Uchanganuzi wa wasifu wa spektra ya FTIR, ni mbinu ya spektroskopi inayopima alama ya kidole ya spektra yenye vigezo vingi inayotokana na mwingiliano wa vifungo vya molekuli katika sampuli ya kibayolojia na mionzi ya infraredi. Katika utafiti huu wa proof-of-concept, watafiti walichunguza kama sifa za FTIR katika seramu na tishu za uvimbe zilizofiksishwa kwa formalini na kupachikwa kwenye parafini kutoka kwa wagonjwa wenye cholangiocarcinoma zilihusiana na unyeti au usugu kwa gemcitabine uliobainishwa ex vivo kwa histoculture drug response assay (HDRA). Utafiti ulitumia sampuli 21 za seramu na tishu 10 za uvimbe za FFPE; kwa wagonjwa saba, sampuli za seramu na tishu zilikuwa jozi zinazolingana. Seramu ilichanganuliwa kwa ATR-FTIR, huku tishu ikichanganuliwa kwa mikrospektroskopi ya FTIR inayotumia mionzi ya synchrotron.

Katika kundi la seramu, wagonjwa 7 waliainishwa kuwa HDRA-nyeti na 14 kuwa HDRA-sugu; katika kundi la tishu za FFPE, wagonjwa 4 walikuwa nyeti na 6 sugu. Katika seramu, tofauti dhahiri za spektra zilionekana katika maeneo ya amide I na amide II yanayohusishwa na protini, na hasa uwiano wa intensiti wa 1633/1649 cm⁻¹, 1539/1649 cm⁻¹ na 1539/1633 cm⁻¹ uliendelea kutofautiana kati ya makundi mawili hata baada ya marekebisho ya kulinganisha mara nyingi ya Benjamini-Hochberg. Thamani ya P iliyorekebishwa kwa ulinganisho wote mitatu ilikuwa 0,041.

Katika matokeo ya FTIR ya tishu, ingawa tofauti nyingi za spektra, hasa katika maeneo ya amide I na II, na utengano wa sehemu wa makundi katika PLS-DA ulionekana, hakuna uwiano wa spektra wa tishu katika kiwango cha mgonjwa ulioonyesha tofauti yenye umuhimu wa kitakwimu. PCA ya seramu ilionyesha mwelekeo wa utengano wa uchunguzi kati ya makundi mawili ya HDRA, lakini mwingiliano kati ya makundi uliendelea kuwepo.

Kikomo muhimu zaidi cha tafsiri ya utafiti ni kwamba madaraja ya “nyeti kwa gemcitabine” na “sugu kwa gemcitabine” hayategemei matokeo halisi ya matibabu ya kliniki ya wagonjwa, bali yanategemea matokeo ya ex vivo HDRA yaliyofanywa kwenye tishu ya uvimbe wa upasuaji. Watafiti hawana data ya majibu ya kliniki kwa gemcitabine. Kwa hiyo, utafiti huu haujathibitisha kwamba sifa za FTIR za seramu zinaweza kutabiri ni mgonjwa gani atakayejibu gemcitabine kliniki.

Matokeo yanatoa ushahidi wa awali kwamba FTIR ya seramu inaweza kunasa tofauti za spektra zenye uzito wa protini zinazohusishwa na HDRA katika sampuli ya kibayolojia isiyo vamizi sana. Ili mbinu hii iwe biomarker ya kliniki, kipimo cha kuchagua matibabu au chombo cha matibabu yaliyobinafsishwa, inahitaji kuthibitishwa katika makundi makubwa zaidi ya wagonjwa yaliyoainishwa kliniki kwa majibu halisi ya matibabu.

Unyeti kwa Gemcitabine Uliofafanuliwa kwa HDRA Unamaanisha Nini?

Katika utafiti huu, “unyeti kwa gemcitabine” haumaanishi kwamba mgonjwa alijibu matibabu ya gemcitabine kliniki; unaelezea uainishaji wa ex vivo ulioundwa kutokana na kupima kwa HDRA majibu ya tishu ya cholangiocarcinoma iliyotolewa kwa upasuaji kwa gemcitabine katika mfumo wa histoculture nje ya mwili.

Cholangiocarcinoma ni nini?

Cholangiocarcinoma (CCA), ni uvimbe mbaya unaotokana na epitheliamu ya mirija ya nyongo. Kulingana na eneo la anatomia, inaweza kuainishwa kuwa intrahepatic cholangiocarcinoma (iCCA), perihilar cholangiocarcinoma (pCCA) na distal cholangiocarcinoma (dCCA).

Sampuli za utafiti zilipatikana kutoka kwa wagonjwa waliofanyiwa resection ya upasuaji katika Khon Kaen University Srinagarind Hospital nchini Thailand. Swali la utafiti la makala si kutambua CCA, bali kuchunguza uhusiano kati ya sifa za spektra za FTIR na unyeti wa ex vivo kwa gemcitabine.

HDRA ni nini?

Histoculture drug response assay (HDRA), ni mbinu ya kipimo cha kiutendaji ambapo tishu ya uvimbe wa upasuaji hukuzwa ex vivo, huwekwa kwenye dawa maalumu, na unyeti kwa dawa hutathminiwa kupitia mabadiliko ya uhai/shughuli ya tishu.

