FTIR spektral profilləmə, bioloji nümunədə molekulyar rabitələrin infraqırmızı şüalanma ilə qarşılıqlı təsirindən yaranan çoxdəyişənli spektral barmaq izini ölçən spektroskopik yanaşmadır. Bu proof-of-concept tədqiqatında tədqiqatçılar xolangiokarsinoma xəstələrindən alınmış serumda və formalinlə fiksasiya olunmuş, parafinə gömülmüş şiş toxumalarında FTIR xüsusiyyətlərinin, histokultura dərman cavabı testi (HDRA) ilə ex vivo müəyyən edilən gemsitabin həssaslığı və davamlılığı ilə əlaqəli olub-olmadığını araşdırmışlar. Tədqiqatda 21 serum nümunəsi və 10 FFPE şiş toxuması istifadə edilmiş; yeddi xəstədə serum və toxuma nümunələri uyğun cüt təşkil etmişdir. Serum ATR-FTIR ilə, toxuma isə sinxrotron şüalanmasına əsaslanan FTIR mikrospektroskopiyası ilə analiz edilmişdir.

Serum qrupunda 7 xəstə HDRA-həssas, 14 xəstə HDRA-davamlı; FFPE toxuma qrupunda isə 4 xəstə həssas və 6 xəstə davamlı kimi təsnif edilmişdir. Serumda zülallarla əlaqəli amide I və amide II sahələrində aydın spektral fərqlər müşahidə edilmiş və xüsusilə 1633/1649 cm⁻¹, 1539/1649 cm⁻¹ və 1539/1633 cm⁻¹ intensivlik nisbətləri Benjamini-Hochberg çoxsaylı müqayisə düzəlişindən sonra da iki qrup arasında fərqli qalmışdır. Hər üç müqayisənin düzəldilmiş P dəyəri 0,041 olmuşdur.

Toxuma FTIR nəticələrində, xüsusilə amide I və II sahələrində çoxsaylı spektral fərqlər və PLS-DA-da qismən qrup ayrılması müşahidə olunsa da, xəstə səviyyəsində toxuma spektral nisbətlərinin heç biri statistik baxımdan əhəmiyyətli fərq göstərməmişdir. Serum PCA-sı iki HDRA qrupunda kəşfiyyat xarakterli ayrılma meyli göstərmiş, lakin qruplar arasında üst-üstə düşmə də qalmışdır.

Tədqiqatın ən mühüm şərh məhdudiyyəti “gemsitabin həssas” və “gemsitabin davamlı” siniflərinin xəstələrin real klinik müalicə nəticələrinə deyil, cərrahi şiş toxumasında aparılmış ex vivo HDRA nəticəsinə əsaslanmasıdır. Tədqiqatçıların klinik gemsitabin cavabı barədə məlumatları yoxdur. Buna görə serum FTIR xüsusiyyətlərinin klinikada hansı xəstənin gemsitabinə cavab verəcəyini proqnozlaşdırdığı bu tədqiqatla sübut edilməmişdir.

Nəticələr serum FTIR-ın daha az invaziv bioloji nümunədə HDRA ilə əlaqəli, zülal-ağırlıqlı spektral fərqləri tuta bildiyini göstərən ilkin sübut təqdim edir. Bunun klinik biomarkerə, müalicə seçimi testinə və ya fərdiləşdirilmiş müalicə vasitəsinə çevrilməsi üçün daha böyük və real müalicə cavabları ilə klinik olaraq annotasiya edilmiş xəstə kohortlarında doğrulanması tələb olunur.

HDRA ilə Müəyyən Edilən Gemsitabin Həssaslığı Nə Deməkdir?

Bu tədqiqatda “gemsitabin həssaslığı” xəstənin klinikada gemsitabin müalicəsinə cavab verdiyi demək deyil; cərrahi yolla çıxarılmış xolangiokarsinoma toxumasının orqanizmdən kənar histokultura sistemində gemsitabinə verdiyi cavabın HDRA ilə ölçülməsi nəticəsində yaradılmış ex vivo təsnifatı ifadə edir.

Xolangiokarsinoma nədir?

Xolangiokarsinoma (CCA), öd yollarının epitelindən mənşə alan bədxassəli şişdir. Anatomik yerləşməsinə görə intrahepatik xolangiokarsinoma (iCCA), perihilar xolangiokarsinoma (pCCA) və distal xolangiokarsinoma (dCCA) kimi təsnif edilə bilər.

Tədqiqat nümunələri Taylanddakı Khon Kaen University Srinagarind Hospital-da cərrahi rezeksiya aparılmış xəstələrdən əldə edilmişdir. Məqalənin tədqiqat sualı CCA diaqnozu qoymaq deyil, FTIR spektral xüsusiyyətlərinin ex vivo gemsitabin həssaslığı ilə əlaqəsini araşdırmaqdır.

HDRA nədir?

Histoculture drug response assay (HDRA), cərrahi şiş toxumasının ex vivo kultivasiya edilərək müəyyən dərmana məruz qoyulduğu və toxumanın canlılığındakı/aktivliyindəki dəyişiklik əsasında dərmana həssaslığın qiymətləndirildiyi funksional test yanaşmasıdır.

