Экстракти хлороформии сабӯси биринҷи сиёҳи Sembada Hitam (chloroform extract of black rice bran; CBRB) дар ин таҳқиқот экстракти растаниест, ки аз сабӯси навъи Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’ бо истифода аз хлороформ омода шуда, дар ҳуҷайраҳои саратони ҷигари HepG2 дар шароити in vitro санҷида шудааст. Муҳаққиқон таъсири CBRB-ро тавассути се самти таҷрибавӣ омӯхтанд: қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳо/ситотоксикӣ бо санҷиши MTT, муҳоҷирати ҳуҷайраҳо бо санҷиши wound-healing ва шакли марги ҳуҷайра бо Annexin V-FITC flow cytometry. Таъсирҳои равшани CBRB умуман дар консентратсияҳои баланд зоҳир шуданд. Барои CBRB IC₅₀ дар 24 соат 1.265 μg/mL ва дар 48 соат 1.868 μg/mL буд, дар ҳоле ки барои doxorubicin мутаносибан 0,44 ва 0,18 μg/mL буд. CBRB дар 1.500 μg/mL муҳоҷирати HepG2-ро ба таври назаррас кам кард ва дар таҳлили flow cytometry %60,35±0,01 апоптози барвақт нишон дод. Бо вуҷуди ин, таҳқиқот танҳо дар фарҳанги ҳуҷайравии HepG2 анҷом дода шудааст; он пешгирӣ ё табобати саратонро дар инсон, бехатарии клиникӣ ё роҳи мушаххаси молекулавиро исбот намекунад.

Дар санҷиши 48-соатаи MTT, CBRB дар 2.000 μg/mL қобилияти зиндамонии HepG2-ро то %30,39±12,23 ва дар 3.000 μg/mL то %4,9±0,67 коҳиш дод. Баръакс, doxorubicin дар консентратсияҳои хеле пасттар таъсири қавии ситотоксикӣ нишон дод. Аз ин рӯ, манбаъ таъкид мекунад, ки CBRB нисбат ба doxorubicin потенсиали ситотоксикии пасттар дорад.

Дар таҷрибаи муҳоҷирати ҳуҷайраҳо 250, 500, 1.000 ва 1.500 μg/mL CBRB санҷида шуд. Қиматҳои gap closure ва migration velocity бо зиёд шудани консентратсия тамоюли коҳишро нишон доданд; фурӯнишонии равшани омории муҳоҷират дар 1.500 μg/mL CBRB мушоҳида шуд. Doxorubicin 2 μg/mL низ migration inhibition-и қавӣ нишон дод.

Дар таҷрибаи flow cytometry консентратсияҳои 500, 1.000 ва 1.500 μg/mL CBRB барои 48 соат санҷида шуданд. Дар 1.500 μg/mL CBRB апоптози барвақт ба %60,35±0,01 расид; дар ҳамин гурӯҳ некроз %2,45±0,06 гузориш шудааст. Муҳаққиқон қайд мекунанд, ки марги ҳуҷайраҳо асосан бо apoptosis мувофиқ аст, аммо ошкоро эътироф мекунанд, ки intrinsic ё extrinsic apoptotic pathway бо таҷрибаҳои мавҷуда муайян карда нашудааст.

Мушкилоти асосии таҳқиқот

Таҳқиқот меомӯзад, ки оё экстракти хлороформии аз сабӯси яке аз навъҳои маҳаллии биринҷи сиёҳи дар Индонезия парваришшаванда — ‘Sembada Hitam’ — гирифташуда дар ҳуҷайраҳои HepG2-и пайдоишашон hepatocellular carcinoma фаъолияти биологӣ нишон медиҳад ё не.

