Бул изилдөө Африкадагы мөмө жеген жарганаттардын эки түрү Ebola вирусунун GP гликопротеинин же Nipah вирусунун G гликопротеинин экспрессиялаган рекомбинанттык вакциналарга туш болгондо пайда кылган антитело жана ген экспрессиясы жоопторун изилдеген эксперименттик in vivo иммундук изилдөө болуп саналат. Изилдөөчүлөр Eidolon helvum жана Epomophorus gambianus түрлөрүн салыштырып; антителолордун байланышын Luminex xMAP негизиндеги мультиплекстүү микросфералык иммуноанализ менен, антителолордун функционалдык нейтралдаштыруу жөндөмүн псевдотип вирусун нейтралдаштыруу тести менен жана Ei. helvumдагы молекулалык жоопту RNA секвенирлөөгө негизделген транскриптомдук анализ менен баалашкан. Nipah вакцинасы жарганаттардын көбүндө айкын anti-Nipah-G антитело жообун түзгөн, ал эми Ebola GP ге каршы айкын байланыш жообу Ep. gambianusта гана байкалган. Тескерисинче, Ei. helvumда Ebola вакцинасы күчтүү серологиялык өсүштү жаратпаганына карабастан ISGylation, T-клеткалардын дифференциациясы жана байланышкан иммундук жолдордо айкын ген экспрессиясынын өзгөрүүлөрү байкалган. Натыйжалар түргө жана антигенге жараша ар башка иммундук жооптор болушу мүмкүн экенин көрсөтөт; бирок үлгүнүн аздыгы, Ep. gambianusтагы жаныбарлардын көп жоголушу, бир гана PBS транскриптомдук контролу жана изилдөөдө тирүү вирус инфекциясынын ордуна вакцина антигендери колдонулгандыктан, жыйынтыктарды чыныгы Ebola же Nipah инфекциясынын түздөн-түз эквиваленти катары чечмелөөгө болбойт.

Изилдөөнүн негизги көйгөйү — жапайы жаратылышты көзөмөлдөөдө жарганаттардагы вируска спецификалык антителолор көбүнчө мурдагы вирустук таасирдин көрсөткүчү катары колдонулат, бирок ар башка жарганат түрлөрүндө бул антителолор канчалык тез пайда болору, канчалык функционалдуу экени жана ар башка түрлөр бир эле антигенге бирдей жооп береби же жокпу жетиштүү белгилүү эмес. Бул белгисиздик бир гана серологиялык позитивдүүлүккө таянып жарганат белгилүү бир вируска жукканын, вирусту алып жүргөнүн же жугузууга жөндөмдүү экенин айтууну кыйындатат.

Изилдөөнүн эң үйрөтүүчү жыйынтыктарынын бири антигенге байланышкан антитело менен вирусту нейтралдаштырган антитело бир эле нерсе эместигин көрсөтүшү. Ebola вакцинасы берилген Ep. gambianus особдорунда Ebola GP ге каршы жогорку байланыш сигналдары өлчөнгөнү менен, текшерилген сары суулар Ebola псевдотип вирусун эксперименттеги эң төмөнкү сары суу суюлтуусунда да нейтралдаштырган эмес. Демек, жогорку серологиялык сигнал өзүнөн өзү коргоочу же нейтралдаштыруучу иммунитетти билдирбейт.

Изилдөө эмне үчүн жүргүзүлгөн?

Жарганаттар ар кандай зооноздук вирустар менен байланыштуу жана талаа шартында вирустун өзүн аныктоо көп учурда кыйын болгондуктан антителолорду өлчөө кеңири колдонулган эпидемиологиялык курал болуп саналат. Бирок сары суу үлгүсүндө белгилүү бир вирустук белокко байланышкан антителонун табылышы инфекция качан болгонун, антитело канча убакыт сакталганын, антитело вирусту таасирсиз кыла аларын же жарганат вирус үчүн чыныгы резервуар экенин өзүнөн өзү көрсөтпөйт. Ошондуктан изилдөөчүлөр көзөмөлдөнгөн эксперименттик шартта белгилүү вирустук антигендерге дуушар болгондо Африкадагы мөмө жеген жарганаттардын эки түрү кандай антитело жана ген экспрессиясы жоопторун өнүктүрөрүн көрүүнү каалашкан.

Изилдөөдө эки түр тандалган. Eidolon helvum саман түстүү Африка мөмө жарганаты катары белгилүү жана henipavirusтар менен байланышы жакшы документтештирилген түр. Epomophorus gambianus болсо Гамбия эполеттүү мөмө жарганаты болуп, filovirusтар менен мүмкүн болгон байланышы үчүн изилдөөгө киргизилген. Эки түрдүн географиялык таралышы жарым-жартылай дал келгенине карабастан, талаадагы серологиялык изилдөөлөр ар кандай вирус топторуна каршы ар башка антитело үлгүлөрүн билдирген. Изилдөө бул байкоолордун артында түргө мүнөздүү иммундук айырмачылыктар бар-жогун текшерүүгө аракет кылат.

Бул Изилдөөдө Рекомбинанттык Вакциналар Эмне Үчүн Тирүү Ebola же Nipah Вирусунун Ордуна Колдонулган?

Рекомбинанттык вакциналар тирүү Ebola же Nipah вирусу менен эксперимент жүргүзүү талап кылган жогорку биокоопсуздук шарттарын колдонбостон жарганаттардын бул вирустардын негизги беттик антигендерине каршы иммундук жообун көзөмөлдөнгөн түрдө стимулдаштыруу үчүн колдонулган. Бул ыкма антигенге таасирленүүнү изилдөөгө мүмкүндүк берет; бирок чыныгы вирустун клеткага кириши, көбөйүшү, ткандарда жайылышы жана ооруну пайда кылышы сыяктуу процесстерди камтыбайт жана ошондуктан чыныгы инфекциянын толук модели эмес.

ChAdOx1 жана MVA эмнени билдирет?