Data za HDRA katika makala hii zilitokana na utafiti wa awali uliotumia kundi hilohilo la wagonjwa. Tishu za uvimbe zilikuzwa kwa siku nne na kila hali ilijaribiwa katika visima vitatu vya utamaduni. Baada ya incubation, incubation ya ziada ya saa nne ilifanywa kwa kipimo cha MTT na absorbance ilipimwa katika 540 nm.

Uwiano wa uzuiaji wa HDRA unahesabiwaje?

Katika utafiti wa chanzo, uwiano wa uzuiaji ulitolewa kwa fomula ifuatayo:

\[ \%IR=\left[1-\left(\frac{T}{C}\right)\right]\times100 \]

%IR, ni inhibition rate, yaani uwiano wa uzuiaji.

T, ni absorbance ya wastani ya utamaduni wa uvimbe uliotibiwa kwa gemcitabine, iliyorekebishwa kwa uzito wa uvimbe.

C, ni absorbance ya wastani ya utamaduni wa kudhibiti usiotibiwa, iliyorekebishwa kwa uzito wa uvimbe.

Katika fomula, uwiano \(T/C\) unawakilisha ishara ya kimetaboliki iliyobaki katika tishu iliyotibiwa ikilinganishwa na tishu ya kudhibiti. Kadiri \(T\) inavyopungua ikilinganishwa na \(C\), \(T/C\) hupungua na \(1-(T/C)\) huongezeka; kwa hiyo %IR huongezeka. Kihisabati, uwiano mkubwa wa uzuiaji unaendana na uzuiaji mkubwa zaidi wa gemcitabine katika utamaduni wa ex vivo.

Utafiti ulitumia 1500 µg/mL gemcitabine pamoja na thamani ya kukata ya HDRA ya %43,28 iliyofafanuliwa hapo awali ili kuunda makundi ya nyeti/jibu na sugu.

Kikomo muhimu cha dozi: Thamani ya 1500 µg/mL ni konsentrashi ya ex vivo ya gemcitabine katika mfumo wa maabara wa HDRA. Si dozi ya kliniki inayotolewa kwa mgonjwa, kiwango cha damu au konsentrashi ya matibabu inayopendekezwa.

FTIR Inapima Nini katika Utafiti Huu?

Badala ya kutambua moja kwa moja protini moja moja katika seramu au tishu, FTIR hupima alama ya kidole ya pamoja ya spektra ya infraredi inayotokana na mitetemo ya vifungo vya molekuli ya biomolekuli nyingi, kama protini, asidi nukleiki, wanga, molekuli zenye fosfati na lipidi.

FTIR inamaanisha nini?

Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), ni mbinu ya spektroskopi inayopima ni katika namba gani za mawimbi mionzi ya infraredi hufyonzwa na modi za mtetemo wa vifungo vya molekuli.

Kwenye mhimili mlalo wa spektra, kitengo cm⁻¹ ni namba ya mawimbi. Namba ya mawimbi ni kiasi cha spektroskopi kinachohusiana na idadi ya mizunguko ya mawimbi katika urefu wa sentimita moja. Katika fasihi ya FTIR, kwa kuwa mitetemo ya vifungo maalumu hutoa ishara katika maeneo maalumu ya namba ya mawimbi, maeneo haya hutumiwa katika tafsiri ya kibiokemia.

Kwa nini Amide I na Amide II ni muhimu?

Tofauti nyingi zenye nguvu zaidi katika utafiti zilionekana katika maeneo yanayohusishwa na protini ya amide I na amide II.

Katika sampuli za tishu, amide I ilijitokeza karibu 1640 cm⁻¹, na amide II karibu 1541 cm⁻¹. Katika seramu, katika eneo la amide I, karibu 1649 na 1633 cm⁻¹, na katika eneo la amide II, karibu 1539 cm⁻¹ zilibainishwa kuwa sifa muhimu.

Chanzo kinahusisha eneo la amide I na muundo wa sekondari wa protini, hasa vipengele vya α-helix/β-sheet. Hata hivyo, bendi ya amide katika FTIR haipimi konsentrashi ya protini moja maalumu. Protini nyingi na hali za kimuundo zinaweza kuchangia eneo lilelile la namba ya mawimbi.

Je, FTIR ilipima protini za hENT1, dCK au RRM?

Hapana. Kutajwa kwa protini kama hENT1, dCK na RRM1/RRM2 ambazo zimehusishwa hapo awali na usugu kwa gemcitabine katika sehemu ya mjadala ya makala hakumaanishi kwamba protini hizi zilipimwa moja moja kwa FTIR katika utafiti huu. Waandishi pia wanaeleza wazi kwamba FTIR haiwezi kutambua moja kwa moja protini mahususi.

Kwa hiyo, tafsiri sahihi katika utafiti huu ni kwamba “sifa za spektra za pamoja zinazohusiana na protini zilitofautiana kati ya makundi ya HDRA”; haiwezi kuhitimishwa kwamba “protini maalumu ya usugu ilipimwa kwa FTIR ya seramu”.

Ulinganisho wa bendi za FTIR za seramu na tishu

Kuwepo kwa maeneo ya spektra yanayofanana kati ya seramu na tishu kunaashiria kwamba ishara za madaraja husika ya kibiokemia zipo katika sampuli zote mbili za kibayolojia. Hata hivyo, chanzo bado hakichukulii ufanano huu kuwa “ushahidi wa biomarker za pamoja”.

Tofauti Kati ya ATR-FTIR na Synchrotron FTIR ni Nini?

