Balık proteini hidrolizatı, proteinlerin daha küçük peptitlere ve amino asitlere parçalanmasıyla oluşan protein kökenli bir karışımdır. Bu çalışma, Scomberomorus commerson işleme yan ürünü kas ve deri dokularının Pediococcus pentosaceus IL13 ile fermantasyonu sonucu oluşan hidrolizatların α-glukozidaz inhibitör aktivitesini ve dört patojen bakteriye karşı antibakteriyel aktivitesini doğrudan laboratuvar ortamında incelemiş; ultrafiltrasyonla <30, <10 ve <3 kDa peptit fraksiyonlarını ayırmış; LC-HRMS tabanlı peptidomik analiz ve çok sayıda in silico prediction platformuyla seçilen peptitlerin potansiyel biyolojik özelliklerini değerlendirmiştir. En düşük crude-hydrolysate IC₅₀ değeri kas+deri karışımından oluşan FXH grubunda 34,692±1,355 mg/mL olarak bulunmuştur. <3 kDa fraksiyonları α-glukozidaz inhibisyonunda ve özellikle Listeria monocytogenes'e karşı antibakteriyel aktivitede öne çıkmıştır. Ancak peptitlerin antidiyabetik, antimikrobiyel, toksik veya alerjen olmasına ilişkin bilgisayar tahminleri gerçek klinik etkinlik veya güvenlik kanıtı değildir.

α-Glukozidaz inhibisyonu için <3 kDa fraksiyonları FMH, FSH ve FXH'de sırasıyla yaklaşık %79,45, %78,03 ve %79,03 inhibition göstermiştir. Freeze-dried crude hydrolysate dose-response analizinde FXH'nin IC₅₀ değeri 34,692±1,355 mg/mL, FSH'nin 36,643±1,384 mg/mL ve FMH'nin 46,541±1,228 mg/mL'dir. Daha düşük IC₅₀, aynı deney sistemi içinde daha düşük konsantrasyonda %50 inhibition elde edildiğini ve dolayısıyla daha güçlü inhibitör potansiyeli ifade eder.

Antibakteriyel deneylerde <3 kDa fraksiyonları özellikle L. monocytogenes üzerinde büyük inhibition zones oluşturmuştur: FSH 23,17±1,89 mm, FMH 22,50±0,50 mm ve FXH 21,83±1,76 mm. Salmonella typhi genel olarak daha düşük duyarlılık göstermiştir. Bu değerler agar-well diffusion testinin zon çaplarıdır; minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) veya insanlarda antibiyotik etkinliği değildir.

LC-HRMS tabanlı çalışma 211 peptide sequence içinden relative abundance esas alınarak 35 temsilci diziyi ileri in silico değerlendirmeye taşımıştır. PeptideRanker'da SPAMPVPGPMGPMGPR 0,926 ile en yüksek genel bioactivity score'u almış; AntiT2DMP-Pred'de aynı peptit 0,811 ile en yüksek type-2-antidiabetic prediction değerini göstermiştir. AVFPSIVGRPR ise birden fazla antimicrobial prediction platformunda olumlu sınıflamalar aldığı için kaynak tarafından güçlü antimicrobial candidate olarak önceliklendirilmiştir. Bu sonuçlar aday seçimi içindir; ilaç etkinliği kanıtı değildir.

Detaylı Açıklama

Araştırmanın temel problemi

Balık işleme endüstrisi kas parçaları, deri, kemik, baş, iç organlar ve diğer yan ürünlerden büyük miktarda biyolojik artık oluşturabilmektedir. Bu yan ürünlerin önemli bölümü protein açısından zengindir. Araştırmanın temel yaklaşımı, düşük değerli veya atık kabul edilen bu protein materyalini mikrobiyal fermantasyonla daha küçük ve biyolojik aktivite gösterebilecek peptitlere dönüştürmek ve böylece aynı anda hem atıkların değerlendirilmesine hem de potansiyel fonksiyonel bileşenlerin keşfine katkı sağlamaktır.

Bu çalışma özellikle iki biyolojik aktiviteyi hedeflemektedir:

• α-glukozidaz enziminin inhibisyonu üzerinden olası antidiyabetik potansiyelin ön taraması,
• Gram-pozitif ve Gram-negatif bakterilere karşı antibakteriyel aktivite.

Bunun üzerine LC-HRMS peptidomik ve in silico prediction katmanı eklenerek hangi peptide sequences'ın ileri deneysel doğrulama için önceliklendirilebileceği araştırılmıştır.

Üç hidrolizat grubu neyi ifade ediyor?

Balık materyali nereden geldi?

Scomberomorus commerson işleme yan ürünleri Ocak 2025'te Muara Baru Fish Market, Penjaringan, Jakarta, Indonesia'dan alınmıştır. Kaynak koordinatları 6°06′36″S, 106°48′06″E olarak vermektedir.

Materyal:

• skin,
• fragmented flesh,
• softened meat,
• ruptured abdominal portions gibi mechanically damaged muscle tissues

içermektedir.

Numuneler yıkanmış, blender ve meat grinder ile homojenize edilmiş; paketlenip etiketlenmiş, ilk 24–48 saat −4°C'de korunmuş, chilled insulated ice boxes ile taşınmış ve analiz öncesinde −20°C'de depolanmıştır.