ChAdOx1 шимпанзе аденовирусунан иштелип чыккан рекомбинанттык вирустук вектор. Бул жерде анын милдети Ebola же Nipah вирусунун өзүн ташуу эмес, тандалган вирустук гликопротеиндин генетикалык маалыматын кожоюн клеткаларга жеткирүү болуп саналат. Клеткалар бул белокту өндүргөндө иммундук система бөтөн антигенди таанып, антитело жана клеткалык жооп өнүктүрө алат.

MVA Modified Vaccinia Ankara дегендин кыскартмасы жана башка вирустук вектор катары күчөтүүчү дозада колдонулган. Ebola тобунда биринчи доза ChAdOx1-Ebola GP, ал эми төрт жумадан кийинки күчөтүүчү доза MVA-Ebola GP болгон. Nipah тобунда биринчи ChAdOx1 вектору Nipah G антигенин ташыган, бирок техникалык даярдоо көйгөйлөрүнө байланыштуу төрт жумадан кийинки MVA күчөтүүчүсү Nipah антигенин ташыган эмес. Бул айырма өзгөчө төрт жумадан кийинки эки вакцина тобун түздөн-түз молекулалык салыштырууну кыйындаткандыктан транскриптомдук анализ биринчи дозадан кийинки алгачкы төрт жума менен чектелген.

Prime-boost стратегиясы деген эмне?

Prime-boost ыкмасында биринчи доза иммундук системаны максаттуу антиген менен биринчи жолу жолуктуруп жоопту баштайт; кийинки күчөтүүчү доза ошол эле максатка багытталган иммундук жоопту кайрадан стимулдаштырат. Бул изилдөөдө биринчи инъекция 0. жумада, экинчи инъекция 4. жумада жасалган. Кан үлгүлөрү жума сайын алынган жана эксперимент болжол менен сегиз жумага созулган.

Изилдөөгө канча жарганат киргизилген?

Жарганаттар июнь 2017-жылы Аккра, Ганадагы табигый конуучу жерлерден кармалган. Жалпысынан 75 жарганат кармалып, жаш особдор жана ургаачылар кайра кое берилген. Алгач 27 бойго жеткен эркек Ei. helvum жана 33 бойго жеткен эркек Ep. gambianus кармалган; ден соолук жана жүрүм-турум байкоосунан кийин акыркы эксперименттик топко 19 Ei. helvum жана 14 Ep. gambianus киргизилген. Эркектерди гана тандоо жаш жана кош бойлуулук сыяктуу физиологиялык өзгөрмөлөрдү азайтууну максат кылган; мунун ордуна изилдөө жыйынтыктарын ургаачы жарганаттарга түздөн-түз жалпылоого болбошу маанилүү чектөө болуп саналат.

Ep. gambianus туткунда кармоо шарттарына күтүүсүздөн начар ыңгайлашкан. Жаныбарлар үч эксперименттик топтун баарында жоголгон; төрт особ экинчи инъекцияга чейин, болгону үч особ сегиз жумалык эксперименттин аягына чейин жашаган. Булак изилдөө бул жоготууларды вакцина инъекциялары менен байланыштырбайт. Бул жагдай үлгүнүн көлөмүн олуттуу азайтып, мүмкүн болгон аман калуу калыстыгын жаратып жана изилдөөчүлөрдүн Ep. gambianus маалыматтарына статистикалык тест колдонбоосуна алып келген.

Серология эмнени өлчөйт?

Серология — сары сууда антителолорду изилдөө. Изилдөөчүлөр Luminex xMAP негизиндеги мультиплекстүү микросфералык иммуноанализди, башкача айтканда MIAны колдонушкан. Ар кандай вирустук белоктор ар башка микросфераларга байланышат; сары суудагы антителолор өздөрү тааныган антигендерге байланышканда флуоресценттик сигнал пайда болот. Жыйынтык MFI, median fluorescence intensity, башкача айтканда медианалык флуоресценция интенсивдүүлүгү катары катталат.

MFI түздөн-түз “мындайча миллиграмм антитело бар” деген абсолюттук антитело концентрациясы эмес. Ал колдонулган эксперименттик система ичинде антигенге байланышкан антитело сигналынын салыштырма өлчөмү. Ошондуктан жогорку MFI күчтүүрөөк антиген байланышы менен шайкеш келет; бирок антитело сөзсүз вирусту нейтралдаштырат дегенди билдирбейт.

Панелде сегиз рекомбинанттык вирустук гликопротеин антигени болгон: Cedar вирусунун F жана G, Hendra вирусунун F жана G, Nipah вирусунун F жана G, Ebola вирусунун GP жана Marburg вирусунун GP. Позитивдүү контролдордо Ebola GP үчүн 5D2, Marburg үчүн 2B8, Hendra/Nipah G үчүн 102.4 жана Cedar үчүн 14F3 моноклоналдык антителолорунун сериялык суюлтуулары колдонулган. Негативдүү контроль чуңкурчаларында сары суу болгон эмес.

Жалпысынан 413 сары суу үлгүсү MIA менен дубликат түрүндө текшерилген. Он үч өлчөө ийгиликсиз болгон; микросфера саны 100 санына жетпеген 12 үлгү сапат көзөмөлүнөн кийин чыгарылган. MFI маалыматтарына \(\log_{10}\) трансформациясы колдонулган. Дубликаттар арасында 0,5 log бирдиктен көбүрөөк айырма көрсөткөн аз сандагы үлгүлөр белгиленген, бирок автоматтык түрдө чыгарылган эмес.

Логарифмдик MFI өзгөрүүсүн кантип окуу керек?