Katika utafiti huu, ATR-FTIR ilitumika kupima moja kwa moja sampuli ndogo za seramu kwenye kioo cha almasi cha ATR; mikrospektroskopi ya synchrotron FTIR ilitumika kuchunguza sifa za spektra za anga za maeneo ya tishu ya kiwango cha mikromita katika sehemu za uvimbe za FFPE.

Kipimo cha ATR-FTIR cha seramu

Vipimo vya seramu vilifanywa kwa kutumia Bruker Tensor II FTIR spectrometer na kioo cha almasi cha ATR.

• Kila sampuli ya seramu: takriban 5 µL.
• Kukausha kwenye kioo cha ATR: takriban dakika 10, chini ya mtiririko mpole wa hewa.
• Masafa ya spektra: 4000–400 cm⁻¹.
• Azimio la spektra: 4 cm⁻¹.
• Idadi ya skani zilizounganishwa kwa spektra moja: 64.
• Marudio ya kiufundi kwa kila mgonjwa: 5.
• Idadi ya wagonjwa: 21.
• Jumla ya spektra za seramu: 105.

Sampuli za damu kwa seramu ziliandaliwa kwa centrifuge katika 3000 g kwa dakika 10, katika 4 °C. Seramu ilihifadhiwa kwanza katika −80 °C, kisha baada ya kugawanywa katika aliquot ikahifadhiwa katika −20 °C. Kila aliquot iliyeyushwa mara moja tu mara moja kabla ya kipimo cha FTIR; mbinu hii ililenga kupunguza uharibifu unaoweza kusababishwa na mizunguko ya mara kwa mara ya kugandisha-kuyeyusha.

Kipimo cha FFPE SR-FTIR cha tishu

Vitalu vya uvimbe vya FFPE viligawanywa katika sehemu sambamba zenye unene wa 5 µm. Sehemu moja iliwekwa kwenye slaidi ya MirrIR yenye utoaji mdogo, huku sehemu sambamba inayolingana ikiwekwa kwenye slaidi ya kawaida ya kioo kwa rangi ya hematoxylin-eosin (H&E).

Kabla ya FTIR, sehemu za MirrIR zilifanyiwa deparaffinization kwa xylene, zikarejeshewa maji kwa mfululizo wa ethanoli wenye viwango tofauti, zikaoshwa kwa maji na kukaushwa kwa hewa katika halijoto ya chumba.

Mwanapatholojia alikagua kwa pamoja sehemu za H&E na MirrIR ili kuthibitisha ujanibishaji sahihi wa maeneo ya mikroskopi ambayo yangepimwa kwa FTIR.

Vipimo vilifanywa katika Synchrotron Light Research Institute Beamline 4.1 nchini Thailand.

• Mikroskopi ya FTIR: Hyperion 2000.
• Objektivu: 36X Cassegrain.
• Detektor: mercury-cadmium-telluride (MCT) iliyopozwa kwa nitrojeni kioevu.
• FTIR spectrometer: Bruker VERTEX 70.
• Aperture: 10 × 10 µm².
• Hali ya kipimo: reflection.
• Masafa ya spektra: 4000–600 cm⁻¹.
• Azimio: 4 cm⁻¹.
• Skani zilizounganishwa: 64.

Rangi inaonyesha nini katika picha za kemikali za FTIR za chanzo?

Ramani za rangi za kemikali za FTIR katika Kielelezo 1 cha chanzo si rangi ya histolojia wala “ramani ya usugu wa saratani” moja kwa moja. Kipimo cha Pseudocolour kinaonyesha mgawanyo wa anga wa intensiti ya jamaa ya ishara ya FTIR kwenye tishu katika maeneo ya spektra yaliyochaguliwa.

1800–900 cm⁻¹ eneo la fingerprint lina michango ya protini, asidi nukleiki, wanga na fosfolipidi, huku eneo la 1750–1480 cm⁻¹ likijumuisha hasa bendi za amide zinazohusiana na protini.

Je, PCA na PLS-DA Hufanya Kitu Kilekile katika Utafiti Huu?

Hapana. PCA iliyotumika kwa seramu ni mbinu ya uchunguzi isiyosimamiwa inayofichua utofauti wa spektra bila kutumia lebo ya daraja wakati wa mafunzo ya modeli; PLS-DA iliyotumika kwa tishu ya FFPE ni mbinu ya vigezo vingi inayosimamiwa inayojaribu kutenganisha makundi kwa kutumia lebo za HDRA-nyeti/sugu.

PCA ilifanya nini?

Principal component analysis (PCA; uchanganuzi wa vipengele vikuu), hubadilisha idadi kubwa ya vigezo vya spektra kuwa idadi ndogo ya vipengele vikuu vinavyofupisha utofauti unaohusiana.

Katika seramu, PCA ilifanywa kwenye spektra 105 za kiufundi zilizofanyiwa uchakataji wa awali. Kati ya hizo, 35 zilikuwa spektra tano za kiufundi za wagonjwa 7 HDRA-nyeti, na 70 zilikuwa za wagonjwa 14 HDRA-sugu.

Katika score plot ya Kielelezo 3 cha chanzo, PC1 inawakilisha %54 ya utofauti wa jumla wa spektra na PC2 %23. Utengano wa uchunguzi ulionekana kati ya makundi, lakini baadhi ya spektra ziliingiliana.