Bu məqalədəki HDRA məlumatları eyni xəstə kohortu ilə daha əvvəl aparılmış tədqiqatdan götürülmüşdür. Şiş toxumaları dörd gün kultivasiya edilmiş və hər şərait üç kultura quyusunda sınaqdan keçirilmişdir. İnkubasiyadan sonra MTT testi üçün əlavə dörd saatlıq inkubasiya aparılmış və absorbans 540 nm-də ölçülmüşdür.

HDRA inhibisiya nisbəti necə hesablanır?

Mənbə tədqiqatında inhibisiya nisbəti aşağıdakı düsturla verilmişdir:

\[ \%IR=\left[1-\left(\frac{T}{C}\right)\right]\times100 \]

%IR, inhibition rate, yəni inhibisiya nisbətidir.

T, gemsitabin tətbiq edilmiş şiş kulturasının şiş çəkisinə normallaşdırılmış orta absorbansıdır.

C, müalicə tətbiq edilməmiş nəzarət kulturasının şiş çəkisinə normallaşdırılmış orta absorbansıdır.

Düsturda \(T/C\) nisbəti müalicə olunmuş toxumanın nəzarət toxumasına nisbətən qalan metabolik siqnalını təmsil edir. \(T\) dəyəri \(C\)-yə nisbətən azaldıqca \(T/C\) azalır və \(1-(T/C)\) böyüyür; nəticədə %IR yüksəlir. Riyazi baxımdan daha yüksək inhibisiya nisbəti ex vivo kulturada gemsitabinin daha güclü inhibisiyası ilə uyğun gəlir.

Tədqiqat, 1500 µg/mL gemsitabin üçün əvvəllər müəyyən edilmiş %43,28 HDRA kəsim dəyərindən həssas/cavab verən və davamlı qrupları yaratmaq üçün istifadə etmişdir.

Vacib doza məhdudiyyəti: 1500 µg/mL dəyəri HDRA laboratoriya sistemindəki ex vivo gemsitabin konsentrasiyasıdır. Xəstəyə tətbiq edilən klinik doza, qan səviyyəsi və ya tövsiyə olunan müalicə konsentrasiyası deyil.

FTIR Bu Tədqiqatda Nəyi Ölçür?

FTIR serum və ya toxuma daxilində ayrı-ayrı zülalları birbaşa müəyyən etmək əvəzinə zülallar, nuklein turşuları, karbohidratlar, fosfat tərkibli molekullar və lipidlər kimi çoxsaylı biomolekulların molekulyar rabitə rəqslərindən yaranan birləşik infraqırmızı spektral barmaq izini ölçür.

FTIR nə deməkdir?

Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), infraqırmızı şüalanmanın molekulyar rabitələrin rəqs modları tərəfindən hansı dalğa ədədlərində udulduğunu ölçən spektroskopik üsuldur.

Spektrin üfüqi oxunda istifadə edilən cm⁻¹ vahidi dalğa ədədidir. Dalğa ədədi bir santimetr uzunluğa düşən dalğa dövrlərinin sayı ilə əlaqəli spektroskopik kəmiyyətdir. FTIR ədəbiyyatında müəyyən rabitələrin rəqsləri müəyyən dalğa ədədi sahələrində siqnal yaratdığı üçün bu sahələr biokimyəvi şərhdə istifadə olunur.

Amide I və Amide II niyə vacibdir?

Tədqiqatdakı ən güclü fərqlərin çoxu zülallarla əlaqəli amide I və amide II sahələrində müşahidə edilmişdir.

Toxuma nümunələrində amide I təxminən 1640 cm⁻¹, amide II təxminən 1541 cm⁻¹ ətrafında önə çıxmışdır. Serumda amide I sahəsində təxminən 1649 və 1633 cm⁻¹, amide II sahəsində təxminən 1539 cm⁻¹ mühüm xüsusiyyətlər kimi müəyyən edilmişdir.

Mənbə amide I sahəsini zülalın ikincili quruluşu və xüsusilə α-heliks/β-təbəqə komponentləri ilə əlaqələndirir. Lakin FTIR-dakı bir amide zolağı konkret bir zülalın konsentrasiyasını ölçmür. Eyni dalğa ədədi sahəsinə çoxsaylı zülal və struktur vəziyyət töhfə verə bilər.

FTIR hENT1, dCK və ya RRM zülallarını ölçdümü?

Xeyr. Məqalənin müzakirə bölməsində hENT1, dCK və RRM1/RRM2 kimi daha əvvəl gemsitabin davamlılığı ilə əlaqələndirilmiş zülallardan bəhs edilməsi, bu zülalların hazırkı tədqiqatda FTIR ilə ayrı-ayrılıqda ölçüldüyü demək deyil. Müəlliflər də FTIR-ın fərdi zülalları birbaşa müəyyən edə bilmədiyini açıq şəkildə bildirirlər.

Buna görə bu tədqiqatda düzgün şərh “zülalla əlaqəli kompozit spektral xüsusiyyətlər HDRA qrupları arasında fərqləndi” şəklindədir; “müəyyən bir davamlılıq zülalı serum FTIR ilə ölçüldü” nəticəsi çıxarıla bilməz.

Serum və toxuma FTIR zolaqlarının müqayisəsi

Serum və toxuma arasında oxşar spektral sahələrin olması iki bioloji nümunədə müvafiq biokimyəvi siniflərə aid siqnalların mövcud olduğunu düşündürür. Lakin mənbə bu oxşarlığı hələ “ortaq biomarkerlərin sübutu” kimi qəbul etmir.