Төмөнкү туюнтма изилдөөнүн жаңы теңдемеси эмес; макалада колдонулган лог-трансформацияланган MFI өзгөрүүсүнүн математикалык маанисин түшүндүрүү үчүн берилген:

\[ \Delta \log_{10}(\mathrm{MFI})= \log_{10}(\mathrm{MFI}_{final})- \log_{10}(\mathrm{MFI}_{initial}) \]

Бул жерде \(\mathrm{MFI}_{initial}\) баштапкы, \(\mathrm{MFI}_{final}\) болсо кийинки убакыт чекитиндеги флуоресценция интенсивдүүлүгү. Логарифм колдонулгандыктан өзгөрүүлөр көбөйтүүчү масштабда окулат. Мисалы, 1,0 \(\log_{10}\) бирдик өсүш математикалык жактан MFIнин баштапкыга салыштырмалуу 10 эсе көбөйүшүнө туура келет. Бул антитело концентрациясы сөзсүз так 10 эсе көбөйгөн дегенди билдирбейт; MFI эксперименттик системанын салыштырма флуоресценция өлчөмү.

MFI жана Нейтралдаштыруу Тести Бир Эле Нерсени Өлчөйбү?

Жок. MFI тести антителолордун белгилүү вирустук антигенге байланышын өлчөйт, ал эми нейтралдаштыруу тести бул сары суу вирустун кирүү механизмин функционалдык түрдө бөгөттөй алабы же жокпу баалайт. Антитело вирустук белокко күчтүү байланышы мүмкүн, бирок вирустун клеткага киришин токтотпогон эпитопту таанышы мүмкүн; ошондуктан жогорку MFI менен жогорку нейтралдаштыруу жөндөмү сөзсүз бир эле натыйжа эмес.

Псевдотип вирус деген эмне?

Псевдотип вирус — изилденип жаткан вирустун кирүү белогун бетинде алып жүргөн, бирок изилдөөнүн максатындагы толук патогендик вирустун өзү болбогон лабораториялык тест системасы. Бул изилдөөдө экинчи муундагы, үч плазмидалуу лентивирустук система колдонулуп, ар кандай filovirus же henipavirus гликопротеиндерин алып жүргөн псевдотиптер өндүрүлгөн. Ошентип, сары суунун өзгөчө вирустук кирүү белогун бутага алган нейтралдаштыруу жөндөмүн өлчөөгө мүмкүн болгон.

Сары суулар үч эселик сериялык суюлтуулар менен 1:50 менен 1:12.150 аралыгында даярдалган. Псевдотип вирус 100 × TCID50 деңгээлинде сары суу менен бир саат 37 °Cде инкубацияланган, андан кийин тиешелүү клетка линиясынан \(2\times10^4\) клетка кошулуп, 48 сааттык инкубациядан кийин люцифераза сигналы өлчөнгөн.

TCID50 клетка культурасы системасында үлгүлөрдүн пайыз 50 бөлүгүндө инфекция пайда кыла алган дозанын эксперименттик өлчөмү. IC50 болсо бул жерде сары суу псевдотип вирус сигналын пайыз 50 басаңдата алган суюлтууну билдирет. Жогорку нейтралдаштыруучу титр сары суу көбүрөөк суюлтулган учурда да таасирин сактай аларын көрсөтөт.

Nipah вакцинасына берилген антитело жообу

Ei. helvum Nipah вакцина тобунда бир особдон башкасынын anti-Nipah-G байланыш сигналы жогорулаган. Ebola жана PBS топтору контроль катары бириктирилгенде, биринчи жана акыркы үлгүнүн ортосундагы anti-Nipah-G өзгөрүүсү Nipah тобунда олуттуу жогору болгон: Wilcoxon ранг суммасы тести үчүн \(W=76\), \(p=0{,}0026\).

Экинчи инъекцияга чейин эле айырма айкын болгон. Биринчи үлгү менен күчөтүүчү дозанын алдындагы акыркы үлгүнүн ортосунда медианалык өзгөрүү Nipah тобунда +1,0 \(\log_{10}\) MFI бирдиги, Ebola тобунда −0,5 жана PBS тобунда 0,0 катары билдирилген. Бул салыштырууда \(W=77\) жана \(p=0{,}0018\).

Бардык убакыт катарын колдонгон сызыктуу аралаш таасирлер моделинде вакцина тобу жана убакыт туруктуу таасирлер, жеке жарганат идентификациясы болсо кокустук таасир катары каралган. Топ × убакыт өз ара аракеттенүүсү \(p<10^{-4}\) менен Nipah вакцинасынын убакыттагы таасирин колдогон. Кокустук жеке таасирди колдонуу бир эле жарганаттан жумалар бою алынган өлчөөлөр бири-биринен толук көз карандысыз эмес экенин моделге киргизүү үчүн маанилүү.

Баштапкы Nipah-G MFI деңгээли менен эксперимент бою байкалган өзгөрүүнүн ортосунда терс корреляция табылган. Бардык Ei. helvum особдорунда Pearson \(r=-0{,}65\), %95 ишеним аралыгы \([-0{,}85,-0{,}28]\); Nipah вакцина тобунда гана \(r=-0{,}90\), %95 ишеним аралыгы \([-0{,}98,-0{,}44]\) катары билдирилген. Бул байланыш баштапкыда сигналы жогору особдордун таза өсүшү азыраак болушу менен шайкеш келет; корреляция өзүнөн өзү мунун себебин түшүндүрбөйт.

Nipah нейтралдаштыруу анализинде 14 акыркы мезгилдеги сары суу үлгүсү колдонулган. MIA өлчөөсү менен псевдотип нейтралдаштыруу натыйжасынын ортосунда күчтүү оң байланыш табылган: Spearman \(\rho=0{,}82\), \(p=0{,}0003\), \(n=14\). Изилдөө үлгүсүндө MFI мааниси болжол менен 200 бирдиктен жогору болгон сары сууларда нейтралдаштыруучу активдүүлүк байкалган. Изилдөөчүлөр ошондой эле мурдагы изилдөөдө Ei. helvum Nipah-G серологиясы үчүн ROC анализине негизделген 500 MFI чеги сунушталганын белгилешет. Ошондуктан 200 жана 500 MFI маанилери бир эле максат үчүн түзүлгөн универсалдуу чектер катары бааланбашы керек.

