FTIR спектралдык профилдөө, биологиялык үлгүдөгү молекулалык байланыштардын инфракызыл нурлануу менен өз ара аракеттенүүсүнөн түзүлгөн көп өзгөрмөлүү спектралдык манжа изин өлчөөчү спектроскопиялык ыкма. Бул proof-of-concept изилдөөдө изилдөөчүлөр холангиокарцинома менен ооруган бейтаптардан алынган сывороткадагы жана формалин менен фиксацияланып, парафинге салынган шишик ткандарындагы FTIR өзгөчөлүктөрү гистомаданияттагы дарыга жооп тести (HDRA) аркылуу ex vivo аныкталган гемцитабинге сезгичтик жана туруктуулук менен байланыштуубу же жокпу изилдешкен. Изилдөөдө 21 сыворотка үлгүсү жана 10 FFPE шишик тканы колдонулган; жети бейтапта сыворотка жана ткань үлгүлөрү жупташкан. Сыворотка ATR-FTIR менен, ткань болсо синхротрондук нурланууга негизделген FTIR микроспектроскопиясы менен анализделген.

Сыворотка тобунда 7 бейтап HDRA-сезгич, 14 бейтап HDRA-туруктуу; FFPE ткань тобунда болсо 4 бейтап сезгич жана 6 бейтап туруктуу деп классификацияланган. Сывороткада белоктор менен байланышкан amide I жана amide II аймактарында айкын спектралдык айырмачылыктар байкалган жана өзгөчө 1633/1649 cm⁻¹, 1539/1649 cm⁻¹ жана 1539/1633 cm⁻¹ интенсивдүүлүк катыштары Benjamini-Hochberg көп жолу салыштырууга түзөтүү жүргүзүлгөндөн кийин да эки топтун ортосунда айырмалуу бойдон калган. Үч салыштыруунун тең түзөтүлгөн P мааниси 0,041 болгон.

Ткань FTIR натыйжаларында amide I жана II аймактарынан баштап көптөгөн спектралдык айырмачылыктар жана PLS-DAда жарым-жартылай топтук бөлүнүү байкалганы менен, бейтап деңгээлиндеги ткань спектралдык катыштарынын эч бири статистикалык жактан маанилүү айырма көрсөткөн эмес. Сыворотканын PCAсы эки HDRA тобунда изилдөөчү бөлүнүү тенденциясын көрсөткөн, бирок топтор арасында кабатташуу да калган.

Изилдөөнүн эң маанилүү чечмелөө чеги — “гемцитабинге сезгич” жана “гемцитабинге туруктуу” класстары бейтаптардын чыныгы клиникалык дарылоо жыйынтыктарына эмес, хирургиялык шишик тканында жүргүзүлгөн ex vivo HDRA жыйынтыгына негизделет. Изилдөөчүлөрдө клиникалык гемцитабинге жооп жөнүндө маалымат жок. Ошондуктан сыворотка FTIR өзгөчөлүктөрү клиникада кайсы бейтап гемцитабинге жооп берерин алдын ала айта турганы бул изилдөө менен далилденген эмес.

Натыйжалар сыворотка FTIR азыраак инвазивдүү биологиялык үлгүдө HDRA менен байланышкан, белокко басымдуу спектралдык айырмачылыктарды кармай аларын көрсөткөн алгачкы далилди берет. Мунун клиникалык биомаркерге, дарылоо тандоо тестине же жекелештирилген дарылоо куралына айланышы үчүн чоңураак жана чыныгы дарылоо жооптору клиникалык түрдө белгиленген бейтап когортторунда ырастоо керек.

HDRA менен Аныкталган Гемцитабинге Сезгичтик Эмнени Билдирет?

Бул изилдөөдө “гемцитабинге сезгичтик” бейтап клиникада гемцитабин дарылоосуна жооп берди дегенди билдирбейт; хирургиялык жол менен алынган холангиокарцинома тканынын организмден тышкаркы гистомаданият системасында гемцитабинге берген жообун HDRA менен өлчөөнүн негизинде түзүлгөн ex vivo классификацияны билдирет.

Холангиокарцинома деген эмне?

Холангиокарцинома (CCA), өт жолдорунун эпителийинен келип чыккан залалдуу шишик. Анатомиялык жайгашуусуна жараша интра-гепатикалык холангиокарцинома (iCCA), перихилярдык холангиокарцинома (pCCA) жана дисталдык холангиокарцинома (dCCA) деп классификацияланышы мүмкүн.

Изилдөөнүн үлгүлөрү Таиланддагы Khon Kaen University Srinagarind Hospitalда хирургиялык резекция жасалган бейтаптардан алынган. Макаланын изилдөө суроосу CCA диагнозун коюу эмес, FTIR спектралдык өзгөчөлүктөрүнүн ex vivo гемцитабинге сезгичтик менен байланышын изилдөө.

HDRA деген эмне?

Histoculture drug response assay (HDRA), хирургиялык шишик тканы ex vivo өстүрүлүп, белгилүү бир дарыга дуушар кылынган жана ткань жашоосундагы/активдүүлүгүндөгү өзгөрүү аркылуу дарыга сезгичтик бааланган функционалдык тест ыкмасы.