Kwa hiyo, matokeo ya PCA hayawezi kutafsiriwa kuwa “wagonjwa waliainishwa kwa usahihi wa %100 kwa FTIR ya seramu”. Chanzo hakiripoti accuracy, sensitivity, specificity au AUC ya uainishaji wa PCA.

PLS-DA ilifanya nini?

Partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), ni mbinu ya vigezo vingi inayosimamiwa inayotumia uhusiano kati ya vigezo vya spektra na lebo za daraja zinazojulikana mapema ili kujaribu kutenganisha makundi.

Katika uchanganuzi wa FFPE, daraja la HDRA-nyeti lilikodishwa kuwa +1 na daraja sugu kuwa −1.

Data ziligawanywa katika seti za mafunzo na majaribio kwa %70:%30 uwiano na katika kiwango cha mgonjwa. Haikuruhusiwa baadhi ya spektra za mgonjwa yuleyule ziende kwenye mafunzo na nyingine kwenye majaribio. Mbinu hii ni muhimu katika kupunguza hatari ya marudio ya kiufundi kuvuja utambulisho wa mgonjwa kwenye modeli.

Kwa kuwa kulikuwa na zaidi ya spektra moja kutoka sampuli moja ya tishu, leverage validation ilitumika katika tathmini ya modeli.

PLS-DA score plot ilionyesha tu utengano wa sehemu wa makundi. Chanzo hakiripoti accuracy, sensitivity, specificity, ROC-AUC au utendaji wa uthibitishaji huru wa nje. Kwa hiyo, Verianla haitengenezi metrika yoyote kati ya hizi.

Kwa nini uchakataji wa awali wa spektra ulifanywa?

Spektra ghafi za FTIR zinaweza kuathiriwa si tu na tofauti za kibiokemia bali pia na athari za kiufundi kama kuhama kwa baseline, mtawanyiko, unene wa sampuli na kipimo cha intensiti. Chanzo kilitumia Unscrambler X 10.4 ili kupunguza athari hizi.

Mpangilio wa uchakataji wa awali:

1. Ubadilishaji wa derivative ya pili ya Savitzky-Golay.
2. Daraja la derivative: 2.
3. Daraja la polynomial: 3.
4. Nukta ya kulainisha: 15.
5. Kisha extended multiplicative signal correction (EMSC).

Uchakataji wa derivative ya pili unaweza kufanya sifa za spektra zilizo karibu au zinazoingiliana zionekane zaidi na kupunguza vipengele vya baseline vinavyobadilika polepole. EMSC inalenga kunormalisha utofauti wa spektra unaotokana na kipimo na mtawanyiko.

Hata hivyo, chanzo kinataja kama kikomo kwamba marekebisho maalumu ya Resonant Mie scattering-EMSC (RMieS-EMSC) hayakutumika katika spektra za tishu za FFPE.

Uwiano Mitatu Muhimu ya FTIR katika Seramu Inapaswa Kutafsiriwaje?

1633/1649, 1539/1649 na 1539/1633 cm⁻¹ kuendelea kutofautiana kati ya makundi ya wagonjwa HDRA-nyeti na HDRA-sugu baada ya marekebisho ya kulinganisha mara nyingi ni matokeo ya kitakwimu yanayoonyesha kwamba sifa za FTIR zinazohusiana na protini za seramu zinahusiana na daraja la majibu ya ex vivo kwa gemcitabine; uwiano huu bado si biomarker zilizothibitishwa za kutabiri majibu ya kliniki kwa matibabu.

Uchanganuzi wa uwiano ulifanywaje?

Uchanganuzi wa uwiano wa spektra ulifanywa kando na uchanganuzi wa vigezo vingi wa PCA/PLS-DA. Vilele vikuu vya spektra vilichaguliwa kutoka spektra za wastani na loading plot, huku uwiano ukihesabiwa kutoka spektra ghafi.

Kwa kila mgonjwa, spektra za marudio ya kiufundi ziliwekwa wastani kwanza ili kuunda spektra moja mwakilishi wa mgonjwa. Hivyo, katika ulinganisho wa kitakwimu, kitengo msingi cha kibayolojia hakikuwa spektra bali mgonjwa.

Vilele vinne vilivyochaguliwa kwa seramu:

• 1649 cm⁻¹,
• 1633 cm⁻¹,
• 1539 cm⁻¹,
• 1042 cm⁻¹.

Uwiano sita wa jozi kati ya vilele hivi vinne ulichanganuliwa.

Uchanganuzi wa kitakwimu ulifanywa kwa mpangilio gani?

Takwimu zilichanganuliwa kwa GraphPad Prism 8.0.1.

1. Kwa kila uwiano, hali ya kawaida ya data ilitathminiwa kwa kipimo cha Shapiro-Wilk.
2. Kwa ulinganisho uliokuwa na mgawanyo wa kawaida, t-test isiyooanishwa yenye marekebisho ya Welch ilitumika.
3. Kwa data isiyo na mgawanyo wa kawaida, kipimo cha Mann-Whitney U kilitumika.
4. Kwa kuwa uwiano zaidi ya mmoja wa spektra ulijaribiwa, thamani za P zilirekebishwa kwa mbinu ya Benjamini-Hochberg.
5. Kiwango cha ugunduzi wa uongo (false discovery rate; FDR) kilidhibitiwa.
6. Katika uchanganuzi uliorekebishwa au unaohusika, P<0,05 ilitumika kama kizingiti cha umuhimu wa kitakwimu.

Kwa nini marekebisho ya Benjamini-Hochberg yanahitajika?