ATR-FTIR ilə Sinxrotron FTIR Arasındakı Fərq Nədir?

Bu tədqiqatda ATR-FTIR kiçik həcmli serum nümunələrinin birbaşa almaz ATR kristalı üzərində ölçülməsi üçün istifadə edilmiş; sinxrotron FTIR mikrospektroskopiyası isə FFPE şiş kəsiklərində mikrometr miqyaslı toxuma sahələrinin məkan spektral xüsusiyyətlərini araşdırmaq üçün istifadə edilmişdir.

Serum ATR-FTIR ölçməsi

Serum ölçmələri Bruker Tensor II FTIR spektrometri və almaz ATR kristalından istifadə edilməklə aparılmışdır.

• Hər serum nümunəsi: təxminən 5 µL.
• ATR kristalı üzərində qurutma: təxminən 10 dəqiqə, zəif hava axını altında.
• Spektral interval: 4000–400 cm⁻¹.
• Spektral ayırdetmə: 4 cm⁻¹.
• Bir spektr üçün birlikdə toplanan skan sayı: 64.
• Hər xəstə üçün texniki təkrar: 5.
• Xəstə sayı: 21.
• Cəmi serum spektri: 105.

Serum qan nümunələri 3000 g-də 10 dəqiqə, 4 °C-də sentrifuqasiya edilərək hazırlanmışdır. Serum əvvəlcə −80 °C-də, daha sonra alikvotlara bölündükdən sonra −20 °C-də saxlanılmışdır. Hər alikvot FTIR ölçməsindən dərhal əvvəl yalnız bir dəfə əridilmişdir; bu yanaşma təkrarlanan donma-ərimə dövrlərinin yarada biləcəyi deqradasiyanı azaltmağı hədəfləmişdir.

FFPE toxuma SR-FTIR ölçməsi

FFPE şiş blokları 5 µm qalınlığında paralel kəsiklərə ayrılmışdır. Bir kəsik MirrIR aşağı emissiyalı slayda, ona uyğun paralel kəsik isə hematoksilin-eozin (H&E) boyaması üçün standart şüşə slayda yerləşdirilmişdir.

FTIR-dan əvvəl MirrIR kəsikləri ksilenlə deparafinizasiya edilmiş, pilləli etanol seriyaları ilə rehidratasiya olunmuş, su ilə yuyulmuş və otaq temperaturunda havada qurudulmuşdur.

Patoloq H&E və MirrIR kəsiklərini birlikdə nəzərdən keçirərək FTIR ölçməsinin aparılacağı mikroskopik sahələrin düzgün lokalizasiyasını yoxlamışdır.

Ölçmələr Tayland Synchrotron Light Research Institute Beamline 4.1-də aparılmışdır.

• FTIR mikroskopu: Hyperion 2000.
• Obyektiv: 36X Cassegrain.
• Detektor: maye azotla soyudulan mercury-cadmium-telluride (MCT).
• FTIR spektrometri: Bruker VERTEX 70.
• Aperture: 10 × 10 µm².
• Ölçmə rejimi: reflection.
• Spektral interval: 4000–600 cm⁻¹.
• Ayırdetmə: 4 cm⁻¹.
• Birlikdə toplanan skan: 64.

Mənbə FTIR kimyəvi görüntülərində rəng nəyi göstərir?

Mənbə Şəkil 1-dəki rəngli FTIR kimyəvi xəritələri histoloji boyama və ya birbaşa “xərçəng davamlılığı xəritəsi” deyil. Pseudocolour şkalası seçilmiş spektral sahələrdəki nisbi FTIR siqnal intensivliyinin toxuma üzərində məkan paylanmasını göstərir.

1800–900 cm⁻¹ fingerprint sahəsi zülal, nuklein turşusu, karbohidrat və fosfolipid töhfələrini əhatə etdiyi halda 1750–1480 cm⁻¹ sahəsi əsasən zülalla əlaqəli amide zolaqlarını əhatə edir.

PCA və PLS-DA Bu Tədqiqatda Eyni İşi Görür?

Xeyr. Serum üçün istifadə edilən PCA sinif etiketini model təlimində istifadə etmədən spektral variasiyanı üzə çıxaran nəzarətsiz kəşfiyyat metodudur; FFPE toxuma üçün istifadə edilən PLS-DA isə HDRA həssas/davamlı etiketlərindən istifadə edərək qrupları ayırmağa çalışan nəzarətli çoxdəyişənli metoddur.

PCA nə etdi?

Principal component analysis (PCA; əsas komponentlər analizi), çoxsaylı spektral dəyişənləri bir-biri ilə əlaqəli variasiyanı ümumiləşdirən daha az sayda əsas komponentə çevirir.

Serumda PCA əvvəlcədən işlənmiş 105 texniki spektr üzərində aparılmışdır. Bunların 35-i 7 HDRA-həssas xəstənin, 70-i isə 14 HDRA-davamlı xəstənin hər birindən alınmış beş texniki spektrdir.

Mənbə Şəkil 3-ün score plot-unda PC1 ümumi spektral variasiyanın %54-nü, PC2 isə %23-nü təmsil edir. Qruplar arasında kəşfiyyat xarakterli ayrılma müşahidə edilmiş, lakin bəzi spektrlər üst-üstə düşmüşdür.

