Hidrolisati ya protini ya samaki ni mchanganyiko wa asili ya protini unaotokana na kuvunjwa kwa protini kuwa peptidi ndogo na aminoasidi. Utafiti huu ulichunguza moja kwa moja katika mazingira ya maabara shughuli ya uzuiaji wa α-glukosidasi na shughuli ya antibakteria dhidi ya bakteria wanne wanaosababisha magonjwa ya hidrolisati zilizotokana na uchachushaji wa tishu za misuli na ngozi, ambazo ni bidhaa za pembeni za uchakataji wa Scomberomorus commerson, kwa kutumia Pediococcus pentosaceus IL13; ukatenganisha kwa ultrafiltration sehemu za peptidi za <30, <10 na <3 kDa; na ukatathmini sifa zinazowezekana za kibayolojia za peptidi zilizochaguliwa kwa uchambuzi wa peptidomiki unaotegemea LC-HRMS na majukwaa mengi ya in silico prediction. Thamani ya chini zaidi ya crude-hydrolysate IC₅₀ ilipatikana katika kundi la FXH, linalojumuisha mchanganyiko wa misuli+ngozi, ikiwa 34,692±1,355 mg/mL. Sehemu za <3 kDa zilijitokeza katika uzuiaji wa α-glukosidasi na hasa katika shughuli ya antibakteria dhidi ya Listeria monocytogenes. Hata hivyo, utabiri wa kompyuta kuhusu kama peptidi ni za kupambana na kisukari, za antimicrobial, zenye sumu au zenye allergenicity si ushahidi wa ufanisi au usalama wa kliniki.

Kwa uzuiaji wa α-glukosidasi, sehemu za <3 kDa zilionyesha inhibition ya takribani %79,45, %78,03 na %79,03 katika FMH, FSH na FXH mtawalia. Katika uchambuzi wa dose-response wa freeze-dried crude hydrolysate, thamani ya IC₅₀ ya FXH ilikuwa 34,692±1,355 mg/mL, ya FSH 36,643±1,384 mg/mL na ya FMH 46,541±1,228 mg/mL. IC₅₀ ya chini humaanisha kwamba %50 inhibition ilipatikana kwa concentration ya chini ndani ya mfumo huohuo wa majaribio na hivyo huashiria uwezo mkubwa zaidi wa uzuiaji.

Katika majaribio ya antibakteria, sehemu za <3 kDa zilitengeneza inhibition zones kubwa hasa dhidi ya L. monocytogenes: FSH 23,17±1,89 mm, FMH 22,50±0,50 mm na FXH 21,83±1,76 mm. Salmonella typhi kwa ujumla ilionyesha unyeti mdogo zaidi. Thamani hizi ni vipenyo vya zone kutoka jaribio la agar-well diffusion; si minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) wala ufanisi wa antibiotiki kwa binadamu.

Utafiti unaotegemea LC-HRMS ulipeleka sequence wakilishi 35 kutoka peptide sequence 211 kwenye tathmini ya kina ya in silico kwa msingi wa relative abundance. Katika PeptideRanker, SPAMPVPGPMGPMGPR ilipata general bioactivity score ya juu zaidi ya 0,926; katika AntiT2DMP-Pred peptidi hiyo hiyo ilionyesha thamani ya juu zaidi ya type-2-antidiabetic prediction ya 0,811. AVFPSIVGRPR ilipewa kipaumbele na chanzo kama antimicrobial candidate yenye nguvu kwa sababu ilipata uainishaji chanya katika zaidi ya jukwaa moja la antimicrobial prediction. Matokeo haya ni kwa ajili ya uchaguzi wa wagombea; si ushahidi wa ufanisi wa dawa.

Maelezo ya Kina

Tatizo kuu la utafiti

Sekta ya uchakataji wa samaki inaweza kuzalisha kiasi kikubwa cha mabaki ya kibayolojia kutoka vipande vya misuli, ngozi, mifupa, vichwa, viungo vya ndani na bidhaa nyingine za pembeni. Sehemu kubwa ya bidhaa hizi za pembeni ina protini nyingi. Njia kuu ya utafiti ni kubadilisha nyenzo hizi za protini zenye thamani ndogo au zinazochukuliwa kuwa taka kuwa peptidi ndogo zinazoweza kuonyesha shughuli za kibayolojia kupitia uchachushaji wa microbial, na hivyo kuchangia kwa wakati mmoja katika matumizi bora ya taka na ugunduzi wa viambato vinavyoweza kuwa functional.

Utafiti huu unalenga hasa shughuli mbili za kibayolojia:

• uchunguzi wa awali wa uwezo unaowezekana wa kupambana na kisukari kupitia uzuiaji wa enzyme ya α-glukosidasi,
• shughuli ya antibakteria dhidi ya bakteria Gram-positive na Gram-negative.

Zaidi ya hayo, kwa kuongeza tabaka la LC-HRMS peptidomics na in silico prediction, ilichunguzwa ni peptide sequences zipi zinaweza kupewa kipaumbele kwa uthibitishaji wa kina wa majaribio.

Makundi matatu ya hidrolisati yana maana gani?

Nyenzo ya samaki ilitoka wapi?

Bidhaa za pembeni za uchakataji wa Scomberomorus commerson zilipatikana Januari 2025 kutoka Muara Baru Fish Market, Penjaringan, Jakarta, Indonesia. Chanzo kinatoa viwianishi 6°06′36″S, 106°48′06″E.

Nyenzo ilikuwa na:

• skin,
• fragmented flesh,
• softened meat,
• mechanically damaged muscle tissues kama ruptured abdominal portions

.

