Modeli ya panya A5H ni modeli ya knock-in ya kipokezi cha seli B (B-cell receptor, BCR) ambapo mfuatano wa VDJ wa mnyororo mzito uliotokana na kingamwili inayoweza kufungamana na epitopu “E” ya aquaporin-5 (AQP5) umeingizwa kwenye lokasi ya mnyororo mzito wa immunoglobulini ya panya. Modeli ilitengenezwa kuchunguza mchakato wa mapema wa autoimmunity ambapo seli B, ingawa hutambua kwa upendeleo PmE-L, peptidi ya uigaji wa mikrobia, zinaweza kubeba ureaktivu fiche wa mtambuka dhidi ya AQP5. Ugunduzi mkuu wa utafiti ni kwamba baada ya immunization kwa PmE-L, seli hizi B zinazoreact kwa uigaji hushiriki katika mwitikio wa kituo cha kijerminali na kuzalisha autoantibody kali za anti-AQP5E, na mwitikio wa kingamwili unaweza kupanuka hadi aquaporin homolog AQP4 na, katika baadhi ya panya, AQP1. Hata hivyo, kuenea kwa epitopu ndani ya molekuli hadi AQP5A, epitopu nyingine ya AQP5, hakukuonekana; uwekaji wa autoantibody kwenye tishu za tezi za mate na patholojia ya tezi inayofanana na Sjögren ulibaki mdogo.

Uigaji wa molekuli (molecular mimicry) ni hali ambayo mwitikio uleule wa kinga unaweza kutambua antijeni ya mikrobia na antijeni ya mwili wenyewe kwa sababu ya kufanana kwa muundo au mfuatano kati yao. Katika utafiti huu, kufanana kati ya eneo la PmE-L/PmE lenye asili ya bakteria na AQP5E kulitumiwa kuchunguza jinsi seli B zenye ureaktivu mtambuka zinavyoweza kutokea na kuamilishwa. PmE na AQP5E hutofautiana kwa amino asidi moja tu; mnyororo mzito unaotokana na Clone 44 uliotumiwa katika utafiti unaonyesha ureaktivu wenye nguvu kidogo zaidi kwa PmE kuliko kwa AQP5E.

Katika panya A5H, maendeleo ya jumla ya seli B yamehifadhiwa kwa kiasi kikubwa. Hakukuonekana kufutwa kwa kati kwa kiwango kikubwa au kusimama kwa maendeleo katika idadi ya seli B zote, zisizokomaa na zilizokomaa katika uboho, nodi za limfu na wengu. Kwa upande mwingine, ongezeko la seli T1, kupungua kwa seli T3 katika sehemu ya seli B za mpito, na kupungua kwa seli B zilizokomaa zenye fenotipu IgD⁺IgM^lo inayohusishwa na anergia katika wengu na nodi za limfu, kulionyesha kwamba seli zenye ureaktivu kwa uigaji zinazobeba mnyororo mzito wa A5H zinaweza kubaki kama hifadhi kubwa zaidi katika pembezoni.

Katika hali ya mapumziko, kingamwili dhidi ya PmE-L ya mikrobia tayari ziliweza kugunduliwa katika panya A5H, lakini autoantibody za anti-AQP5E hazikugunduliwa kwa ELISA. Baada ya immunization moja kwa PmE-L, panya wote wa +/A5H walizalisha autoantibody za anti-AQP5E kufikia siku ya 13, na mwitikio uliongezeka zaidi siku ya 21. Katika jaribio hilo hilo, mwitikio wa anti-AQP5E ulionekana kwa panya mmoja tu wa aina ya mwitu. Ingawa idadi ya jumla ya seli B katika nodi ya limfu haikubadilika kwa kiasi kikubwa, seli B za kituo cha kijerminali na seli B zinazofungamana na AQP5E ndani ya kituo cha kijerminali ziliongezeka katika panya +/A5H.

Mojawapo ya matokeo muhimu ya utafiti ni kwamba panya heterozygous +/A5H walitengeneza mwitikio wa autoantibody wenye nguvu zaidi kuliko panya homozygous A5H/A5H. Katika panya +/A5H, miitikio ya kingamwili dhidi ya anti-AQP5E, anti-AQP4 na streptavidin ilikuwa na nguvu zaidi. Waandishi wanajadili kwamba hii inaweza kuhusishwa na uwezekano wa allelic inclusion, ambapo aleli ya mnyororo mzito A5H na aleli ya mnyororo mzito ya asili zinaweza kuonyeshwa pamoja katika idadi ileile ya seli B. Hata hivyo, utafiti haukuonyesha moja kwa moja utaratibu wa allelic inclusion kwa sequencing ya repertoire; kwa hiyo, maelezo haya ni tafsiri yenye nguvu ya kibayolojia lakini si utaratibu wa sababu uliothibitishwa moja kwa moja.

Mwitikio uliotokea dhidi ya AQP5E haukubaki kwa AQP5 pekee. IgG ya seramu ilifungamana kwa mtambuka na AQP4 homolog, na mwitikio wa AQP4 ulikuwa wenye nguvu zaidi katika panya +/A5H kuliko katika panya A5H/A5H. Kufungamana kwa kiwango cha chini na AQP1 kulionekana katika baadhi ya wanyama; baada ya immunization ya PmE-L, kiwango cha juu cha anti-AQP1 kiligunduliwa katika panya wawili wa kike. Kinyume chake, kingamwili ya anti-AQP5A dhidi ya epitopu tofauti “A” ya protini hiyo hiyo ya AQP5 haikuonyeshwa katika panya yeyote. Tofauti hii inaonyesha kwamba, ingawa ureaktivu mtambuka kati ya protini homolog unaweza kuendelea, kuenea kwa ndani ya molekuli kuelekea epitopu tofauti za protini hiyo hiyo hakukutokea katika jaribio hili.

Licha ya viwango vya juu vya kingamwili za anti-AQP5E, matokeo ya histolojia yalikuwa machache. Uingizaji wa limfosaiti katika tezi za mate ulibaki mdogo; focus score ≥1 ilionekana katika panya mmoja tu, na uwekaji wa IgG kwenye tishu uligunduliwa katika panya wachache tu. Kwa hiyo, utafiti hauungi mkono hitimisho kwamba “autoantibody za AQP5 pekee husababisha ugonjwa wa Sjögren”. Modeli hii kimsingi ni modeli ya autoimmunity ya mapema inayochunguza jinsi uigaji wa molekuli unavyoanzisha na kutofautisha mwitikio wa seli B zenye ureaktivu kwa nafsi.

Tatizo kuu la utafiti ni nini?

Wakati wa maendeleo, mfumo wa kinga unaweza kuunda seli B zinazoweza kutambua antijeni za mwili wenyewe. Katika hali za kawaida, mifumo ya uvumilivu kama kufutwa kwa kloni, uhariri wa kipokezi, anergia na uashiriaji wa vipokezi vizuizi huzuia seli hizi kuzalisha autoantibody hatari. Hata hivyo, ikiwa antijeni ya mikrobia inafanana vya kutosha na eneo la protini ya mwili wenyewe, mwitikio unaoanza dhidi ya antijeni ya kigeni unaweza pia kutambua antijeni ya mwili wenyewe. Hali hii huitwa uigaji wa molekuli.