Бул макаладагы HDRA маалыматтары ошол эле бейтап когорту менен мурда жүргүзүлгөн изилдөөдөн алынган. Шишик ткандары төрт күн өстүрүлүп, ар бир шарт үч маданият кудугунда текшерилген. Инкубациядан кийин MTT тести үчүн кошумча төрт саат инкубация жүргүзүлүп, абсорбанс 540 nmде өлчөнгөн.

HDRA ингибиция катышы кантип эсептелет?

Булак изилдөөдө ингибиция катышы төмөнкү формула менен берилген:

\[ \%IR=\left[1-\left(\frac{T}{C}\right)\right]\times100 \]

%IR, inhibition rate, башкача айтканда ингибиция катышы.

T, гемцитабин колдонулган шишик маданиятынын шишик салмагына нормалдаштырылган орточо абсорбансы.

C, дарылоо берилбеген контролдук маданияттын шишик салмагына нормалдаштырылган орточо абсорбансы.

Формулада \(T/C\) катышы дарыланган ткандын контролдук тканга салыштырмалуу калган метаболикалык сигналын билдирет. \(T\) мааниси \(C\)ге салыштырмалуу азайган сайын \(T/C\) төмөндөйт жана \(1-(T/C)\) чоңоёт; натыйжада %IR жогорулайт. Математикалык жактан жогорку ингибиция катышы ex vivo маданиятта гемцитабиндин күчтүүрөөк ингибициясына шайкеш.

Изилдөө 1500 µg/mL гемцитабин үчүн мурда аныкталган %43,28 HDRA кесүү маанисин сезгич/жооп берүүчү жана туруктуу топторду түзүү үчүн колдонгон.

Маанилүү доза чеги: 1500 µg/mL мааниси HDRA лабораториялык системасындагы ex vivo гемцитабин концентрациясы. Бул бейтапка берилүүчү клиникалык доза, кандагы деңгээл же сунушталган дарылоо концентрациясы эмес.

FTIR Бул Изилдөөдө Эмнени Өлчөйт?

FTIR сыворотка же ткань ичиндеги өзүнчө белокторду түздөн-түз аныктоонун ордуна белоктор, нуклеин кислоталары, углеводдор, фосфат камтыган молекулалар жана липиддер сыяктуу көптөгөн биомолекулалардын молекулалык байланыш термелүүлөрүнөн турган бириккен инфракызыл спектралдык манжа изин өлчөйт.

FTIR эмнени билдирет?

Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), инфракызыл нурланууну молекулалык байланыштардын термелүү режимдери кайсы толкун сандарында жутарын өлчөгөн спектроскопиялык ыкма.

Спектрдин горизонталдык огунда колдонулган cm⁻¹ бирдиги толкун саны. Толкун саны бир сантиметр узундукка туура келген толкун циклдеринин саны менен байланышкан спектроскопиялык чоңдук. FTIR адабиятында белгилүү байланыштардын термелүүлөрү белгилүү толкун саны аймактарында сигнал түзгөндүктөн, бул аймактар биохимиялык чечмелөөдө колдонулат.

Amide I жана Amide II эмне үчүн маанилүү?

Изилдөөдөгү эң күчтүү айырмачылыктардын көбү белоктор менен байланышкан amide I жана amide II аймактарында байкалган.

Ткань үлгүлөрүндө amide I болжол менен 1640 cm⁻¹, amide II болжол менен 1541 cm⁻¹ тегерегинде өзгөчө көрүнгөн. Сывороткада amide I аймагында болжол менен 1649 жана 1633 cm⁻¹, amide II аймагында болжол менен 1539 cm⁻¹ маанилүү өзгөчөлүктөр катары аныкталган.

Булак amide I аймагын белоктун экинчилик түзүлүшү жана өзгөчө α-спираль/β-катмар компоненттери менен байланыштырат. Бирок FTIRдагы amide тилкеси белгилүү бир белоктун концентрациясын өлчөбөйт. Бир эле толкун саны аймагына көптөгөн белоктор жана түзүмдүк абалдар салым кошо алат.

FTIR hENT1, dCK же RRM белокторун өлчөдүбү?

Жок. Макаланын талкуу бөлүмүндө hENT1, dCK жана RRM1/RRM2 сыяктуу мурда гемцитабинге туруктуулук менен байланышкан белоктор жөнүндө сөз болушу бул белоктор азыркы изилдөөдө FTIR менен өз-өзүнчө өлчөнгөн дегенди билдирбейт. Авторлор да FTIR жеке белокторду түздөн-түз аныктай албасын ачык белгилешет.

Ошондуктан бул изилдөөдө туура чечмелөө “белок менен байланышкан курамдуу спектралдык өзгөчөлүктөр HDRA топторунун ортосунда айырмаланды” түрүндө; “белгилүү бир туруктуулук белогу сыворотка FTIR менен өлчөндү” деген жыйынтык чыгарууга болбойт.

Сыворотка жана ткань FTIR тилкелерин салыштыруу

Сыворотка менен ткань арасында окшош спектралдык аймактардын болушу эки биологиялык үлгүдө тиешелүү биохимиялык класстарга тиешелүү сигналдар бар экенин болжолдойт. Бирок булак бул окшоштукту азырынча “жалпы биомаркерлердин далили” катары кабыл албайт.

ATR-FTIR менен Синхротрон FTIRдин Айырмасы Эмне?

