FTIR spektral profilleme, biyolojik bir numunedeki moleküler bağların kızılötesi ışınımla etkileşiminden oluşan çok değişkenli spektral parmak izini ölçen bir spektroskopik yaklaşımdır. Bu proof-of-concept çalışmada araştırmacılar, kolanjiyokarsinom hastalarından alınmış serum ve formalinle fikse-parafine gömülü tümör dokularındaki FTIR özelliklerinin, histokültür ilaç yanıt testi (HDRA) ile ex vivo olarak tanımlanan gemsitabin duyarlılığı ve direnciyle ilişkili olup olmadığını araştırmıştır. Çalışmada 21 serum örneği ve 10 FFPE tümör dokusu kullanılmış; yedi hastada serum ve doku örnekleri eşleşmiştir. Serum ATR-FTIR ile, doku ise senkrotron ışınımına dayalı FTIR mikrospektroskopisiyle analiz edilmiştir.

Serum grubunda 7 hasta HDRA-duyarlı, 14 hasta HDRA-dirençli; FFPE doku grubunda ise 4 hasta duyarlı ve 6 hasta dirençli olarak sınıflandırılmıştır. Serumda proteinlerle ilişkili amide I ve amide II bölgelerinde belirgin spektral farklılıklar görülmüş ve özellikle 1633/1649 cm⁻¹, 1539/1649 cm⁻¹ ve 1539/1633 cm⁻¹ yoğunluk oranları Benjamini-Hochberg çoklu karşılaştırma düzeltmesinden sonra da iki grup arasında farklı kalmıştır. Üç karşılaştırmanın düzeltilmiş P değeri de 0,041'dir.

Doku FTIR sonuçlarında amide I ve II bölgeleri başta olmak üzere çok sayıda spektral farklılık ve PLS-DA'da kısmi grup ayrımı görülmesine rağmen, hasta düzeyindeki doku spektral oranlarının hiçbiri istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermemiştir. Serum PCA'sı iki HDRA grubunda keşifsel bir ayrım eğilimi göstermiş, ancak gruplar arasında örtüşme de kalmıştır.

Çalışmanın en önemli yorum sınırı, “gemsitabin duyarlı” ve “gemsitabin dirençli” sınıflarının hastaların gerçek klinik tedavi sonuçlarına değil, cerrahi tümör dokusunda gerçekleştirilen ex vivo HDRA sonucuna dayanmasıdır. Araştırmacıların klinik gemsitabin yanıt verileri bulunmamaktadır. Bu nedenle serum FTIR özelliklerinin klinikte hangi hastanın gemsitabine yanıt vereceğini öngördüğü bu çalışma tarafından kanıtlanmamıştır.

Sonuçlar, serum FTIR'ın daha az invaziv bir biyolojik örnekte HDRA ile ilişkili protein-ağırlıklı spektral farklılıkları yakalayabildiğini gösteren ön kanıt sunmaktadır. Bunun klinik biyobelirteç, tedavi seçim testi veya kişiselleştirilmiş tedavi aracı haline gelebilmesi için daha büyük ve gerçek tedavi yanıtlarıyla klinik olarak anotlanmış hasta kohortlarında doğrulanması gerekmektedir.

HDRA ile Tanımlanan Gemsitabin Duyarlılığı Ne Anlama Geliyor?

Bu çalışmada “gemsitabin duyarlılığı”, hastanın klinikte gemsitabin tedavisine yanıt verdiği anlamına gelmez; cerrahi olarak çıkarılmış kolanjiyokarsinom dokusunun laboratuvar dışında değil, vücut dışındaki bir histokültür sisteminde gemsitabine verdiği yanıtın HDRA ile ölçülmesi sonucunda oluşturulan ex vivo sınıflamayı ifade eder.

Kolanjiyokarsinom nedir?

Kolanjiyokarsinom (CCA), safra kanallarının epitelinden köken alan malign bir tümördür. Anatomik yerleşimine göre intrahepatik kolanjiyokarsinom (iCCA), perihilar kolanjiyokarsinom (pCCA) ve distal kolanjiyokarsinom (dCCA) olarak sınıflandırılabilir.

Çalışmanın örnekleri Tayland'daki Khon Kaen University Srinagarind Hospital'da cerrahi rezeksiyon uygulanmış hastalardan elde edilmiştir. Makalenin araştırma sorusu CCA'nın tanısını koymak değil, FTIR spektral özelliklerinin ex vivo gemsitabin duyarlılığıyla ilişkisini araştırmaktır.

HDRA nedir?

Histoculture drug response assay (HDRA), cerrahi tümör dokusunun ex vivo olarak kültüre edilip belirli bir ilaca maruz bırakıldığı ve doku canlılığındaki/aktivitesindeki değişim üzerinden ilaca duyarlılığın değerlendirildiği fonksiyonel bir test yaklaşımıdır.