Wakati kulinganisha nyingi za kitakwimu zinafanywa kwenye data ileile, uwezekano wa kupata matokeo ya P<0,05 kwa bahati pekee huongezeka. Mbinu ya Benjamini-Hochberg hutathmini thamani zote za P kwa pamoja ili kujaribu kudhibiti uwiano wa matokeo chanya ya uongo.

Mfano mahususi katika utafiti huu ni uwiano wa 1042/1633. Katika uchanganuzi ghafi P=0,048 ilionekana chini ya 0,05, lakini baada ya marekebisho ya Benjamini-Hochberg iliongezeka hadi P=0,059 na haikuchukuliwa tena kuwa muhimu kitakwimu.

Ukubwa wa athari unaongeza nini?

Wakati thamani ya P hutathmini kiwango ambacho tofauti iliyoonekana hailingani na dhana ya kutokuwa na tofauti, ukubwa wa athari hutoa taarifa ya ziada kuhusu ukubwa wa tofauti kati ya makundi.

Kwa uwiano uliotumia Mann-Whitney U, chanzo kiliripoti rank-biserial r, na kwa uwiano uliotumia Welch t-test kiliripoti kipimo cha tofauti ya wastani iliyosanifishwa kinachoitwa Hedges' g.

Kwa kuwa mwelekeo wa alama ya ukubwa wa athari hutegemea mpangilio wa makundi na ufafanuzi wa hesabu, mwelekeo wa kibayolojia wa “mzuri/mbaya” haupaswi kuhitimishwa kwa kuangalia alama hasi au chanya pekee. Chanzo kinaonyesha kando katika Figure 4 mielekeo ya makundi iliyozingatiwa kwa uwiano.

Mwelekeo wa uwiano katika Figure 4 ulikuwaje?

Katika box plot za kiwango cha mgonjwa za chanzo, uwiano wa 1633/1649 na 1539/1649 unaonekana kuwa juu zaidi katika kundi HDRA-nyeti, huku uwiano wa 1539/1633 ukionekana kuwa juu zaidi katika kundi HDRA-sugu. Uwiano huu mitatu ndio uliobaki muhimu baada ya marekebisho ya kulinganisha mara nyingi.

Kwa kuwa chanzo hakikuchapisha thamani ghafi za wagonjwa za Figure 4 kwa jedwali, Verianla haizalishi upya box plot hizi kwa kuzigeuza takribani kuwa namba.

Nini kilipatikana katika uwiano wa tishu?

Katika tishu ya FFPE, 1640 cm⁻¹ ilitumika kama kilele cha marejeo na uwiano ulihesabiwa kwa kutumia vilele vya 1541, 1510, 1235, 1120 na 1075 cm⁻¹.

Kwa mujibu wa Supplemental Figure S1, hakuna uwiano ufuatao ulioonyesha tofauti muhimu kati ya makundi HDRA-nyeti na HDRA-sugu:

• 1541/1640,
• 1235/1640,
• 1120/1640,
• 1075/1640,
• 1025/1640.

Kwa hiyo, matokeo ya kitakwimu ya uwiano katika utafiti yanapatikana upande wa seramu; tofauti za spektra upande wa tishu zilionekana kama mwelekeo wa kuona/vigezo vingi lakini hazikuthibitishwa katika kipimo cha uwiano wa kiwango cha mgonjwa.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Muundo wa sampuli

Kwa wagonjwa saba, sampuli za seramu na tishu za FFPE zilikuwa jozi zinazolingana. Kwa hiyo, sampuli zote 21 za seramu na 10 za tishu si sampuli za watu wale wale zilizo katika jozi moja kwa moja.

Mgawanyo wa klinikopatolojia wa kohorti

Katika kundi la FFPE kulikuwa na visa vinne nyeti na sita sugu. Katika kundi nyeti kulikuwa na wanaume watatu na mwanamke mmoja; katika kundi sugu, wanaume wanne na wanawake wawili.

Katika kundi la seramu, kati ya visa saba nyeti, watano walikuwa wanaume na wawili wanawake; kati ya visa 14 sugu, wanane walikuwa wanaume na sita wanawake.

Utafiti unajumuisha uvimbe wa mirija ya nyongo wa intrahepatic na perihilar. Distal cholangiocarcinoma haikuripotiwa kama kundi tofauti la sampuli katika Table 1.

Matokeo ya picha za kemikali za FTIR za tishu

Katika picha za kemikali za FFPE, tofauti za mgawanyo wa anga wa ishara zilionekana kati ya tishu HDRA-nyeti na sugu katika eneo la fingerprint la 1800–900 cm⁻¹ na eneo lenye uzito wa protini la 1750–1480 cm⁻¹.

Katika baadhi ya maeneo ya fingerprint ya tishu sugu, intensiti ya jamaa ya spektra ilionekana kuwa juu zaidi. Hata hivyo, hizi ni picha representative na peke yake hazithibitishi mafanikio ya kiasi ya kuainisha wagonjwa.

Matokeo ya spektra ya FFPE SR-FTIR

Katika spektra za wastani za derivative ya pili, tofauti zilizo wazi zaidi zilionekana karibu 1640 na 1541 cm⁻¹ katika maeneo ya amide I/II.

Tofauti za ziada:

• 1235 cm⁻¹,
• 1120 cm⁻¹,
• 1075 cm⁻¹,
• 1025 cm⁻¹,
• 923 cm⁻¹.