Pengo la kisayansi si swali la “je, uigaji wa molekuli unaweza kusababisha autoimmunity?” pekee. Swali kuu ni jinsi hifadhi ya seli B ambayo mwanzoni hujibu kwa uigaji wa mikrobia inavyoamilishwa na kuanza kutoa mwitikio dhidi ya antijeni za mwili wenyewe, na jinsi mwitikio huo baadaye unavyoweza kupanuka hadi antijeni nyingine za mwili wenyewe. Modeli ya A5H ilitengenezwa ili kufuatilia matukio haya ya mapema katika kiwango cha seli B.

Uigaji wa Molekuli Unawezaje Kuifanya Seli B Kuwa na Ureaktivu kwa Nafsi?

Uigaji wa molekuli unaweza kuruhusu kipokezi cha seli B kutambua kwa nguvu antijeni ya mikrobia huku pia kikitambua epitopu inayofanana ya mwili wenyewe kwa ureaktivu mtambuka wa kiwango cha chini lakini wenye maana; katika modeli ya A5H, seli B zinazotambua kwa upendeleo PmE-L/PmE ziliposhiriki katika mwitikio wa kituo cha kijerminali baada ya immunization, mwitikio dhahiri wa autoantibody dhidi ya AQP5E ulijitokeza.

AQP5 ni nini?

Aquaporin-5 (AQP5) ni mwanachama wa familia ya protini za aquaporin. Utafiti huu unazingatia hasa epitopu “E”, yaani AQP5E, kati ya epitopu mbili za nje ya seli za AQP5 zilizokuwa zimechorwa awali. AQP5A ni epitopu nyingine ya nje ya seli ya protini hiyo hiyo na ilipimwa kama lengo tofauti ili kupima kuenea kwa epitopu ndani ya molekuli.

PmE na PmE-L ni nini?

PmE ni epitopu ya seli B ya mikrobia iliyotokana na aquaporin ya Prevotella melaninogenica na inayoiga AQP5E. Kuna tofauti ya amino asidi moja tu kati ya PmE na AQP5E. PmE-L ni muundo mrefu zaidi wa peptidi uliotumiwa katika immunization ya majaribio, unaojumuisha epitopu za seli B na seli T. Chanzo kinasisitiza kwamba PmE na AQP5E zina epitopu ya seli B pekee, ilhali PmE-L ina epitopu za seli B na T.

BCR ni nini?

B-cell receptor (BCR) ni kipokezi cha utambuzi wa antijeni kwenye uso wa seli B. Kinaweza kuonekana kama umbo la immunoglobulini lililofungamana na utando. Uanuwai wa eneo la BCR linalofungamana na antijeni hutokana na upangaji upya wa jeni za minyororo mizito na mepesi ya immunoglobulini.

VDJ ina maana gani?

Eneo badilifu linalotambua antijeni la mnyororo mzito wa immunoglobulini huundwa kwa upangaji upya wa segmenti za jeni V (variable), D (diversity) na J (joining). Katika utafiti huu, usemi “VDJ knock-in” unamaanisha kuingiza kwa kulengwa mfuatano wa VDJ uliotayarishwa kutoka kwa mnyororo mzito wa kingamwili maalum kwenye lokasi ya asili ya Igh ya panya.

Kwa nini Clone 44 ilichaguliwa?

Clone 44 ni kloni ya kingamwili yenye ureaktivu kwa AQP5E iliyotengwa hapo awali kutoka maktaba ya kingamwili ya phage-display kwa kutumia PmE. Katika eneo badilifu la mnyororo mzito kuna jumla ya mabadiliko saba ya amino asidi yanayotokana na IGHV5-6, IGHD2-3 na IGHJ2; katika eneo badilifu la mnyororo mwepesi kuna mabadiliko manne ya amino asidi yanayotokana na IGKV14–111 na IGKJ4.

IgG rekombinanti inayotokana na Clone 44 hufungamana na PmE na AQP5E, lakini huonyesha ureaktivu wenye nguvu kidogo zaidi kwa PmE. Haifungamani na epitopu isiyohusiana ya AQP5A. Sifa hii hutofautisha modeli hii na modeli ya kawaida ya BCR yenye affinity ya juu moja kwa moja kwa antijeni ya mwili wenyewe: kipokezi cha A5H hupendelea uigaji wa mikrobia huku kikibeba ureaktivu mtambuka kwa AQP5E ya mwili wenyewe.

Panya wa A5H knock-in walitengenezwa vipi?

Mfuatano wa VDJ wa mnyororo mzito uliopatikana kutoka BCR inayofungamana na AQP5E uliwekwa kwenye vekta ya kulenga yenye mikono miwili ya homolojia na kulengwa kwenye lokasi ya Igh ya panya C57BL/6J. Mstari uliopatikana uliitwa A5H. Ujumuishaji sahihi wa kijeni na uhifadhi wa reading frame ulithibitishwa kwa Sanger sequencing ya lokasi lengwa.

Katika PCR genotyping, aleli ya A5H hutoa bidhaa ya jozi 361 za besi, ilhali aleli ya aina ya mwitu hutoa bidhaa ya jozi 234 za besi. Panya wa kiume na wa kike wenye umri wa wiki 6–21 walitumika katika utafiti.

Ili kupunguza uwezekano wa ubadilishaji wa jeni ya mnyororo mzito ndani ya eneo la VH, mabadiliko kimya ya TGT → TGC yalitengenezwa katika eneo la ndani la heptamer. Mabadiliko haya ya nukleotidi, ambayo hayabadili amino asidi inayosimbwa, yalitumiwa kubadilisha ishara ya mfuatano inayohusiana na utaratibu wa VH replacement.

Minyororo mizito na mepesi hujiendesha vipi katika panya A5H?

Wakati seli B katika mstari wa A5H zinaonyesha mnyororo mzito unaotokana na Clone 44, minyororo mepesi huendelea kujipanga upya kwa njia ya asili. Maelezo haya ni muhimu sana, kwa sababu kuoanisha mnyororo mzito uliowekwa na minyororo tofauti ya asili inaweza kutoa sifa tofauti za kufungamana na antijeni katika seli B tofauti licha ya kuwa na mnyororo mzito uleule.

Kulenga mfuatano wa knock-in kwenye lokasi ya asili ya Igh pia huruhusu michakato kama somatic hypermutation, ukomavu wa affinity na ubadilishaji wa isotype, ambayo inaweza kutokea wakati wa kituo cha kijerminali, kufanya kazi ndani ya modeli.

Somatic hypermutation ni nini?

Somatic hypermutation ni mchakato wa kituo cha kijerminali ambapo seli B zilizoamilishwa hutengeneza mabadiliko mengi ya nukta katika jeni za maeneo badilifu ya immunoglobulini. Kati ya lahaja za BCR zinazotokea, seli zinazofungamana vizuri zaidi na antijeni zinaweza kuchaguliwa.

Ukomavu wa affinity ni nini?