Bu makaledeki HDRA verileri aynı hasta kohortuyla daha önce yapılmış bir çalışmadan alınmıştır. Tümör dokuları dört gün kültüre edilmiş ve her koşul üç kültür kuyusunda test edilmiştir. İnkübasyonun ardından MTT testi için dört saatlik ek inkübasyon yapılmış ve absorbans 540 nm'de ölçülmüştür.

HDRA inhibisyon oranı nasıl hesaplanıyor?

Kaynak çalışmada inhibisyon oranı şu formülle verilmiştir:

\[ \%IR=\left[1-\left(\frac{T}{C}\right)\right]\times100 \]

%IR, inhibition rate yani inhibisyon oranıdır.

T, gemsitabin uygulanmış tümör kültürünün tümör ağırlığına normalize edilmiş ortalama absorbansıdır.

C, tedavi uygulanmamış kontrol kültürünün tümör ağırlığına normalize edilmiş ortalama absorbansıdır.

Formülde \(T/C\) oranı tedavi edilen dokunun kontrol dokuya göre kalan metabolik sinyalini temsil eder. \(T\) değeri \(C\)'ye göre küçüldükçe \(T/C\) azalır ve \(1-(T/C)\) büyür; dolayısıyla %IR yükselir. Matematiksel olarak daha yüksek inhibisyon oranı, ex vivo kültürde gemsitabinin daha güçlü inhibisyonuyla uyumludur.

Çalışma, 1500 µg/mL gemsitabin için daha önce tanımlanmış %43,28 HDRA kesme değerini duyarlı/yanıt ve dirençli grupları oluşturmak için kullanmıştır.

Önemli doz sınırı: 1500 µg/mL değeri HDRA laboratuvar sistemindeki ex vivo gemsitabin konsantrasyonudur. Bir hastaya uygulanan klinik doz, kan düzeyi veya önerilen tedavi konsantrasyonu değildir.

FTIR Bu Çalışmada Neyi Ölçüyor?

FTIR, serum veya doku içindeki tek tek proteinleri doğrudan tanımlamak yerine proteinler, nükleik asitler, karbonhidratlar, fosfat içeren moleküller ve lipitler gibi çok sayıda biyomolekülün moleküler bağ titreşimlerinden oluşan birleşik kızılötesi spektral parmak izini ölçmektedir.

FTIR ne demektir?

Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), kızılötesi ışınımın moleküler bağların titreşim modları tarafından hangi dalga sayılarında soğurulduğunu ölçen spektroskopik bir yöntemdir.

Spektrumun yatay ekseninde kullanılan cm⁻¹ birimi dalga sayısıdır. Dalga sayısı, bir santimetrelik uzunluğa düşen dalga çevrimi sayısıyla ilişkili spektroskopik büyüklüktür. FTIR literatüründe belirli bağların titreşimleri belirli dalga sayısı bölgelerinde sinyal oluşturduğu için bu bölgeler biyokimyasal yorumda kullanılır.

Amide I ve Amide II neden önemli?

Çalışmadaki en güçlü farklılıkların çoğu proteinlerle ilişkili amide I ve amide II bölgelerinde görülmüştür.

Doku örneklerinde amide I yaklaşık 1640 cm⁻¹, amide II yaklaşık 1541 cm⁻¹ civarında öne çıkmıştır. Serumda amide I bölgesinde yaklaşık 1649 ve 1633 cm⁻¹, amide II bölgesinde yaklaşık 1539 cm⁻¹ önemli özellikler olarak belirlenmiştir.

Kaynak, amide I bölgesini protein sekonder yapısıyla ve özellikle α-heliks/β-tabaka bileşenleriyle ilişkilendirmektedir. Ancak FTIR'daki bir amide bandı belirli tek bir proteinin konsantrasyonunu ölçmez. Aynı dalga sayısı bölgesine çok sayıda protein ve yapısal durum katkıda bulunabilir.

FTIR hENT1, dCK veya RRM proteinlerini ölçtü mü?

Hayır. Makalenin tartışma bölümünde hENT1, dCK ve RRM1/RRM2 gibi gemsitabin direnciyle daha önce ilişkilendirilmiş proteinlerden söz edilmesi, bu proteinlerin mevcut çalışmada FTIR ile ayrı ayrı ölçüldüğü anlamına gelmez. Yazarlar da FTIR'ın tekil proteinleri doğrudan tanımlayamadığını açıkça belirtmektedir.

Dolayısıyla bu çalışmada doğru yorum “proteinle ilişkili kompozit spektral özellikler HDRA grupları arasında farklılaştı” şeklindedir; “belirli bir direnç proteini serum FTIR ile ölçüldü” sonucu çıkarılamaz.

Serum ve doku FTIR bantlarının karşılaştırılması

Serum ile doku arasında benzer spektral bölgelerin bulunması, iki biyolojik örnekte ilgili biyokimyasal sınıflara ait sinyallerin bulunduğunu düşündürür. Ancak kaynak bu benzerliği henüz “ortak biyobelirteçlerin kanıtı” olarak kabul etmemektedir.