Sampuli zilioshwa na kuhomojenishwa kwa blender na meat grinder; zikafungwa na kuwekwa lebo, zikahifadhiwa kwa −4°C katika saa 24–48 za kwanza, zikasafirishwa kwa chilled insulated ice boxes na kuhifadhiwa kwa −20°C kabla ya uchambuzi.

Kwa nini Pediococcus pentosaceus IL13 ilitumika?

Pediococcus pentosaceus IL13 ndiyo microorganism ya uchachushaji ya utafiti. Chanzo kinaeleza kwamba bakteria huyu wa lactic acid alipatikana kutoka Microbial Bioprospecting Laboratory, Research Center for Biotechnology, IPB University.

Mantiki ya kisayansi ya uchachushaji ni kwamba microorganisms na michakato inayohusiana ya proteolytic inaweza kuvunja miundo mikubwa ya protini kuwa peptide fragments ndogo. Baadhi ya bioactive peptide sequences ambazo hapo awali hazikuwa rahisi kufikiwa ndani ya protini zinaweza kuachiliwa kupitia mchakato huu wa proteolysis/hydrolysis.

Uchachushaji ulifanywaje?

P. pentosaceus IL13 glycerol stock kwanza iliamilishwa tena katika MRS broth kwa 37°C kwa saa 24.

Kisha:

1. Ilistreakiwa kwenye MRS agar plate.
2. Iliinkubatiwa kwa 37°C kwa saa 48.
3. Colony moja ilihamishwa kwenda 10 mL MRS broth na kukuzwa kwa 37°C kwa saa 24.
4. Ili kuandaa starter culture, 1 mL kutoka pre-culture hii ilichukuliwa na kuingizwa kwenye 100 mL fresh MRS broth.
5. Experimental group tatu ziliandaliwa: muscle, skin na 1:1 muscle+skin.
6. 10 g ya nyenzo kutoka kila kundi iliwekwa katika 50 mL Falcon tube tofauti.
7. 40 mL %10 (w/v) glucose solution iliongezwa.
8. Sampuli zilisterilishwa kwa 121°C kwa dakika 15.
9. 400 μL ya P. pentosaceus IL13 culture iliinoculatewa kwenye kila sampuli.

Muda wa submerged fermentation ulikuwa siku nne kwa muscle na mixed samples, na siku tano kwa skin.

Hidrolisati zilivunwa katika hatua ya optimal growth curve ya P. pentosaceus IL13. Supernatant ilitenganishwa kwa centrifugation kwa 14.000×g kwa dakika 30 katika 4°C; liquid hydrolysate ilihifadhiwa kwa −20°C.

Kwa Nini Ultrafiltration Iliifanya Sehemu ya <3 kDa Kujitokeza?

Ultrafiltration ni njia ya fractionation inayotenganisha molekuli katika hidrolisati kwa kuzipitisha kwenye membranes kulingana na ukubwa wao wa molekuli wa takribani; katika utafiti huu membranes za 30, 10 na 3 kDa molecular-weight-cutoff zilitumika, na <3 kDa permeate, kama sehemu yenye utajiri wa peptidi ndogo, ilionyesha matokeo yenye nguvu zaidi katika uzuiaji wa α-glukosidasi na katika sehemu muhimu ya majaribio ya antibakteria.

kDa ina maana gani?

kDa ni kitengo cha kilodalton. Dalton ni kitengo cha molekular mass; 1 kDa ni takribani 1.000 Da. Kauli “<3 kDa fraction” katika utafiti huu inaeleza eneo la molecular weight chini ya takribani 3 kilodalton linaloweza kupita kwenye ultrafiltration membrane iliyotumika.

Kauli hii haimaanishi kwamba peptidi zote zina ukubwa sawa; inaeleza molecular-weight range.

Masharti ya ultrafiltration

Mfumo wa Amicon Ultra-15, Millipore ultrafiltration na membranes za MWCO za 30, 10 na 3 kDa mtawalia zilitumika.

Fractionation:

5.000×g, dakika 30, 10°C

ilifanywa chini ya masharti hayo.

Chanzo kinafafanua sehemu kama:

• F-I: <30 kDa,
• F-II: <10 kDa,
• F-III: <3 kDa

.

Sehemu zilizokusanywa zilihifadhiwa kwa −20°C kabla ya bioactivity evaluation.

Kwa Nini Uzuiaji wa α-Glukosidasi Unachunguzwa Kama “Uwezo wa Kupambana na Kisukari”?

α-Glukosidasi ni mojawapo ya enzyme zinazobadilisha miundo midogo ya sukari kuwa glukosi katika hatua za mwisho za usagaji wa wanga; kiwanja kinachoweza kupunguza kasi ya shughuli ya enzyme kinaweza kutathminiwa katika maabara kama mgombea wa kupunguza kutengenezwa kwa postprandial glucose, lakini uzuiaji wa α-glukosidasi katika utafiti huu ni in vitro enzyme assay pekee na hauthibitishi kupungua kwa sukari ya damu kwa binadamu.

Vipengele vya jaribio la α-glukosidasi

Chanzo kilitumia α-glukosidasi kutoka Saccharomyces cerevisiae katika assay.

Kwa kila reaction system:

• 50 μL diluted hydrolysate sample,
• 30 μL phosphate buffer, pH 6,8,
• 60 μL p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG),
• 60 μL α-glucosidase enzyme solution

ilitumika.

