalnız dört hayvan ikinci enjeksiyona ve üç hayvan deney sonuna ulaşmıştır. Bu durum hem istatistiksel gücü azaltmış hem de deney sonuna ulaşan hayvanların türün tamamını temsil etmeyebileceği bir sağkalım yanlılığı oluşturmuştur.

Transkriptomik analizde Ep. gambianus verisi bulunmamaktadır. Ayrıca kalite ve başlangıç antikor profili nedeniyle kontrol örneklerinin çıkarılması sonrasında diferansiyel ifade analizleri tek bir PBS kontrol bireyine dayanmıştır. Araştırmacılar bu ikili karşılaştırmaları açık biçimde ön bulgu olarak değerlendirmektedir.

Kan transkriptlerinin yaklaşık %75'inin hemoglobine eşleşmesi nedeniyle düşük düzeyde ifade edilen bazı genlerin yakalanamamış olması mümkündür.

Yarasaların doğal enfeksiyon geçmişleri bilinmemektedir. Aktif henipavirüs enfeksiyonunu güvenilir biçimde dışlamak mümkün olmamıştır; bu nedenle bazı antikor değişikliklerinin kafes içindeki doğal maruziyetlerle ilişkili olabileceği tamamen dışlanamamaktadır. PBS grubundaki bir yarasada deney sonunda görülen anti-Nipah-G artışı buna örnek olarak tartışılmıştır.

Ebola virüsüyle enfekte olduğu kesin olarak bilinen yarasalardan elde edilmiş pozitif kontrol serumunun bulunmaması, özellikle Ebola serolojik testlerinin duyarlılık ve özgüllüğünün kesin kalibrasyonunu sınırlandırmaktadır.

Nipah grubunda ikinci MVA dozunun hedef Nipah antijenini taşımaması, iki aşı rejiminin 4. haftadan sonra eşdeğer olmamasına neden olmuştur. Bu nedenle gen ifadesi karşılaştırmasının güçlendirici doz sonrasına taşınmaması doğru fakat kapsamı daraltan bir yöntemsel karardır.

Sonuçların bilimsel anlamı

Araştırmanın ortaya koyduğu temel tablo, yarasalardaki antiviral bağışıklığın yalnız “antikor var/yok” şeklinde yorumlanamayacağıdır. Ei. helvum Nipah antijenine güçlü serum antikoru ve nötralizasyon yanıtı gösterebilirken Ebola GP antijenine karşı belirgin serum antikoru üretmemiş, buna rağmen yüzlerce gen ve çeşitli bağışıklık yolaklarında moleküler değişiklik göstermiştir. Ep. gambianus ise incelenebilen az sayıdaki bireyde Ebola GP'ye belirgin bağlanma yanıtı oluşturmuş fakat bu serum nötralizasyon testine yansımamıştır.

Bu farklılıklar, yaban yarasalarında serolojik sürveyans sonuçları yorumlanırken türün, hedef viral antijenin ve kullanılan testin birlikte değerlendirilmesi gerektiğini göstermektedir. Aynı MFI değerinin farklı türlerde aynı biyolojik anlamı taşıdığı varsayılamaz; antijene bağlanma, nötralizasyon ve hücresel/transkriptomik yanıt birbirinden ayrı ölçüm katmanlarıdır.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma: Serological and transcriptomic response of African fruit bats to immune challenge with recombinant vaccines expressing Ebola or Nipah virus antigens.

Yazarlar: Elinor Jax; Romain Garnier; Georgia Tsagkogeorga; Hubert Buczkowski; Louise Gibson; Pius Benia; Richard Suu-Ire; Vera M. Warmuth; Sylvester Languon; Osbourne Quaye; Lianying Yan; Christopher C. Broder; Stephen J. Rossiter; Edward Wright; Sarah C. Gilbert; Teresa Lambe; James L. N. Wood; Andrew A. Cunningham; Olivier Restif.

Sorumlu yazar: Olivier Restif. Kaynakta eş birinci yazarlık veya eş katkı işareti belirtilmemektedir.

Kurumlar: University of Cambridge Department of Veterinary Medicine; Queen Mary University of London School of Biological and Behavioural Sciences; University of Sussex Viral Pseudotype Unit; Zoological Society of London Institute of Zoology; University of Ghana School of Veterinary Medicine; University of Ghana Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology ve West African Centre for Cell Biology of Infectious Pathogens; Ludwig-Maximilians-Universität München Biozentrum Martinsried; Uniformed Services University Department of Microbiology and Immunology; Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine; University of Oxford Pandemic Sciences Institute; Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute; Oxford Vaccine Group.