ATR-FTIR ile Senkrotron FTIR Arasındaki Fark Nedir?

Bu çalışmada ATR-FTIR küçük hacimli serum örneklerinin doğrudan elmas ATR kristali üzerinde ölçülmesi için kullanılmış; senkrotron FTIR mikrospektroskopisi ise FFPE tümör kesitlerinde mikrometre ölçekli doku bölgelerinin uzamsal spektral özelliklerini incelemek için kullanılmıştır.

Serum ATR-FTIR ölçümü

Serum ölçümleri Bruker Tensor II FTIR spektrometresi ve elmas ATR kristali kullanılarak yapılmıştır.

• Her serum örneği: yaklaşık 5 µL.
• ATR kristali üzerinde kurutma: yaklaşık 10 dakika, hafif hava akımı altında.
• Spektral aralık: 4000–400 cm⁻¹.
• Spektral çözünürlük: 4 cm⁻¹.
• Bir spektrum için birlikte toplanan tarama sayısı: 64.
• Her hasta için teknik tekrar: 5.
• Hasta sayısı: 21.
• Toplam serum spektrumu: 105.

Serum kan örnekleri 3000 g'de 10 dakika, 4 °C'de santrifüj edilerek hazırlanmıştır. Serum önce −80 °C'de, ardından alikotlandıktan sonra −20 °C'de saklanmıştır. Her alikot FTIR ölçümünden hemen önce yalnız bir kez çözündürülmüştür; bu yaklaşım tekrar eden donma-çözünme döngülerinin oluşturabileceği bozulmayı azaltmayı amaçlamıştır.

FFPE doku SR-FTIR ölçümü

FFPE tümör blokları 5 µm kalınlıkta paralel kesitlere ayrılmıştır. Bir kesit MirrIR düşük emisyonlu slayda, karşılık gelen paralel kesit ise hematoksilen-eozin (H&E) boyaması için standart cam slayda yerleştirilmiştir.

FTIR'dan önce MirrIR kesitleri ksilenle deparafinizasyon işleminden geçirilmiş, dereceli etanol serileriyle rehidrate edilmiş, suyla yıkanmış ve oda sıcaklığında hava ile kurutulmuştur.

Bir patolog H&E ve MirrIR kesitlerini birlikte inceleyerek FTIR ölçümü yapılacak mikroskobik bölgelerin doğru lokalizasyonunu kontrol etmiştir.

Ölçümler Tayland Synchrotron Light Research Institute Beamline 4.1'de gerçekleştirilmiştir.

• FTIR mikroskobu: Hyperion 2000.
• Objektif: 36X Cassegrain.
• Dedektör: sıvı azot soğutmalı mercury-cadmium-telluride (MCT).
• FTIR spektrometresi: Bruker VERTEX 70.
• Aperture: 10 × 10 µm².
• Ölçüm modu: reflection.
• Spektral aralık: 4000–600 cm⁻¹.
• Çözünürlük: 4 cm⁻¹.
• Birlikte toplanan tarama: 64.

Kaynak FTIR kimyasal görüntülerinde renk neyi gösteriyor?

Kaynak Şekil 1'deki renkli FTIR kimyasal haritaları histolojik boyama veya doğrudan “kanser direnci haritası” değildir. Pseudocolour ölçeği seçilen spektral bölgelerdeki göreli FTIR sinyal şiddetinin doku üzerindeki uzamsal dağılımını gösterir.

1800–900 cm⁻¹ fingerprint bölgesi protein, nükleik asit, karbonhidrat ve fosfolipit katkıları içerirken 1750–1480 cm⁻¹ bölgesi ağırlıklı olarak protein ilişkili amide bantlarını kapsamaktadır.

PCA ve PLS-DA Bu Çalışmada Aynı Şeyi mi Yapıyor?

Hayır. Serum için kullanılan PCA, sınıf etiketini model eğitiminde kullanmadan spektral varyasyonu ortaya çıkaran gözetimsiz bir keşif yöntemidir; FFPE doku için kullanılan PLS-DA ise HDRA duyarlı/dirençli etiketlerini kullanarak grupları ayırmaya çalışan gözetimli bir çok değişkenli yöntemdir.

PCA ne yaptı?

Principal component analysis (PCA; temel bileşen analizi), çok sayıda spektral değişkeni birbirleriyle ilişkili varyasyonu özetleyen daha az sayıda temel bileşene dönüştürür.

Serumda PCA, ön işlenmiş 105 teknik spektrum üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bunların 35'i 7 HDRA-duyarlı hastanın, 70'i 14 HDRA-dirençli hastanın beşer teknik spektrumudur.

Kaynak Şekil 3'ün score plot'unda PC1 toplam spektral varyasyonun %54'ünü, PC2 %23'ünü temsil etmektedir. Gruplar arasında keşifsel ayrılma görülmüş ancak bazı spektrumlar örtüşmüştür.