Ukomavu wa affinity ni kuongezeka kwa kloni za seli B zinazofungamana na antijeni kwa affinity ya juu zaidi kutokana na somatic hypermutation na uteuzi wakati wa mwitikio wa kituo cha kijerminali. Utafiti huu haukufanya sequencing moja kwa moja ya historia ya mabadiliko ya kila kloni ya kingamwili; hata hivyo, kuanzishwa kwa mfumo wa A5H katika lokasi ya asili ya Igh kunaruhusu michakato hii ya kibayolojia.

Ubadilishaji wa isotype ni nini?

Class-switch recombination au ubadilishaji wa isotype ni mchakato ambapo seli B hubadilisha eneo thabiti la mnyororo mzito wa kingamwili huku kwa kiasi kikubwa ikihifadhi umaalumu wake wa kutambua antijeni. Kwa njia hii, kwa mfano, mwitikio wa aina ya IgM unaweza kubadilika kuwa madarasa ya IgG yenye kazi tofauti za efektor.

Anergia ni Nini na Kwa Nini ni Muhimu katika Panya A5H?

Anergia ya seli B ni utaratibu wa uvumilivu wa pembezoni ambapo seli B inayoweza kutambua antijeni ya mwili wenyewe huwekwa katika hali ya kutoweza kuitikia au kuitikia kwa kiwango kidogo badala ya kuondolewa kabisa kimwili; katika panya A5H, kupungua kwa sehemu ya seli B zilizokomaa zenye IgD⁺IgM^lo inayohusishwa na anergia kunahusishwa na uwezo wa hifadhi kubwa zaidi ya seli B zenye ureaktivu kwa uigaji wa mikrobia na ureaktivu fiche kwa nafsi kujibu immunization.

Je, kufutwa kwa kati kulitokea?

Katika panya A5H, idadi ya jumla ya seli B na uwiano wa seli B zisizokomaa/zilizokomaa ulihifadhiwa kwa kiasi kikubwa katika uboho, wengu na nodi za limfu. Matokeo haya yanaunga mkono kutokuwepo kwa kufutwa kwa kloni kwa kati kwa kiwango kikubwa au kizuizi cha jumla cha maendeleo ya seli B.

Seli B za mpito T1, T2 na T3 ni nini?

Katika utafiti, seli B za mpito zisizokomaa ziliainishwa kwa usemi wa IgM na CD23: seli T1 zilifafanuliwa kama IgM^hiCD23⁻, seli T2 kama IgM^hiCD23⁺, na seli T3 kama IgM^loCD23⁺. Katika panya A5H, uwiano wa seli T1 uliongezeka huku uwiano wa seli T3 ukipungua.

Seli B za follicular na marginal zone ni nini?

Miongoni mwa seli B zilizokomaa katika wengu, seli B za follicular na seli B za marginal zone (MZB) zinawakilisha sehemu tofauti za kinga. Katika utafiti, seli MZB zilifafanuliwa kwa fenotipu IgM^hiCD23⁻, na seli follicular kwa IgM^int/loCD23⁺. Katika panya A5H, sehemu ya MZB ya wengu ilipanuka huku seli B za follicular za wengu zikipungua; seli follicular za nodi za limfu hazikuathiriwa kwa kiasi kikubwa.

Kufungamana kwa antijeni kulipimwa vipi?

Suspension za seli moja ziliandaliwa kutoka uboho, wengu na nodi za limfu na kupitishwa kwenye kichujio cha seli cha 40 μm. Seli B ziliinkubatiwa na PmE-L iliyowekwa alama ya FITC na AQP5E iliyowekwa alama ya Cy5 na kuchambuliwa kwa flow cytometry.

Katika hali ya probe yenye uteuzi wa chini zaidi kama 100 nM, seli zinazofungamana na PmE-L ziliongezeka katika sehemu nyingi za seli B za panya +/A5H na A5H/A5H. Ongezeko la seli zinazofungamana na AQP5E lilikuwa dhahiri hasa katika sehemu za jumla na zilizokomaa za seli B za wengu wa +/A5H.

Katika hali ya probe ya 10 nM inayotoa uteuzi wa juu zaidi, kufungamana kwa PmE-L kulifanana zaidi kati ya genotipu, huku seli B zinazofungamana na AQP5E zikibaki zimeongezeka hasa katika sehemu za marginal zone na follicular za wengu wa +/A5H.

Kwa nini jaribio la ushindani lilifanywa?

Ili kupima kama kufungamana kulikoonekana kwa antijeni iliyowekwa alama ya fluorescent kulitokana kweli na umaalumu unaohusiana na PmE/AQP5E, seli ziliinkubatiwa na PmE au AQP5E isiyowekwa alama kwa kiasi mara kumi zaidi kabla ya probes zilizowekwa alama. PmE ya ziada ilipunguza marudio ya seli zilizogunduliwa kwa probe ya AQP5E, ilhali AQP5E isiyowekwa alama haikuwa na ufanisi kwa kiwango sawa. Waandishi wanatafsiri matokeo haya kuwa kufungamana kwa AQP5E kulikogunduliwa kunaakisi umaalumu wa ureaktivu mtambuka unaotokana na mnyororo mzito wa A5H na wenye affinity ya juu zaidi kwa PmE.

Mwitikio wa Kituo cha Kijerminali Ulichangiaje Uanuwai wa Autoantibody?

Katika panya +/A5H waliochochewa kwa PmE-L, seli B zenye ureaktivu kwa uigaji zilishiriki kwa nguvu zaidi katika sehemu ya kituo cha kijerminali, seli B za kituo cha kijerminali zinazofungamana na AQP5E na plasmablast zinazofungamana na AQP5E ziliongezeka, na sambamba na hilo mwitikio wenye nguvu wa autoantibody za anti-AQP5E ukaibuka.

Kituo cha kijerminali ni nini?

Kituo cha kijerminali (GC) ni eneo maalum la mwitikio wa kimaikroanatomia ndani ya follicle za tishu za limfoidi ambapo seli B zilizoamilishwa huzaliana, hupitia somatic hypermutation katika jeni za immunoglobulini, na huchaguliwa kulingana na sifa zao za kufungamana na antijeni. Katika utafiti, seli B za GC zilifafanuliwa kama GL7⁺CD38⁻ ndani ya seli TCRβ⁻B220⁺CD138⁻.

Plasmablast ni nini?

Plasmablast ni seli ya mapema inayozalisha kingamwili inayotofautiana kutoka seli B iliyoamilishwa kuelekea seli plasma inayotoa kingamwili. Katika utafiti, plasmablast zilifafanuliwa kama CD138⁺ ndani ya idadi ya jumla ya seli B.

Makundi ya jaribio la immunization ya PmE-L

Jaribio hili linajumuisha data iliyounganishwa kutoka majaribio matatu huru. Kingamwili za seramu zilitathminiwa siku ya 13 na 21.

Immunization ilifanywaje?

100 μg ya peptidi PmE-L iliwekwa emulsion kwa uwiano wa 1:1 na incomplete Freund's adjuvant (IFA). Panya walipewa kwa njia ya subcutaneous 50 μl/upande katika pande mbili za msingi wa mkia.

IFA ni nini?