Reaction iliendelea kwa dakika 30 katika 37°C, kisha kwa kila well:

60 μL 200 mM Na₂CO₃

iliongezwa ili kusimamisha reaction.

Absorbance ilipimwa kwa 405 nm kwa microplate spectrophotometer.

pNPG na pNP zinafanya kazi gani?

pNPG ni chromogenic substrate ambayo α-glukosidasi inaweza kuvunja. Enzyme inapohydrolyze pNPG, hutengeneza p-nitrophenol (pNP), mojawapo ya bidhaa zenye rangi zinazoweza kupimwa.

Kwa hiyo mantiki ya msingi ni:

α-glukosidasi hai zaidi → pNP nyingi zaidi hutengenezwa.

Uzuiaji wenye nguvu zaidi wa α-glukosidasi → pNP kidogo zaidi hutengenezwa.

Chanzo kiliandaa 0–500 ppm pNP standard curve na kutumia linear regression na absorbance ya 405 nm:

\[ R^2>0.99 \]

Calibration curve hii ilitumika kubadilisha absorbance iliyopimwa kuwa pNP concentration.

Chanzo hakiandiki formula wazi ya asilimia ya pNP inhibition. Kwa hiyo Verianla haiongezi assay equation ambayo haipo kwenye chanzo kana kwamba ni “formula ya makala”.

Controls

Katika α-glukosidasi assay:

• Acarbose 100 ppm positive control,
• Sterile distilled water negative control

zilitumika.

Pia, control system isiyo na enzyme iliandaliwa kwa baseline absorbance correction.

Table 1: Kwa nini utengenezaji wa pNP ni muhimu?

Katika makundi yote matatu ya hidrolisati, pNP production kwa ujumla ilipungua kadiri molecular-weight fraction ilivyokuwa ndogo. pNP concentration ya chini zaidi ilikuwa 37,323 ppm katika kundi la FMH <3 kDa. Kupungua kwa pNP kunaendana, katika mantiki ya assay, na α-glukozidasi inhibition ya juu zaidi.

Katika ulinganisho huu, chanzo kinaonyesha statistical differences katika kiwango cha p<0,05 kwa superscript letters tofauti.

Thamani ya IC50 Inapaswa Kutafsiriwaje?

IC₅₀ inaeleza concentration inayohitajika ili nyenzo inayojaribiwa ifikishe response ya kibayolojia inayopimwa katika kiwango cha %50; katika masharti yale yale ya assay, IC₅₀ ya chini huashiria inhibitory potency ya juu zaidi, lakini haijengi ulinganifu wa moja kwa moja wa dozi ya kliniki kati ya mbinu tofauti za assay au vitu tofauti.

Kwa uchambuzi wa IC₅₀, freeze-dried crude hydrolysates zilijaribiwa katika:

10–50 mg/mL

.

Dose-response curves ziliundwa kati ya percentage inhibition na sample concentration, na IC₅₀ ilihesabiwa kwa kutumia:

nonlinear regression kwa GraphPad Prism version 10.0

.

IC₅₀ ya chini ya FXH inaendana na mixed hydrolysate kuwa na inhibitory potency ya juu zaidi katika assay hii.

Sehemu ya Discussion inatafsiri hili kama uwezekano wa “synergistic enhancement” kati ya muscle na skin peptide pools. Hata hivyo, utafiti haukufanya synergy design ya kawaida, combination index wala isobologram analysis. Kwa hiyo synergy hapa si matokeo tofauti ya majaribio yaliyopimwa moja kwa moja, bali ni mechanistic interpretation ya waandishi.

Shughuli ya Antibakteria Ilipimwaje?

Utafiti ulipima antibacterial activity kwa mbinu ya agar-well diffusion; bakteria zilizostandardishwa zilisambazwa kwenye agar, 100 μL ya hydrolysate iliyochujwa ikaongezwa kwenye wells za 6 mm, na baada ya incubation ya saa 24 kipenyo cha clear inhibition zone kilichotokea kikapimwa kwa milimita.

Bakteria zilizojaribiwa

Bakteria nne zilitumika:

• Listeria monocytogenes,
• Enterococcus faecalis,
• Escherichia coli,
• Salmonella typhi.

Bacterial cultures zilikuzwa katika LB broth kwa 37°C kwa saa 24 na kurekebishwa hadi 0,5 McFarland turbidity standard.

Chanzo kinatoa msongamano huu kuwa takribani:

\[ 1\times10^8\ \text{CFU/mL} \]

.

100 μL ya standardized bacterial culture ilichanganywa na molten LB agar ya takribani 45°C.

Baada ya agar solidification, wells zenye kipenyo cha 6 mm zilifunguliwa na 100 μL ya filter-sterilized hydrolysate sample ikaongezwa kwenye kila well.

Samples ziliachwa kwa saa moja katika room temperature kwa diffusion; kisha ziliinkubatiwa kwa 37°C kwa saa 24.

Majaribio yalifanywa triplicate.

Negative control ilikuwa sterile distilled water, na positive control ilikuwa chloramphenicol 100 ppm.

Uainishaji wa inhibition zone

Chanzo kinatumia uainishaji wa Davis na Stout:

Table 2: Matokeo ya antibakteria

Katika chanzo, superscript letters tofauti zinaonyesha statistical differences katika kiwango cha p<0,05.

L. monocytogenes inaonekana kuwa nyeti hasa kwa sehemu zenye molecular weight ndogo. Sehemu zote tatu za <3 kDa za FMH, FSH na FXH ziko katika kundi la “very strong” kwa sababu ni ≥20 mm katika uainishaji wa chanzo.