Bu nedenle PCA sonucu “serum FTIR ile hastalar %100 doğru sınıflandırıldı” şeklinde yorumlanamaz. Kaynak herhangi bir PCA sınıflandırma doğruluğu, duyarlılık, özgüllük veya AUC değeri raporlamamaktadır.

PLS-DA ne yaptı?

Partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), spektral değişkenler ile önceden bilinen sınıf etiketleri arasındaki ilişkiyi kullanarak grupları ayırmaya çalışan gözetimli çok değişkenli bir yöntemdir.

FFPE analizinde HDRA-duyarlı sınıf +1, dirençli sınıf −1 olarak kodlanmıştır.

Veri eğitim ve test kümelerine %70:%30 oranında ve hasta düzeyinde ayrılmıştır. Aynı hastadan gelen spektrumların bir kısmının eğitime, diğer kısmının teste dağılmasına izin verilmemiştir. Bu yaklaşım teknik tekrarların hasta kimliğini modele sızdırması riskini azaltmak açısından önemlidir.

Bir doku numunesinden birden fazla spektrum bulunduğu için model değerlendirmesinde leverage validation kullanılmıştır.

PLS-DA score plot yalnız kısmi grup ayrımı göstermiştir. Kaynak sınıflandırma accuracy, sensitivity, specificity, ROC-AUC veya bağımsız harici doğrulama performansı raporlamamaktadır. Bu nedenle Verianla bu metriklerden hiçbirini üretmemektedir.

Spektral ön işleme neden yapıldı?

Ham FTIR spektrumları yalnız biyokimyasal farklılıklardan değil baseline kayması, saçılma, örnek kalınlığı ve yoğunluk ölçeği gibi teknik etkilerden de etkilenebilir. Kaynak bu etkileri azaltmak amacıyla Unscrambler X 10.4 kullanmıştır.

Ön işleme sırası:

1. Savitzky-Golay ikinci türev dönüşümü.
2. Türev derecesi: 2.
3. Polinom derecesi: 3.
4. Yumuşatma noktası: 15.
5. Ardından extended multiplicative signal correction (EMSC).

İkinci türev işlemi birbirine yakın veya örtüşen spektral özellikleri daha görünür hale getirebilir ve yavaş değişen baseline bileşenlerini azaltabilir. EMSC ise ölçek ve saçılma kaynaklı spektral varyasyonları normalize etmeyi amaçlar.

Bununla birlikte kaynak, FFPE doku spektrumlarında özel bir Resonant Mie scattering-EMSC (RMieS-EMSC) düzeltmesi kullanılmadığını bir sınırlılık olarak belirtmektedir.

Serumdaki Üç Anlamlı FTIR Oranı Nasıl Yorumlanmalıdır?

1633/1649, 1539/1649 ve 1539/1633 cm⁻¹ oranlarının HDRA-duyarlı ve HDRA-dirençli hasta grupları arasında çoklu karşılaştırma düzeltmesinden sonra farklı kalması, serum protein ilişkili FTIR özelliklerinin ex vivo gemsitabin yanıt sınıfıyla ilişkili olduğunu gösteren istatistiksel bir bulgudur; bu oranlar henüz klinik tedavi yanıtını öngören doğrulanmış biyobelirteçler değildir.

Oran analizi nasıl yapıldı?

Spektral oran analizi çok değişkenli PCA/PLS-DA analizinden ayrı olarak yürütülmüştür. Ana spektral pikler ortalama spektrumlar ve loading plot'lardan seçilmiş, oranlar ise ham spektrumlar üzerinden hesaplanmıştır.

Her hasta için teknik tekrar spektrumları önce ortalanarak tek bir temsilî hasta spektrumu oluşturulmuştur. Böylece istatistiksel karşılaştırmada temel biyolojik birim spektrum değil hasta olmuştur.

Serum için seçilen dört pik:

• 1649 cm⁻¹,
• 1633 cm⁻¹,
• 1539 cm⁻¹,
• 1042 cm⁻¹.

Bu dört pik arasındaki altı ikili oran analiz edilmiştir.

İstatistiksel analiz hangi sırayla yapıldı?

İstatistik GraphPad Prism 8.0.1 ile gerçekleştirilmiştir.

1. Her oran için veri normalitesi Shapiro-Wilk testiyle değerlendirilmiştir.
2. Normal dağılım gösteren karşılaştırmalarda eşleştirilmemiş Welch düzeltmeli t-testi kullanılmıştır.
3. Normal dağılmayan verilerde Mann-Whitney U testi kullanılmıştır.
4. Birden fazla spektral oran test edildiği için P değerleri Benjamini-Hochberg yöntemiyle düzeltilmiştir.
5. Yanlış keşif oranı (false discovery rate; FDR) kontrol edilmiştir.
6. Düzeltilmiş veya ilgili analizde P<0,05 istatistiksel anlamlılık sınırı olarak kullanılmıştır.