Бул изилдөөдө ATR-FTIR аз көлөмдөгү сыворотка үлгүлөрүн түздөн-түз алмаз ATR кристалында өлчөө үчүн колдонулган; синхротрон FTIR микроспектроскопиясы болсо FFPE шишик кесиндилериндеги микрометр масштабындагы ткань аймактарынын мейкиндик спектралдык өзгөчөлүктөрүн изилдөө үчүн колдонулган.

Сыворотка ATR-FTIR өлчөөсү

Сыворотка өлчөөлөрү Bruker Tensor II FTIR спектрометри жана алмаз ATR кристалы менен жүргүзүлгөн.

• Ар бир сыворотка үлгүсү: болжол менен 5 µL.
• ATR кристалында кургатуу: болжол менен 10 мүнөт, жеңил аба агымы астында.
• Спектралдык диапазон: 4000–400 cm⁻¹.
• Спектралдык ажыратуучулук: 4 cm⁻¹.
• Бир спектр үчүн бириктирилип алынган скандардын саны: 64.
• Ар бир бейтап үчүн техникалык кайталоо: 5.
• Бейтаптардын саны: 21.
• Жалпы сыворотка спектри: 105.

Сыворотка кан үлгүлөрү 3000 gде 10 мүнөт, 4 °Cде центрифугаланып даярдалган. Сыворотка алгач −80 °Cде, андан кийин аликвотторго бөлүнгөн соң −20 °Cде сакталган. Ар бир аликвот FTIR өлчөөсүнүн алдында бир гана жолу эритилген; бул ыкма кайталанган тоңдуруу-эритүү циклдеринен келип чыга турган бузулууну азайтууга багытталган.

FFPE ткань SR-FTIR өлчөөсү

FFPE шишик блоктору 5 µm калыңдыктагы параллелдүү кесиндилерге бөлүнгөн. Бир кесинди MirrIR төмөн эмиссиялуу слайдга, ага туура келген параллелдүү кесинди болсо гематоксилин-эозин (H&E) боёосу үчүн стандарттык айнек слайдга жайгаштырылган.

FTIRга чейин MirrIR кесиндилери ксилол менен депарафинизацияланып, баскычтуу этанол сериялары менен кайра гидратацияланып, суу менен жуулуп, бөлмө температурасында абада кургатылган.

Патолог H&E жана MirrIR кесиндилерин чогуу карап, FTIR өлчөөсү жүргүзүлө турган микроскопиялык аймактардын туура локализациясын текшерген.

Өлчөөлөр Таиланддагы Synchrotron Light Research Institute Beamline 4.1 бөлүмүндө жүргүзүлгөн.

• FTIR микроскобу: Hyperion 2000.
• Объектив: 36X Cassegrain.
• Детектор: суюк азот менен муздатылган mercury-cadmium-telluride (MCT).
• FTIR спектрометри: Bruker VERTEX 70.
• Aperture: 10 × 10 µm².
• Өлчөө режими: reflection.
• Спектралдык диапазон: 4000–600 cm⁻¹.
• Ажыратуучулук: 4 cm⁻¹.
• Бириктирилип алынган скан: 64.

Булактагы FTIR химиялык сүрөттөрүндө түс эмнени көрсөтөт?

Булактагы 1-сүрөттөгү түстүү FTIR химиялык карталары гистологиялык боёо же түздөн-түз “ракка туруктуулук картасы” эмес. Pseudocolour шкаласы тандалган спектралдык аймактардагы салыштырмалуу FTIR сигнал интенсивдүүлүгүнүн ткань үстүндөгү мейкиндик бөлүштүрүлүшүн көрсөтөт.

1800–900 cm⁻¹ fingerprint аймагы белок, нуклеин кислотасы, углевод жана фосфолипид салымдарын камтыйт, ал эми 1750–1480 cm⁻¹ аймагы негизинен белок менен байланышкан amide тилкелерин камтыйт.

PCA жана PLS-DA Бул Изилдөөдө Бир Эле Нерсени Жасайбы?

Жок. Сыворотка үчүн колдонулган PCA класс белгисин модель окутууда колдонбой туруп спектралдык вариацияны ачып берген көзөмөлсүз изилдөө ыкмасы; FFPE ткань үчүн колдонулган PLS-DA болсо HDRA сезгич/туруктуу белгилерин колдонуп топторду ажыратууга аракет кылган көзөмөлдөнгөн көп өзгөрмөлүү ыкма.

PCA эмне кылды?

Principal component analysis (PCA; негизги компоненттер анализи), көп сандагы спектралдык өзгөрмөлөрдү өз ара байланышкан вариацияны жалпылаган азыраак сандагы негизги компоненттерге айландырат.

Сывороткада PCA алдын ала иштетилген 105 техникалык спектрде жүргүзүлгөн. Алардын 35 спектри 7 HDRA-сезгич бейтапка, 70 спектри 14 HDRA-туруктуу бейтапка тиешелүү болгон; ар бир бейтаптан беш техникалык спектр алынган.

Булактагы Figure 3 score plotунда PC1 жалпы спектралдык вариациянын %54 бөлүгүн, PC2 болсо %23 бөлүгүн билдирет. Топтор арасында изилдөөчү бөлүнүү байкалган, бирок айрым спектрлер кабатташкан.