S. typhi ndiyo organism iliyoonyesha unyeti mdogo zaidi. Hasa katika FSH crude, <30 kDa na <10 kDa, inhibition ya 0 mm iliripotiwa.

Kwa nini kipenyo cha zone hakipaswi kulinganishwa moja kwa moja na nguvu ya antibiotiki?

Matokeo ya agar-well diffusion hayaathiriwi tu na biological inhibition; tabia ya diffusion ya test material ndani ya agar pia huchangia ukubwa wa zone. Kwa hiyo, ukweli kwamba FSH <3 kDa ilitengeneza zone ya 23,17 mm kwa Listeria na chloramphenicol control ikatengeneza 14,25 mm hauwezi kutafsiriwa moja kwa moja kuwa “hidrolisati ni antibiotiki yenye nguvu zaidi kuliko chloramphenicol”.

Utafiti hauripoti kwa hydrolysates:

• MIC,
• MBC,
• time-kill kinetics,
• in vivo infection outcome

.

Maandalizi ya peptidomiki ya LC-HRMS

Kwa kila uchambuzi, 100 mg ya freeze-dried hydrolysate ilisuspensiwa katika 1 mL ya 50 mM ammonium bicarbonate buffer pH 8,0.

Hatua kuu za maandalizi:

1. 14.000×g, dakika 20, 4°C centrifugation.
2. 500 μL supernatant + kiasi sawa cha −20°C acetone.
3. −20°C kwa saa 4 incubation.
4. 16.000×g, dakika 20, 4°C centrifugation.
5. Pellet kukaushwa kwa 45°C kwa dakika 30.
6. Kuyeyushwa tena katika 500 μL buffer.
7. Reduction kwa 10 μL 10 mM DTT kwa 56°C kwa dakika 60.
8. Alkylation kwa 10 μL 20 mM IAA gizani kwa dakika 60.
9. Digestion kwa 0,1 mg/mL trypsin kwa 37°C kwa saa 17.
10. Reaction termination kwa 500 μL %1 TFA.
11. 8.100×g, dakika 5 centrifugation.
12. 0,2 μm PVDF membrane filtration.

Uchambuzi wa Peptidomiki wa LC-HRMS Unafanya Nini?

LC-HRMS ni njia ya uchambuzi inayotenganisha kwanza peptide mixtures changamano kwa liquid chromatography, kisha kupima taarifa ya mass/charge kwa high-resolution mass spectrometry ili kusaidia utambuzi wa peptide sequences; katika utafiti huu, tabaka la LC-HRMS/LFQ lilitoa peptide identity na relative abundance na hivyo kuwa msingi wa kuchagua representative sequences 35 kwa tathmini ya baadaye ya in silico.

Upande wa LC

Peptide separation ilifanywa kwa:

• Vanquish™ Horizon UHPLC,
• PepMap™ 100 C18 column, 150 mm × 1 mm, 3 μm,
• 75 μL/min flow rate,
• 30°C,
• water na acetonitrile mobile phases zenye 0,1% formic acid

.

Upande wa MS

Mass-spectrometry system iliripotiwa kuwa:

• Orbitrap Exploris 240 HRMS,
• OptaMax™ NG H-ESI source,
• positive mode,
• Full MS/dd-MS2 acquisition,
• Full-MS resolution: 120.000,
• MS2 resolution: 15.000 FWHM

.

Raw data ilichakatwa katika Proteome Discoverer 2.5 kwa SequestHT dhidi ya UniProt na NCBI databases.

Label-free quantification (LFQ) ni njia ya kulinganisha relative peptide abundance kwa kutumia ukubwa wa ishara za MS bila kuongeza isotope-label.

Walifikaje kutoka peptidi 211 hadi peptidi 35?

Chanzo kilichagua sehemu ya highest-abundance kwa takribani kila hydrolysate type kutoka peptide sequence 211 na kupeleka jumla ya representative peptide sequence 35 katika uchambuzi zaidi wa in silico.

Sequence hizi 35:

• zina urefu wa 8–18 amino acid,
• nyingi ziko katika 10–14 residue,
• FMH 20 unique sequence,
• FSH 10 unique sequence,
• peptide tano ni za pamoja katika zaidi ya hydrolysate type moja

kama ilivyoripotiwa.

Je, Matokeo ya In Silico Prediction Yanamaanisha Shughuli Halisi ya Kibayolojia?

Hapana. Majukwaa ya in silico prediction huhesabu uwezekano wa peptide sequence kufanana na darasa fulani la kibayolojia au score ya shughuli inayotabiriwa kutokana na sifa za sequence; score hizi ni muhimu kwa kupanga wagombea, lakini peke yake hazithibitishi kwamba peptide ni ya kupambana na kisukari, antibakteria, yenye sumu, allergenic au salama katika organism halisi.

PeptideRanker

PeptideRanker ilitumika kuweka kipaumbele kwa uwezekano wa sequence kuwa bioactive-peptide kwa ujumla.

Katika chanzo, score range iliripotiwa kuwa:

\[ 0.000-0.926 \]

kama ilivyoripotiwa.

Peptide tisa zilipata score zaidi ya 0,5.

Zilizojitokeza:

Uchambuzi wa novelty

Katika ulinganisho wa BIOPEP-UWM database:

33/35 peptide = %94,3

ziliainishwa na chanzo kuwa novel.

Sequence mbili zilizopatikana kuwa Reported:

• IWHHTFYNELR,
• AGFAGDDAPR.