Benjamini-Hochberg düzeltmesi neden gerekli?

Aynı veri üzerinde çok sayıda istatistiksel karşılaştırma yapıldığında yalnız şans nedeniyle P<0,05 sonuçlarının ortaya çıkma olasılığı yükselir. Benjamini-Hochberg yaklaşımı bütün P değerlerini birlikte değerlendirerek yanlış pozitif bulguların oranını kontrol etmeye çalışır.

Bu çalışmada bunun somut örneği 1042/1633 oranıdır. Ham analizde P=0,048 ile 0,05'in altında görünürken Benjamini-Hochberg düzeltmesinden sonra P=0,059'a yükselmiş ve artık istatistiksel anlamlı kabul edilmemiştir.

Etki büyüklüğü neyi ekliyor?

P değeri gözlenen farkın sıfır fark varsayımı altında ne kadar uyumsuz olduğunu değerlendirirken etki büyüklüğü gruplar arasındaki farkın büyüklüğü hakkında ek bilgi sağlar.

Mann-Whitney U kullanılan oranlarda kaynak rank-biserial r, Welch t-testi kullanılan oranlarda ise standartlaştırılmış ortalama fark ölçüsü olan Hedges' g raporlamıştır.

Etki büyüklüğünün işaretinin yönü kullanılan grup sırası ve hesaplama tanımına bağlı olduğundan yalnız eksi veya artı işaretine bakarak biyolojik bir “iyi/kötü” yönü çıkarılmamalıdır. Kaynak Figure 4'te oranların gözlenen grup yönleri ayrı olarak görünür.

Figure 4'te oranların yönü neydi?

Kaynak hasta düzeyi kutu grafiklerinde 1633/1649 ve 1539/1649 oranları HDRA-duyarlı grupta daha yüksek görünürken, 1539/1633 oranı HDRA-dirençli grupta daha yüksek görünmektedir. Bu üç oran çoklu karşılaştırma düzeltmesinden sonra anlamlı kalan oranlardır.

Kaynak Figure 4'ün ham hasta değerleri tablo halinde yayımlanmadığı için Verianla bu kutu grafikleri yaklaşık sayısallaştırarak yeniden üretmemektedir.

Doku oranlarında ne bulundu?

FFPE dokuda 1640 cm⁻¹ referans pik olarak kullanılmış ve 1541, 1510, 1235, 1120 ve 1075 cm⁻¹ pikleriyle oranlar hesaplanmıştır.

Supplemental Figure S1'e göre şu oranların hiçbirinde HDRA-duyarlı ve HDRA-dirençli gruplar arasında anlamlı fark bulunmamıştır:

• 1541/1640,
• 1235/1640,
• 1120/1640,
• 1075/1640,
• 1025/1640.

Dolayısıyla çalışmanın istatistiksel oran bulgusu serum tarafında bulunmaktadır; doku tarafındaki spektral farklılıklar görsel/multivaryat eğilim olarak görülmüş ancak hasta düzeyi oran testinde doğrulanmamıştır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Örneklem yapısı

Yedi hastada serum ve FFPE doku örnekleri eşleşmiştir. Bu nedenle 21 serum ile 10 doku örneğinin tümü aynı bireylerin bire bir eşleşmiş örnekleri değildir.

Kohortun klinikopatolojik dağılımı

FFPE grubunda dört duyarlı ve altı dirençli vaka bulunmuştur. Duyarlı grupta üç erkek ve bir kadın; dirençli grupta dört erkek ve iki kadın vardır.

Serum grubunda yedi duyarlı vakanın beşi erkek ve ikisi kadın; 14 dirençli vakanın sekizi erkek ve altısı kadındır.

Çalışma hem intrahepatik hem perihilar safra kanalı tümörlerini içermektedir. Distal kolanjiyokarsinom Table 1'de ayrı bir örnek grubu olarak raporlanmamıştır.

Doku FTIR kimyasal görüntüleme sonucu

FFPE kimyasal görüntülerinde HDRA-duyarlı ve dirençli dokular arasında 1800–900 cm⁻¹ fingerprint bölgesinde ve 1750–1480 cm⁻¹ protein ağırlıklı bölgede uzamsal sinyal dağılım farklılıkları görülmüştür.

Dirençli dokuların fingerprint bölgesinde bazı alanlarda daha yüksek göreli spektral yoğunluk gösterdiği gözlenmiştir. Ancak bunlar representative görüntülerdir ve tek başlarına nicel hasta sınıflandırma başarısı oluşturmaz.

FFPE SR-FTIR spektral sonucu

Ortalama ikinci türev spektrumlarında en belirgin farklılıklar yaklaşık 1640 ve 1541 cm⁻¹ amide I/II bölgelerinde görülmüştür.