Ошондуктан PCA жыйынтыгын “сыворотка FTIR менен бейтаптар %100 туура классификацияланды” деп чечмелөөгө болбойт. Булак PCA классификациясынын тактыгын, сезгичтигин, спецификалуулугун же AUC маанисин билдирбейт.

PLS-DA эмне кылды?

Partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), спектралдык өзгөрмөлөр менен алдын ала белгилүү класс белгилеринин ортосундагы байланышты колдонуп топторду ажыратууга аракет кылган көзөмөлдөнгөн көп өзгөрмөлүү ыкма.

FFPE анализинде HDRA-сезгич класс +1, туруктуу класс −1 деп коддолгон.

Маалыматтар окутуу жана тест топтомдоруна %70:%30 катышында жана бейтап деңгээлинде бөлүнгөн. Бир эле бейтаптан келген спектрлердин бир бөлүгүн окутууга, башка бөлүгүн тестке бөлүүгө жол берилген эмес. Бул ыкма техникалык кайталоолор бейтаптын идентификациясын моделге өткөрүп жиберүү коркунучун азайтуу үчүн маанилүү.

Бир ткань үлгүсүндө бир нече спектр болгондуктан модель баалоодо leverage validation колдонулган.

PLS-DA score plot болгону жарым-жартылай топтук бөлүнүүнү көрсөткөн. Булак классификация accuracy, sensitivity, specificity, ROC-AUC же көз карандысыз тышкы валидация көрсөткүчүн билдирбейт. Ошондуктан Verianla бул метрикалардын эч бирин чыгарбайт.

Спектралдык алдын ала иштетүү эмне үчүн жасалды?

Чийки FTIR спектрлерине биохимиялык айырмачылыктар гана эмес, baseline жылышы, чачыроо, үлгү калыңдыгы жана интенсивдүүлүк масштабы сыяктуу техникалык таасирлер да таасир этиши мүмкүн. Булак бул таасирлерди азайтуу үчүн Unscrambler X 10.4 колдонгон.

Алдын ала иштетүү тартиби:

1. Savitzky-Golay экинчи туунду өзгөртүүсү.
2. Туунду даражасы: 2.
3. Полином даражасы: 3.
4. Жумшартуу чекити: 15.
5. Андан кийин extended multiplicative signal correction (EMSC).

Экинчи туунду иштетүү бири-бирине жакын же кабатташкан спектралдык өзгөчөлүктөрдү даана көрсөтүп, жай өзгөргөн baseline компоненттерин азайтышы мүмкүн. EMSC болсо масштаб жана чачыроодон келип чыккан спектралдык вариацияларды нормалдаштырууга багытталган.

Ошол эле учурда булак FFPE ткань спектрлеринде атайын Resonant Mie scattering-EMSC (RMieS-EMSC) түзөтүүсү колдонулбаганын чектөө катары белгилейт.

Сывороткадагы Үч Маанилүү FTIR Катышын Кантип Чечмелөө Керек?

1633/1649, 1539/1649 жана 1539/1633 cm⁻¹ катыштары HDRA-сезгич жана HDRA-туруктуу бейтап топторунун ортосунда көп жолу салыштырууга түзөтүүдөн кийин да айырмалуу бойдон калышы сывороткадагы белок менен байланышкан FTIR өзгөчөлүктөрү ex vivo гемцитабинге жооп классы менен байланыштуу экенин көрсөткөн статистикалык табылга; бул катыштар азырынча клиникалык дарылоо жообун алдын ала айтуучу ырасталган биомаркерлер эмес.

Катыш анализи кантип жүргүзүлгөн?

Спектралдык катыш анализи көп өзгөрмөлүү PCA/PLS-DA анализинен өзүнчө жүргүзүлгөн. Негизги спектралдык чокулар орточо спектрлерден жана loading plotтардан тандалып, катыштар болсо чийки спектрлер боюнча эсептелген.

Ар бир бейтап үчүн техникалык кайталоо спектрлери адегенде орточолонуп, бир өкүлчүлүктүү бейтап спектри түзүлгөн. Ошентип статистикалык салыштырууда негизги биологиялык бирдик спектр эмес, бейтап болгон.

Сыворотка үчүн тандалган төрт чоку:

• 1649 cm⁻¹,
• 1633 cm⁻¹,
• 1539 cm⁻¹,
• 1042 cm⁻¹.

Бул төрт чокунун арасындагы алты жуп катыш анализделген.

Статистикалык анализ кандай тартипте жүргүзүлдү?

Статистика GraphPad Prism 8.0.1 менен жүргүзүлгөн.

1. Ар бир катыш үчүн маалыматтардын нормалдуулугу Shapiro-Wilk тести менен бааланган.
2. Нормалдуу бөлүштүрүлгөн салыштырууларда жупташтырылбаган Welch түзөтүүсү бар t-тест колдонулган.
3. Нормалдуу бөлүштүрүлбөгөн маалыматтарда Mann-Whitney U тести колдонулган.
4. Бир нече спектралдык катыш текшерилгендиктен P маанилери Benjamini-Hochberg ыкмасы менен түзөтүлгөн.
5. Жалган табылга катышы (false discovery rate; FDR) көзөмөлдөнгөн.
6. Түзөтүлгөн же тиешелүү анализде P<0,05 статистикалык маанилүүлүк чеги катары колдонулган.