Profaili za loading za PLS-DA zilionyesha kuwa hasa maeneo ya 1664, 1640, 1621, 1541, 1525, 1510, 1235, 1120, 1075, 1025 na 985 cm⁻¹ yalichangia utengano wa makundi.

Baadhi yake yanahusishwa na protini, wanga, vikundi vya fosfati na asidi nukleiki. Hata hivyo, hakuna uwiano wa tishu katika kiwango cha mgonjwa uliofikia umuhimu wa kitakwimu.

Matokeo ya spektra ya seramu ATR-FTIR

Tofauti muhimu katika spektra za wastani za derivative ya pili za seramu:

• Amide I: 1649 na 1633 cm⁻¹,
• Amide II: 1539 cm⁻¹,
• namba za mawimbi za chini: takriban 1123, 1077, 1042 na 1025 cm⁻¹

zilibainishwa.

Katika profaili ya loading ya PCA, 1649, 1633, 1583, 1558, 1539, 1512 na 1042 cm⁻¹ zilijitokeza.

Katika Figure 3 ya chanzo, sehemu ya kwanza ya PCA, PC1, inawakilisha %54 ya utofauti wa spektra na PC2 %23. Kuna mwelekeo unaoonekana wa utengano kati ya makundi mawili, lakini baadhi ya sampuli zinaingiliana.

Kwa nini spektra tano za seramu kwa kila mgonjwa ni muhimu?

Marudio matano si sampuli tano huru za kibayolojia zilizochukuliwa kutoka kwa mtu mmoja. Ni marudio ya kiufundi ya kipimo cha seramu ileile.

Katika uchanganuzi wa vigezo vingi, chanzo kilihifadhi spektra 105 kama uchunguzi tofauti wa spektra lakini kiligawa data katika kiwango cha mgonjwa. Katika takwimu za uwiano wa spektra, marudio matano ya kiufundi yaliwekwa wastani kwa kila mgonjwa.

Tofauti hii ya muundo ni muhimu; vinginevyo, kutafsiri vibaya kohorti ya watu 21 kama wagonjwa huru 105 kungeongeza ukubwa wa sampuli ya kitakwimu kuliko ulivyo.

Kwa nini kuna mwingiliano wa spektra?

Chanzo kinasisitiza kwamba CCA ni heterojeni kwa mabadiliko ya molekuli, aina ndogo ya histolojia, kiwango cha differentiation na maendeleo ya ugonjwa. Heterojeniti hii ya kibayolojia inaweza kuchangia kutofanana kabisa kwa profaili za FTIR za wagonjwa hata ndani ya daraja lilelile la HDRA.

Aidha, HDRA hupima majibu ya kiutendaji kwa dawa katika hali maalumu za majaribio, huku FTIR ikihisi muundo mzima wa kibiokemia kwa pamoja. Kwa hiyo, haipaswi kutarajiwa kwamba vipimo hivi viwili vinapima sifa ileile ya kibayolojia moja kwa moja.

Sampuli zisizolingana zilizojadiliwa katika chanzo

Ingawa sampuli nyingi zilionyesha clustering ya spektra inayolingana na daraja lao la HDRA, visa vichache vilibaki visivyolingana.

Sampuli moja iliyokuwa HDRA-sugu lakini ilicluster karibu na kundi nyeti katika FTIR ilikuwa na sifa za klinikopatolojia zisizo kali sana, kama histolojia iliyodifferentiation vizuri zaidi na kutokuwepo kwa metastasis ya nodi za limfu.

Kinyume chake, sampuli moja iliyokuwa HDRA-nyeti lakini ilicluster karibu na kundi sugu katika FTIR ilikuwa na utambuzi wa combined hepatocellular-cholangiocarcinoma (cHCC-CCA) na ilionyesha sifa kali zaidi kama differentiation ya kiwango cha kati, uvamizi wa mishipa na metastasis ya nodi za limfu.

Waandishi wanajadili uchunguzi huu kama uwezekano kwamba fenotipu ya spektra ya FTIR inaweza kuakisi si majibu ya dawa pekee bali pia biolojia pana ya uvimbe. Tafsiri hii ni ya uchunguzi na haithibitishi sababu na athari katika sampuli ndogo ya sasa.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• Katika spektra za FTIR za seramu, tofauti zilionekana kati ya makundi HDRA-nyeti na sugu, hasa katika maeneo ya amide I na II.
• Uchanganuzi wa PCA wa seramu ulionyesha utengano wa uchunguzi na mwingiliano wa sehemu kati ya makundi.
• Uwiano wa seramu wa 1633/1649, 1539/1649 na 1539/1633 cm⁻¹ uliendelea kuwa muhimu baada ya marekebisho ya Benjamini-Hochberg.
• Thamani ya P iliyorekebishwa kwa ulinganisho mitatu muhimu ilikuwa 0,041.
• Ingawa thamani ghafi ya P ya uwiano wa 1042/1633 ilikuwa 0,048, thamani ya P iliyorekebishwa ilikuwa 0,059 na haikuvuka kizingiti cha umuhimu.
• Katika spektra za tishu za FFPE, tofauti katika maeneo ya amide na fingerprint pamoja na utengano wa sehemu katika PLS-DA zilionekana.
• Hakuna uwiano wa spektra wa tishu za FFPE ulioonyesha tofauti muhimu.
• Baadhi ya maeneo ya spektra ya kibiokemia yanayofanana yalionekana katika seramu na tishu.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono

• Haijathibitishwa kwamba FTIR ya seramu inatabiri majibu ya kliniki kwa gemcitabine.
• Haijaonyeshwa kwamba FTIR ni kipimo cha kliniki kilichothibitishwa kinachoweza kutumika kuchagua matibabu.
• Majibu halisi ya matibabu ya wagonjwa waliopokea gemcitabine hayakuchanganuliwa katika utafiti.
• Haijaonyeshwa kwamba uwiano wa spektra unatabiri kuishi au maendeleo ya ugonjwa.
• FTIR haikupima moja kwa moja konsentrashi ya protini moja maalumu.
• hENT1, dCK, RRM1/RRM2, GLUT1, PKM2 au LDHA hazikupimwa moja moja katika jaribio hili.
• Hakuna thamani ya clinical classification accuracy, sensitivity, specificity au ROC-AUC iliyotolewa kwa PCA/PLS-DA.
• Haijaonyeshwa kwamba matokeo kutoka kwa wagonjwa 21 wa seramu yanaweza kujumlishwa kwa idadi yote ya watu wenye CCA.
• Uhusiano kati ya FTIR na HDRA si ushahidi wa mekanizimu ya sababu.

Vikwazo vikuu vya utafiti

Sampuli ndogo: Seramu n=21, tishu ya FFPE n=10. Waandishi wanaeleza wazi kwamba kohorti ndogo inapunguza uwezo wa kujumlisha matokeo.

Hakuna jibu la kliniki la matibabu: Lebo za nyeti/sugu zinatokana na ex vivo HDRA. Majibu halisi ya kliniki ya wagonjwa kwa gemcitabine hayapo katika utafiti wa sasa.

Muda kamili wa kuhifadhi seramu haukurekodiwa: Ingawa sampuli zilihifadhiwa katika hali za kawaida, hakuna rekodi kamili ya muda wa jumla wa kuhifadhi kila seramu.

Mabaki ya parafini katika FFPE: Ingawa deparaffinization ilifanywa, kuondolewa kabisa kwa parafini hakukuthibitishwa kwa njia huru na ya kiasi. Chanzo kinaeleza hasa kwamba eneo la 1400–1000 cm⁻¹ linaweza kuathiriwa na parafini iliyobaki.

Marekebisho ya mtawanyiko wa Mie: EMSC ilitumika, lakini marekebisho maalumu ya mtawanyiko wa Mie kama RMieS-EMSC hayakufanywa.

Heterojeniti ya CCA: Aina ndogo ya uvimbe, histolojia, differentiation na sifa nyingine za klinikopatolojia zinaweza kuchangia utofauti wa spektra.

Mekanizimu ya molekuli haikupimwa moja kwa moja: Tofauti za FTIR zinaonyesha alama ya pamoja ya kibiokemia; njia gani ya molekuli inayosababisha tofauti hii haikubainishwa moja kwa moja.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Utafiti asilia: Serum FTIR spectral features associated with HDRA-defined gemcitabine sensitivity in cholangiocarcinoma

Waandishi: Kanokporn Matra; Patutong Chatchawal; Molin Wongwattanakul; Patipat Rachawangmuang; Sutthiwan Janthamala; Thanaphong Rattanathip; Sirinart Chio-Srichan; Chanchai Hongsa; Malinee Thanee; Supakan Amontailak; Juthamas Jaimanee; Piyapong Simtong; Anchalee Techasen.

Mwandishi wa mawasiliano: Anchalee Techasen.

Barua pepe ya mwandishi wa mawasiliano: anchte@kku.ac.th

Taasisi 1: Biomedical Science Program, Graduate School, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Taasisi 2: School of Medical Technology, Faculty of Associated Medical Sciences, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Taasisi 3: Beamline Division, Synchrotron Light Research Institute (Public Organization), Nakhon Ratchasima, Thailand.

Taasisi 4: Department of Pathology, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Taasisi 5: Cholangiocarcinoma Research Institute, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Jarida: Biomolecules and Biomedicine.

Aina ya uchapishaji: Research Article; utafiti wa proof-of-concept wa sampuli za kibayolojia za binadamu.

DOI: 10.17305/bb.2026.14765.

Tarehe ya kuwasilisha: 18 Julai 2026.

Tarehe ya kukubaliwa: 29 Septemba 2026.

Tarehe ya kuchapishwa mtandaoni: 7 Oktoba 2026.

Hali ya bibliografia: Rekodi ya PubMed inaonyesha makala kama ahead of print. PDF iliyopakiwa bado haina juzuu, toleo au masafa ya kurasa.

Mchapishaji: Association of Basic Medical Sciences.

Mapitio ya rika: Biomolecules and Biomedicine ni jarida linalopitiwa na wenzao; sera rasmi ya jarida hutumia double-blind peer review na wakaguzi 2-5 wa nje.

Leseni: Creative Commons Attribution 4.0 International — CC BY 4.0.

Idhini ya maadili: Khon Kaen University Ethics Committee for Human Research, Reference No. HE681229.

Kiwango cha maadili: Kanuni za Declaration of Helsinki na ICH Good Clinical Practice.

Ridhaa iliyoarifiwa: Written informed consent ilipatikana kutoka kwa washiriki wote.

Ufadhili: Utafiti wa Khon Kaen University wa “Integrated Accurate Diagnostic and Targeted Therapeutic Strategies in hepato-pancreato-biliary cancer” uliungwa mkono na National Science Research and Innovation Fund (NSRF).