Сабӯси биринҷи сиёҳ дар заминаи адабиёти манбаъ бо пайвастагиҳои аз ҷиҳати биологӣ ҷолиб, аз ҷумла anthocyaninҳо, γ-oryzanol, polyphenolҳо, изоформаҳои vitamin E ва hydroxycinnamic acid алоқаманд карда мешавад. Бо вуҷуди ин, таҳқиқоти мазкур таркиби химиявии CBRB-ро мустақиман таҳлил накардааст. Аз ин рӯ, таҷрибавӣ нишон дода нашудааст, ки кадом пайвастагии мушаххас барои таъсири ҳуҷайравии мушоҳидашуда масъул аст.

Саволи асосии таҳқиқотии манбаъро ба се қисм ҷудо кардан мумкин аст:

• Оё CBRB қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳои HepG2-ро коҳиш медиҳад?
• Оё CBRB муҳоҷирати ҳуҷайраҳои HepG2-ро дар рӯи сатҳ коҳиш медиҳад?
• Оё марги ҳуҷайрае, ки бо CBRB ба вуҷуд меояд, бо apoptosis алоқаманд аст?

Ҳуҷайраҳои HepG2 Дар Ин Таҳқиқот Чиро Ифода Мекунанд?

HepG2 дар ин таҳқиқот хатти ҳуҷайравии инсон бо пайдоиши hepatoma/hepatocellular carcinoma мебошад, ки барои арзёбии потенсиали зиддисаратонии экстракти сабӯси биринҷи сиёҳ дар шароити лабораторӣ истифода шудааст; натиҷаҳои гирифташуда дар HepG2 ҷавоби модели фарҳанги ҳуҷайраро нишон медиҳанд ва бевосита маънои самаранокӣ ё бехатарии табобатро дар беморони инсон надоранд.

Давомнокии таҳқиқот ва маводи биологӣ

Таҳқиқот аз декабри 2022 то октябри 2023 анҷом дода шудааст.

Ҳуҷайраҳои HepG2 дар Laboratory of Parasitology, Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada парвариш карда шудаанд.

Биринҷи сиёҳи Sembada Hitam аз деҳқонони маҳаллии Ngaglik, Sleman, Special Region of Yogyakarta гирифта шудааст. Манбаъ маълумоти nomenclature-и навъро бо Indonesian Minister of Agriculture Decree No. 125/HK.540/C/03/2019 алоқаманд мекунад.

Экстракти хлороформ чӣ гуна омода шуд?

Дар манбаъ марҳилаҳои экстраксия чунин оварда шудаанд:

1. 10 g хокаи сабӯси биринҷи сиёҳи Sembada Hitam истифода шуд.
2. Сабӯс дар 100 mL chloroform ҳал/паҳн карда шуд.
3. Омехта бо омехтакунии даврӣ барои 48 соат ба раванди maceration гузошта шуд.
4. Экстракт бо Whatman No.1 filter paper филтр карда шуд.
5. Филтрат ба раванди overnight remaceration гузаронида шуд.
6. Сипас solvent хориҷ карда шуда, экстракти paste-like solid ба даст оварда шуд.
7. Маҳлули санҷишӣ бо ҳал кардани CBRB дар %1 DMSO омода шуд.

Maceration равандест, ки дар он маводи растанӣ муддати муайян дар solvent нигоҳ дошта шуда, компонентҳои дар solvent ҳалшаванда аз мавод экстраксия мешаванд.

Хлороформ дар ин ҷо solvent-и экстраксия мебошад. Бахши discussion-и таҳқиқот хлороформро ҳамчун nonpolar extraction solvent тавсиф карда, муҳокима мекунад, ки он нисбат ба polar solventҳо барои экстраксияи баъзе компонентҳои phytochemical метавонад камтар самаранок бошад.

Манбаъ фоизи extraction yield-ро намедиҳад. Илова бар ин, консентратсияҳои anthocyanin, cyanidin-3-glucoside, peonidin-3-glucoside ё дигар компонентҳои CBRB-и омодашуда дар ин таҳқиқот бо усулҳои таҳлилӣ чен карда нашудаанд.

Консентратсияҳои CBRB, ки барои MTT истифода шуданд

CBRB дар консентратсияҳои зерин омода карда шуд:

7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1.000; 1.500; 2.000 ва 3.000 μg/mL.