Benjamini-Hochberg түзөтүүсү эмне үчүн керек?

Бир эле маалыматта көп сандагы статистикалык салыштыруулар жүргүзүлгөндө кокустуктан эле P<0,05 натыйжаларынын чыгуу ыктымалдыгы көбөйөт. Benjamini-Hochberg ыкмасы бардык P маанилерин чогуу баалап, жалган оң табылгалардын катышын көзөмөлдөөгө аракет кылат.

Бул изилдөөдө мунун так мисалы 1042/1633 катышы. Чийки анализде P=0,048 болуп 0,05 маанисинен төмөн көрүнгөн, бирок Benjamini-Hochberg түзөтүүсүнөн кийин P=0,059 маанисине жогорулап, статистикалык жактан маанилүү деп эсептелбей калган.

Таасир көлөмү эмне кошот?

P мааниси байкалган айырманын нөлдүк айырма гипотезасына канчалык туура келбестигин бааласа, таасир көлөмү топтор арасындагы айырманын чоңдугу жөнүндө кошумча маалымат берет.

Mann-Whitney U колдонулган катыштарда булак rank-biserial r, Welch t-тести колдонулган катыштарда болсо стандартташтырылган орточо айырма өлчөмү болгон Hedges' g көрсөткүчүн билдирген.

Таасир көлөмүнүн белгисинин багыты колдонулган топ тартибине жана эсептөө аныктамасына көз каранды болгондуктан, минус же плюс белгисине гана карап биологиялык “жакшы/жаман” багыт чыгарбоо керек. Булак Figure 4 ичинде катыштардын байкалган топтук багыттарын өзүнчө көрсөтөт.

Figure 4 ичинде катыштардын багыты кандай болгон?

Булактын бейтап деңгээлиндеги кутуча графиктеринде 1633/1649 жана 1539/1649 катыштары HDRA-сезгич топто жогору көрүнсө, 1539/1633 катышы HDRA-туруктуу топто жогору көрүнөт. Бул үч катыш көп жолу салыштырууга түзөтүүдөн кийин маанилүү бойдон калган катыштар.

Булак Figure 4 үчүн чийки бейтап маанилерин таблица түрүндө жарыялабагандыктан Verianla бул кутуча графиктерин болжолдуу санга айландырып кайра түзбөйт.

Ткань катыштарында эмне табылган?

FFPE тканында 1640 cm⁻¹ эталондук чоку катары колдонулуп, 1541, 1510, 1235, 1120 жана 1075 cm⁻¹ чокулары менен катыштар эсептелген.

Supplemental Figure S1 боюнча төмөнкү катыштардын эч биринде HDRA-сезгич жана HDRA-туруктуу топтордун ортосунда маанилүү айырма табылган эмес:

• 1541/1640,
• 1235/1640,
• 1120/1640,
• 1075/1640,
• 1025/1640.

Демек, изилдөөнүн статистикалык катыш боюнча табылгасы сыворотка тарапта; ткань тараптагы спектралдык айырмачылыктар визуалдык/көп өзгөрмөлүү тенденция катары байкалган, бирок бейтап деңгээлиндеги катыш тестинде ырасталган эмес.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Үлгү түзүлүшү

Жети бейтапта сыворотка жана FFPE ткань үлгүлөрү жупташкан. Ошондуктан 21 сыворотка менен 10 ткань үлгүсүнүн баары бир эле адамдардын бирден-бир жупташкан үлгүлөрү эмес.

Когорттун клиникопатологиялык бөлүштүрүлүшү

FFPE тобунда төрт сезгич жана алты туруктуу учур болгон. Сезгич топто үч эркек жана бир аял; туруктуу топто төрт эркек жана эки аял бар.

Сыворотка тобунда жети сезгич учурдун бешөө эркек, экөө аял; 14 туруктуу учурдун сегизи эркек жана алтоосу аял.

Изилдөө интра-гепатикалык да, перихилярдык да өт жолунун шишиктерин камтыйт. Дисталдык холангиокарцинома Table 1 ичинде өзүнчө үлгү тобу катары билдирилген эмес.

Ткань FTIR химиялык сүрөттөө жыйынтыгы

FFPE химиялык сүрөттөрүндө HDRA-сезгич жана туруктуу ткандардын ортосунда 1800–900 cm⁻¹ fingerprint аймагында жана 1750–1480 cm⁻¹ белокко басымдуу аймакта мейкиндик сигнал бөлүштүрүлүшүнүн айырмачылыктары байкалган.

Туруктуу ткандардын fingerprint аймагындагы айрым жерлерде жогорураак салыштырмалуу спектралдык интенсивдүүлүк байкалган. Бирок булар representative сүрөттөр жана өз алдынча сандык бейтап классификациясынын ийгилигин түзбөйт.

FFPE SR-FTIR спектралдык жыйынтыгы

Орточо экинчи туунду спектрлеринде эң айкын айырмачылыктар болжол менен 1640 жана 1541 cm⁻¹ amide I/II аймактарында байкалган.

Кошумча айырмачылыктар:

• 1235 cm⁻¹,
• 1120 cm⁻¹,
• 1075 cm⁻¹,
• 1025 cm⁻¹,
• 923 cm⁻¹.