Buna görə PCA nəticəsi “serum FTIR ilə xəstələr %100 düzgün təsnif edildi” kimi şərh edilə bilməz. Mənbə hər hansı PCA təsnifat dəqiqliyi, həssaslıq, spesifiklik və ya AUC dəyəri bildirmir.

PLS-DA nə etdi?

Partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), spektral dəyişənlərlə əvvəlcədən məlum sinif etiketləri arasındakı əlaqədən istifadə edərək qrupları ayırmağa çalışan nəzarətli çoxdəyişənli metoddur.

FFPE analizində HDRA-həssas sinif +1, davamlı sinif −1 kimi kodlaşdırılmışdır.

Məlumatlar təlim və test dəstlərinə %70:%30 nisbətində və xəstə səviyyəsində bölünmüşdür. Eyni xəstədən gələn spektrlərin bir hissəsinin təlimə, digər hissəsinin testə düşməsinə icazə verilməmişdir. Bu yanaşma texniki təkrarların xəstə kimliyini modelə sızdırması riskini azaltmaq baxımından vacibdir.

Bir toxuma nümunəsindən birdən çox spektr olduğu üçün modelin qiymətləndirilməsində leverage validation istifadə edilmişdir.

PLS-DA score plot yalnız qismən qrup ayrılması göstərmişdir. Mənbə təsnifat accuracy, sensitivity, specificity, ROC-AUC və ya müstəqil xarici doğrulama performansı bildirmir. Buna görə Verianla bu metriklərdən heç birini yaratmır.

Spektral ön işləmə niyə aparıldı?

Xam FTIR spektrləri yalnız biokimyəvi fərqlərdən deyil, baseline sürüşməsi, səpilmə, nümunə qalınlığı və intensivlik miqyası kimi texniki təsirlərdən də təsirlənə bilər. Mənbə bu təsirləri azaltmaq üçün Unscrambler X 10.4 istifadə etmişdir.

Ön işləmə ardıcıllığı:

1. Savitzky-Golay ikinci törəmə çevrilməsi.
2. Törəmə dərəcəsi: 2.
3. Polinom dərəcəsi: 3.
4. Hamarlama nöqtəsi: 15.
5. Daha sonra extended multiplicative signal correction (EMSC).

İkinci törəmə əməliyyatı bir-birinə yaxın və ya üst-üstə düşən spektral xüsusiyyətləri daha görünən edə və yavaş dəyişən baseline komponentlərini azalda bilər. EMSC isə miqyas və səpilmə mənşəli spektral variasiyaları normallaşdırmağı hədəfləyir.

Bununla yanaşı mənbə FFPE toxuma spektrlərində xüsusi Resonant Mie scattering-EMSC (RMieS-EMSC) düzəlişinin istifadə edilməməsini məhdudiyyət kimi qeyd edir.

Serumdakı Üç Əhəmiyyətli FTIR Nisbəti Necə Şərh Edilməlidir?

1633/1649, 1539/1649 və 1539/1633 cm⁻¹ nisbətlərinin HDRA-həssas və HDRA-davamlı xəstə qrupları arasında çoxsaylı müqayisə düzəlişindən sonra fərqli qalması, serum zülalı ilə əlaqəli FTIR xüsusiyyətlərinin ex vivo gemsitabin cavab sinfi ilə əlaqəli olduğunu göstərən statistik nəticədir; bu nisbətlər hələ klinik müalicə cavabını proqnozlaşdıran doğrulanmış biomarkerlər deyil.

Nisbət analizi necə aparıldı?

Spektral nisbət analizi çoxdəyişənli PCA/PLS-DA analizindən ayrıca aparılmışdır. Əsas spektral piklər orta spektrlərdən və loading plot-lardan seçilmiş, nisbətlər isə xam spektrlər üzərindən hesablanmışdır.

Hər xəstə üçün texniki təkrar spektrləri əvvəlcə ortalanaraq vahid təmsilçi xəstə spektri yaradılmışdır. Beləliklə statistik müqayisədə əsas bioloji vahid spektr deyil, xəstə olmuşdur.

Serum üçün seçilmiş dörd pik:

• 1649 cm⁻¹,
• 1633 cm⁻¹,
• 1539 cm⁻¹,
• 1042 cm⁻¹.

Bu dörd pik arasındakı altı ikili nisbət analiz edilmişdir.

Statistik analiz hansı ardıcıllıqla aparıldı?

Statistik analiz GraphPad Prism 8.0.1 ilə aparılmışdır.

1. Hər nisbət üçün məlumatların normallığı Shapiro-Wilk testi ilə qiymətləndirilmişdir.
2. Normal paylanma göstərən müqayisələrdə cütləşdirilməmiş Welch düzəlişli t-testi istifadə edilmişdir.
3. Normal paylanmayan məlumatlarda Mann-Whitney U testi istifadə edilmişdir.
4. Birdən çox spektral nisbət sınaqdan keçirildiyi üçün P dəyərləri Benjamini-Hochberg üsulu ilə düzəldilmişdir.
5. Yanlış kəşf nisbəti (false discovery rate; FDR) nəzarətdə saxlanılmışdır.
6. Düzəldilmiş və ya müvafiq analizdə P<0,05 statistik əhəmiyyət həddi kimi istifadə edilmişdir.