Эксперименттин аягында Nipah вакцина тобунда нейтралдаштыруу тести жүргүзүлгөн сегиз жарганаттын баарында аныктала турган нейтралдаштыруучу антитело болгон.

Ebola вакцинасына берилген антитело жообу

Eidolon helvumда Ebola вакцинасынан кийин anti-Ebola-GP антитело байланышынын туруктуу өсүшү байкалган эмес. Тескерисинче, биринчи Ebola вакцинасынан кийин кеминде бир жума жашаган төрт Ep. gambianus особунда Ebola GP MFI маанилеринде чоң өсүштөр болгон. Бирок жаныбарлардын саны өтө аз болгондуктан бул түрдө статистикалык тест жүргүзүлгөн эмес.

Изилдөөнүн бул жердеги эң маанилүү айырмасы — нейтралдаштыруу эксперименти. Эксперименттин акыркы күнү алынган 15 сары суу үлгүсү Ebola GP алып жүргөн лентивирустук псевдотип менен текшерилген. Алар Ebola тобундагы сегиз Ei. helvum, PBS тобундагы төрт Ei. helvum жана изилдөөнү аяктаган үч Ep. gambianus сары суусун камтыган. Эч бир үлгү эң төмөнкү 1:50 сары суу суюлтуусунда Ebola псевдотипин нейтралдаштырган эмес.

Изилдөөчүлөр Ebola GP1 белогунун күчтүү гликозилденген муцин аймагы антитело байланышын өзгөртүшү мүмкүн экенин да изилдеп, муцин аймагы алып салынган Ebola GP1 псевдотипи менен тестти кайталаган. Ошого карабастан сары суулардын эч бири 1:50 суюлтууда нейтралдаштыруу көрсөткөн эмес.

Бул жыйынтык, айрыкча Ep. gambianusта өлчөнгөн жогорку Ebola-GP байланыш сигналы автоматтык түрдө нейтралдаштыруучу антитело дегенди билдирбей турганын көрсөтөт. Авторлор бул антителолор нейтралдаштырууну камсыз кылбаган GP эпитопторун таанышы мүмкүн экенин талкуулашат. Антителолордун фагоцитоз же табигый өлтүргүч клеткаларды активдештирүү сыяктуу Fc аркылуу башка функциялары бар-жогу бул экспериментте текшерилген эмес.

Вакцина векторунун клеткаларга кире албашы түшүндүрмө болушу мүмкүнбү?

Изилдөөчүлөр эки вакцина вектору тең Ei. helvum жана Ep. gambianus клеткаларын in vitro флуоресценттик инфекция экспериментинде белгилүү сезгич адам клеткаларына окшош натыйжалуулукта инфекциялай аларын тастыкташкан. Ошондуктан Ei. helvumда Ebola GP ге каршы айкын сары суу антителосу пайда болбогонун аденовирустук вектор бул түрдүн клеткаларына кире албаганы менен гана түшүндүрүү изилдөө маалыматтары тарабынан колдоого алынбайт.

Транскриптомдук анализ эмнени изилдейт?

Транскриптом — белгилүү клеткада же тканада белгилүү учурда экспрессияланган RNA молекулаларынын жыйындысы. Гендин DNAда болушу менен анын ошол учурда канчалык активдүү экени эки башка нерсе. RNA секвенирлөө кайсы гендерден канча RNA өндүрүлүп жатканын болжол менен сандык баалап, иммундук системанын кайсы молекулалык программалары стимулдашканын изилдөөгө мүмкүндүк берет.

Транскриптомдук анализ Ei. helvumда гана жүргүзүлгөн. Башында Ebola вакцина тобунан 8, Nipah тобунан 3 жана PBS тобунан 2 особдун кан үлгүлөрү тандалган. Контроль особдорунун биринин баштапкы антитело профили жогору жана транскриптомдук жүрүм-туруму четтөөчү болгондуктан дифференциалдык ген экспрессиясы анализинен чыгарылып, топтук салыштыруулар бир гана PBS контролуна негизделген. Бул жагдай жыйынтыктардын статистикалык күчүн олуттуу чектейт.

Nipah тобунун 4. жумадагы MVA күчөтүүчүсү Nipah антигенин ташыбагандыктан, топтор арасында маанилүү салыштырууну сактоо үчүн транскриптомдук баалоо биринчи ChAdOx1 дозасынан кийинки алгачкы төрт жума менен гана жүргүзүлгөн.

RNA секвенирлөө кандай жүргүзүлгөн?

RNA 150 µl бүт кандан RNAzol BD ыкмасы менен бөлүнгөн. Булак изилдөө кичинекей үлгү көлөмүнө ылайыкташтырылган протоколду кеңири берет: 300 µl RNAzol BD, 4,05 µl уксус кислотасы, 450 µl лизат, 22,5 µl 1-bromo-3-chloropropane, 78,75 µl изопропанол жана 60–120 µl %75 этанол колдонулган; тиешелүү этапта 225 µl супернатант иштетилген.

RNA көлөмү NanoDrop 2000 менен, RNA бүтүндүгү Agilent 2100 Bioanalyzer менен бааланган. Үлгүлөр Illumina платформасында 150 база жуп узундуктагы paired-end катары секвенирленген. Ар бир үлгүдөгү чийки окуулардын саны орточо \(26{,}25 \pm 3{,}02\) миллион деп билдирилген.

Сапат көзөмөлү FastQC v0.11.4 менен жүргүзүлүп, сапаты төмөн ырааттуулуктар BBTools пакетиндеги bbduk.sh менен кыркылган. Ашыкча көрсөтүлгөн ырааттуулуктар жана адаптерлер алынып салынган. Кан транскрипттеринин болжол менен %75 бөлүгү гемоглобинге дал келгендиктен алар маалымат топтомунан чыгарылган. Окуулардын сол жактагы алгачкы 10 базасы алынып; эки учу орточо Phred сапат упайы кеминде 10 болчудай кыркылган жана 25 базадан кыска окуулар ташталган. Бул иштетүүлөрдөн кийин ар бир үлгүдө орточо \(6{,}82 \pm 3{,}08\) миллион окуу калган.