PLS-DA loading профилдери өзгөчө 1664, 1640, 1621, 1541, 1525, 1510, 1235, 1120, 1075, 1025 жана 985 cm⁻¹ аймактары топтук бөлүнүүгө салым кошконун көрсөткөн.

Булардын айрымдары белоктор, углеводдор, фосфат топтору жана нуклеин кислоталары менен байланышкан. Бирок бейтап деңгээлиндеги ткань катыштарынын эч бири статистикалык маанилүүлүккө жеткен эмес.

Сыворотка ATR-FTIR спектралдык жыйынтыгы

Сыворотканын орточо экинчи туунду спектрлериндеги маанилүү айырмачылыктар:

• Amide I: 1649 жана 1633 cm⁻¹,
• Amide II: 1539 cm⁻¹,
• төмөн толкун сандары: болжол менен 1123, 1077, 1042 жана 1025 cm⁻¹

деп аныкталган.

PCA loading профилинде 1649, 1633, 1583, 1558, 1539, 1512 жана 1042 cm⁻¹ өзгөчө көрүнгөн.

Булак Figure 3 ичинде PCAнын биринчи компоненти PC1 спектралдык вариациянын %54 бөлүгүн, PC2 болсо %23 бөлүгүн көрсөтөт. Эки топтун ортосунда көрүнгөн бөлүнүү тенденциясы бар, бирок үлгүлөрдүн бир бөлүгү кабатташат.

Ар бир бейтап үчүн беш сыворотка спектри эмне үчүн маанилүү?

Беш кайталоо бир адамдан алынган беш көз карандысыз биологиялык үлгү эмес. Булар бир эле сыворотканын техникалык өлчөө кайталоолору.

Көп өзгөрмөлүү анализде булак 105 спектрди өзүнчө спектралдык байкоо катары сактаган, бирок маалыматтарды бөлүүнү бейтап деңгээлинде жүргүзгөн. Спектралдык катыш статистикасында болсо беш техникалык кайталоо бейтап боюнча орточолонгон.

Бул дизайн айырмасы маанилүү; антпесе 21 адамдык когортту жаңылыш түрдө 105 көз карандысыз бейтап катары чечмелөө статистикалык үлгү көлөмүн ашыкча көрсөтмөк.

Спектралдык кабатташуу эмне үчүн бар?

Булак CCA молекулалык өзгөрүүлөр, гистологиялык субтип, дифференциация даражасы жана оорунун өнүгүшү жагынан гетерогендүү экенин белгилейт. Бул биологиялык гетерогендүүлүк бир HDRA класстагы бейтаптардын FTIR профилдери да толугу менен бирдей болбой калышына салым кошо алат.

Мындан тышкары, HDRA белгилүү эксперименттик шарттарда функционалдык дары жообун өлчөсө, FTIR бүтүндөй биохимиялык курамды бирге кабыл алат. Ошондуктан эки тест бир эле биологиялык өзгөчөлүктү бирден-бир өлчөйт деп күтүүгө болбойт.

Булакта талкууланган шайкеш эмес үлгүлөр

Көпчүлүк үлгүлөр HDRA классына шайкеш спектралдык кластерленүүнү көрсөткөнү менен, бир нече учур шайкеш эмес калган.

HDRA-туруктуу болгонуна карабастан FTIRда сезгич топко жакын кластерленген бир үлгү жакшыраак дифференциацияланган гистология жана лимфа түйүнүнүн метастазынын жоктугу сыяктуу азыраак агрессивдүү клиникопатологиялык өзгөчөлүктөргө ээ болгон.

Тескерисинче, HDRA-сезгич болуп туруп FTIRда туруктуу топко жакын кластерленген бир үлгү combined hepatocellular-cholangiocarcinoma (cHCC-CCA) диагнозуна ээ болгон жана орточо даражадагы дифференциация, кан тамыр инвазиясы жана лимфа түйүнү метастазы сыяктуу агрессивдүүрөөк белгилерди көрсөткөн.

Авторлор бул байкоону FTIR спектралдык фенотипи дары жообун гана эмес, шишик биологиясынын кеңири өзгөчөлүктөрүн да чагылдырышы мүмкүн деп талкуулашат. Бул чечмелөө байкоочулук мүнөздө жана азыркы кичине үлгүдө себептүүлүктү далилдебейт.

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

• Сыворотка FTIR спектрлеринде HDRA-сезгич жана туруктуу топтордун ортосунда, өзгөчө amide I жана II аймактарында айырмачылыктар байкалган.
• Сыворотка PCA анализи топтор арасында изилдөөчү бөлүнүү жана жарым-жартылай кабатташуу көрсөткөн.
• 1633/1649, 1539/1649 жана 1539/1633 cm⁻¹ сыворотка катыштары Benjamini-Hochberg түзөтүүсүнөн кийин да маанилүү бойдон калган.
• Үч маанилүү салыштыруунун түзөтүлгөн P мааниси 0,041.
• 1042/1633 катышынын чийки P мааниси 0,048 болгонуна карабастан, түзөтүлгөн P мааниси 0,059 болуп, маанилүүлүк чегинен өтпөгөн.
• FFPE ткань спектрлеринде amide жана fingerprint аймактарында айырмачылыктар жана PLS-DAда жарым-жартылай бөлүнүү байкалган.
• FFPE ткань спектралдык катыштарынын эч бири маанилүү айырма көрсөткөн эмес.
• Сыворотка менен ткандарда айрым окшош биохимиялык спектралдык аймактар байкалган.