Pediococcus pentosaceus IL13 neden kullanıldı?

Pediococcus pentosaceus IL13 çalışmanın fermantasyon mikroorganizmasıdır. Kaynak bu laktik asit bakterisinin Microbial Bioprospecting Laboratory, Research Center for Biotechnology, IPB University'den elde edildiğini belirtmektedir.

Fermantasyonun bilimsel mantığı, mikroorganizmaların ve ilgili proteolitik süreçlerin büyük protein yapılarını daha küçük peptide fragments'a parçalayabilmesidir. Protein içinde başlangıçta erişilemeyen bazı bioactive peptide sequences bu proteolysis/hydrolysis işlemiyle serbestleşebilir.

Fermantasyon nasıl yapıldı?

P. pentosaceus IL13 glycerol stock önce MRS broth içinde 37°C'de 24 saat yeniden aktive edilmiştir.

Daha sonra:

1. MRS agar plate üzerine streak edilmiştir.
2. 37°C'de 48 saat inkübe edilmiştir.
3. Tek bir colony 10 mL MRS broth'a aktarılmış ve 37°C'de 24 saat büyütülmüştür.
4. Starter culture hazırlamak için bu pre-culture'dan 1 mL alınarak 100 mL fresh MRS broth'a inoculate edilmiştir.
5. Muscle, skin ve 1:1 muscle+skin olmak üzere üç experimental group hazırlanmıştır.
6. Her gruptan 10 g materyal ayrı 50 mL Falcon tube'a yerleştirilmiştir.
7. 40 mL %10 (w/v) glucose solution eklenmiştir.
8. Numuneler 121°C'de 15 dakika sterilize edilmiştir.
9. Her numuneye 400 μL P. pentosaceus IL13 culture inoculate edilmiştir.

Submerged fermentation süresi muscle ve mixed samples için dört gün, skin için beş gündür.

Hidrolizatlar P. pentosaceus IL13'ün optimal growth curve zaman noktasında hasat edilmiştir. Supernatant 14.000×g'de 30 dakika, 4°C'de santrifüjle ayrılmış; liquid hydrolysate −20°C'de saklanmıştır.

Ultrafiltrasyon Neden <3 kDa Fraksiyonunu Öne Çıkardı?

Ultrafiltrasyon, hidrolizattaki molekülleri yaklaşık moleküler büyüklüklerine göre membranlardan geçirerek ayıran bir fraksiyonlama yöntemidir; bu çalışmada 30, 10 ve 3 kDa molecular-weight-cutoff membranları kullanılmış ve <3 kDa permeate, daha küçük peptitlerin zenginleştiği fraksiyon olarak hem α-glukozidaz inhibisyonunda hem de antibakteriyel deneylerin önemli bölümünde en güçlü sonuçları göstermiştir.

kDa ne demektir?

kDa, kilodalton birimidir. Dalton moleküler kütle birimidir; 1 kDa yaklaşık 1.000 Da anlamına gelir. “<3 kDa fraction” ifadesi bu çalışmada kullanılan ultrafiltration membrane'dan geçebilen ve yaklaşık 3 kilodaltonun altında kalan moleküler ağırlık bölgesini ifade eder.

Bu ifade bütün peptitlerin aynı büyüklükte olduğu anlamına gelmez; bir molecular-weight range tanımlar.

Ultrafiltrasyon koşulları

Amicon Ultra-15, Millipore ultrafiltration sistemi ve sırasıyla 30, 10 ve 3 kDa MWCO membranları kullanılmıştır.

Fractionation:

5.000×g, 30 dakika, 10°C

koşulunda gerçekleştirilmiştir.

Kaynak fraksiyonları:

• F-I: <30 kDa,
• F-II: <10 kDa,
• F-III: <3 kDa

olarak tanımlamaktadır.

Toplanan fraksiyonlar bioactivity evaluation öncesinde −20°C'de saklanmıştır.

α-Glukozidaz İnhibisyonu Neden “Antidiyabetik Potansiyel” Olarak İnceleniyor?

α-Glukozidaz, karbonhidrat sindiriminin son basamaklarında daha küçük şeker yapılarını glukoza dönüştüren enzimlerden biridir; enzimin aktivitesini yavaşlatabilen bir bileşik laboratuvar ortamında postprandial glukoz oluşumunu azaltmaya yönelik aday olarak değerlendirilebilir, ancak bu çalışmadaki α-glukozidaz inhibisyonu yalnız in vitro enzim assay'idir ve insanlarda kan şekeri düşürdüğünü kanıtlamaz.

α-Glukozidaz deneyinin bileşenleri

Kaynak assay'de Saccharomyces cerevisiae kökenli α-glukozidaz kullanmıştır.

Her reaction system için:

• 50 μL diluted hydrolysate sample,
• 30 μL phosphate buffer, pH 6,8,
• 60 μL p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG),
• 60 μL α-glucosidase enzyme solution

kullanılmıştır.

Reaksiyon 37°C'de 30 dakika sürdürülmüş, ardından her well'e:

60 μL 200 mM Na₂CO₃

eklenerek durdurulmuştur.

Absorbance 405 nm'de microplate spectrophotometer ile ölçülmüştür.

pNPG ve pNP ne işe yarıyor?

pNPG, α-glukozidazın parçalayabildiği chromogenic substrate'dır. Enzim pNPG'yi hidrolize ettiğinde ölçülebilir renkli ürünlerden biri olan p-nitrophenol (pNP) oluşur.