Incomplete Freund's adjuvant ni adjuvant yenye msingi wa mafuta inayosaidia antijeni iliyotolewa kutambuliwa na mfumo wa kinga kwa nguvu zaidi na kwa muda mrefu zaidi. Ilitumika katika utafiti kuwasilisha PmE-L katika hali ya immunization. IFA yenyewe si maambukizi halisi ya binadamu; kwa hiyo, jaribio halipaswi kuchukuliwa kama nakala ya moja kwa moja ya mfiduo wa asili wa mikrobia.

Nini kilipatikana siku ya 13 na 21?

Ingawa kingamwili za anti-PmE-L zilikuwepo katika panya sham +/A5H, mwitikio wa anti-AQP5E kwa ELISA haukugunduliwa. Baada ya immunization ya PmE-L, kingamwili za anti-PmE-L na anti-AQP5E ziliongezeka katika kundi la +/A5H siku ya 13 na 21. Panya wote +/A5H walitengeneza mwitikio wa anti-AQP5E kufikia siku ya 13, na viwango viliongezeka zaidi siku ya 21.

Katika panya wa aina ya mwitu, mwitikio wa anti-AQP5E uligunduliwa kwa panya mmoja tu katika jaribio hilo hilo. Chanzo kinaeleza kwamba katika majaribio ya awali ya modeli, angalau immunization mbili zilihitajika ili kupata mwitikio dhahiri wa anti-AQP5E katika panya wa aina ya mwitu.

Nini kilibadilika katika nodi ya limfu?

Katika draining lymph node, idadi ya jumla ya seli B na marudio ya seli zinazofungamana na AQP5E miongoni mwa seli B zote yalikuwa sawa kati ya makundi. Kinyume chake, marudio ya seli B za GC na marudio ya seli zinazofungamana na AQP5E ndani ya seli B za GC yaliongezeka katika panya +/A5H waliofanyiwa immunization ya PmE-L.

Ingawa marudio ya jumla ya plasmablast yalikuwa chini katika panya +/A5H kuliko katika aina ya mwitu, plasmablast zinazofungamana na AQP5E ziliongezeka. Matokeo haya yanaonyesha kwamba kiasi cha jumla cha plasmablast na uwiano wa plasmablast maalum kwa antijeni lengwa si kitu kilekile.

ELISA hupima nini?

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ni mbinu ya kinga inayotumika kupima kiasi cha kingamwili katika seramu kinachofungamana na antijeni maalum. Katika vipimo vya PmE-L, AQP5E na AQP5A, 0.2 μg ya peptidi iliyobiotinishwa kwa kila well ilifungwa kwenye sahani zilizofunikwa avidin; kwa anti-streptavidin IgG, sahani zilifunikwa na 0.2 μg streptavidin kwa kila well.

Mikondo ya kawaida iliandaliwa kwa kutumia 40–0.625 ng/ml ya IgG1 ya panya. Dilution za seramu zilikuwa 1:3.000–1:10.000 kwa anti-PmE-L na anti-AQP5E, 1:300 kwa anti-AQP5A, na 1:10.000 kwa anti-streptavidin.

Kwa Nini Panya Heterozygous +/A5H Walitoa Mwitikio Wenye Nguvu Zaidi kuliko Panya Homozygous A5H/A5H?

Katika utafiti, panya +/A5H walionyesha mwitikio wa humoral wenye nguvu zaidi kuliko panya A5H/A5H kwa anti-AQP5E, anti-AQP4 na anti-streptavidin; waandishi wanapendekeza kwamba hii inaweza kuhusiana na allelic inclusion inayoruhusu mnyororo mzito wa asili na mnyororo mzito wa A5H kuonyeshwa pamoja na hivyo repertoire pana zaidi ya BCR, lakini utaratibu huu haukuthibitishwa moja kwa moja kwa sequencing ya repertoire.

Allelic exclusion ni nini?

Katika biolojia ya kawaida ya seli B, usemi wa uzalishaji wa kawaida wa aleli moja tu kati ya aleli za mnyororo mzito wa immunoglobulini husaidia seli moja kuwa na umaalumu wa antijeni ulio wa pekee zaidi. Mpangilio huu huitwa allelic exclusion.

Allelic inclusion ni nini?

Allelic inclusion ni hali ambapo zaidi ya aleli moja ya immunoglobulini inaweza kutoa mchango wa kiutendaji ndani ya seli B ileile. Katika hali hiyo, seli inaweza kuonyesha zaidi ya umaalumu mmoja wa kipokezi. Waandishi wanajadili kwamba kuwepo kwa pamoja kwa aleli ya A5H na aleli ya mnyororo mzito ya asili katika panya +/A5H kunaweza kuruhusu repertoire pana zaidi ya antijeni na kusaidia seli zenye ureaktivu kwa nafsi kukwepa kufutwa au anergia.

Hata hivyo, haiwezi kusemwa kwamba “+/A5H ilitoa mwitikio wenye nguvu zaidi, kwa hiyo sababu yake bila shaka ni allelic inclusion”. Chanzo kinaeleza wazi kwamba uhusiano wa sababu bado haujawekwa na kwamba hasa athari ya kizuizi cha repertoire ya mnyororo mzito katika A5H/A5H homozygous inapaswa kuthibitishwa kwa sequencing ya repertoire.

Jaribio la genotipu na jinsia liliundwaje?

Katika hali ya sham, kingamwili za anti-PmE-L ziligunduliwa katika genotipu zote mbili za A5H na zilikuwa juu zaidi katika panya A5H/A5H kuliko katika panya +/A5H; kinyume chake, kingamwili za anti-AQP5E hazikugunduliwa kwa ELISA katika genotipu yoyote.

Baada ya immunization ya PmE-L, miitikio ya anti-PmE-L na anti-AQP5E iliongezeka katika genotipu zote mbili za A5H, lakini kwa ujumla ilionyesha mwelekeo wa kuwa chini katika kundi la A5H/A5H. Panya wawili homozygous waliopata immunization hawakuzalisha mwitikio wa anti-AQP5E. Miitikio ya kingamwili ilikuwa kwa kiasi kikubwa sawa kati ya dume na jike.

Tofauti Kati ya Kuenea kwa Epitopu na Ureaktivu Mtambuka ni Nini?

Katika utafiti huu, ureaktivu mtambuka ulitokea kwa maeneo ya epitopu yanayofanana ya protini homolog AQP5, AQP4 na kwa kiasi AQP1, lakini mwitikio mpya wa kingamwili haukutokea dhidi ya epitopu tofauti AQP5A ya molekuli hiyo hiyo ya AQP5; kwa hiyo, chanzo kinatofautisha wazi kwamba upanuzi wa mwitikio kati ya protini homolog unachukuliwa kama uanuwai wa intermolecular unaoendeshwa na uigaji wa molekuli, ilhali kuenea kwa epitopu ndani ya molekuli ya AQP5 hakukuonyeshwa.

Kuenea kwa epitopu ndani ya molekuli ni nini?

Kuenea kwa epitopu ndani ya molekuli ni kupanuka kwa mwitikio wa kinga kutoka epitopu ya mwanzo hadi epitopu tofauti kwenye protini hiyo hiyo. Katika jaribio hili, epitopu ya mwanzo ya mwili wenyewe ilikuwa AQP5E, na kingamwili dhidi ya epitopu AQP5A ya protini hiyo hiyo ya AQP5 zilitafutwa. Anti-AQP5A haikugunduliwa katika panya yeyote.