Benjamini-Hochberg düzəlişi niyə lazımdır?

Eyni məlumat üzərində çoxsaylı statistik müqayisə aparıldıqda yalnız təsadüf nəticəsində P<0,05 nəticələrinin ortaya çıxma ehtimalı artır. Benjamini-Hochberg yanaşması bütün P dəyərlərini birlikdə qiymətləndirərək yanlış müsbət tapıntıların nisbətini nəzarətdə saxlamağa çalışır.

Bu tədqiqatda bunun konkret nümunəsi 1042/1633 nisbətidir. Xam analizdə P=0,048 ilə 0,05-dən aşağı göründüyü halda Benjamini-Hochberg düzəlişindən sonra P=0,059-a yüksəlmiş və artıq statistik cəhətdən əhəmiyyətli hesab edilməmişdir.

Effekt ölçüsü nə əlavə edir?

P dəyəri müşahidə olunan fərqin sıfır fərq fərziyyəsi ilə nə dərəcədə uyğunsuz olduğunu qiymətləndirərkən, effekt ölçüsü qruplar arasındakı fərqin böyüklüyü barədə əlavə məlumat verir.

Mann-Whitney U istifadə edilən nisbətlərdə mənbə rank-biserial r, Welch t-testi istifadə edilən nisbətlərdə isə standartlaşdırılmış orta fərq ölçüsü olan Hedges' g bildirmişdir.

Effekt ölçüsünün işarəsinin istiqaməti istifadə olunan qrup sırasından və hesablama tərifindən asılı olduğuna görə yalnız mənfi və ya müsbət işarəyə baxaraq bioloji “yaxşı/pis” istiqamət çıxarmaq olmaz. Mənbə Figure 4-də nisbətlərin müşahidə olunan qrup istiqamətlərini ayrıca göstərir.

Figure 4-də nisbətlərin istiqaməti necə idi?

Mənbənin xəstə səviyyəli qutu qrafiklərində 1633/1649 və 1539/1649 nisbətləri HDRA-həssas qrupda daha yüksək göründüyü halda, 1539/1633 nisbəti HDRA-davamlı qrupda daha yüksək görünür. Bu üç nisbət çoxsaylı müqayisə düzəlişindən sonra əhəmiyyətli qalan nisbətlərdir.

Mənbə Figure 4-ün xam xəstə dəyərləri cədvəl şəklində dərc edilmədiyinə görə Verianla bu qutu qrafiklərini təxmini rəqəmləşdirərək yenidən yaratmır.

Toxuma nisbətlərində nə tapıldı?

FFPE toxumada 1640 cm⁻¹ referans pik kimi istifadə edilmiş və 1541, 1510, 1235, 1120 və 1075 cm⁻¹ pikləri ilə nisbətlər hesablanmışdır.

Supplemental Figure S1-ə görə aşağıdakı nisbətlərin heç birində HDRA-həssas və HDRA-davamlı qruplar arasında əhəmiyyətli fərq aşkar edilməmişdir:

• 1541/1640,
• 1235/1640,
• 1120/1640,
• 1075/1640,
• 1025/1640.

Beləliklə tədqiqatın statistik nisbət tapıntısı serum tərəfindədir; toxuma tərəfindəki spektral fərqlər vizual/çoxdəyişənli meyl kimi müşahidə edilmiş, lakin xəstə səviyyəli nisbət testində təsdiqlənməmişdir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Nümunə strukturu

Yeddi xəstədə serum və FFPE toxuma nümunələri uyğun cüt təşkil etmişdir. Buna görə 21 serum və 10 toxuma nümunəsinin hamısı eyni şəxslərin bir-birinə uyğun nümunələri deyil.

Kohortun klinikopatoloji paylanması

FFPE qrupunda dörd həssas və altı davamlı hal olmuşdur. Həssas qrupda üç kişi və bir qadın; davamlı qrupda dörd kişi və iki qadın var.

Serum qrupunda yeddi həssas halın beşi kişi və ikisi qadın; 14 davamlı halın səkkizi kişi və altısı qadındır.

Tədqiqat həm intrahepatik, həm də perihilar öd yolu şişlərini əhatə edir. Distal xolangiokarsinoma Table 1-də ayrıca nümunə qrupu kimi bildirilməmişdir.

Toxuma FTIR kimyəvi görüntüləmə nəticəsi

FFPE kimyəvi görüntülərində HDRA-həssas və davamlı toxumalar arasında 1800–900 cm⁻¹ fingerprint sahəsində və 1750–1480 cm⁻¹ zülal-ağırlıqlı sahədə məkan siqnal paylanması fərqləri müşahidə edilmişdir.

Davamlı toxumaların fingerprint sahəsində bəzi sahələrdə daha yüksək nisbi spektral intensivlik göstərdiyi müşahidə olunmuşdur. Lakin bunlar representative görüntülərdir və təkbaşına kəmiyyət xəstə təsnifat uğuru yaratmır.

FFPE SR-FTIR spektral nəticəsi

Orta ikinci törəmə spektrlərində ən aydın fərqlər təxminən 1640 və 1541 cm⁻¹ amide I/II sahələrində müşahidə edilmişdir.

Əlavə fərqlər:

• 1235 cm⁻¹,
• 1120 cm⁻¹,
• 1075 cm⁻¹,
• 1025 cm⁻¹,
• 923 cm⁻¹.