Bu nedenle temel mantık şöyledir:

Daha çok aktif α-glukozidaz → daha fazla pNP oluşumu.

Daha güçlü α-glukozidaz inhibisyonu → daha az pNP oluşumu.

Kaynak 0–500 ppm pNP standard curve hazırlamış ve 405 nm absorbance ile linear regression kullanmıştır:

\[ R^2>0.99 \]

Bu calibration curve, ölçülen absorbance'ın pNP concentration'a çevrilmesinde kullanılmıştır.

Kaynak pNP inhibition için açık bir cebirsel yüzde formülü yazmamaktadır. Bu nedenle Verianla kaynakta bulunmayan bir assay equation'ı “makalenin formülü” gibi eklememektedir.

Kontroller

α-Glukozidaz assay'de:

• Acarbose 100 ppm positive control,
• Sterile distilled water negative control

olarak kullanılmıştır.

Ayrıca baseline absorbance correction için enzyme eklenmeyen bir control system hazırlanmıştır.

Table 1: pNP oluşumu neden önemli?

Üç hidrolizat grubunun tamamında molecular-weight fraction küçüldükçe pNP production genel olarak azalmıştır. En düşük pNP concentration FMH <3 kDa grubunda 37,323 ppm'dir. pNP'nin azalması, assay mantığında daha yüksek α-glukozidaz inhibition ile uyumludur.

Bu karşılaştırmada kaynak farklı superscript letters ile p<0,05 düzeyindeki statistical differences'ı göstermektedir.

IC50 Değeri Nasıl Yorumlanmalı?

IC₅₀, test edilen bir materyalin ölçülen biyolojik yanıtı %50 düzeyine getirmek için gereken konsantrasyonu ifade eder; aynı assay koşullarında daha düşük IC₅₀ daha yüksek inhibitör potency'ye işaret eder, fakat farklı assay yöntemleri veya farklı maddeler arasında doğrudan klinik doz eşdeğerliği oluşturmaz.

IC₅₀ analizi için freeze-dried crude hydrolysates:

10–50 mg/mL

aralığında test edilmiştir.

Percentage inhibition ile sample concentration arasında dose-response curves oluşturulmuş ve IC₅₀:

GraphPad Prism version 10.0 ile nonlinear regression

kullanılarak hesaplanmıştır.

FXH'nin daha düşük IC₅₀ göstermesi mixed hydrolysate'ın bu assay içinde daha yüksek inhibitory potency taşıdığıyla uyumludur.

Discussion bölümü bunu muscle ve skin peptide pools arasında olası “synergistic enhancement” şeklinde yorumlamaktadır. Ancak çalışma klasik bir synergy design, combination index veya isobologram analizi yapmamıştır. Dolayısıyla sinerji burada doğrudan ölçülmüş ayrı bir deney sonucu değil, yazarların mechanistic interpretation'ıdır.

Antibakteriyel Aktivite Nasıl Ölçüldü?

Çalışma antibacterial activity'yi agar-well diffusion yöntemiyle ölçmüştür; standartlaştırılmış bakteriler agar içine dağıtılmış, 6 mm kuyulara 100 μL filtrelenmiş hydrolysate eklenmiş ve 24 saat inkübasyon sonunda oluşan clear inhibition zone çapı milimetre cinsinden ölçülmüştür.

Test edilen bakteriler

Dört bakteri kullanılmıştır:

• Listeria monocytogenes,
• Enterococcus faecalis,
• Escherichia coli,
• Salmonella typhi.

Bacterial cultures 37°C'de 24 saat LB broth içinde büyütülmüş ve 0,5 McFarland turbidity standardına ayarlanmıştır.

Kaynak bu yoğunluğu yaklaşık:

\[ 1\times10^8\ \text{CFU/mL} \]

olarak vermektedir.

100 μL standardized bacterial culture yaklaşık 45°C'deki molten LB agar ile karıştırılmıştır.

Agar solidification sonrasında 6 mm çapında wells açılmış ve her well'e 100 μL filter-sterilized hydrolysate sample eklenmiştir.

Samples diffusion için room temperature'da bir saat bekletilmiş; ardından 37°C'de 24 saat inkübe edilmiştir.

Deneyler triplicate yürütülmüştür.

Negative control sterile distilled water, positive control ise chloramphenicol 100 ppm'dir.

İnhibisyon zonu sınıflaması

Kaynak Davis ve Stout sınıflamasını kullanmaktadır:

Table 2: Antibakteriyel sonuçlar

Kaynakta farklı superscript letters p<0,05 düzeyindeki statistical differences'ı göstermektedir.

L. monocytogenes özellikle düşük-molecular-weight fraksiyonlara duyarlı görünmektedir. FMH, FSH ve FXH'nin <3 kDa fraksiyonlarının üçü de kaynak sınıflamasında ≥20 mm olduğu için “very strong” kategorisindedir.

S. typhi ise en düşük duyarlılığı gösteren organizmadır. Özellikle FSH crude, <30 kDa ve <10 kDa fraksiyonlarında 0 mm inhibition raporlanmıştır.

Neden zon çapını antibiyotik gücüyle doğrudan eşitlememeliyiz?