Hapa “novel” inatumika kwa maana kwamba sequence haijawahi kuripotiwa hapo awali kama bioactive peptide katika database/literature cross-reference husika; haimaanishi “imejitokeza kwa mara ya kwanza katika maumbile”.

Toxicity prediction

Kulingana na Table 3:

32/35 = %91,43 non-toxic prediction

ipo.

Peptide tatu zilizoonyeshwa kuwa Toxin:

• IEELEEEIEAER,
• TGPIGMPGAR,
• VEELEEEIEAER.

Ingawa prose ya chanzo hapa inatumia kauli “two peptides”, inaorodhesha sequence tatu. Table 3 na hesabu ya 32/35 zinaendana na toxic-predicted peptide tatu.

Kwa nini allergenicity haitoi matokeo moja?

Chanzo kilitumia njia tatu tofauti za prediction:

• pLM4Alg-640,
• AlgPred2,
• AllerCatPro 2.0.

Peptide hiyo hiyo inaweza kuainishwa tofauti na modeli tofauti. Hali hii inaonekana wazi katika Table 3.

Chanzo kinaeleza kwamba peptide nne pekee zilionyesha non-allergen prediction inayolingana katika angalau modeli mbili:

• IWHHTFYNELR,
• GYSFVTTAER,
• AGEPGAAGLR,
• SPAMPVPGPMGPMGPR.

Kwa hiyo hata “non-allergen prediction” si matokeo ya clinical food-allergy safety.

Tofauti za uandishi wa sequence ndani ya chanzo

Zana za antidiabetic prediction

Zana mbili tofauti zilitumika:

• AntiDMP-pred: general antidiabetic bioactive peptide prediction,
• AntiT2DMP-Pred: Type 2 diabetes-related peptide prediction.

Katika chanzo, prediction score iko kati ya 0–1 na thamani zaidi ya 0,5 zilitathminiwa kuwa potential positive prediction.

Katika AntiDMP-pred, 27/35 peptide, yaani %77,1, zilipata score zaidi ya 0,5.

AntiT2DMP-Pred ilitoa matokeo yenye uteuzi mkubwa zaidi. Kati ya peptide 35, sequence mbili pekee zilipata score zaidi ya 0,5:

Tofauti hii ya zana ni muhimu kisayansi. Kwa mfano, VAEQELVDASER ni 0,83 katika AntiDMP-pred lakini 0,012 tu katika AntiT2DMP-Pred. AVFPSIVGRPR ni 0,31 katika AntiDMP-pred na 0,663 katika AntiT2DMP-Pred.

Kwa hiyo “antidiabetic peptide” si classification moja isiyotegemea modeli.

Zana za antimicrobial prediction

Chanzo kilitumia mifumo ifuatayo:

• CAMPR4 — algorithms za Random Forest, Support Vector Machine na Artificial Neural Network,
• Antimicrobial Peptide Scanner v2,
• ADAM,
• AntiBP3 — Gram-positive na Gram-negative antibacterial prediction.

Katika CAMPR4 header ya Table 5, lebo ya modeli ya tatu imechapishwa tena kama “SVM”; hata hivyo, sehemu ya method, Results prose na table footnote zinatambua modeli ya tatu kuwa Artificial Neural Network. Kwa hiyo Verianla haiandiki upya header ya chanzo kana kwamba haina hitilafu.

Kwa nini modeli hazitoi matokeo sawa?

Kila modeli hutumia training dataset, features, architecture na classification threshold tofauti. Kwa hiyo peptide hiyo hiyo inaweza kuwa:

• AMP katika modeli moja,
• Non-AMP katika modeli nyingine,
• ABP katika tawi moja la AntiBP3,
• non-ABP katika lingine

.

Footnote ya Table 5 yenyewe inaeleza matokeo yenye alama ya nyota kama internal prediction inconsistencies.

Hii inaonyesha kwamba zana za prediction si zisizo na makosa na kwamba matokeo ya algorithm moja hayapaswi kutumiwa kama ukweli wa mwisho wa kibayolojia.

Kwa nini AVFPSIVGRPR inajitokeza?

Katika Table 5, AVFPSIVGRPR ina:

Prose ya chanzo inalinganisha baadhi ya nambari za Scanner/ADAM za AVFPSIVGRPR kwa namna tofauti na Table 5. Jedwali hapo juu linahifadhi thamani zilizochapishwa katika Table 5.

Kauli “Most promising antimicrobial peptide” ni kipaumbele cha mgombea kinachotegemea mwelekeo wa pamoja wa prediction kutoka modeli nyingi; purified AVFPSIVGRPR peptide assay dhidi ya bakteria halisi haikufanywa katika utafiti huu.

Kwa nini SPAMPVPGPMGPMGPR inajitokeza?

Collagen-derived sequence hii inajitokeza katika tabaka tatu tofauti za prediction:

Katika sehemu moja ya Results prose, chanzo kinaita SPAMPVPGPMGPMGPR “peptide 23”; Table 4 na maelezo mengine ya Results yanaeleza sequence hii kuwa peptide 28. GFPGSDGSAGPK inaonyeshwa kama peptide 23. Tofauti hii ya peptide-number haijafichwa kimya kimya.

Uchambuzi wa takwimu

Experimental data:

• Microsoft Excel,
• GraphPad Prism,
• IBM SPSS Statistics version 27

zilichambuliwa.

Statistical differences kati ya treatment groups zilitathminiwa kwa:

One-way analysis of variance (ANOVA)

na kisha:

Duncan's multiple range test

.

Kiwango cha umuhimu kiliwekwa kuwa:

\[ P<0.05 \]

.