Uanuwai wa intermolecular ni nini?

Kupanuka kwa mwitikio kutoka protini moja hadi protini nyingine zinazofanana kimuundo kunaweza kuonekana kama uanuwai wa intermolecular. Katika utafiti, AQP4 na AQP1 zenye mifuatano homolog na eneo la AQP5E zilichunguzwa kwa mtazamo huu.

Ureaktivu mtambuka kwa AQP4 ulithibitishwaje?

Katika vipande vya tezi ya mate, colocalization ya IgG ya seramu na AQP4 ilitathminiwa kwa double immunofluorescence. Kisha assay ya flow cytometry ya seli ilifanywa kwa kutumia seli L929 zinazoonyesha human AQP4-M23-EGFP. Seli parental L929 zilitumiwa kama udhibiti hasi.

Katika hali za sham na immunized, kufungamana kwa AQP4 katika seramu ya +/A5H kulikuwa juu kuliko katika panya A5H/A5H. Immunofluorescence na assay ya seli ziliunga mkono tofauti hiyo hiyo ya jumla ya genotipu.

AQP1 ilipimwaje?

Seli thabiti za HEK293 zinazoonyesha human AQP1 ziliundwa na kufungamana kwa seramu ya panya na seli hizi kulipimwa kwa flow cytometry. Kwa assay ya AQP1, seramu ilipunguzwa kwa uwiano wa 1:20, na kwa assay ya AQP4 kwa uwiano wa 1:200.

Ureaktivu wa kiwango cha chini kwa AQP1 ulionekana katika baadhi ya panya bila kutegemea immunization, genotipu au jinsia. Baada ya immunization ya PmE-L, mwitikio wa juu wa anti-AQP1 ulitokea katika panya wawili wa kike, mmoja +/A5H na mwingine A5H/A5H. Kutokana na uchunguzi huu wawili haiwezi kuhitimishwa kwamba “panya wa kike wana uwezekano mkubwa zaidi wa kuwa na autoantibody za AQP1”; katika uchambuzi wa genotipu-jinsia wa utafiti, miitikio ya kingamwili kwa ujumla ilikuwa sawa kwa kiasi kikubwa kati ya jinsia.

Uhusiano kati ya miitikio ya AQP5 na AQP4

Uhusiano wenye maana ulipatikana kati ya uwepo na ukubwa wa autoantibody zinazofungamana na AQP5 na AQP4: Kendall's Tau-b test p<0.001. Uhusiano huu wa kitakwimu unaunga mkono kwamba miitikio hiyo miwili ya kingamwili hubadilika pamoja; hauonyeshi peke yake kwamba kingamwili moja husababisha nyingine.

Kwa nini AQP4 na AQP1 hazikutoa mwitikio kwa kiwango sawa?

Chanzo kinaeleza kwamba katika eneo homolog na AQP5E, AQP4 hutofautiana na AQP5 kwa amino asidi moja tu, ilhali AQP1 hutofautiana kwa amino asidi mbili. Hata hivyo, viwango vya juu vya anti-AQP1 vilionekana katika baadhi tu ya panya. Waandishi wanajadili kwamba hii inaweza kuhusishwa na tofauti za nasibu katika repertoire ya minyororo mepesi ya kila mnyama na upatikanaji wa antijeni wakati wa maendeleo ya seli B.

Maelezo haya si utaratibu pekee uliothibitishwa moja kwa moja katika jaribio. Hasa, ukweli kwamba AQP1 hupatikana kwa wingi katika seli nyekundu za damu na endothelium ya mishipa unawasilishwa kama tafsiri inayoweza kuchangia kufutwa kwa seli B zenye ureaktivu kwa AQP1 wakati wa maendeleo.

Kwa nini immunofluorescence inaweza kutoa matokeo tofauti na ELISA?

Ingawa colocalization ya IgG ya seramu na AQP5 ilionekana katika immunofluorescence ya tezi ya mate kwa 13 kati ya 24 (%54) ya panya sham A5H, ELISA ya anti-AQP5E ilikuwa hasi. Mbinu hizi mbili hazipimi sifa ileile ya kibayolojia moja kwa moja: ELISA hupima kufungamana na peptidi AQP5E iliyofafanuliwa, ilhali immunofluorescence ya tishu hutathmini ishara ya IgG ya seramu inayolocalize pamoja na AQP5 katika mazingira ya asili ya tishu. Kwa hiyo, chanzo hakikuchukulia uchunguzi huu kuwa sawa na matokeo ya AQP5E ELISA.

Je, Antijeni Immunodominant Kama Streptavidin Iliweza Kuzuia Mwitikio wa A5H?

Katika jaribio la PmE-L lililokompleksishwa na streptavidin, panya wa aina ya mwitu hawakuzalisha anti-AQP5E licha ya mwitikio wenye nguvu wa anti-streptavidin, ilhali panya +/A5H na A5H/A5H waliweza kutengeneza anti-AQP5E; matokeo haya yanaonyesha kwamba seli B zenye ureaktivu kwa uigaji zinazotokana na A5H zinaweza kushiriki katika mwitikio wa kituo cha kijerminali hata chini ya ushindani wa antijeni carrier immunodominant.

Mpangilio huu wa pili wa immunization ulifanywaje?

Panya kwanza walipatiwa prime kwa lysate ya P. melaninogenica, kisha wakapewa boost mara mbili kwa tetramer ya PmE-L iliyokompleksishwa na streptavidin. Miitikio ya kingamwili ilitathminiwa siku ya 24 na 34.

Uwezo wa panya wa aina ya mwitu kuzalisha mwitikio wenye nguvu wa anti-SA bila kuweza kuzalisha anti-AQP5E unaendana na uchunguzi wa awali kwamba mwitikio dhidi ya carrier immunodominant unaweza kukandamiza njia ya autoantibody inayohusiana na PmE-L. Kinyume chake, katika panya A5H, hifadhi ya seli B zenye ureaktivu kwa uigaji iliyokuwa tayari imepanuka ilizalisha anti-AQP5E katika hali hii ya ushindani.

Kutokutokea kwa kingamwili za anti-SA katika panya A5H/A5H kunajadiliwa na waandishi kama matokeo ya kiutendaji yanayowezekana ya kizuizi kikubwa sana cha repertoire ya BCR. Hata hivyo, sequencing ya repertoire ya BCR inahitajika kuthibitisha hili.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Vipengele vya msingi vya modeli ya majaribio

Ukubwa wa sampuli ulipangwaje?

Ukubwa wa sampuli ulihesabiwa kulingana na data kutoka jaribio la majaribio au seti za kwanza za majaribio. Katika hesabu, kiwango cha umuhimu α=0.05 na nguvu ya kitakwimu %80 zilitumika. Kwa upangaji, wastani na standard deviation za marudio ya seli AQP5E⁺ katika panya +/+ na +/A5H pamoja na viwango vya autoantibody za anti-AQP5E katika +/A5H baada ya immunization vilitumika.

α=0.05 ina maana gani?

α=0.05 ni kizingiti cha %5 kilichowekwa mapema kwa uwezekano wa kupata matokeo ya uongo-chanya wakati null hypothesis ni kweli katika kanuni ya uamuzi wa kitakwimu ya utafiti. Thamani hii haimaanishi kwamba kila p-value iliyopatikana ni “sahihi kwa uwezekano wa %95”.