Agar-well diffusion sonucu yalnız biyolojik inhibition'dan etkilenmez; test maddesinin agar içinde diffusion davranışı da zona katkı sağlar. Dolayısıyla FSH <3 kDa'nın Listeria için 23,17 mm, chloramphenicol control'ün 14,25 mm zon oluşturması “hidrolizat chloramphenicol'den daha güçlü antibiyotiktir” şeklinde doğrudan çevrilemez.

Çalışma hydrolysates için:

• MIC,
• MBC,
• time-kill kinetics,
• in vivo infection outcome

raporlamamaktadır.

LC-HRMS peptidomik hazırlığı

Her analiz için 100 mg freeze-dried hydrolysate, 1 mL 50 mM ammonium bicarbonate buffer pH 8,0 içinde süspanse edilmiştir.

Başlıca hazırlık basamakları:

1. 14.000×g, 20 dakika, 4°C centrifugation.
2. 500 μL supernatant + eşit hacimde −20°C acetone.
3. −20°C'de 4 saat incubation.
4. 16.000×g, 20 dakika, 4°C centrifugation.
5. Pellet 45°C'de 30 dakika kurutma.
6. 500 μL buffer içinde yeniden çözme.
7. 10 μL 10 mM DTT ile 56°C'de 60 dakika reduction.
8. 10 μL 20 mM IAA ile karanlıkta 60 dakika alkylation.
9. 0,1 mg/mL trypsin ile 37°C'de 17 saat digestion.
10. 500 μL %1 TFA ile reaction termination.
11. 8.100×g, 5 dakika centrifugation.
12. 0,2 μm PVDF membrane filtration.

LC-HRMS Peptidomik Analizi Neyi Yapıyor?

LC-HRMS, karmaşık peptide mixtures'ı önce liquid chromatography ile ayıran, ardından high-resolution mass spectrometry ile kütle/yük bilgilerini ölçerek peptide sequences'ın tanımlanmasına yardımcı olan analitik yaklaşımdır; bu çalışmada LC-HRMS/LFQ katmanı peptide identity ve relative abundance sağlayarak daha sonra in silico değerlendirmeye alınacak 35 temsilci dizinin seçilmesine temel oluşturmuştur.

LC tarafı

Peptide separation:

• Vanquish™ Horizon UHPLC,
• PepMap™ 100 C18 column, 150 mm × 1 mm, 3 μm,
• 75 μL/min flow rate,
• 30°C,
• 0,1% formic acid içeren water ve acetonitrile mobile phases

ile yapılmıştır.

MS tarafı

Mass-spectrometry system:

• Orbitrap Exploris 240 HRMS,
• OptaMax™ NG H-ESI source,
• positive mode,
• Full MS/dd-MS2 acquisition,
• Full-MS resolution: 120.000,
• MS2 resolution: 15.000 FWHM

olarak raporlanmıştır.

Raw data Proteome Discoverer 2.5 içinde SequestHT ile UniProt ve NCBI databases'a karşı işlenmiştir.

Label-free quantification (LFQ), peptide abundance karşılaştırmasını isotope-label eklemeden MS sinyal yoğunlukları üzerinden göreli biçimde yapmaya yönelik yaklaşımdır.

211 peptitten 35 peptide nasıl geçildi?

Kaynak 211 peptide sequence içinden yaklaşık her hydrolysate type için highest-abundance bölümünü seçerek toplam 35 representative peptide sequence'ı ileri in silico analizlere taşımıştır.

Bu 35 sequence:

• 8–18 amino acid uzunluğundadır,
• çoğunluğu 10–14 residue aralığındadır,
• FMH 20 unique sequence,
• FSH 10 unique sequence,
• beş peptide birden fazla hydrolysate type içinde ortak

olarak raporlanmıştır.

In Silico Prediction Sonucu Gerçek Biyolojik Aktivite Anlamına Gelir mi?

Hayır. In silico prediction platformları peptide sequence özelliklerinden hareketle belirli biyolojik sınıflara benzeme olasılığını veya tahmini aktivite skorunu hesaplar; bu skorlar adayları sıralamak için değerlidir fakat peptide'ın gerçek bir organizmada antidiyabetik, antibakteriyel, toksik, alerjen veya güvenli olduğunu tek başına kanıtlamaz.

PeptideRanker

PeptideRanker sequence'ın genel bioactive-peptide olma olasılığını önceliklendirmek için kullanılmıştır.

Kaynakta score aralığı:

\[ 0.000-0.926 \]

olarak raporlanmıştır.

Dokuz peptide 0,5'in üzerinde score almıştır.

Öne çıkanlar:

Novelty analizi

BIOPEP-UWM database karşılaştırmasında:

33/35 peptide = %94,3

kaynak tarafından novel olarak sınıflandırılmıştır.

Reported olarak bulunan iki sequence:

• IWHHTFYNELR,
• AGFAGDDAPR.

Buradaki “novel”, sequence'ın ilgili database/literature cross-reference içinde daha önce bioactive peptide olarak raporlanmadığı anlamında kullanılmaktadır; “doğada ilk kez var oldu” anlamına gelmez.

Toxicity prediction

Table 3'e göre:

32/35 = %91,43 non-toxic prediction

vardır.

Toxin olarak gösterilen üç peptide:

• IEELEEEIEAER,
• TGPIGMPGAR,
• VEELEEEIEAER.