ANOVA hutathmini kama kuna tofauti ya jumla dhidi ya null hypothesis kwamba wastani wa makundi mengi ni sawa. Duncan multiple range test ni njia ya post-hoc inayolenga kubainisha kwa makundi ya herufi ni makundi yapi yanatofautiana baada ya kupatikana tofauti ya jumla yenye umuhimu.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Muonekano wa jumla wa muundo wa majaribio

Jambo kuu la α-glukosidasi

Ultrafiltration kwa ujumla iliambatana na α-glukosidasi inhibition ya juu zaidi katika lower-molecular-weight fractions.

<3 kDa:

• FMH ≈ %79,45,
• FSH ≈ %78,03,
• FXH ≈ %79,03

zilionyesha inhibition.

Chanzo mwanzoni mwa paragraph hiyo hiyo ya Results kinaandika general inhibition range ya takribani %61,97–79,09. Kwa kuwa katika paragraph hiyo hiyo FMH <3 kDa imepewa %79,45, kuna tofauti ndogo ya upper limit ndani ya chanzo kati ya ripoti hizi mbili.

Jambo la dose-response la crude hydrolysate

Kati ya 10–50 mg/mL, inhibition iliongezeka kwa namna inayotegemea concentration.

Mpangilio wa IC₅₀:

FXH 34,692±1,355 < FSH 36,643±1,384 < FMH 46,541±1,228 mg/mL.

Mpangilio huu unaendana na FXH kuonyesha α-glukosidasi inhibitory potency ya juu zaidi katika kiwango cha crude-hydrolysate chini ya masharti ya assay yaliyopimwa.

Jambo kuu la antibakteria

Kadiri molecular weight ilivyopungua, inhibition zone iliongezeka hasa katika ulinganisho mwingi wa FMH, FSH na FXH.

L. monocytogenes inajitokeza kama organism nyeti zaidi.

Katika sehemu za <3 kDa:

• FSH: 23,17±1,89 mm,
• FMH: 22,50±0,50 mm,
• FXH: 21,83±1,76 mm

zilipimwa.

Katika classification ya chanzo, zote tatu ziko katika kundi la very strong inhibition zone.

211 peptide → 35 candidate

LC-HRMS/MS peptide pool ina jumla ya sequence 211.

Kwa kutumia relative abundance na hydrolysate coverage, representative sequence 35 zilichaguliwa na computational profiling ikafanywa.

Lengo la uchaguzi huu wa wagombea si kuonyesha kwamba peptide zote 211 zina nguvu sawa; ni kupunguza peptide pool kwa ajili ya utafiti wa kina zaidi wa prediction.

Wagombea wanaojitokeza

Matokeo yanayoungwa mkono moja kwa moja na utafiti

• Protein hydrolysates zilipatikana kutoka bidhaa za pembeni za misuli, ngozi na mchanganyiko wa mackerel zilizochachushwa kwa P. pentosaceus IL13.
• <3 kDa fractions kwa ujumla zilionyesha α-glukosidasi inhibition yenye nguvu.
• FXH crude hydrolysate ina IC50 ya chini zaidi kati ya crude group tatu, ikiwa 34,692±1,355 mg/mL.
• Low-molecular-weight fractions zilionyesha inhibition zones kubwa zaidi katika antibacterial comparison nyingi.
• L. monocytogenes ni nyeti hasa kwa <3 kDa fractions.
• Kuna peptide sequence 211 katika LC-HRMS peptidomic pool.
• Representative peptide 35 zilichaguliwa kwa computational evaluation zaidi.
• 33/35 sequence ziliainishwa kuwa novel katika ulinganisho wa BIOPEP-UWM.
• Kulingana na data ya Table 3, 32/35 peptide zilipata non-toxic prediction.
• SPAMPVPGPMGPMGPR na AVFPSIVGRPR ni miongoni mwa computational candidates wanaojitokeza kwa uthibitishaji zaidi wa majaribio.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono moja kwa moja

• Haijaonyeshwa kwamba hidrolisati zinatibu kisukari kwa binadamu.
• Postprandial glucose reduction kwa binadamu haikupimwa.
• Oral bioavailability ya peptidi haijaonyeshwa.
• Haijajaribiwa kama zinabaki active baada ya gastrointestinal digestion.
• Antidiabetic effect ya purified SPAMPVPGPMGPMGPR kwa binadamu haijaonyeshwa.
• MIC/MBC halisi ya purified AVFPSIVGRPR dhidi ya bakteria haikupimwa katika utafiti huu.
• In silico non-toxic prediction si usalama wa toxicology kwa binadamu.
• In silico non-allergen prediction si food-allergy safety kwa binadamu.
• Agar inhibition zone si sawa na clinical potency ya antibiotiki.
• Pharmacological synergy halisi ya FXH haijaonyeshwa kwa combination-index method.
• Hakuna functional-food au nutraceutical product iliyotengenezwa.
• Hakuna in vivo efficacy wala human clinical trial iliyofanywa.

Tofauti muhimu za kuripoti ndani ya chanzo

Nguvu kuu za utafiti

Utafiti hautumii bioactivity assay moja tu. Unatathmini nyenzo ile ile katika tabaka za:

• fermentation,
• molecular-weight fractionation,
• α-glucosidase inhibition,
• antibacterial testing,
• LC-HRMS peptidomics,
• general bioactivity prediction,
• toxicity prediction,
• allergenicity prediction,
• general antidiabetic prediction,
• type-2-specific prediction,
• multi-model antimicrobial prediction

.