Nguvu ya kitakwimu ya %80 ina maana gani?

Nguvu ya %80 inamaanisha kwamba katika upangaji wa sampuli, ikiwa athari na variability zinazodhaniwa zipo kweli, lengo ni kwamba mtihani wa kitakwimu uwe na uwezekano wa takriban %80 wa kugundua athari hiyo katika kiwango cha α kilichowekwa. Chanzo hakiripoti fomula kamili ya effect size iliyotumika katika hesabu ya sampuli; kwa hiyo Verianla haitengenezi mlinganyo wa namba wa nguvu ambao haupo katika chanzo.

Mantiki ya gating ya flow cytometry

Kwanza eneo la seli hai lilichaguliwa kwa FSC-A na SSC-A, doublets zikaondolewa kwa FSC-A/FSC-H, na seli zilizokufa zenye Ghost Dye positive zikaondolewa.

Ujumbe mkuu wa Figure 1 na Figure 2

Katika Figure 1, panya n=6 kwa kila genotipu — dume wanne na jike wawili — walitathminiwa katika majaribio mawili huru. Wakati maendeleo ya jumla ya seli B yalihifadhiwa, mgawanyo wa T1/T3, sehemu inayohusishwa na anergia, na uwiano wa MZB/seli B za follicular wa wengu ulibadilika.

Figure 2 inaonyesha mgawanyo wa seli B zinazofungamana na AQP5E na PmE-L. Wakati hifadhi ya seli zenye ureaktivu kwa PmE-L ilipanuka kwa aleli ya A5H, kuongezeka kwa seli zinazotambua kwa dhahiri AQP5E ya mwili wenyewe hasa katika sehemu zilizokomaa za wengu wa heterozygous +/A5H ni moja ya sifa muhimu za modeli. Fenotipu inayohusishwa na anergia ndani ya seli B zilizokomaa zinazofungamana na AQP5E pia ilipungua katika panya A5H.

Histolojia ya tishu ilitathminiwaje?

Tezi za mate za submandibular ziliwekwa fixation katika %4 paraformaldehyde kwa 4 °C kwa saa 24, zikaingizwa paraffin, na vipande vya 4 μm vikapakwa H&E ili kuchunguza infiltration ya limfosaiti.

Kwa immunofluorescence, tishu ziliwekwa fixation katika Zinc Fixative usiku kucha kwa 4 °C, zikafanyiwa cryoprotection kwa %10–30 sucrose na kuingizwa OCT. Vipande vilivyogandishwa vya 10 μm viliwekwa fixation katika acetone baridi sana kwa dakika 10.

Kwa AQP5 au AQP4, vipande viliinkubatiwa usiku kucha kwa 4 °C na kingamwili za msingi za sungura zinazohusika pamoja na seramu ya panya iliyopunguzwa 1:10; baadaye zikawekewa kingamwili za sekondari za fluorescent. Picha zilipatikana kwa microscope ya confocal Carl Zeiss LSM980 kwa magnification 400×.

Mfumo wa alama wa immunofluorescence

Kufungamana kwa IgG kulitathminiwa kwa upofu kwa scale ya hatua sita kutoka 0–5. Alama ilitegemea kiwango ambacho ishara ya fluorescence ilibaki kugundulika wakati threshold ya brightness ya picha ilipobadilishwa. Hivyo, tathmini ya nusu-kiasi ilifanywa kwa hatua za threshold zilizofafanuliwa mapema badala ya kutegemea tu hisia ya mtazamaji ya “kung'aa/dhaifu”.

Assay ya seli ya AQP4

Seli za fibroblast za panya L929 zinazoonyesha kwa uthabiti human AQP4-M23-EGFP zilitengenezwa kwa lentiviral vector na kudumishwa chini ya uteuzi wa puromycin. Seli parental L929 zilikuwa udhibiti hasi. Seli ziliinkubatiwa kwa saa moja na seramu iliyopunguzwa 1:200.

Assay ya seli ya AQP1

Seli za HEK293 zinazoonyesha human AQP1 zilitransfectiwa kwa vector pEGFP-N1-AQP1 na kuchaguliwa kwa G418. Seli 1 × 10⁶ ziliinkubatiwa kwa saa moja na seramu iliyopunguzwa 1:20, kisha zikapakwa kingamwili ya sekondari ya fluorescent.

Mtiririko wa uamuzi wa kitakwimu

Normality ya mgawanyo wa data ilitathminiwa kwa Shapiro–Wilk test. Katika kulinganisha makundi mawili, unpaired two-sided t-test ilitumika; wakati F test ilionyesha kwa p<0.05 kwamba variances hazikuwa sawa, marekebisho ya Welch yalitumika.

Katika kulinganisha zaidi ya makundi mawili, one-way ANOVA na Tukey multiple-comparison test zilitumika. Wakati Brown–Forsythe test ilionyesha variance zisizo sawa kwa p<0.05, Brown–Forsythe na Welch ANOVA zilitumika badala ya ANOVA ya kawaida; Dunnett T3 test ilitumika katika post hoc comparisons.

Kizingiti cha umuhimu wa kitakwimu kilikuwa p<0.05 na data ziliwasilishwa kama wastani ± standard deviation.

Shapiro–Wilk test hukagua nini?

Shapiro–Wilk test hutumika kutathmini ulinganifu wa data ya sampuli na normal distribution. Jukumu lake si kuonyesha uwepo wa athari ya kibayolojia, bali kusaidia kutathmini dhana ya mgawanyo ya mbinu za kulinganisha za parametric.

Kwa nini marekebisho ya Welch hutumiwa?

t-test ya kawaida inaweza kutegemea dhana kwamba variances za makundi mawili ni sawa. Zinapokuwa tofauti, mbinu ya Welch hurekebisha degrees of freedom ipasavyo na kutoa ulinganisho unaofaa zaidi.

ANOVA hupima nini?

One-way ANOVA hupima null hypothesis kwamba wastani wa makundi matatu au zaidi yote ni sawa. ANOVA inapokuwa significant, post hoc tests kama Tukey hutumika kubaini ni makundi gani yanayotofautiana. Wakati usawa wa variance ulivunjika, Brown–Forsythe/Welch ANOVA na Dunnett T3 zilipendelewa katika utafiti.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• Mnyororo mzito wa A5H unaweza kuunda hifadhi ya seli B zinazotambua kwa upendeleo PmE/PmE-L ya mikrobia na kubeba ureaktivu mtambuka kwa AQP5E.
• Katika panya A5H, idadi ya jumla ya seli B na ukomavu wa msingi huhifadhiwa huku sehemu ya pembezoni ya seli B inayohusishwa na anergia ikipungua.
• Immunization ya PmE-L huchochea mwitikio wenye nguvu wa autoantibody za anti-AQP5E katika panya +/A5H.
• Seli B zenye ureaktivu kwa uigaji hushiriki katika miitikio ya kituo cha kijerminali na seli B za GC zinazofungamana na AQP5E pamoja na plasmablast huongezeka.
• Panya +/A5H huonyesha mwitikio wenye nguvu zaidi wa anti-AQP5E na anti-AQP4 kuliko panya A5H/A5H.
• Mwitikio unaohusiana na AQP5E unaweza kuonyesha ureaktivu mtambuka kwa AQP4 homolog na, katika baadhi ya panya, AQP1.
• Kwa sababu kingamwili dhidi ya AQP5A hazikutokea, kuenea kwa epitopu ndani ya molekuli katika protini hiyo hiyo ya AQP5 hakukuonyeshwa.
• Panya A5H wanaweza kutengeneza mwitikio wa anti-AQP5E hata katika uwepo wa antijeni carrier immunodominant kama streptavidin.
• Licha ya viwango vya juu vya autoantibody zinazozunguka, uwekaji wa tishu na patholojia ya limfosaiti katika tezi ya mate ni mdogo.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono

• Haijaonyeshwa kwamba panya A5H ni modeli kamili ya ugonjwa wa Sjögren.
• Haijaonyeshwa kwamba autoantibody ya anti-AQP5E pekee inatosha kusababisha uharibifu wa tezi ya mate.
• Haijathibitishwa moja kwa moja kwamba allelic inclusion ndiyo sababu ya uhakika ya mwitikio wenye nguvu katika panya heterozygous.
• Sababu ya uhakika ya kutokuwepo kwa anti-SA katika panya A5H/A5H bado haijathibitishwa kuwa ni kizuizi cha repertoire kwa sequencing ya repertoire.
• Haijajaribiwa moja kwa moja ni antijeni gani ya mwili wenyewe au utaratibu gani wa repertoire unaosababisha fenotipu ya chini ya anergia katika seli zinazofungamana na AQP5E.
• Kwa sababu mwitikio wa AQP5A haukutokea, kuenea kwa jumla kwa ndani ya molekuli hadi epitopu nyingine za molekuli AQP5 hakukuonyeshwa.
• Kuonekana kwa mwitikio wa juu wa AQP1 katika panya wawili tu wa kike hakuthibitishi utaratibu wa jumla unaotegemea jinsia.
• Matokeo ya modeli ya panya hayathibitishi kwamba uigaji wa molekuli kwa binadamu husababisha ugonjwa wa autoimmune kwa mlolongo na ukubwa uleule.
• Utafiti huu haupimi hatari ya ugonjwa au athari ya matibabu ya kliniki kwa binadamu waliopata maambukizi.

Nguvu za utafiti

Nguvu ya kwanza ni mfumo maalum wa knock-in ambao, tofauti na modeli za kawaida za BCR autoreactive zinazotambua moja kwa moja antijeni ya mwili wenyewe yenye affinity ya juu, huchunguza seli B zinazotambua kwa upendeleo uigaji wa mikrobia lakini zina ureaktivu fiche kwa nafsi.

Nguvu ya pili ni kwamba hatua nyingi za mwanzo wa autoimmunity — kutoka maendeleo ya seli B hadi mwitikio wa kituo cha kijerminali, autoantibody za seramu, kufungamana na tishu na ureaktivu mtambuka kwa aquaporin homolog — zilichunguzwa katika modeli moja.

Nguvu ya tatu ni uwezekano wa kuchunguza nadharia za uanuwai wa BCR na allelic inclusion/kizuizi cha repertoire kwa kulinganisha genotipu +/A5H na A5H/A5H.

Nguvu ya nne ni kwamba ureaktivu mtambuka wa AQP4 ulitathminiwa si kwa immunofluorescence ya tishu pekee bali pia kwa assay ya seli inayoonyesha AQP4.

Mapungufu makuu ya utafiti

Kutokuwepo kwa patholojia ya tishu yenye maana ya kliniki: Chanzo kinaeleza hili wazi kama mojawapo ya mapungufu makuu ya modeli. Licha ya mwitikio mkubwa wa autoantibody, patholojia dhahiri ya tezi ya mate inayofanana na Sjögren haikutokea.

Kutothibitishwa kwa utaratibu wa sababu wa allelic inclusion: Mwitikio wenye nguvu zaidi katika panya +/A5H unaendana na allelic inclusion, lakini utaratibu haukuonyeshwa kwa sequencing ya moja kwa moja ya repertoire ya BCR.

Chanzo cha utaratibu wa anergia hakijulikani: Haijajaribiwa moja kwa moja kama fenotipu ya anergia katika seli B zilizokomaa zinazofungamana na AQP5E inatokana na antijeni mbadala za mwili wenyewe au na mnyororo mzito uliowekwa unaopunguza uanuwai wa repertoire.

Kuenea kwa epitopu ndani ya molekuli hakukuonekana: Immunization ya PmE-L haikuzalisha kingamwili za AQP5A. Katika hali hii ya majaribio, modeli haizalishi upya kuenea kwa epitopu kwa upana kuelekea antijeni kamili ya mwili wenyewe AQP5.

Kikomo cha modeli ya mnyama: Jaribio lilifanywa katika modeli ya panya iliyodhibitiwa na katika hali ya immunization inayosaidiwa na adjuvant. Halipimi moja kwa moja mwanzo wa asili au maendeleo ya kliniki ya ugonjwa wa autoimmune kwa binadamu.

Kwa nini modeli hii ni tofauti na modeli za kawaida za BCR autoreactive?

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Kichwa asili: Aquaporin-5–specific heavy chain VDJ knock-in (A5H) mice reveal molecular mimicry–driven initiation and diversification of autoreactive B-cell responses.

Waandishi na mpangilio: Hyunjin Kim, Nayoon Lee, Sabin Acharya, Sungmin Kim, Youngnim Choi.

Mchango sawa: Chanzo hakina tamko la mchango sawa au waandishi wenza wa kwanza.

Mwandishi wa mawasiliano: Youngnim Choi.

Taasisi 1: Department of Immunology and Molecular Microbiology in Dental Sciences, Seoul National University and Dental Research Institute, Seoul, Republic of Korea.

Taasisi 2: Department of Translational Medicine, College of Medicine, Seoul National University, Seoul, Republic of Korea.

Taasisi 3: Department of Neurology, Seoul National University Hospital, Seoul, Republic of Korea.

Taasisi 4: Department of Neurology, College of Medicine, Seoul National University, Seoul, Republic of Korea.

Jarida: Frontiers in Immunology.

Sehemu: Autoimmune Disorders.

Mchapishaji/jukwaa: Frontiers / Frontiers Media SA.

Juzuu / nambari ya makala: 17:1866158.

DOI: 10.3389/fimmu.2026.1866158.

Received: 27 Aprili 2026.

Revised: 30 Mei 2026.

Accepted: 18 Juni 2026.

Published: 2 Julai 2026.

Aina ya chanzo: Original Research; utafiti wa majaribio wa immunolojia ya wanyama na modeli ya kijeni ya knock-in.

Hali ya peer-review: Ni makala ya utafiti iliyochapishwa na kupitiwa na wataalamu. Kwenye ukurasa wa chanzo, Gunnar Houen ameorodheshwa kama editor; Chandrani Thakur na Jin Hu kama reviewers.

Hali ya preprint: Chanzo kilichotolewa ni makala iliyochapishwa ya Frontiers. Hakuna utambulisho tofauti wa preprint uliotajwa katika hati iliyotolewa.