Kaynak prose burada “two peptides” ifadesini kullanmasına rağmen üç sequence sıralamaktadır. Table 3 ve 32/35 hesabı üç toxic-predicted peptide ile uyumludur.

Allergenicity neden tek bir sonuç vermiyor?

Kaynak üç farklı prediction yaklaşımı kullanmıştır:

• pLM4Alg-640,
• AlgPred2,
• AllerCatPro 2.0.

Aynı peptide farklı modeller tarafından farklı biçimde sınıflandırılabilmektedir. Bu durum Table 3'te belirgindir.

Kaynak yalnız dört peptide'ın en az iki modelde tutarlı non-allergen tahmini gösterdiğini belirtmektedir:

• IWHHTFYNELR,
• GYSFVTTAER,
• AGEPGAAGLR,
• SPAMPVPGPMGPMGPR.

Dolayısıyla “non-allergen prediction” bile clinical food-allergy safety sonucu değildir.

Kaynak içindeki sequence yazım farkları

Antidiyabetik prediction araçları

İki farklı araç kullanılmıştır:

• AntiDMP-pred: general antidiabetic bioactive peptide prediction,
• AntiT2DMP-Pred: Type 2 diabetes-related peptide prediction.

Kaynakta prediction score 0–1 arasındadır ve 0,5'in üzerindeki değerler potential positive prediction olarak değerlendirilmiştir.

AntiDMP-pred'de 27/35 peptide, yani %77,1, 0,5'in üzerinde score almıştır.

AntiT2DMP-Pred ise çok daha seçici sonuç vermiştir. 35 peptide içinde yalnız iki dizi 0,5'in üzerinde score almıştır:

Bu araç farkı bilimsel olarak önemlidir. Örneğin VAEQELVDASER AntiDMP-pred'de 0,83 iken AntiT2DMP-Pred'de yalnız 0,012'dir. AVFPSIVGRPR ise AntiDMP-pred'de 0,31, AntiT2DMP-Pred'de 0,663'tür.

Dolayısıyla “antidiabetic peptide” tek ve modelden bağımsız bir classification değildir.

Antimicrobial prediction araçları

Kaynak şu sistemleri kullanmıştır:

• CAMPR4 — Random Forest, Support Vector Machine ve Artificial Neural Network algoritmaları,
• Antimicrobial Peptide Scanner v2,
• ADAM,
• AntiBP3 — Gram-positive ve Gram-negative antibacterial prediction.

Table 5'in CAMPR4 header'ında üçüncü model etiketi tekrar “SVM” yazmaktadır; ancak yöntem bölümü, Results prose ve table footnote üçüncü modeli Artificial Neural Network olarak tanımlar. Bu nedenle Verianla kaynak header'ını yanlışsızmış gibi yeniden yazmaz.

Modeller neden birbirleriyle aynı sonucu vermiyor?

Her model farklı training dataset, features, architecture ve classification threshold kullanır. Bu yüzden aynı peptide:

• bir modelde AMP,
• başka modelde Non-AMP,
• bir AntiBP3 kolunda ABP,
• diğerinde non-ABP

olabilir.

Table 5'in kendi dipnotu yıldız işareti bulunan sonuçları internal prediction inconsistencies olarak tanımlar.

Bu, prediction araçlarının hatasız olmadığını ve tek bir algoritmanın sonucunun kesin biyolojik gerçek olarak kullanılmaması gerektiğini gösterir.

AVFPSIVGRPR neden öne çıkıyor?

AVFPSIVGRPR Table 5'te:

Kaynak prose AVFPSIVGRPR için bazı Scanner/ADAM rakamlarını Table 5'tekinden farklı eşleştirmektedir. Yukarıdaki tablo yayımlanan Table 5 değerlerini korumaktadır.

“Most promising antimicrobial peptide” ifadesi birçok modelin ortak prediction yönüne dayalı aday önceliğidir; gerçek bakterilere karşı purified AVFPSIVGRPR peptide assay bu çalışmada yapılmamıştır.

SPAMPVPGPMGPMGPR neden öne çıkıyor?

Bu collagen-derived sequence üç farklı prediction katmanında dikkat çekmektedir:

Kaynak Results prose'un bir noktasında SPAMPVPGPMGPMGPR için “peptide 23” demektedir; Table 4 ve diğer Results anlatımı bu diziyi peptide 28 olarak tanımlar. GFPGSDGSAGPK ise peptide 23 olarak verilmektedir. Bu peptide-number farkı sessizce gizlenmemiştir.

İstatistiksel analiz

Experimental data:

• Microsoft Excel,
• GraphPad Prism,
• IBM SPSS Statistics version 27

ile analiz edilmiştir.

Treatment groups arasındaki statistical differences:

One-way analysis of variance (ANOVA)

ve ardından:

Duncan's multiple range test

ile değerlendirilmiştir.

Anlamlılık eşiği:

\[ P<0.05 \]

olarak belirlenmiştir.

ANOVA, birden fazla grubun ortalamalarının tamamının aynı olduğu null hypothesis'e karşı genel fark olup olmadığını değerlendirir. Duncan multiple range test ise anlamlı genel fark sonrasında hangi grupların birbirlerinden ayrıldığını harf gruplarıyla belirlemeye yönelik post-hoc yaklaşımdır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Deney tasarımının toplu görünümü

Ana α-glukozidaz bulgusu

Ultrafiltration genel olarak lower-molecular-weight fractions içinde daha yüksek α-glukozidaz inhibition ile birlikte görülmüştür.