Сапат фильтринен өткөн окуулар изилдөө тобу түзгөн Ei. helvum долбоордук геномуна STAR v2.7.3a менен, --quantMode GeneCounts параметри колдонулуп тегизделген. Кыркылган окуулардын %76–88 бөлүгү геномдо уникалдуу бир позицияга дал келген.

Экинчи жумадагы PBS үлгүсүнүн RNA сапаты төмөн болгондуктан ошол жумада PBS менен вакцина топторунун ортосунда дифференциалдык экспрессия салыштырылган эмес.

Дифференциалдык ген экспрессиясы деген эмне?

Гендин вакцина тобунда контроль тобуна салыштырмалуу жогору же төмөн деңгээлде экспрессияланышы дифференциалдык ген экспрессиясы деп аталат. Анализ DESeq2 v1.36.0 менен жүргүзүлүп, көп гипотеза тесттеринен чыккан жалган оң натыйжаларды чектөө үчүн Benjamini-Hochberg жалган табылга деңгээли, башкача айтканда FDR коррекциясы колдонулган. \(FDR<0{,}05\) болгон гендер дифференциалдык экспрессияланган ген, башкача айтканда DEG деп кабыл алынган.

Дифференциалдык экспрессия көбүнчө \(\log_2\) fold-change менен көрсөтүлөт. Төмөнкү туюнтма түшүндүрүүчү математикалык ачылыш:

\[ \log_2 FC=\log_2\left(\frac{\mathrm{ifade}_{tedavi}} {\mathrm{ifade}_{karşılaştırma}}\right) \]

\(\log_2 FC=1\) математикалык жактан эки эсе, \(\log_2 FC=-1\) жарым деңгээл, \(\log_2 FC=2\) төрт эсе экспрессия катышына туура келет. Бирок чоң fold-change өзүнөн өзү биологиялык маанилүүлүктүн далили эмес; үлгү көлөмү, вариация жана көп тест коррекциясы да бааланышы керек.

ISGylation Деген Эмне жана Бул Изилдөөдө Эмне Үчүн Маанилүү?

ISGylation — интерферон менен стимулдашкан ISG15 аттуу ubiquitin-сымал белоктун башка белокторго ферменттик жол менен байланышы болгон клеткалык жөнгө салуу процесси. Изилдөөдө Ebola жана Nipah вакцина топтору салыштырылганда UBA7, ISG15, HERC5 жана USP18 сыяктуу ISGylation менен байланышкан гендердин экспрессиялары айырмаланган; ошондуктан бул жол эки вирустук гликопротеинге каршы пайда болгон ар башка молекулалык иммундук жоопторду түшүнүүдө негизги табылгалардын бири болгон.

Булак изилдөөдө сүрөттөлгөн негизги ISGylation чынжырында ISG15 алгач E1 ферменти UBA7 тарабынан активдештирилет, андан кийин E2 ферменти UBE2L6га өткөрүлүп, E3 ферменти HERC5 аркылуу максаттуу белокко байланышат. Изилдөөнүн биринчи жумадагы Ebola-Nipah түз салыштыруусунда UBA7 эң күчтүү дифференциалдык гендердин бири болгон; ISG15, HERC5 жана USP18 да олуттуу айырма көрсөткөн. Бул төрт гендин экспрессия деңгээли Ebola вакцина тобунда Nipah тобуна салыштырмалуу төмөн болгон. Бирок Ebola тобу PBS контролу менен салыштырганда ошол эле убакыт чекитинде бул гендердин баары олуттуу төмөн болгон эмес; булакта UBA7 гана олуттуу төмөн регуляцияланган деп айтылат. Бул айырма маанилүү.

ISGylation көп учурда I типтеги интерферон менен байланышкан антивирустук жооптор менен байланыштуу. Бирок бул экспериментте тирүү вирустун көбөйүшү болбогондуктан, байкалган ISGylation менен байланышкан өзгөрүүлөр вирустук репликациянын далили эмес. Авторлор аларды ChAdOx1 вакцина вектору жана ташылган Nipah-G же Ebola-GP антигендерине каршы иммундук активдешүү контекстинде чечмелешет.

GO жана KEGG анализдери эмне кылат?

Жүздөгөн өзүнчө гендердин тизмесин чечмелөө кыйын. Gene Ontology, башкача айтканда GO анализи дифференциалдык гендер белгилүү биологиялык процесстерде күтүлгөндөн көбүрөөк көрсөтүлгөнбү же жокпу изилдейт. KEGG болсо клеткалык жана молекулалык жолдордун уюштурулган маалымат базасы. Бул жерде WebGestalt 2019 колдонулуп DEG тизмелеринде белгилүү биологиялык процесстер жана KEGG жолдору ашыкча көрсөтүлгөнбү же жокпу изилденген.

Nipah вакцина тобун PBS менен салыштырганда ашыкча көрсөтүлгөн KEGG жолу же биологиялык процесс аныкталган эмес. Ebola вакцина тобунда болсо лейкоциттердин дифференциациясы менен байланышкан ар кандай GO терминдери; Th1 жана Th2 клеткалардын дифференциациясы, Notch сигналдашуусу жана JAK/STAT каскады сыяктуу иммундук системанын маанилүү жөнгө салуучу жолдору менен байланышкан сигналдар табылган.

Бирок изилдөөчүлөр цитокин транскрипттери чектелүү аныкталгандыктан кайсы T-жардамчы клетка субтиби басымдуу экенин аныктай алышкан эмес. Ошондуктан “Ebola антигенине каршы антитело пайда болгон жок, анткени иммундук система клеткалык жоопко өттү” деген так механизм изилдөө тарабынан далилденген эмес.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Жаныбарларды кармоо жана үлгү алуу

Экспериментке алынган жарганаттар 80 × 80 × 80 cm торлордо, бир түрдөн эң көп беш особдон турган топтордо кармалган. Торлор болжол менен 2 m аралыкта жайгаштырылып, заара, бөлүндү, азык же суу аркылуу түз жана кыйыр байланышты азайтуу үчүн металл тосмолор менен бөлүнгөн. Жаныбарларга манго, папайя жана банан сыяктуу тууралган аралаш мөмөлөр жана эркин суу берилген; күн сайын жаңыланып турган.