Ek farklılıklar:

• 1235 cm⁻¹,
• 1120 cm⁻¹,
• 1075 cm⁻¹,
• 1025 cm⁻¹,
• 923 cm⁻¹.

PLS-DA loading profilleri özellikle 1664, 1640, 1621, 1541, 1525, 1510, 1235, 1120, 1075, 1025 ve 985 cm⁻¹ bölgelerinin grup ayrımına katkıda bulunduğunu göstermiştir.

Bunların bazıları proteinler, karbonhidratlar, fosfat grupları ve nükleik asitlerle ilişkilidir. Bununla birlikte hasta düzeyi doku oranlarının hiçbiri istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır.

Serum ATR-FTIR spektral sonucu

Serumun ortalama ikinci türev spektrumlarında önemli farklılıklar:

• Amide I: 1649 ve 1633 cm⁻¹,
• Amide II: 1539 cm⁻¹,
• alt dalga sayıları: yaklaşık 1123, 1077, 1042 ve 1025 cm⁻¹

olarak belirlenmiştir.

PCA loading profilinde 1649, 1633, 1583, 1558, 1539, 1512 ve 1042 cm⁻¹ öne çıkmıştır.

Kaynak Figure 3'te PCA'nın birinci bileşeni PC1 spektral varyasyonun %54'ünü, PC2 ise %23'ünü göstermektedir. İki grup arasında görünür bir ayrılma eğilimi vardır ancak örneklerin bir kısmı örtüşmektedir.

Hasta başına beş serum spektrumu neden önemli?

Beş tekrar aynı insandan alınmış beş bağımsız biyolojik örnek değildir. Bunlar aynı serumun teknik ölçüm tekrarlarıdır.

Çok değişkenli analizde kaynak 105 spektrumu ayrı spektral gözlem olarak korumuş ancak veri bölünmesini hasta düzeyinde yapmıştır. Spektral oran istatistiğinde ise beş teknik tekrar hasta başına ortalanmıştır.

Bu tasarım ayrımı önemlidir; aksi halde 21 kişilik kohortu yanlış biçimde 105 bağımsız hasta gibi yorumlamak istatistiksel örneklem büyüklüğünü olduğundan fazla gösterirdi.

Spektral örtüşme neden var?

Kaynak, CCA'nın moleküler değişiklikler, histolojik alt tip, farklılaşma derecesi ve hastalık ilerlemesi açısından heterojen olduğunu vurgulamaktadır. Bu biyolojik heterojenlik aynı HDRA sınıfındaki hastaların FTIR profillerinin de tamamen aynı olmamasına katkıda bulunabilir.

Ayrıca HDRA belirli deney koşullarında fonksiyonel ilaç yanıtını ölçerken FTIR bütün biyokimyasal bileşimi birlikte algılar. Bu nedenle iki testin aynı biyolojik özelliği bire bir ölçmesi beklenmemelidir.

Kaynakta tartışılan uyumsuz örnekler

Çoğu örnek HDRA sınıfıyla uyumlu spektral kümelenme gösterse de birkaç vaka uyumsuz kalmıştır.

HDRA-dirençli olduğu halde FTIR'da duyarlı gruba yakın kümelenen bir örnek daha iyi diferansiye histoloji ve lenf nodu metastazının bulunmaması gibi daha az agresif klinikopatolojik özelliklere sahipti.

Buna karşılık HDRA-duyarlı olup FTIR'da dirençli gruba yakın kümelenen bir örnek combined hepatocellular-cholangiocarcinoma (cHCC-CCA) tanısına sahipti ve orta dereceli farklılaşma, vasküler invazyon ve lenf nodu metastazı gibi daha agresif özellikler gösteriyordu.

Yazarlar bu gözlemi FTIR spektral fenotipinin yalnız ilaç yanıtını değil daha geniş tümör biyolojisini de yansıtabileceği şeklinde tartışmaktadır. Bu yorum gözlemseldir ve mevcut küçük örneklemde nedensellik kanıtlamaz.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• Serum FTIR spektrumlarında HDRA-duyarlı ve dirençli gruplar arasında özellikle amide I ve II bölgelerinde farklılıklar gözlenmiştir.
• Serum PCA analizi gruplar arasında keşifsel ayrılma ve kısmi örtüşme göstermiştir.
• 1633/1649, 1539/1649 ve 1539/1633 cm⁻¹ serum oranları Benjamini-Hochberg düzeltmesinden sonra da anlamlı kalmıştır.
• Üç anlamlı karşılaştırmanın düzeltilmiş P değeri 0,041'dir.
• 1042/1633 oranının ham P değeri 0,048 olmasına rağmen düzeltilmiş P değeri 0,059 olmuş ve anlamlılık sınırını geçememiştir.
• FFPE doku spektrumlarında amide ve fingerprint bölgelerinde farklılıklar ve PLS-DA'da kısmi ayrım gözlenmiştir.
• FFPE doku spektral oranlarının hiçbiri anlamlı farklılık göstermemiştir.
• Serum ile dokuda bazı benzer biyokimyasal spektral bölgeler görülmüştür.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• Serum FTIR'ın klinik gemsitabin yanıtını öngördüğü kanıtlanmamıştır.
• FTIR'ın tedavi seçiminde kullanılabilecek doğrulanmış bir klinik test olduğu gösterilmemiştir.
• Çalışmada gemsitabin alan hastaların gerçek tedavi yanıtları analiz edilmemiştir.
• Spektral oranların sağkalımı veya hastalık progresyonunu öngördüğü gösterilmemiştir.
• FTIR belirli bir tekil proteinin konsantrasyonunu doğrudan ölçmemiştir.
• hENT1, dCK, RRM1/RRM2, GLUT1, PKM2 veya LDHA mevcut deneyde ayrı ayrı ölçülmemiştir.
• PCA/PLS-DA için klinik sınıflandırma accuracy, sensitivity, specificity veya ROC-AUC değeri verilmemiştir.
• 21 serum hastasından elde edilen sonuçların bütün CCA popülasyonuna genellenebilirliği gösterilmemiştir.
• FTIR ve HDRA arasındaki ilişki nedensel mekanizma kanıtı değildir.