PLS-DA loading profilləri xüsusilə 1664, 1640, 1621, 1541, 1525, 1510, 1235, 1120, 1075, 1025 və 985 cm⁻¹ sahələrinin qrup ayrılmasına töhfə verdiyini göstərmişdir.

Bunların bəziləri zülallar, karbohidratlar, fosfat qrupları və nuklein turşuları ilə əlaqəlidir. Bununla belə xəstə səviyyəli toxuma nisbətlərinin heç biri statistik əhəmiyyətə çatmamışdır.

Serum ATR-FTIR spektral nəticəsi

Serumun orta ikinci törəmə spektrlərində mühüm fərqlər:

• Amide I: 1649 və 1633 cm⁻¹,
• Amide II: 1539 cm⁻¹,
• aşağı dalğa ədədləri: təxminən 1123, 1077, 1042 və 1025 cm⁻¹

kimi müəyyən edilmişdir.

PCA loading profilində 1649, 1633, 1583, 1558, 1539, 1512 və 1042 cm⁻¹ önə çıxmışdır.

Mənbə Figure 3-də PCA-nın birinci komponenti PC1 spektral variasiyanın %54-nü, PC2 isə %23-nü göstərir. İki qrup arasında görünən ayrılma meyli var, lakin nümunələrin bir hissəsi üst-üstə düşür.

Hər xəstə üçün beş serum spektri niyə vacibdir?

Beş təkrar eyni insandan alınmış beş müstəqil bioloji nümunə deyil. Bunlar eyni serumun texniki ölçmə təkrarlarıdır.

Çoxdəyişənli analizdə mənbə 105 spektri ayrı spektral müşahidə kimi saxlamış, lakin məlumat bölünməsini xəstə səviyyəsində aparmışdır. Spektral nisbət statistikasında isə beş texniki təkrar xəstə üzrə ortalanmışdır.

Bu dizayn fərqi vacibdir; əks halda 21 nəfərlik kohortu yanlış şəkildə 105 müstəqil xəstə kimi şərh etmək statistik nümunə ölçüsünü olduğundan böyük göstərərdi.

Spektral üst-üstə düşmə niyə var?

Mənbə CCA-nın molekulyar dəyişikliklər, histoloji alt tip, diferensiasiya dərəcəsi və xəstəliyin irəliləməsi baxımından heterogen olduğunu vurğulayır. Bu bioloji heterogenlik eyni HDRA sinfindəki xəstələrin FTIR profillərinin də tam eyni olmamasına töhfə verə bilər.

Bundan əlavə, HDRA müəyyən eksperimental şəraitdə funksional dərman cavabını ölçdüyü halda FTIR bütün biokimyəvi tərkibi birlikdə qavrayır. Buna görə iki testin eyni bioloji xüsusiyyəti bir-bir ölçməsi gözlənilməməlidir.

Mənbədə müzakirə olunan uyğunsuz nümunələr

Nümunələrin çoxu HDRA sinfi ilə uyğun spektral klasterləşmə göstərsə də, bir neçə hal uyğunsuz qalmışdır.

HDRA-davamlı olmasına baxmayaraq FTIR-da həssas qrupa yaxın klasterləşən bir nümunə daha yaxşı diferensiasiya olunmuş histologiya və limfa düyünü metastazının olmaması kimi daha az aqressiv klinikopatoloji xüsusiyyətlərə malik idi.

Əksinə, HDRA-həssas olub FTIR-da davamlı qrupa yaxın klasterləşən bir nümunə combined hepatocellular-cholangiocarcinoma (cHCC-CCA) diaqnozuna malik idi və orta dərəcəli diferensiasiya, vaskulyar invaziya və limfa düyünü metastazı kimi daha aqressiv xüsusiyyətlər göstərirdi.

Müəlliflər bu müşahidəni FTIR spektral fenotipinin yalnız dərman cavabını deyil, daha geniş şiş biologiyasını da əks etdirə biləcəyi kimi müzakirə edirlər. Bu şərh müşahidə xarakterlidir və hazırkı kiçik nümunədə səbəbiyyəti sübut etmir.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• Serum FTIR spektrlərində HDRA-həssas və davamlı qruplar arasında, xüsusilə amide I və II sahələrində fərqlər müşahidə edilmişdir.
• Serum PCA analizi qruplar arasında kəşfiyyat xarakterli ayrılma və qismən üst-üstə düşmə göstərmişdir.
• 1633/1649, 1539/1649 və 1539/1633 cm⁻¹ serum nisbətləri Benjamini-Hochberg düzəlişindən sonra da əhəmiyyətli qalmışdır.
• Üç əhəmiyyətli müqayisənin düzəldilmiş P dəyəri 0,041-dir.
• 1042/1633 nisbətinin xam P dəyəri 0,048 olmasına baxmayaraq, düzəldilmiş P dəyəri 0,059 olmuş və əhəmiyyət həddini keçməmişdir.
• FFPE toxuma spektrlərində amide və fingerprint sahələrində fərqlər və PLS-DA-da qismən ayrılma müşahidə edilmişdir.
• FFPE toxuma spektral nisbətlərinin heç biri əhəmiyyətli fərq göstərməmişdir.
• Serum və toxumada bəzi oxşar biokimyəvi spektral sahələr müşahidə edilmişdir.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