Жарганаттар экспериментке чейин 8–10 күн ветеринардык көзөмөлдө кармалып, эксперимент бою стресс, салмак жоготуу жана жаракат алуу боюнча көзөмөлдөнгөн.

Биринчи кан үлгүсү вакцинацияга чейин 0,5 ml катары алынган. Биринчи инъекция булчуңга болжол менен \(10^7\) IU ChAdOx1 же 0,25 ml PBS түрүндө берилген. Төрт жумадан кийин болжол менен \(10^7\) pfu MVA же PBS берилген. Жумалык кан үлгүлөрүнүн көлөмү 0,3 ml болгон. Сегизинчи жумада калган жаныбарлар вена аркылуу кетамин/медетомидиндин ашыкча дозасы менен эвтаназияланып, мээ, боор, көк боор, бөйрөк жана мүмкүн болсо лимфа түйүндөрүнүн үлгүлөрү алынган.

Сары суу үлгүлөрү мүмкүн болгон патогендерди инактивациялоо үчүн 56 °Cде 30 мүнөт ысытылып, үлгүлөр −80 °Cде сакталган.

Негизги серологиялык жыйынтыктар

Транскриптомдук маалыматтарды иштетүүнүн кыскача мазмуну

Дифференциалдык ген экспрессиясынын сандык жыйынтыктары

PBS контролу менен ар бир убакыт чекити өзүнчө салыштырылганда Ebola вакцина тобунда дифференциалдык экспрессияланган гендердин саны 261 менен 789 аралыгында өзгөрүп, орточо \(506 \pm 266{,}0\) болгон. Nipah вакцина тобунда болсо саны 3 менен 28 аралыгында гана өзгөрүп, орточо \(16{,}3 \pm 12{,}6\) деп билдирилген.

Nipah тобунда кеминде бир убакыт чекитинде дифференциалдык экспрессияланган жалпы 38 гендин ичинен 30 ген Ebola тобунда да кеминде бир убакыт чекитинде дифференциалдык экспрессияланган. Бардык анализдер бирге бааланганда Ebola тобуна мүнөздүү 968, Nipah тобуна мүнөздүү 8 DEG билдирилген.

Ebola жана Nipah вакцина топтору түз салыштырылганда алгачкы төрт жумадагы DEG саны 185 менен 788 аралыгында өзгөрүп, орточо \(405 \pm 282\) болгон. Эң жогорку DEG сандары биринчи жана төртүнчү жумаларда байкалган.

T-клетка дифференциациясы жана JAK/STAT жыйынтыктары

Ebola вакцина тобун PBS менен салыштырганда T-жардамчы клетка дифференциациясы менен байланышкан GO терминдери ашыкча көрсөтүлгөн. Th1 жана Th2 дифференциациясы менен байланышкан гендерден тышкары Notch жана JAK/STAT сигнал жолдору да белгиленген.

Th1 клеткалары жалпы түрдө клетка ичиндеги патогендерге каршы иммундук жооптор менен; Th2 клеткалары болсо B-клетка активдешүүсү жана гуморалдык жооптор менен байланышат. Бирок изилдөөдө тиешелүү цитокин RNAлары чектелүү аныкталгандыктан Ebola вакцинасына дуушар болгон Ei. helvumда Th1 же Th2 багытында басымдуу жооп бар экенин аныктоо мүмкүн болгон эмес.

Ошондуктан серологиялык anti-Ebola жообу көрүнбөгөнүн “иммунитет толугу менен клеткалык бутакка өттү” деп түшүндүрүү булак тарабынан колдоого алынбайт.

ISGylation жолундагы жыйынтыктардын деталдары

Ebola жана Nipah вакцина топторунун биринчи жумадагы түз салыштыруусунда эң күчтүү DEG UBA7 болгон. ISG15, HERC5 жана USP18 да эки топтун ортосунда дифференциалдык экспрессия көрсөткөн. UBA7, ISG15, HERC5 жана USP18 экспрессия деңгээлдери Ebola тобунда Nipah тобуна салыштырмалуу төмөн болгон.

Бул жерде эки башка салыштырууну аралаштырбоо керек. “Ebola тобунда Nipah тобуна салыштырмалуу төмөн” деген жыйынтык автоматтык түрдө “Ebola тобунда контролдон төмөн” дегенди билдирбейт. PBS менен салыштырганда биринчи жумада бул төрт гендин ичинен UBA7 гана Ebola тобунда олуттуу төмөн регуляцияланган деп билдирилген.

Eidolon helvum жана Epomophorus gambianus Бир Эле Антигендерге Бирдей Жооп Бердиби?

Жок. Nipah G антигенине каршы эки түрдө тең айкын антитело жооптору көрүнгөнү менен, Ebola GP антигенине каршы күчтүү байланыш жообу аз сандагы тирүү калган Epomophorus gambianus особдорунда гана байкалган, ал эми Eidolon helvumда туруктуу anti-Ebola-GP сары суу антителосунун өсүшү аныкталган эмес. Ошол эле учурда Ei. helvumдагы транскриптомдук жооп Ebola вакцинасына каршы көп сандаган гендер жана иммундук жолдор өзгөргөнүн көрсөткөн; демек “антитело өсүшү жок = иммундук жооп жок” деген тыянак чыгарууга болбойт.