Изилдөө колдобогон жыйынтыктар

• Сыворотка FTIR клиникалык гемцитабин жообун алдын ала айтары далилденген эмес.
• FTIR дарылоо тандоодо колдонууга боло турган ырасталган клиникалык тест экени көрсөтүлгөн эмес.
• Изилдөөдө гемцитабин алган бейтаптардын чыныгы дарылоо жооптору анализделген эмес.
• Спектралдык катыштар жашап калууну же оорунун прогрессиясын алдын ала айтары көрсөтүлгөн эмес.
• FTIR белгилүү бир жеке белоктун концентрациясын түздөн-түз өлчөгөн эмес.
• hENT1, dCK, RRM1/RRM2, GLUT1, PKM2 же LDHA азыркы экспериментте өз-өзүнчө өлчөнгөн эмес.
• PCA/PLS-DA үчүн клиникалык классификация accuracy, sensitivity, specificity же ROC-AUC мааниси берилген эмес.
• 21 сыворотка бейтаптан алынган жыйынтыктар бүт CCA популяциясына жалпылана алары көрсөтүлгөн эмес.
• FTIR менен HDRAнын байланышы себептик механизмдин далили эмес.

Изилдөөнүн негизги чектөөлөрү

Кичине үлгү: Сыворотка n=21, FFPE ткань n=10. Авторлор кичине когорт жалпыланууну чектээрин ачык белгилешет.

Клиникалык дарылоо жообу жок: Сезгич/туруктуу белгилери ex vivo HDRAдан алынган. Бейтаптардын чыныгы клиникалык гемцитабин жообу азыркы изилдөөдө жок.

Сыворотканын так сактоо мөөнөтү катталган эмес: Үлгүлөр стандарттык шарттарда сакталганына карабастан, ар бир сыворотканын жалпы сактоо мөөнөтүнүн так жазуусу жок.

FFPE парафин калдыгы: Депарафинизация жасалганына карабастан, парафин толук алынып салынганы көз карандысыз түрдө сандык ырасталган эмес. Булак өзгөчө 1400–1000 cm⁻¹ аймагына калган парафин таасир этиши мүмкүн экенин белгилейт.

Mie чачыроосун түзөтүү: EMSC колдонулган, бирок атайын RMieS-EMSC сыяктуу Mie чачыроосун түзөтүү жүргүзүлгөн эмес.

CCA гетерогендүүлүгү: Шишиктин субтиби, гистология, дифференциация жана башка клиникопатологиялык өзгөчөлүктөр спектралдык вариацияга салым кошо алат.

Молекулалык механизм түздөн-түз өлчөнгөн эмес: FTIR айырмачылыктары курамдуу биохимиялык изди көрсөтөт; кайсы молекулалык жол бул айырмачылыкка себеп болгону түздөн-түз аныкталган эмес.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска изилдөө: Serum FTIR spectral features associated with HDRA-defined gemcitabine sensitivity in cholangiocarcinoma

Авторлор: Kanokporn Matra; Patutong Chatchawal; Molin Wongwattanakul; Patipat Rachawangmuang; Sutthiwan Janthamala; Thanaphong Rattanathip; Sirinart Chio-Srichan; Chanchai Hongsa; Malinee Thanee; Supakan Amontailak; Juthamas Jaimanee; Piyapong Simtong; Anchalee Techasen.

Жооптуу автор: Anchalee Techasen.

Жооптуу автордун электрондук почтасы: anchte@kku.ac.th

Мекеме 1: Biomedical Science Program, Graduate School, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Мекеме 2: School of Medical Technology, Faculty of Associated Medical Sciences, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Мекеме 3: Beamline Division, Synchrotron Light Research Institute (Public Organization), Nakhon Ratchasima, Thailand.

Мекеме 4: Department of Pathology, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Мекеме 5: Cholangiocarcinoma Research Institute, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Журнал: Biomolecules and Biomedicine.

Жарыя түрү: Research Article; proof-of-concept адам биологиялык үлгүлөрү боюнча изилдөө.

DOI: 10.17305/bb.2026.14765.

Жөнөтүлгөн күнү: 18 июль 2026.

Кабыл алынган күнү: 29 сентябрь 2026.

Онлайн жарыяланган күнү: 7 октябрь 2026.

Библиографиялык статус: PubMed жазуусу макаланы ahead of print деп көрсөтөт. Жүктөлгөн PDFте азырынча том, сан жана барак диапазону берилген эмес.

Басмакана: Association of Basic Medical Sciences.

Рецензия: Biomolecules and Biomedicine рецензияланган журнал; расмий журнал саясатында 2-5 тышкы рецензент менен кош сокур peer review жүргүзүлөт.

Лицензия: Creative Commons Attribution 4.0 International — CC BY 4.0.

Этикалык уруксат: Khon Kaen University Ethics Committee for Human Research, Reference No. HE681229.

Этикалык стандарт: Declaration of Helsinki жана ICH Good Clinical Practice принциптери.

Маалымдалган макулдук: Бардык катышуучулардан жазуу жүзүндөгү informed consent алынган.