• Serum FTIR-ın klinik gemsitabin cavabını proqnozlaşdırdığı sübut edilməmişdir.
• FTIR-ın müalicə seçimində istifadə edilə bilən doğrulanmış klinik test olduğu göstərilməmişdir.
• Tədqiqatda gemsitabin alan xəstələrin real müalicə cavabları analiz edilməmişdir.
• Spektral nisbətlərin sağqalımı və ya xəstəliyin proqressiyasını proqnozlaşdırdığı göstərilməmişdir.
• FTIR konkret bir fərdi zülalın konsentrasiyasını birbaşa ölçməmişdir.
• hENT1, dCK, RRM1/RRM2, GLUT1, PKM2 və ya LDHA hazırkı təcrübədə ayrı-ayrılıqda ölçülməmişdir.
• PCA/PLS-DA üçün klinik təsnifat accuracy, sensitivity, specificity və ya ROC-AUC dəyəri verilməmişdir.
• 21 serum xəstəsindən əldə edilən nəticələrin bütün CCA populyasiyasına ümumiləşdirilə bilməsi göstərilməmişdir.
• FTIR ilə HDRA arasındakı əlaqə səbəbli mexanizmin sübutu deyil.

Tədqiqatın əsas məhdudiyyətləri

Kiçik nümunə: Serum n=21, FFPE toxuma n=10-dur. Müəlliflər kiçik kohortun ümumiləşdirilə bilməni məhdudlaşdırdığını açıq şəkildə bildirirlər.

Klinik müalicə cavabı yoxdur: Həssas/davamlı etiketləri ex vivo HDRA-dan gəlir. Xəstələrin real klinik gemsitabin cavabı hazırkı tədqiqatda mövcud deyil.

Dəqiq serum saxlama müddəti qeydə alınmayıb: Nümunələr standart şəraitdə saxlanılsa da, hər serumun ümumi saxlama müddətinin dəqiq qeydi yoxdur.

FFPE parafin qalığı: Deparafinizasiya aparılsa da, parafinin tam çıxarıldığı müstəqil şəkildə kəmiyyətcə doğrulanmamışdır. Mənbə xüsusilə 1400–1000 cm⁻¹ sahəsinin qalıq parafindən təsirlənə biləcəyini bildirir.

Mie səpilmə düzəlişi: EMSC tətbiq edilmişdir, lakin xüsusi RMieS-EMSC kimi Mie səpilmə düzəlişi aparılmamışdır.

CCA heterogenliyi: Şiş alt tipi, histologiya, diferensiasiya və digər klinikopatoloji xüsusiyyətlər spektral variasiyaya töhfə verə bilər.

Molekulyar mexanizm birbaşa ölçülməyib: FTIR fərqləri biokimyəvi kompozit imzanı göstərir; hansı molekulyar yolun bu fərqə səbəb olduğu birbaşa müəyyən edilməmişdir.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal tədqiqat: Serum FTIR spectral features associated with HDRA-defined gemcitabine sensitivity in cholangiocarcinoma

Müəlliflər: Kanokporn Matra; Patutong Chatchawal; Molin Wongwattanakul; Patipat Rachawangmuang; Sutthiwan Janthamala; Thanaphong Rattanathip; Sirinart Chio-Srichan; Chanchai Hongsa; Malinee Thanee; Supakan Amontailak; Juthamas Jaimanee; Piyapong Simtong; Anchalee Techasen.

Məsul müəllif: Anchalee Techasen.

Məsul müəllifin e-poçtu: anchte@kku.ac.th

Qurum 1: Biomedical Science Program, Graduate School, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Qurum 2: School of Medical Technology, Faculty of Associated Medical Sciences, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Qurum 3: Beamline Division, Synchrotron Light Research Institute (Public Organization), Nakhon Ratchasima, Thailand.

Qurum 4: Department of Pathology, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Qurum 5: Cholangiocarcinoma Research Institute, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Jurnal: Biomolecules and Biomedicine.

Nəşr növü: Research Article; proof-of-concept insan bioloji nümunə tədqiqatı.

DOI: 10.17305/bb.2026.14765.

Göndərilmə tarixi: 18 iyul 2026.

Qəbul tarixi: 29 sentyabr 2026.

Onlayn nəşr tarixi: 7 oktyabr 2026.

Biblioqrafik status: PubMed qeydi məqaləni ahead of print kimi göstərir. Yüklənmiş PDF-də hələ cild, nömrə və səhifə intervalı verilməmişdir.

Nəşriyyat: Association of Basic Medical Sciences.

Resenziya: Biomolecules and Biomedicine resenziyalı jurnaldır; rəsmi jurnal siyasətində 2-5 xarici rəyçi ilə ikiqat-kor peer review tətbiq edilir.

Lisenziya: Creative Commons Attribution 4.0 International — CC BY 4.0.

Etik təsdiq: Khon Kaen University Ethics Committee for Human Research, Reference No. HE681229.

Etik standart: Declaration of Helsinki və ICH Good Clinical Practice prinsipləri.

Məlumatlandırılmış razılıq: Bütün iştirakçılardan yazılı informed consent alınmışdır.

Maliyyələşdirmə: Khon Kaen University-nin “Integrated Accurate Diagnostic and Targeted Therapeutic Strategies in hepato-pancreato-biliary cancer” tədqiqatı National Science Research and Innovation Fund (NSRF) tərəfindən dəstəklənmişdir.