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

• Nipah G антигенин алып жүргөн вакцина, айрыкча Ei. helvumда айкын жана статистикалык жактан колдоого алынган anti-Nipah-G антитело өсүшүн пайда кылган.
• Nipah-G MIA сигналы менен псевдотип нейтралдаштыруу активдүүлүгүнүн ортосунда изилденген үлгүлөрдө күчтүү байланыш табылган.
• Ep. gambianusта Ebola GP ге байланышкан антитело сигналы көбөйгөн; бирок бул жыйынтык өтө аз жаныбар санына негизделет.
• Ebola GP ге байланышкан сары суу антителолору текшерилген шарттарда Ebola псевдотипин нейтралдаштырган эмес.
• Ei. helvumда Ebola вакцинасы айкын сары суу антителосунун өсүшүн жаратпаганы менен кеңири транскриптомдук жооп менен байланышкан.
• Ebola жана Nipah вакцина топторунун ортосунда ISGylation, I типтеги интерферон жообу, вируска жооп жана T-клетка тандоосу менен байланышкан гендерде жана жолдордо айырмачылыктар байкалган.
• Жарганат түрлөрүнүн бир эле вирустук антигендерге иммундук жооп берүү жолдору бири-биринен айырмаланышы мүмкүн.

Изилдөө колдобогон жыйынтыктар

Изилдөө Eidolon helvum же Epomophorus gambianus табигый шартта Ebola же Nipah вирусун канчалык көп алып жүрөрүн өлчөгөн эмес. Вакцинага жооп берүү табигый резервуар статусун далилдебейт. Сары сууда антителонун табылышы активдүү инфекцияны, тирүү вирустун бөлүнүшүн же жугуштуулукту билдирбейт.

Экспериментте тирүү Ebola же Nipah вирусу колдонулбагандыктан, чыныгы инфекция учурунда вирустун көбөйүшү, ткандык тропизм, оорунун өнүгүшү же вирустун бөлүнүшү тууралуу түз жыйынтык чыгарбайт.

Ep. gambianusта Ebola GP ге байланышкан антителолор коргоочу экени көрсөтүлгөн эмес. Тескерисинче, колдонулган псевдотип нейтралдаштыруу экспериментинде нейтралдаштыруу табылган эмес. Бирок изилдөө нейтралдаштырбаган антителолордун башка иммундук функцияларын түздөн-түз текшерген эмес.

Ei. helvumдагы кеңири Ebola вакцина транскриптомдук жообу бул түр чыныгы Ebola инфекциясына дал ушундай жооп берет деген далил эмес. Вакцина вектору жана антигенди көрсөтүү менен тирүү вирустук инфекция биологиялык жактан бир эле процесс эмес.

Изилдөө бойго жеткен эркек жарганаттарды гана камтыгандыктан, ургаачыларда, жаш особдордо же башка жаш топторунда ошол эле жыйынтыктар чыгарын көрсөтпөйт.

Негизги чектөөлөр

Эң чоң чектөө — Ep. gambianus особдорунун тез жоголушу. Башында 14 особ болгонуна карабастан, төрт жаныбар гана экинчи инъекцияга жана үч жаныбар гана эксперименттин аягына жеткен. Бул жагдай статистикалык күчтү азайтып, эксперименттин аягына жеткен жаныбарлар түрдүн баарын өкүлчүлүк кылбай калышы мүмкүн болгон аман калуу калыстыгын жараткан.

Транскриптомдук анализде Ep. gambianus маалыматы жок. Мындан тышкары сапат жана баштапкы антитело профили себептүү контроль үлгүлөрү чыгарылгандан кийин дифференциалдык экспрессия анализдери бир гана PBS контроль особго негизделген. Изилдөөчүлөр бул жуптук салыштырууларды ачык түрдө алдын ала табылгалар катары баалашат.

Кан транскрипттеринин болжол менен %75 бөлүгү гемоглобинге дал келгендиктен, төмөн деңгээлде экспрессияланган айрым гендер кармалбай калган болушу мүмкүн.

Жарганаттардын табигый инфекция тарыхы белгисиз. Активдүү henipavirus инфекциясын ишенимдүү четтетүү мүмкүн болгон эмес; ошондуктан айрым антитело өзгөрүүлөрү тор ичиндеги табигый таасирлер менен байланыштуу болушу мүмкүн экенин толук четке кагууга болбойт. PBS тобундагы бир жарганатта эксперименттин аягында байкалган anti-Nipah-G өсүшү буга мисал катары талкууланган.

Ebola вирусуна жукканы так белгилүү болгон жарганаттардан алынган позитивдүү контроль сары суусунун болбошу, айрыкча Ebola серологиялык тесттеринин сезгичтигин жана өзгөчөлүгүн так калибрлөөнү чектейт.

Nipah тобунда экинчи MVA дозасы максаттуу Nipah антигенин ташыбагандыктан, эки вакцина режими 4. жумадан кийин эквиваленттүү болбой калган. Ошондуктан ген экспрессиясын салыштырууну күчөтүүчү дозадан кийинки мезгилге узартпоо туура, бирок камтууну тарылткан методологиялык чечим болгон.

Жыйынтыктардын илимий мааниси

Изилдөө көрсөткөн негизги көрүнүш — жарганаттардагы антивирустук иммунитетти “антитело бар/жок” деп гана чечмелөөгө болбой турганы. Ei. helvum Nipah антигенине күчтүү сары суу антителосу жана нейтралдаштыруу жообун көрсөтө алганы менен Ebola GP антигенине каршы айкын сары суу антителосун өндүргөн эмес, бирок ошого карабастан жүздөгөн гендерде жана ар кандай иммундук жолдордо молекулалык өзгөрүүлөрдү көрсөткөн. Ep. gambianus болсо изилдөөгө мүмкүн болгон аз сандагы особдордо Ebola GP ге айкын байланыш жообун түзгөн, бирок бул сары суу нейтралдаштыруу тестинде чагылдырылган эмес.

Бул айырмачылыктар жапайы жарганаттардагы серологиялык көзөмөл натыйжаларын чечмелегенде түр, максаттуу вирустук антиген жана колдонулган тест чогуу бааланышы керек экенин көрсөтөт. Бир эле MFI мааниси ар башка түрдө бирдей биологиялык мааниге ээ деп болжолдоого болбойт; антигенге байланыш, нейтралдаштыруу жана клеткалык/транскриптомдук жооп бири-биринен өзүнчө өлчөө деңгээлдери.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска изилдөө: Serological and transcriptomic response of African fruit bats to immune challenge with recombinant vaccines expressing Ebola or Nipah virus antigens.