Çalışmanın temel sınırlılıkları

Küçük örneklem: Serum n=21, FFPE doku n=10'dur. Yazarlar küçük kohortun genellenebilirliği sınırlandırdığını açıkça belirtmektedir.

Klinik tedavi yanıtı yok: Duyarlı/dirençli etiketleri ex vivo HDRA'dan gelmektedir. Hastaların gerçek klinik gemsitabin yanıtı mevcut çalışmada bulunmamaktadır.

Kesin serum saklama süresi kaydedilmedi: Numuneler standart koşullarda saklanmış olsa da her serumun toplam saklama süresinin kesin kaydı bulunmamaktadır.

FFPE parafin kalıntısı: Deparafinizasyon yapılmış olsa da parafinin tamamen çıkarıldığı bağımsız biçimde nicel olarak doğrulanmamıştır. Kaynak özellikle 1400–1000 cm⁻¹ bölgesinin artık parafinden etkilenebileceğini belirtmektedir.

Mie saçılma düzeltmesi: EMSC uygulanmıştır ancak özel RMieS-EMSC gibi bir Mie saçılma düzeltmesi yapılmamıştır.

CCA heterojenliği: Tümör alt tipi, histoloji, diferansiyasyon ve diğer klinikopatolojik özellikler spektral varyasyona katkıda bulunabilir.

Moleküler mekanizma doğrudan ölçülmedi: FTIR farklılıkları biyokimyasal kompozit imzayı göstermektedir; hangi moleküler yolun bu farklılığa neden olduğu doğrudan belirlenmemiştir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma: Serum FTIR spectral features associated with HDRA-defined gemcitabine sensitivity in cholangiocarcinoma

Yazarlar: Kanokporn Matra; Patutong Chatchawal; Molin Wongwattanakul; Patipat Rachawangmuang; Sutthiwan Janthamala; Thanaphong Rattanathip; Sirinart Chio-Srichan; Chanchai Hongsa; Malinee Thanee; Supakan Amontailak; Juthamas Jaimanee; Piyapong Simtong; Anchalee Techasen.

Sorumlu yazar: Anchalee Techasen.

Sorumlu yazar e-postası: anchte@kku.ac.th

Kurum 1: Biomedical Science Program, Graduate School, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Kurum 2: School of Medical Technology, Faculty of Associated Medical Sciences, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Kurum 3: Beamline Division, Synchrotron Light Research Institute (Public Organization), Nakhon Ratchasima, Thailand.

Kurum 4: Department of Pathology, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Kurum 5: Cholangiocarcinoma Research Institute, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Dergi: Biomolecules and Biomedicine.

Yayın türü: Research Article; proof-of-concept insan biyolojik örnek çalışması.

DOI: 10.17305/bb.2026.14765.

Gönderim tarihi: 18 Temmuz 2026.

Kabul tarihi: 29 Eylül 2026.

Çevrimiçi yayın tarihi: 7 Ekim 2026.

Bibliyografik durum: PubMed kaydı makaleyi ahead of print olarak göstermektedir. Yüklenen PDF'de henüz cilt, sayı ve sayfa aralığı verilmemektedir.

Yayınevi: Association of Basic Medical Sciences.

Hakemlik: Biomolecules and Biomedicine hakemli bir dergidir; resmî dergi politikasında 2-5 dış hakemle çift-kör peer review uygulanmaktadır.

Lisans: Creative Commons Attribution 4.0 International — CC BY 4.0.

Etik onay: Khon Kaen University Ethics Committee for Human Research, Reference No. HE681229.

Etik standart: Declaration of Helsinki ve ICH Good Clinical Practice ilkeleri.

Bilgilendirilmiş onam: Tüm katılımcılardan yazılı informed consent alınmıştır.