Dergi: Royal Society Open Science. Yayınevi: The Royal Society. Cilt: 13. Sayı: 10. Makale numarası: 252189. Yayın tarihi: 7 Ekim 2026. DOI: 10.1098/rsos.252189. Alınma tarihi: 11 Kasım 2025. Kabul tarihi: 8 Haziran 2026.

Kaynak türü ve hakemlik: Hakemli araştırma makalesidir. Lisans: Creative Commons Attribution 4.0, CC BY 4.0.

Çalışma türü: Yabandan yakalanmış yetişkin erkek Afrika meyve yarasalarında rekombinant viral vektörlerle yapılan deneysel in vivo bağışıklık uyarımı; serum antikor analizi; lentiviral psödotip nötralizasyon testi; bir türde tam kan RNA-seq transkriptomik analizi ve tamamlayıcı in vitro hücre kontrol deneyleri.

Önemli yöntem sınırı: Deneyde canlı Ebola veya Nipah virüsüyle enfeksiyon yapılmamıştır. Aşı vektörleri Ebola GP veya Nipah G antijenlerini ifade etmektedir. Bu nedenle sonuçlar viral enfeksiyon patogenezi, bulaştırıcılık veya doğal rezervuar yeterliliğiyle eşitlenmemelidir.

Etik izinler: Zoological Society of London, proje WLE719, 26 Mayıs 2017; Ghana Council for Scientific Industrial Research, RPN 001/CSIR-IRB/2017, 22 Haziran 2017.

Veri erişilebilirliği: Ham mRNA-seq verileri NCBI Sequence Read Archive'da PRJNA1054324 erişim numarasıyla depolanmıştır. Araştırmada oluşturulan taslak Ei. helvum genomu ve anotasyonu Figshare DOI 10.6084/m9.figshare.29117609.v2 altında; temel seroloji ve diferansiyel ifade analizlerini yeniden üretmek için kullanılan S1–S3 veri kümeleri ve R kodu Figshare DOI 10.6084/m9.figshare.29126510.v2 altında paylaşılmıştır. Ek materyal koleksiyonu DOI 10.6084/m9.figshare.c.8655631 olarak belirtilmiştir.

Çıkar çatışması: Yazarlar rekabet eden çıkar bulunmadığını bildirmiştir.

Finansman: Çalışma Elinor Jax için Deutsche Forschungsgemeinschaft araştırma bursu 438001934; Olivier Restif için Royal Society GCRF CH160115; James L. N. Wood, Andrew A. Cunningham ve Osbourne Quaye için MRC MR/P025226/1; Romain Garnier için AXA Research Fund Junior Fellowship; ALBORADA Trust; Research England ve Christopher C. Broder için NIH AI054715 desteğiyle yürütülmüştür.

Yazarların AI beyanı: Kaynak makalede yazarlar makalenin hazırlanmasında yapay zekâ destekli teknolojiler kullanmadıklarını bildirmiştir.

Yazar katkılarının özeti: Elinor Jax formal analiz, yöntem, görselleştirme ve ilk taslak; Romain Garnier kavramsallaştırma ve araştırma; Georgia Tsagkogeorga formal analiz ve araştırma; Hubert Buczkowski yöntem ve araştırma; Louise Gibson veri kürasyonu, yöntem ve proje yönetimi; Pius Benia araştırma; Richard Suu-Ire araştırma ve proje yönetimi; Vera M. Warmuth formal analiz; Sylvester Languon araştırma; Osbourne Quaye proje yönetimi ve gözetim; Lianying Yan yöntem; Christopher C. Broder finansman, yöntem ve kaynaklar; Stephen J. Rossiter kavramsallaştırma ve gözetim; Edward Wright araştırma ve yöntem; Sarah C. Gilbert ile Teresa Lambe yöntem ve kaynaklar; James L. N. Wood ile Andrew A. Cunningham kavramsallaştırma, finansman, proje yönetimi ve gözetim; Olivier Restif kavramsallaştırma, formal analiz, yöntem, proje yönetimi, görselleştirme ve ilk taslak görevlerini üstlenmiştir. Makale, tüm yazarların nihai onayıyla yayımlanmıştır.