Каржылоо: Khon Kaen Universityнин “Integrated Accurate Diagnostic and Targeted Therapeutic Strategies in hepato-pancreato-biliary cancer” изилдөөсү National Science Research and Innovation Fund (NSRF) тарабынан колдоого алынган.

Ыраазычылык: Synchrotron Light Research Institute (SLRI), Thailand мекемесине beamtime allocation үчүн ыраазычылык билдирилген.

Кызыкчылыктардын кагылышы: Авторлор кызыкчылыктардын кагылышы жок экенин билдиришкен.

Маалыматтын жеткиликтүүлүгү: Изилдөөнүн жыйынтыктарын колдогон маалыматтар жүйөлүү суроо-талап боюнча жооптуу автордон берилиши мүмкүн экени көрсөтүлгөн.

Авторлордун салымы: Каралган негизги PDFте өзүнчө Author Contributions же CRediT бөлүмү жок.

Тең салым: Каралган PDFте тең салым же тең биринчи авторлук жөнүндө билдирүү жок.

Preprint: Каралган PDFте жана ырасталган библиографиялык жазууда өзүнчө preprint версиясы көрсөтүлгөн эмес.

Үлгү: 21 сыворотка жана 10 FFPE шишик тканы; жети жупташкан сыворотка-ткань жуптары.

HDRA топтору: Сыворотка: 7 сезгич, 14 туруктуу. FFPE: 4 сезгич, 6 туруктуу.

HDRA шарты: Төрт күндүк шишик гистомаданияты; ар бир шартта үч кудук; андан кийин 4 саат MTT инкубациясы; 540 nm абсорбанс; гемцитабин 1500 µg/mL; булакта колдонулган классификация кесүү мааниси %IR=43,28.

Сыворотканы даярдоо: 3000 g, 10 мүнөт, 4 °C центрифугалоо; башында −80 °C, аликвоттон кийин −20 °C сактоо; ар бир аликвот FTIR алдында бир гана жолу эритилген.

Сыворотка ATR-FTIR: Tensor II FTIR, алмаз ATR; болжол менен 5 µL сыворотка; болжол менен 10 мүнөт кургатуу; 4000–400 cm⁻¹; 4 cm⁻¹ ажыратуучулук; 64 co-added scan; ар бир бейтапка беш техникалык кайталоо.

FFPE SR-FTIR: 5 µm кесинди; Hyperion 2000 микроскоп; 36X Cassegrain объектив; MCT детектор; VERTEX 70 FTIR; 10 × 10 µm² aperture; reflection mode; 4000–600 cm⁻¹; 4 cm⁻¹; 64 co-added scan.

Спектралдык алдын ала иштетүү: Unscrambler X 10.4; Savitzky-Golay экинчи туунду, derivative order 2, polynomial order 3, 15 smoothing point; андан кийин EMSC.

Ткань көп өзгөрмөлүү анализи: PLS-DA; HDRA сезгич +1, туруктуу −1; %70:%30 окутуу-тест бөлүнүшү бейтап деңгээлинде; leverage validation.

Сыворотка көп өзгөрмөлүү анализи: Көзөмөлсүз PCA; жалпы 105 техникалык сыворотка спектри.

Бейтап деңгээлиндеги катыш анализи: Техникалык кайталоолор адегенде бейтап боюнча орточолонуп, андан кийин спектралдык катыштар салыштырылган.

Статистика: GraphPad Prism 8.0.1; Shapiro-Wilk нормалдуулук тести; Welch түзөтүүсү бар жупташтырылбаган t-тест же Mann-Whitney U; Benjamini-Hochberg FDR түзөтүүсү; P<0,05 маанилүүлүк чеги.

Негизги сыворотка жыйынтыгы: 1633/1649, 1539/1649 жана 1539/1633 cm⁻¹ катыштары Benjamini-Hochberg түзөтүүсүнөн кийин маанилүү бойдон калган; adjusted P=0,041.

Ткань жыйынтыгы: FFPE тканында бейтап деңгээлиндеги спектралдык катыштардын эч бири маанилүү айырма көрсөткөн эмес.

Техникалык кайталоо чеги: 105 сыворотка спектри 105 көз карандысыз бейтап эмес; бул 21 бейтаптын ар биринен беш техникалык кайталоо.

Клиникалык чек: Сезгич/туруктуу белгилери ex vivo HDRAга негизделет; клиникалык гемцитабин дарылоо жообу жөнүндө маалымат жок.

Биомаркер чеги: Үч маанилүү сыворотка катышы клиникалык жактан ырасталган предиктивдүү биомаркерлер эмес. Чыныгы дарылоо жообу белгилүү чоңураак когорттордо ырастоо талап кылынат.

Молекулалык чечмелөө чеги: FTIR курамдуу биохимиялык изди өлчөйт; белгилүү бир белок же метаболикалык жол түздөн-түз сандык бааланган эмес.

FFPE техникалык чеги: Парафин толук алынып салынганы көз карандысыз түрдө ырасталган эмес жана 1400–1000 cm⁻¹ аймагында калган парафиндин таасири болушу мүмкүн.

Чачыроону түзөтүү чеги: EMSC колдонулган, бирок dedicated Mie scattering correction / RMieS-EMSC колдонулган эмес.

Сыворотка сактоо чеги: Үлгүлөр стандартташтырылган шарттарда сакталганына карабастан, так сактоо мөөнөттөрү катталган эмес.