Авторлор: Elinor Jax; Romain Garnier; Georgia Tsagkogeorga; Hubert Buczkowski; Louise Gibson; Pius Benia; Richard Suu-Ire; Vera M. Warmuth; Sylvester Languon; Osbourne Quaye; Lianying Yan; Christopher C. Broder; Stephen J. Rossiter; Edward Wright; Sarah C. Gilbert; Teresa Lambe; James L. N. Wood; Andrew A. Cunningham; Olivier Restif.

Жооптуу автор: Olivier Restif. Булакта тең биринчи авторлук же тең салым белгиси көрсөтүлгөн эмес.

Мекемелер: University of Cambridge Department of Veterinary Medicine; Queen Mary University of London School of Biological and Behavioural Sciences; University of Sussex Viral Pseudotype Unit; Zoological Society of London Institute of Zoology; University of Ghana School of Veterinary Medicine; University of Ghana Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology жана West African Centre for Cell Biology of Infectious Pathogens; Ludwig-Maximilians-Universität München Biozentrum Martinsried; Uniformed Services University Department of Microbiology and Immunology; Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine; University of Oxford Pandemic Sciences Institute; Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute; Oxford Vaccine Group.

Журнал: Royal Society Open Science. Басмакана: The Royal Society. Том: 13. Саны: 10. Макала номери: 252189. Жарыяланган күнү: 7 Октябрь 2026. DOI: 10.1098/rsos.252189. Келип түшкөн күнү: 11 Ноябрь 2025. Кабыл алынган күнү: 8 Июнь 2026.

Булак түрү жана рецензия: Рецензияланган изилдөө макаласы. Лицензия: Creative Commons Attribution 4.0, CC BY 4.0.

Изилдөө түрү: Жапайыдан кармалган бойго жеткен эркек Африка мөмө жарганаттарында рекомбинанттык вирустук векторлор менен жүргүзүлгөн эксперименттик in vivo иммундук стимулдаштыруу; сары суу антитело анализи; лентивирустук псевдотип нейтралдаштыруу тести; бир түрдө бүт кан RNA-seq транскриптомдук анализи жана кошумча in vitro клеткалык контроль эксперименттери.

Маанилүү методологиялык чек: Экспериментте тирүү Ebola же Nipah вирусу менен инфекция жасалган эмес. Вакцина векторлору Ebola GP же Nipah G антигендерин экспрессиялайт. Ошондуктан жыйынтыктар вирустук инфекциянын патогенези, жугуштуулук же табигый резервуар жөндөмдүүлүгү менен теңештирилбеши керек.

Этикалык уруксаттар: Zoological Society of London, долбоор WLE719, 26 Май 2017; Ghana Council for Scientific Industrial Research, RPN 001/CSIR-IRB/2017, 22 Июнь 2017.

Маалымат жеткиликтүүлүгү: Чийки mRNA-seq маалыматтары NCBI Sequence Read Archive'да PRJNA1054324 жетүү номери менен сакталган. Изилдөөдө түзүлгөн долбоордук Ei. helvum геному жана аннотациясы Figshare DOI 10.6084/m9.figshare.29117609.v2 астында; негизги серология жана дифференциалдык экспрессия анализдерин кайра жаратуу үчүн колдонулган S1–S3 маалымат топтомдору жана R коду Figshare DOI 10.6084/m9.figshare.29126510.v2 астында бөлүшүлгөн. Кошумча материалдар жыйнагы DOI 10.6084/m9.figshare.c.8655631 катары көрсөтүлгөн.

Кызыкчылыктардын кагылышы: Авторлор атаандаш кызыкчылык жок экенин билдиришкен.

Каржылоо: Изилдөө Elinor Jax үчүн Deutsche Forschungsgemeinschaft изилдөө стипендиясы 438001934; Olivier Restif үчүн Royal Society GCRF CH160115; James L. N. Wood, Andrew A. Cunningham жана Osbourne Quaye үчүн MRC MR/P025226/1; Romain Garnier үчүн AXA Research Fund Junior Fellowship; ALBORADA Trust; Research England жана Christopher C. Broder үчүн NIH AI054715 колдоосу менен жүргүзүлгөн.

Авторлордун AI билдирүүсү: Булак макалада авторлор макаланы даярдоодо жасалма интеллект колдогон технологияларды колдонбогонун билдиришкен.

Авторлордун салымдарынын кыскача мазмуну: Elinor Jax формалдык анализ, ыкма, визуалдаштыруу жана биринчи долбоор; Romain Garnier концептуалдаштыруу жана изилдөө; Georgia Tsagkogeorga формалдык анализ жана изилдөө; Hubert Buczkowski ыкма жана изилдөө; Louise Gibson маалыматтарды курациялоо, ыкма жана долбоор башкаруу; Pius Benia изилдөө; Richard Suu-Ire изилдөө жана долбоор башкаруу; Vera M. Warmuth формалдык анализ; Sylvester Languon изилдөө; Osbourne Quaye долбоор башкаруу жана көзөмөл; Lianying Yan ыкма; Christopher C. Broder каржылоо, ыкма жана ресурстар; Stephen J. Rossiter концептуалдаштыруу жана көзөмөл; Edward Wright изилдөө жана ыкма; Sarah C. Gilbert жана Teresa Lambe ыкма жана ресурстар; James L. N. Wood жана Andrew A. Cunningham концептуалдаштыруу, каржылоо, долбоор башкаруу жана көзөмөл; Olivier Restif концептуалдаштыруу, формалдык анализ, ыкма, долбоор башкаруу, визуалдаштыруу жана биринчи долбоор милдеттерин аткарган. Макала бардык авторлордун акыркы макулдугу менен жарыяланган.