<3 kDa:

• FMH ≈ %79,45,
• FSH ≈ %78,03,
• FXH ≈ %79,03

inhibition göstermiştir.

Kaynak aynı Results paragrafının başında genel inhibition aralığını yaklaşık %61,97–79,09 olarak yazmaktadır. FMH <3 kDa için aynı paragrafta %79,45 verildiği için bu iki raporlama arasında küçük bir kaynak-içi üst sınır farkı vardır.

Crude hydrolysate dose-response bulgusu

10–50 mg/mL arasında inhibition concentration-dependent artmıştır.

IC₅₀ sıralaması:

FXH 34,692±1,355 < FSH 36,643±1,384 < FMH 46,541±1,228 mg/mL.

Bu sıralama test edilen assay koşullarında FXH'nin crude-hydrolysate düzeyinde daha yüksek α-glukozidaz inhibitory potency göstermesiyle uyumludur.

Ana antibakteriyel bulgu

Molecular weight küçüldükçe inhibition zone özellikle birçok FMH, FSH ve FXH karşılaştırmasında artmıştır.

L. monocytogenes en duyarlı organizma olarak öne çıkmaktadır.

<3 kDa fraksiyonlarında:

• FSH: 23,17±1,89 mm,
• FMH: 22,50±0,50 mm,
• FXH: 21,83±1,76 mm

ölçülmüştür.

Kaynak classification'ında üçü de very strong inhibition zone kategorisindedir.

211 peptide → 35 candidate

LC-HRMS/MS peptide pool toplam 211 sequence içermektedir.

Relative abundance ve hydrolysate coverage kullanılarak 35 representative sequence seçilmiş ve computational profiling yapılmıştır.

Bu aday seçiminin amacı bütün 211 peptidin eşit ölçüde güçlü olduğunu göstermek değildir; daha ayrıntılı prediction çalışması için peptide pool'u daraltmaktır.

Öne çıkan adaylar

Çalışmanın doğrudan desteklediği sonuçlar

• P. pentosaceus IL13 ile fermente edilen uskumru kas, deri ve karışık yan ürünlerinden protein hydrolysates elde edilmiştir.
• <3 kDa fractions genel olarak güçlü α-glukozidaz inhibition göstermiştir.
• FXH crude hydrolysate 34,692±1,355 mg/mL ile üç crude group arasında en düşük IC50 değerine sahiptir.
• Low-molecular-weight fractions birçok antibacterial comparison'da daha büyük inhibition zones göstermiştir.
• L. monocytogenes özellikle <3 kDa fractions'a duyarlıdır.
• LC-HRMS peptidomic pool içinde 211 peptide sequence bulunmaktadır.
• 35 representative peptide ileri computational evaluation için seçilmiştir.
• 33/35 sequence BIOPEP-UWM karşılaştırmasında novel olarak sınıflandırılmıştır.
• Table 3 verisine göre 32/35 peptide non-toxic prediction almıştır.
• SPAMPVPGPMGPMGPR ve AVFPSIVGRPR ileri deneysel doğrulama için öne çıkan computational candidates arasındadır.

Çalışmanın doğrudan desteklemediği sonuçlar

• Hidrolizatların insanlarda diyabeti tedavi ettiği gösterilmemiştir.
• İnsanlarda postprandial glucose düşüşü ölçülmemiştir.
• Peptitlerin oral bioavailability'si gösterilmemiştir.
• Gastrointestinal digestion sonrasında aktif kalıp kalmadıkları test edilmemiştir.
• Purified SPAMPVPGPMGPMGPR'nin insanlarda antidiyabetik etkisi gösterilmemiştir.
• Purified AVFPSIVGRPR'nin bakterilere karşı gerçek MIC/MBC değeri bu çalışmada ölçülmemiştir.
• In silico non-toxic prediction insan toksikoloji güvenliği değildir.
• In silico non-allergen prediction insanlarda food-allergy safety değildir.
• Agar inhibition zone antibiyotik klinik potency'sine eşit değildir.
• FXH için gerçek pharmacological synergy combination-index yöntemiyle gösterilmemiştir.
• Functional-food veya nutraceutical ürün geliştirilmiş değildir.
• In vivo efficacy veya human clinical trial yapılmamıştır.

Kaynak içindeki önemli raporlama farklılıkları

Çalışmanın temel güçlü yönleri

Çalışma yalnız tek bir bioactivity assay kullanmamaktadır. Aynı materyali:

• fermentation,
• molecular-weight fractionation,
• α-glucosidase inhibition,
• antibacterial testing,
• LC-HRMS peptidomics,
• general bioactivity prediction,
• toxicity prediction,
• allergenicity prediction,
• general antidiabetic prediction,
• type-2-specific prediction,
• multi-model antimicrobial prediction

katmanlarında değerlendirmektedir.

Bu yapı, tek bir prediction modeline güvenmek yerine candidate prioritization için farklı kanıt katmanlarını yan yana getirmektedir.

Temel sınırlılıklar

In vitro α-glukozidaz assay: İnsan metabolizmasını temsil etmez.

Agar diffusion: Inhibition zone, diffusion property'den etkilenir ve MIC/MBC yerine geçmez.