Muundo huu unaweka tabaka tofauti za ushahidi pamoja kwa candidate prioritization badala ya kutegemea prediction model moja.

Mapungufu makuu

In vitro α-glukozidaz assay: Haiwakilishi metabolism ya binadamu.

Agar diffusion: Inhibition zone huathiriwa na diffusion property na haiwezi kuchukua nafasi ya MIC/MBC.

In silico prediction: Sequence-based predictions zinahitaji experimental validation.

Peptide purification: Haijaonyeshwa kwamba individual peptides wanaojitokeza walitakaswa katika utafiti huu na kuthibitishwa kwa α-glukosidaz au antibacterial assay tofauti.

Bioavailability: Haikupimwa.

Gastrointestinal stability: Haikupimwa.

In vivo validation: Haipo.

Human clinical validation: Haipo.

Prediction disagreement: Matokeo ya modeli kwa sequence hiyo hiyo mara nyingi hutofautiana.

Sequence/reporting inconsistencies: Kuna baadhi ya tofauti za sequence na model-score kati ya Table 3–5 na prose.

Synergy: IC50 ya chini ya FXH ilionekana, lakini formal synergy analysis haikufanywa.

Tafiti zijazo

Sehemu ya hitimisho ya chanzo inaomba hasa uthibitishaji ufuatao:

• molecular interaction analysis,
• gastrointestinal stability,
• bioavailability,
• majaribio zaidi ya in vitro,
• in vivo experiments.

Mahitaji haya yanaweka wazi kwamba matokeo ya sasa yako katika kiwango cha candidate-discovery na preliminary bioactivity.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Utafiti asili: α-Glucosidase Inhibitory and Antibacterial Activity of Fermented Mackerel By-Product Muscle and Skin Hydrolysates: In Vitro and In Silico Peptidomics Analysis.

Waandishi: Ariandi Ariandi, Dimas Andrianto, Apon Zaenal Mustopa, Anja Meryandini.

Mpangilio wa waandishi: Mpangilio katika PDF ya chanzo na metadata ya sasa ya jarida rasmi umehifadhiwa.

Mchango sawa: Chanzo hakina tamko la equal-contribution.

Mwandishi anayewajibika: Anja Meryandini.

Affiliation 1: Doctoral Program in Microbiology, Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Bogor Agricultural University (IPB University), IPB Dramaga Campus, Bogor City 16680, Indonesia.

Affiliation 2: Department of Biotechnology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Sulawesi Barat, Majene, West Sulawesi 91412, Indonesia.

Affiliation 3: Department of Biochemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Bogor Agricultural University (IPB University), IPB Dramaga Campus, Bogor City 16680, Indonesia.

Affiliation 4: Research Center for Genetic Engineering, National Research and Innovation Agency (BRIN), Bogor City 16680, Indonesia.

Affiliation 5: Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Bogor Agricultural University (IPB University), IPB Dramaga Campus, Bogor City 16680, Indonesia.

Affiliation 6: Biotechnology Research Center, Bogor Agricultural University (IPB University), IPB Dramaga Campus, Bogor City 16680, Indonesia.

Jarida: HAYATI Journal of Biosciences.

Muundo wa uchapishaji: Department of Biology, Bogor Agricultural University/IPB University na Indonesian Society for Biology.

Juzuu / toleo: Vol. 33 No. 6.

Kurasa: 1423–1440.

DOI: 10.4308/hjb.33.6.1423-1440.

ISSN: 1978-3019.

EISSN: 2086-4094.

Aina ya chanzo: Research Article.

Mapitio ya rika: HAYATI Journal of Biosciences hutumia double-blind peer review; section editor huomba review kutoka angalau scientist wawili.

Received: July 1, 2026.

Received in revised form: September 3, 2026.

Accepted: September 9, 2026.

PDF Available Online: October 1, 2026.

Published katika metadata rasmi ya issue: November 1, 2026.

Leseni: Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC 4.0).

Preprint: Hakuna rekodi tofauti ya preprint iliyotajwa katika PDF ya chanzo au ukurasa rasmi wa makala uliothibitishwa.

Nyenzo ya samaki: Scomberomorus commerson processing by-products; skin na mechanically damaged muscle tissues.

Tarehe na mahali pa sampuli: January 2025; Muara Baru Fish Market, Penjaringan, Jakarta, Indonesia; 6°06′36″S, 106°48′06″E.

Organism ya uchachushaji: Pediococcus pentosaceus IL13.

Makundi ya majaribio: FMH, FSH na FXH; FXH muscle+skin 1:1 (w/w).

Mzigo wa uchachushaji: 10 g sample + 40 mL %10 (w/v) glucose solution + 400 μL starter culture.

Sterilization: 121°C, dakika 15.

Fermentation: Muscle na mixed samples siku 4; skin sample siku 5.

Hydrolysate separation: 14.000×g, dakika 30, 4°C.

Ultrafiltration: 30, 10 na 3 kDa MWCO; 5.000×g, dakika 30, 10°C.

Fractions: <30 kDa, <10 kDa, <3 kDa.

α-Glukozidaz: Saccharomyces cerevisiae source; Sigma Type I, ≥10 units/mg protein.

α-Glukozidaz assay: 50 μL sample + 30 μL phosphate buffer pH 6,8 + 60 μL pNPG + 60 μL enzyme; 37°C, dakika 30.

Reaction stop: 60 μL 200 mM Na2CO3.

Absorbance: 405 nm.

pNP standard curve: 0–500 ppm; linear regression R²>0,99.

Positive control: Acarbose 100 ppm.