Shukrani: Synchrotron Light Research Institute (SLRI), Thailand ilishukuriwa kwa beamtime allocation.

Mgongano wa maslahi: Waandishi walitangaza kwamba hakuna mgongano wa maslahi.

Upatikanaji wa data: Imeelezwa kuwa data zinazounga mkono matokeo ya utafiti zinaweza kupatikana kutoka kwa mwandishi wa mawasiliano baada ya ombi linalofaa.

Michango ya waandishi: Hakuna sehemu tofauti ya Author Contributions au CRediT katika PDF kuu iliyochunguzwa.

Mchango sawa: Hakuna tamko la mchango sawa au uandishi wa kwanza wa pamoja katika PDF iliyochunguzwa.

Preprint: Hakuna toleo tofauti la preprint lililotajwa katika PDF iliyochunguzwa au rekodi ya bibliografia iliyothibitishwa.

Sampuli: Seramu 21 na tishu 10 za uvimbe za FFPE; jozi saba zinazolingana za seramu-tishu.

Makundi ya HDRA: Seramu: 7 nyeti, 14 sugu. FFPE: 4 nyeti, 6 sugu.

Hali ya HDRA: Histoculture ya uvimbe ya siku nne; visima vitatu kwa kila hali; kisha incubation ya MTT ya saa 4; absorbance ya 540 nm; gemcitabine 1500 µg/mL; thamani ya kukata ya uainishaji iliyotumika katika chanzo %IR=43,28.

Maandalizi ya seramu: 3000 g, dakika 10, centrifuge katika 4 °C; kuhifadhi kwanza katika −80 °C, kisha baada ya aliquot katika −20 °C; kila aliquot iliyeyushwa mara moja tu kabla ya FTIR.

Seramu ATR-FTIR: Tensor II FTIR, ATR ya almasi; takriban 5 µL seramu; takriban dakika 10 za kukausha; 4000–400 cm⁻¹; 4 cm⁻¹ azimio; 64 co-added scan; marudio matano ya kiufundi kwa kila mgonjwa.

FFPE SR-FTIR: Sehemu ya 5 µm; mikroskopi ya Hyperion 2000; objektivu ya 36X Cassegrain; detektor ya MCT; VERTEX 70 FTIR; 10 × 10 µm² aperture; reflection mode; 4000–600 cm⁻¹; 4 cm⁻¹; 64 co-added scan.

Uchakataji wa awali wa spektra: Unscrambler X 10.4; derivative ya pili ya Savitzky-Golay, derivative order 2, polynomial order 3, 15 smoothing point; kisha EMSC.

Uchanganuzi wa vigezo vingi wa tishu: PLS-DA; HDRA nyeti +1, sugu −1; mgawanyo wa mafunzo-majaribio %70:%30 katika kiwango cha mgonjwa; leverage validation.

Uchanganuzi wa vigezo vingi wa seramu: PCA isiyosimamiwa; jumla ya spektra 105 za kiufundi za seramu.

Uchanganuzi wa uwiano katika kiwango cha mgonjwa: Marudio ya kiufundi yaliwekwa wastani kwa kila mgonjwa kwanza, kisha uwiano wa spektra ulilinganishwa.

Takwimu: GraphPad Prism 8.0.1; kipimo cha hali ya kawaida cha Shapiro-Wilk; t-test isiyooanishwa yenye marekebisho ya Welch au Mann-Whitney U; marekebisho ya Benjamini-Hochberg FDR; kizingiti cha umuhimu P<0,05.

Matokeo makuu ya seramu: Uwiano wa 1633/1649, 1539/1649 na 1539/1633 cm⁻¹ uliendelea kuwa muhimu baada ya marekebisho ya Benjamini-Hochberg; adjusted P=0,041.

Matokeo ya tishu: Katika tishu ya FFPE, hakuna uwiano wa spektra wa kiwango cha mgonjwa ulioonyesha tofauti muhimu.

Kikomo cha marudio ya kiufundi: Spektra 105 za seramu si wagonjwa huru 105; ni marudio matano ya kiufundi ya kila mmoja wa wagonjwa 21.

Kikomo cha kliniki: Lebo za nyeti/sugu zinategemea ex vivo HDRA; data za majibu ya kliniki kwa matibabu ya gemcitabine hazipo.

Kikomo cha biomarker: Uwiano mitatu muhimu ya seramu si biomarker za kutabiri zilizothibitishwa kliniki. Uthibitishaji unahitajika katika kohorti kubwa zaidi zenye majibu halisi ya matibabu yanayojulikana.

Kikomo cha tafsiri ya molekuli: FTIR hupima alama ya pamoja ya kibiokemia; protini maalumu au njia ya kimetaboliki haijapimwa moja kwa moja kwa kiasi.

Kikomo cha kiufundi cha FFPE: Kuondolewa kabisa kwa parafini hakujathibitishwa kwa njia huru na kuna uwezekano wa athari ya parafini iliyobaki katika eneo la 1400–1000 cm⁻¹.

Kikomo cha marekebisho ya mtawanyiko: EMSC ilitumika, lakini dedicated Mie scattering correction / RMieS-EMSC haikutumika.

Kikomo cha kuhifadhi seramu: Ingawa sampuli zilihifadhiwa katika hali zilizosanifishwa, muda sahihi wa kuhifadhi haukurekodiwa.