Finansman: Khon Kaen University'nin “Integrated Accurate Diagnostic and Targeted Therapeutic Strategies in hepato-pancreato-biliary cancer” araştırması National Science Research and Innovation Fund (NSRF) tarafından desteklenmiştir.

Teşekkür: Synchrotron Light Research Institute (SLRI), Thailand'a beamtime allocation için teşekkür edilmiştir.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmiştir.

Veri erişilebilirliği: Çalışmanın bulgularını destekleyen verilerin makul talep üzerine sorumlu yazardan sağlanabileceği belirtilmiştir.

Yazar katkıları: İncelenen ana PDF'de ayrı bir Author Contributions veya CRediT bölümü bulunmamaktadır.

Eşit katkı: İncelenen PDF'de eşit katkı veya eş birinci yazarlık beyanı bulunmamaktadır.

Preprint: İncelenen PDF ve doğrulanan bibliyografik kayıtta ayrı bir preprint sürümü belirtilmemektedir.

Örneklem: 21 serum ve 10 FFPE tümör dokusu; yedi eşleşmiş serum-doku çifti.

HDRA grupları: Serum: 7 duyarlı, 14 dirençli. FFPE: 4 duyarlı, 6 dirençli.

HDRA koşulu: Dört günlük tümör histokültürü; koşul başına üç kuyu; ardından 4 saat MTT inkübasyonu; 540 nm absorbans; gemsitabin 1500 µg/mL; kaynakta kullanılan sınıflama kesme değeri %IR=43,28.

Serum hazırlığı: 3000 g, 10 dakika, 4 °C santrifüj; başlangıçta −80 °C, alikot sonrası −20 °C saklama; her alikot FTIR öncesi yalnız bir kez çözündürülmüştür.

Serum ATR-FTIR: Tensor II FTIR, elmas ATR; yaklaşık 5 µL serum; yaklaşık 10 dakika kurutma; 4000–400 cm⁻¹; 4 cm⁻¹ çözünürlük; 64 co-added scan; hasta başına beş teknik tekrar.

FFPE SR-FTIR: 5 µm kesit; Hyperion 2000 mikroskop; 36X Cassegrain objektif; MCT dedektör; VERTEX 70 FTIR; 10 × 10 µm² aperture; reflection mode; 4000–600 cm⁻¹; 4 cm⁻¹; 64 co-added scan.

Spektral ön işleme: Unscrambler X 10.4; Savitzky-Golay ikinci türev, derivative order 2, polynomial order 3, 15 smoothing point; ardından EMSC.

Doku çok değişkenli analiz: PLS-DA; HDRA duyarlı +1, dirençli −1; %70:%30 eğitim-test bölünmesi hasta düzeyinde; leverage validation.

Serum çok değişkenli analiz: Gözetimsiz PCA; toplam 105 teknik serum spektrumu.

Hasta düzeyi oran analizi: Teknik tekrarlar önce hasta başına ortalanmış, ardından spektral oranlar karşılaştırılmıştır.

İstatistik: GraphPad Prism 8.0.1; Shapiro-Wilk normalite testi; Welch düzeltmeli eşleştirilmemiş t-testi veya Mann-Whitney U; Benjamini-Hochberg FDR düzeltmesi; P<0,05 anlamlılık eşiği.

Ana serum sonucu: 1633/1649, 1539/1649 ve 1539/1633 cm⁻¹ oranları Benjamini-Hochberg düzeltmesinden sonra anlamlı kalmıştır; adjusted P=0,041.

Doku sonucu: FFPE dokuda hasta düzeyi spektral oranların hiçbiri anlamlı farklılık göstermemiştir.

Teknik tekrar sınırı: 105 serum spektrumu 105 bağımsız hasta değildir; 21 hastanın beşer teknik tekrarıdır.

Klinik sınır: Duyarlı/dirençli etiketleri ex vivo HDRA'ya dayanmaktadır; klinik gemsitabin tedavi yanıt verileri bulunmamaktadır.

Biyobelirteç sınırı: Üç anlamlı serum oranı klinik olarak doğrulanmış prediktif biyobelirteç değildir. Daha büyük, gerçek tedavi yanıtı bilinen kohortlarda doğrulama gereklidir.

Moleküler yorum sınırı: FTIR kompozit biyokimyasal imza ölçmektedir; belirli protein veya metabolik yol doğrudan nicelendirilmemiştir.

FFPE teknik sınırı: Parafinin tamamen çıkarıldığı bağımsız olarak doğrulanmamıştır ve 1400–1000 cm⁻¹ bölgesinde artık parafin etkisi olasılığı vardır.

Saçılma düzeltme sınırı: EMSC uygulanmış ancak dedicated Mie scattering correction / RMieS-EMSC kullanılmamıştır.

Serum saklama sınırı: Numuneler standartlaştırılmış koşullarda saklanmış olsa da kesin saklama süreleri kaydedilmemiştir.