Leseni: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Modeli kuu: Mstari wa panya A5H wenye VDJ knock-in ya mnyororo mzito wenye ureaktivu mtambuka kwa epitopu E ya aquaporin-5 kwenye background ya C57BL/6J.

Genotipu za modeli: Aina ya mwitu +/+, heterozygous +/A5H na homozygous A5H/A5H.

Uthibitishaji wa modeli: PCR genotyping na Sanger sequencing katika lokasi lengwa ya Igh.

Kiwango cha umri wa wanyama wa majaribio: Wiki 6–21; katika majaribio maalum zilitumika safu nyembamba zaidi za umri.

Antijeni: PmE-L iliyotokana na aquaporin ya Prevotella melaninogenica; PmE-L ina epitopu za seli B na T, ilhali PmE na AQP5E zina epitopu ya seli B pekee.

Immunization ya kawaida ya PmE-L: 100 μg PmE-L, incomplete Freund's adjuvant kwa uwiano wa 1:1; 50 μl/upande subcutaneous katika pande mbili za msingi wa mkia.

Tetramer ya streptavidin: Streptavidin na PmE-L iliyobiotinishwa zilichanganywa kwa uwiano wa molar 1:4; ziliinkubatiwa dakika 30 kwenye joto la chumba na kisha usiku kucha kwa 4 °C; zikachakatwa kwa kichujio cha 50-kDa Amicon.

Upakaji wa ELISA: Kwa PmE-L/AQP5E/AQP5A, 0.2 μg/well ya peptidi iliyobiotinishwa; katika kipimo cha anti-SA, 0.2 μg/well streptavidin.

Mkondo wa kawaida wa ELISA: 40–0.625 ng/ml ya IgG1 ya panya.

Dilution za seramu: anti-PmE-L 1:3.000–1:10.000; anti-AQP5E 1:3.000–1:10.000; anti-AQP5A 1:300; anti-SA 1:10.000.

Probe ya antijeni: FITC-PmE-L na Cy5-AQP5E kwa Flow cytometry; 100 nM na 10 nM katika uchambuzi teule wa high-stringency.

Ushindani: Pre-incubation kwa dakika 30 kwa 4 °C na kiasi mara kumi zaidi cha PmE au AQP5E kabla ya probe iliyowekwa alama.

Flow cytometer: BD LSR Fortessa X-20; katika uchambuzi wa seli wa AQP4/AQP1, BD FACS Symphony A5 SE au Fortessa X-20.

Programu ya uchambuzi: FlowJo v10.10.0; FlowJo katika assays za seli.

Histolojia ya tishu: Tezi ya mate ya submandibular; %4 paraformaldehyde, 4 °C, saa 24; paraffin; kipande cha 4 μm H&E.

Immunofluorescence: Zinc Fixative, 4 °C usiku kucha; %10–30 sucrose; OCT; kipande kilichogandishwa cha 10 μm; dakika 10 katika acetone; blocking kwa 5% BSA + 10% horse serum.

Kingamwili msingi ya AQP5: 1:200.

Kingamwili msingi ya AQP4: 1:100.

Seramu ya immunofluorescence: 1:10.

Microscope ya confocal: Carl Zeiss LSM980, 400×.

Assay ya seli ya AQP4: Seli L929 zinazoonyesha human AQP4-M23-EGFP; parental L929 kama udhibiti hasi; seramu 1:200.

Assay ya seli ya AQP1: Seli HEK293 zinazoonyesha human AQP1; seramu 1:20.

Idadi ya seli: Seli 1 × 10⁶ katika assays za AQP4/AQP1.

Programu ya takwimu: GraphPad Prism 9.0.

Normality: Shapiro–Wilk.

Makundi mawili: Unpaired two-sided t-test; marekebisho ya Welch wakati variance si sawa.

Zaidi ya makundi mawili: One-way ANOVA + Tukey; ikiwa Brown–Forsythe itaonyesha variance zisizo sawa, Brown–Forsythe/Welch ANOVA + Dunnett T3.

Kizingiti cha umuhimu: p<0.05.

Uwasilishaji: Wastani ± standard deviation.

Uchambuzi wa ziada wa uhusiano: Kendall's Tau-b kati ya autoantibody zinazofungamana na AQP5 na AQP4; p<0.001.

Mpango wa sampuli: α=0.05 na nguvu ya %80; ulitegemea marudio ya seli AQP5E⁺ na viwango vya autoantibody za anti-AQP5E katika data ya pilot/majaribio ya kwanza.

Hali ya fomula ya hisabati: Chanzo hakina mlinganyo wa wazi wa hisabati uliotumika kuzalisha matokeo ya kisayansi. Verianla haijaongeza fomula ambayo haipo katika chanzo.

Idhini ya maadili: Seoul National University Animal Care and Use Committee; No. SNU-21104-2-6.

Upatikanaji wa data: Imeelezwa kwamba michango ya awali ya utafiti inapatikana ndani ya makala na Supplementary Material; maswali ya ziada yanaweza kuelekezwa kwa mwandishi wa mawasiliano.

Ufadhili: National Research Foundation of Korea Basic Science Research Program Grant, #RS-2024-00342340; ulifadhiliwa na Republic of Korea Ministry of Science & ICT.

Mgongano wa maslahi: Waandishi wameripoti kutokuwa na uhusiano unaoweza kusababisha mgongano wa kibiashara au kifedha. Youngnim Choi aliripoti kuwa mwanachama wa Frontiers editorial board wakati wa kuwasilisha; kulingana na chanzo, hali hii haikuathiri mchakato wa peer-review au uamuzi wa mwisho.

Michango ya waandishi: Hyunjin Kim — data curation, formal analysis, investigation, writing-original draft; Nayoon Lee — investigation, writing-review & editing; Sabin Acharya — investigation, writing-review & editing; Sungmin Kim — supervision, writing-review & editing; Youngnim Choi — conceptualization, formal analysis, funding acquisition, supervision, writing-review & editing.

Tamko la Generative AI: Waandishi wameripoti kwamba walitumia generative AI si kwa kuzalisha data au kufanya majaribio, bali kutafuta marejeo yanayofaa kusaidia tafsiri ya data na kurekebisha/polish Kiingereza. Frontiers pia inaeleza kwamba alt text za figures zinaweza kuundwa kwa msaada wa akili bandia na kupitiwa na waandishi kadiri iwezekanavyo.

Kikomo kikuu cha tafsiri: Katika panya A5H, uigaji wa molekuli ulizalisha mwitikio wenye nguvu wa autoantibody na ureaktivu mtambuka kwa aquaporin homolog; hata hivyo, autoantibody zinazozunguka pekee hazikusababisha patholojia dhahiri ya tezi ya mate inayofanana na Sjögren.

Kikomo cha pili muhimu: Mwitikio wenye nguvu zaidi katika panya +/A5H unaendana na allelic inclusion lakini si ushahidi wa sababu wa moja kwa moja; sequencing ya repertoire inahitajika.

Kikomo cha tatu muhimu: Kwa sababu mwitikio wa Anti-AQP5A haukupatikana, kuenea kwa epitopu ndani ya molekuli kwenye native AQP5 hakukuonyeshwa katika jaribio hili.