In silico prediction: Sequence-based tahminler experimental validation gerektirir.

Peptide purification: Öne çıkan individual peptides'ın bu çalışmada saflaştırılıp ayrı α-glukozidaz veya antibacterial assay ile doğrulandığı gösterilmemiştir.

Bioavailability: Ölçülmemiştir.

Gastrointestinal stability: Ölçülmemiştir.

In vivo validation: Yoktur.

Human clinical validation: Yoktur.

Prediction disagreement: Aynı sequence için model sonuçları sık sık farklılaşmaktadır.

Sequence/reporting inconsistencies: Table 3–5 ile prose arasında bazı sequence ve model-score farklılıkları bulunmaktadır.

Synergy: FXH'nin daha düşük IC50 değeri gözlenmiştir fakat formal synergy analysis yapılmamıştır.

Gelecek çalışmalar

Kaynağın sonuç bölümü özellikle şu doğrulamaları istemektedir:

• molecular interaction analysis,
• gastrointestinal stability,
• bioavailability,
• ileri in vitro experiments,
• in vivo experiments.

Bu gereksinimler, mevcut sonuçların candidate-discovery ve preliminary bioactivity düzeyinde olduğunu açık biçimde sınırlar.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma: α-Glucosidase Inhibitory and Antibacterial Activity of Fermented Mackerel By-Product Muscle and Skin Hydrolysates: In Vitro and In Silico Peptidomics Analysis.

Yazarlar: Ariandi Ariandi, Dimas Andrianto, Apon Zaenal Mustopa, Anja Meryandini.

Yazar sırası: Kaynak PDF ve güncel resmî dergi metadata sırası korunmuştur.

Eş katkı: Kaynakta equal-contribution beyanı bulunmamaktadır.

Sorumlu yazar: Anja Meryandini.

Afiliasyon 1: Doctoral Program in Microbiology, Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Bogor Agricultural University (IPB University), IPB Dramaga Campus, Bogor City 16680, Indonesia.

Afiliasyon 2: Department of Biotechnology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Sulawesi Barat, Majene, West Sulawesi 91412, Indonesia.

Afiliasyon 3: Department of Biochemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Bogor Agricultural University (IPB University), IPB Dramaga Campus, Bogor City 16680, Indonesia.

Afiliasyon 4: Research Center for Genetic Engineering, National Research and Innovation Agency (BRIN), Bogor City 16680, Indonesia.

Afiliasyon 5: Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Bogor Agricultural University (IPB University), IPB Dramaga Campus, Bogor City 16680, Indonesia.

Afiliasyon 6: Biotechnology Research Center, Bogor Agricultural University (IPB University), IPB Dramaga Campus, Bogor City 16680, Indonesia.

Dergi: HAYATI Journal of Biosciences.

Yayımlayıcı yapı: Department of Biology, Bogor Agricultural University/IPB University ve Indonesian Society for Biology.

Cilt / sayı: Vol. 33 No. 6.

Sayfalar: 1423–1440.

DOI: 10.4308/hjb.33.6.1423-1440.

ISSN: 1978-3019.

EISSN: 2086-4094.

Kaynak türü: Research Article.

Hakemlik: HAYATI Journal of Biosciences double-blind peer review uygular; section editor en az iki scientist'tan review ister.

Received: July 1, 2026.

Received in revised form: September 3, 2026.

Accepted: September 9, 2026.

PDF Available Online: October 1, 2026.

Resmî issue metadata Published: November 1, 2026.

Lisans: Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC 4.0).

Preprint: Kaynak PDF veya doğrulanan resmî makale sayfasında ayrı bir preprint kaydı belirtilmemektedir.

Balık materyali: Scomberomorus commerson processing by-products; skin ve mechanically damaged muscle tissues.

Numune tarihi ve yeri: January 2025; Muara Baru Fish Market, Penjaringan, Jakarta, Indonesia; 6°06′36″S, 106°48′06″E.

Fermantasyon organizması: Pediococcus pentosaceus IL13.

Deney grupları: FMH, FSH ve FXH; FXH muscle+skin 1:1 (w/w).

Fermantasyon yükü: 10 g sample + 40 mL %10 (w/v) glucose solution + 400 μL starter culture.

Sterilizasyon: 121°C, 15 dakika.

Fermantasyon: Muscle ve mixed samples 4 gün; skin sample 5 gün.

Hydrolysate separation: 14.000×g, 30 dakika, 4°C.

Ultrafiltration: 30, 10 ve 3 kDa MWCO; 5.000×g, 30 dakika, 10°C.

Fractions: <30 kDa, <10 kDa, <3 kDa.

α-Glukozidaz: Saccharomyces cerevisiae source; Sigma Type I, ≥10 units/mg protein.

α-Glukozidaz assay: 50 μL sample + 30 μL phosphate buffer pH 6,8 + 60 μL pNPG + 60 μL enzyme; 37°C, 30 dakika.

Reaction stop: 60 μL 200 mM Na2CO3.

Absorbance: 405 nm.

pNP standard curve: 0–500 ppm; linear regression R²>0,99.

Positive control: Acarbose 100 ppm.

Negative control: Sterile distilled water.

IC50 concentration series: 10–50 mg/mL freeze-dried crude hydrolysates.