Təşəkkür: Synchrotron Light Research Institute (SLRI), Thailand-a beamtime allocation üçün təşəkkür edilmişdir.

Maraqların toqquşması: Müəlliflər maraqların toqquşmasının olmadığını bəyan etmişlər.

Məlumatların əlçatanlığı: Tədqiqat nəticələrini dəstəkləyən məlumatların məqbul sorğu əsasında məsul müəllifdən əldə edilə biləcəyi bildirilmişdir.

Müəllif töhfələri: Araşdırılan əsas PDF-də ayrıca Author Contributions və ya CRediT bölməsi yoxdur.

Bərabər töhfə: Araşdırılan PDF-də bərabər töhfə və ya bərabər birinci müəlliflik bəyanatı yoxdur.

Preprint: Araşdırılan PDF və təsdiqlənmiş biblioqrafik qeyddə ayrıca preprint versiyası göstərilmir.

Nümunə: 21 serum və 10 FFPE şiş toxuması; yeddi uyğunlaşdırılmış serum-toxuma cütü.

HDRA qrupları: Serum: 7 həssas, 14 davamlı. FFPE: 4 həssas, 6 davamlı.

HDRA şəraiti: Dörd günlük şiş histokulturası; hər şərait üçün üç quyu; daha sonra 4 saat MTT inkubasiyası; 540 nm absorbans; gemsitabin 1500 µg/mL; mənbədə istifadə olunan təsnifat kəsim dəyəri %IR=43,28.

Serum hazırlığı: 3000 g, 10 dəqiqə, 4 °C sentrifuqasiya; əvvəlcə −80 °C, alikvotdan sonra −20 °C saxlama; hər alikvot FTIR-dan əvvəl yalnız bir dəfə əridilmişdir.

Serum ATR-FTIR: Tensor II FTIR, almaz ATR; təxminən 5 µL serum; təxminən 10 dəqiqə qurutma; 4000–400 cm⁻¹; 4 cm⁻¹ ayırdetmə; 64 co-added scan; hər xəstə üçün beş texniki təkrar.

FFPE SR-FTIR: 5 µm kəsik; Hyperion 2000 mikroskop; 36X Cassegrain obyektiv; MCT detektor; VERTEX 70 FTIR; 10 × 10 µm² aperture; reflection mode; 4000–600 cm⁻¹; 4 cm⁻¹; 64 co-added scan.

Spektral ön işləmə: Unscrambler X 10.4; Savitzky-Golay ikinci törəmə, derivative order 2, polynomial order 3, 15 smoothing point; daha sonra EMSC.

Toxuma çoxdəyişənli analizi: PLS-DA; HDRA həssas +1, davamlı −1; %70:%30 təlim-test bölünməsi xəstə səviyyəsində; leverage validation.

Serum çoxdəyişənli analizi: Nəzarətsiz PCA; cəmi 105 texniki serum spektri.

Xəstə səviyyəli nisbət analizi: Texniki təkrarlar əvvəlcə xəstə üzrə ortalanmış, sonra spektral nisbətlər müqayisə edilmişdir.

Statistika: GraphPad Prism 8.0.1; Shapiro-Wilk normallıq testi; Welch düzəlişli cütləşdirilməmiş t-testi və ya Mann-Whitney U; Benjamini-Hochberg FDR düzəlişi; P<0,05 əhəmiyyət həddi.

Əsas serum nəticəsi: 1633/1649, 1539/1649 və 1539/1633 cm⁻¹ nisbətləri Benjamini-Hochberg düzəlişindən sonra əhəmiyyətli qalmışdır; adjusted P=0,041.

Toxuma nəticəsi: FFPE toxumada xəstə səviyyəli spektral nisbətlərin heç biri əhəmiyyətli fərq göstərməmişdir.

Texniki təkrar məhdudiyyəti: 105 serum spektri 105 müstəqil xəstə deyil; 21 xəstənin hər birindən beş texniki təkrardır.

Klinik məhdudiyyət: Həssas/davamlı etiketləri ex vivo HDRA-ya əsaslanır; klinik gemsitabin müalicə cavabı məlumatları yoxdur.

Biomarker məhdudiyyəti: Üç əhəmiyyətli serum nisbəti klinik olaraq doğrulanmış prediktiv biomarkerlər deyil. Daha böyük, real müalicə cavabı məlum olan kohortlarda doğrulama tələb olunur.

Molekulyar şərh məhdudiyyəti: FTIR kompozit biokimyəvi imzanı ölçür; konkret zülal və ya metabolik yol birbaşa kəmiyyətləşdirilməmişdir.

FFPE texniki məhdudiyyəti: Parafinin tam çıxarıldığı müstəqil şəkildə doğrulanmamışdır və 1400–1000 cm⁻¹ sahəsində qalıq parafin təsiri ehtimalı vardır.

Səpilmə düzəlişi məhdudiyyəti: EMSC tətbiq edilmiş, lakin dedicated Mie scattering correction / RMieS-EMSC istifadə edilməmişdir.

Serum saxlama məhdudiyyəti: Nümunələr standartlaşdırılmış şəraitdə saxlanılsa da, dəqiq saxlama müddətləri qeydə alınmamışdır.