Negative control: Sterile distilled water.

IC50 concentration series: 10–50 mg/mL freeze-dried crude hydrolysates.

IC50 analysis: Nonlinear regression, GraphPad Prism 10.0.

FMH IC50: 46,541±1,228 mg/mL.

FSH IC50: 36,643±1,384 mg/mL.

FXH IC50: 34,692±1,355 mg/mL.

Antibacterial test: Agar-well diffusion.

Test bacteria: Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella typhi.

Bacterial density: 0,5 McFarland ≈1×10⁸ CFU/mL.

Well diameter: 6 mm.

Hydrolysate volume: 100 μL/well.

Diffusion: Room temperature, saa 1.

Incubation: 37°C, saa 24.

Antibacterial replicates: Triplicate.

Antibacterial positive control: Chloramphenicol 100 ppm.

Antibacterial negative control: Sterile distilled water / Table 2 notation medium.

LC-HRMS sample: 100 mg freeze-dried hydrolysate.

Reduction: 10 μL 10 mM DTT, 56°C, dakika 60.

Alkylation: 10 μL 20 mM IAA, gizani dakika 60.

Digestion: Trypsin 0,1 mg/mL, saa 17, 37°C.

UHPLC: Vanquish™ Horizon UHPLC.

Column: PepMap™ 100 C18, 150 mm × 1 mm, 3 μm.

Flow: 75 μL/min.

Column temperature: 30°C.

HRMS: Orbitrap Exploris 240, OptaMax™ NG H-ESI.

Acquisition: Positive mode, Full MS/dd-MS2.

Resolution: 120.000 Full MS; 15.000 MS2 FWHM.

Processing: Proteome Discoverer 2.5, SequestHT, UniProt na NCBI.

Quantification: Label-free quantification (LFQ).

Peptide pool: 211 identified sequences.

In silico selected set: 35 representative sequences.

Peptide length: 8–18 amino acids; nyingi 10–14 residues.

General bioactivity: PeptideRanker.

Novelty: BIOPEP-UWM.

Toxicity: Kiungo cha ToxinPred katika Method; jina la ToxinPred3 katika Results/Table 3.

Allergenicity: pLM4Alg-640, AlgPred2, AllerCatPro 2.0.

General antidiabetic: AntiDMP-pred.

Type 2 antidiabetic: AntiT2DMP-Pred.

Antimicrobial prediction: CAMPR4, Antimicrobial Peptide Scanner v2, ADAM, AntiBP3.

Statistics: One-way ANOVA + Duncan's multiple range test, P<0,05.

Software: Microsoft Excel, GraphPad Prism, IBM SPSS Statistics version 27.

Funding: Center for Higher Education Funding and Assessment (PPAPT), Ministry of Higher Education, Science, and Technology of the Republic of Indonesia; Indonesian Endowment Fund for Education (LPDP), Ministry of Finance of the Republic of Indonesia; Indonesian Education Scholarship/BPI, Grant No. 00769/BPPT/BPI.06/9/2023, BPI ID 202327091759.

Acknowledgement: Genomic Laboratories na Taksa Laboratories, KST Cibinong, National Research and Innovation Agency (BRIN).

Data Availability: PDF ya chanzo haina data-availability statement tofauti.

Conflict of Interest: PDF ya chanzo haina conflict-of-interest statement tofauti.

CRediT / Author Contributions: PDF ya chanzo haina sehemu tofauti ya author-contribution au CRediT.

Ethical approval: Chanzo hakina tamko tofauti la kamati ya maadili. Nyenzo zilizoripotiwa za utafiti ni processing by-products zilizochukuliwa sokoni na microorganisms zilizopatikana kutoka culture collections; hakuna jaribio la uingiliaji kwa washiriki wa binadamu au wanyama hai lililoripotiwa.

Kikomo kikuu cha tafsiri: α-glukozidaz inhibition na bacterial inhibition zones ni matokeo ya in vitro; sehemu muhimu ya matokeo ya individual peptide bioactivity, toxicity, allergenicity, antidiabetic na antimicrobial ni in silico prediction. Haya hayatoi hitimisho la clinical efficacy au human safety.

Dokezo la kuripoti ndani ya chanzo 1: Wakati range ya Results katika Figure 1 imetolewa kuwa takribani %61,97–79,09, paragraph hiyo hiyo inaripoti takribani %79,45 kwa FMH <3 kDa.

Dokezo la kuripoti ndani ya chanzo 2: Ingawa prose inasema “two peptides”, Table 3 na sequence za sentensi hiyo hiyo zinaonyesha toxic-predicted peptide tatu.

Dokezo la kuripoti ndani ya chanzo 3: Kuna baadhi ya tofauti za peptide sequence transcription kati ya Table 3–4 na prose.

Dokezo la kuripoti ndani ya chanzo 4: Katika CAMPR4 header ya Table 5, algorithm ya tatu imechapishwa “SVM”; method, Results na footnote zinaeleza modeli ya tatu kuwa ANN.

Dokezo la kuripoti ndani ya chanzo 5: SPAMPVPGPMGPMGPR peptide number inaonekana kama 23 katika sentensi moja ya Results, huku source context nyingine ikiunga mkono peptide 28.

Dokezo la kuripoti ndani ya chanzo 6: Kwa AVFPSIVGRPR, baadhi ya antimicrobial prediction score mappings katika Table 5 na prose hazilingani.

Uthibitishaji wa baadaye: Molecular interaction analysis, gastrointestinal stability, bioavailability, majaribio zaidi ya in vitro na in vivo.