IC50 analysis: Nonlinear regression, GraphPad Prism 10.0.

FMH IC50: 46,541±1,228 mg/mL.

FSH IC50: 36,643±1,384 mg/mL.

FXH IC50: 34,692±1,355 mg/mL.

Antibacterial test: Agar-well diffusion.

Test bacteria: Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella typhi.

Bacterial density: 0,5 McFarland ≈1×10⁸ CFU/mL.

Well diameter: 6 mm.

Hydrolysate volume: 100 μL/well.

Diffusion: Room temperature, 1 saat.

Incubation: 37°C, 24 saat.

Antibacterial replicates: Triplicate.

Antibacterial positive control: Chloramphenicol 100 ppm.

Antibacterial negative control: Sterile distilled water / Table 2 notation medium.

LC-HRMS sample: 100 mg freeze-dried hydrolysate.

Reduction: 10 μL 10 mM DTT, 56°C, 60 dakika.

Alkylation: 10 μL 20 mM IAA, karanlıkta 60 dakika.

Digestion: Trypsin 0,1 mg/mL, 17 saat, 37°C.

UHPLC: Vanquish™ Horizon UHPLC.

Column: PepMap™ 100 C18, 150 mm × 1 mm, 3 μm.

Flow: 75 μL/min.

Column temperature: 30°C.

HRMS: Orbitrap Exploris 240, OptaMax™ NG H-ESI.

Acquisition: Positive mode, Full MS/dd-MS2.

Resolution: 120.000 Full MS; 15.000 MS2 FWHM.

Processing: Proteome Discoverer 2.5, SequestHT, UniProt ve NCBI.

Quantification: Label-free quantification (LFQ).

Peptide pool: 211 identified sequences.

In silico selected set: 35 representative sequences.

Peptide length: 8–18 amino acids; çoğunluğu 10–14 residues.

General bioactivity: PeptideRanker.

Novelty: BIOPEP-UWM.

Toxicity: Method'da ToxinPred bağlantısı; Results/Table 3'te ToxinPred3 adı.

Allergenicity: pLM4Alg-640, AlgPred2, AllerCatPro 2.0.

General antidiabetic: AntiDMP-pred.

Type 2 antidiabetic: AntiT2DMP-Pred.

Antimicrobial prediction: CAMPR4, Antimicrobial Peptide Scanner v2, ADAM, AntiBP3.

Statistics: One-way ANOVA + Duncan's multiple range test, P<0,05.

Software: Microsoft Excel, GraphPad Prism, IBM SPSS Statistics version 27.

Funding: Center for Higher Education Funding and Assessment (PPAPT), Ministry of Higher Education, Science, and Technology of the Republic of Indonesia; Indonesian Endowment Fund for Education (LPDP), Ministry of Finance of the Republic of Indonesia; Indonesian Education Scholarship/BPI, Grant No. 00769/BPPT/BPI.06/9/2023, BPI ID 202327091759.

Acknowledgement: Genomic Laboratories ve Taksa Laboratories, KST Cibinong, National Research and Innovation Agency (BRIN).

Data Availability: Kaynak PDF'de ayrı data-availability statement bulunmamaktadır.

Conflict of Interest: Kaynak PDF'de ayrı conflict-of-interest statement bulunmamaktadır.

CRediT / Author Contributions: Kaynak PDF'de ayrı author-contribution veya CRediT bölümü bulunmamaktadır.

Ethical approval: Kaynakta ayrı etik kurul beyanı bulunmamaktadır. Çalışmanın bildirilen materyali marketten alınan işleme yan ürünleri ve kültür koleksiyonlarından sağlanan mikroorganizmalardır; insan katılımcı veya canlı hayvan müdahale deneyi raporlanmamaktadır.

Temel yorum sınırı: α-glukozidaz inhibition ve bacterial inhibition zones in vitro sonuçlardır; individual peptide bioactivity, toxicity, allergenicity, antidiabetic ve antimicrobial sonuçlarının önemli bölümü in silico prediction'dır. Bunlar clinical efficacy veya human safety sonucu oluşturmaz.

Kaynak-içi raporlama notu 1: Figure 1 Results aralığı yaklaşık %61,97–79,09 olarak verilirken aynı paragraf FMH <3 kDa için yaklaşık %79,45 bildirmektedir.

Kaynak-içi raporlama notu 2: Prose “two peptides” demesine rağmen Table 3 ve aynı cümlenin dizileri üç toxic-predicted peptide göstermektedir.

Kaynak-içi raporlama notu 3: Table 3–4 ile prose arasında bazı peptide sequence transcription farklılıkları vardır.

Kaynak-içi raporlama notu 4: Table 5 CAMPR4 header'ında üçüncü algorithm “SVM” olarak basılmıştır; yöntem, Results ve footnote üçüncü modelin ANN olduğunu belirtmektedir.

Kaynak-içi raporlama notu 5: SPAMPVPGPMGPMGPR peptide number bir Results cümlesinde 23 olarak görünürken diğer source context peptide 28'i desteklemektedir.

Kaynak-içi raporlama notu 6: AVFPSIVGRPR için Table 5 ile prose'daki bazı antimicrobial prediction score eşleştirmeleri uyuşmamaktadır.

Gelecek doğrulamalar: Molecular interaction analysis, gastrointestinal stability, bioavailability, ileri in vitro ve in vivo experiments.