Ин доираи васеи консентратсияҳо барои омӯзиши тағйирёбии вобаста ба доза дар қобилияти зиндамонии ҳуҷайра ва қимати IC₅₀ истифода шуд.

Санҷиши MTT ва IC50 Чиро Чен Мекунанд?

Санҷиши MTT санҷиши қобилияти зиндамонии ҳуҷайра мебошад, ки аз қобилияти ҳуҷайраҳои аз ҷиҳати метаболикӣ фаъол барои табдил додани пайвастагии tetrazolium бо номи MTT ба маҳсулоти рангаи formazan истифода бурда, миқдори ҳуҷайраҳои зиндаро ғайримустақим арзёбӣ мекунад; IC₅₀ бошад консентратсияи моддаи санҷиширо ифода мекунад, ки дар шароити муайяни таҷриба барои тақрибан %50 кам кардани афзоиш ё қобилияти зиндамонии ҳуҷайра лозим аст, ва IC₅₀-и пасттар одатан ба потенсиали ситотоксикии баландтар ишора мекунад.

Тарҳи таҷрибаи MTT

Ҳуҷайраҳои HepG2 ба 96-well plate бо зичии:

\[ 1\times10^4\ \text{hücre/well} \]

кишт карда шуданд.

Муҳити фарҳанг Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) буда:

• %10 fetal bovine serum (FBS),
• %2 penicillin–streptomycin,
• %0,5 amphotericin B

дошт.

Ҳуҷайраҳо аввал дар incubator-и %5 CO₂ барои 24 соат инкубатсия шуданд.

Сипас муҳити фарҳанг бо маҳлулҳои санҷишии CBRB иваз шуд.

Чаро гурӯҳҳои назоратӣ муҳиманд?

Дар таҷрибаи MTT се навъи асосии муқоиса вуҷуд дорад:

• Cell control: Сатҳи асосии қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳои бидуни treatment-ро нишон медиҳад.
• %1 DMSO control: Барои ҷудо кардани таъсири худи DMSO, ки барои ҳал кардани экстракт истифода шудааст, кӯмак мекунад.
• Doxorubicin: Ҳамчун моддаи мусбати муқоисавӣ бо таъсири маълуми зиддисаратонӣ истифода шудааст.

Doxorubicin:

0,25; 0,5; 1; 2; 4 ва 8 μg/mL

дар консентратсияҳои зикршуда санҷида шуд.

Ҳамаи гурӯҳҳои treatment ва control дар шароити 24 ва 48 соат арзёбӣ шуданд.

Реаксияи MTT чӣ гуна анҷом дода шуд?

Дар охири инкубатсия ба ҳар well 100 μL маҳлули MTT илова шуда, чор соат инкубатсия карда шуд.

Сипас реаксия бо илова кардани:

100 μL %10 sodium dodecyl sulfate (SDS)

қатъ карда шуд ва намунаҳо overnight инкубатсия шуданд.

Натиҷаҳо бо inverted microscope мушоҳида шуда, absorbance бо ELISA microplate reader дар:

\[ 595\ \text{nm} \]

дарозии мавҷ чен карда шуд.

Формулаи қобилияти зиндамонии ҳуҷайра

Формулаи дар манбаъ истифодашуда:

\[ \%\ \text{Cell Viability} = \frac{ A_{\text{treatment}}-A_{\text{medium}} }{ A_{\text{cell control}}-A_{\text{medium}} } \times100 \]

Дар ин ҷо:

• \(A_{\text{treatment}}\): қимати absorbance-и well-и treatment,
• \(A_{\text{medium}}\): қимати absorbance-и medium/background бе ҳуҷайра,
• \(A_{\text{cell control}}\): қимати absorbance-и untreated cell-control.

Дар суръат сигнали background-и аз medium омада аз ченаки treatment тарҳ карда мешавад. Махраҷ сигнали background-corrected-и untreated cell control аст. Ҳамин тавр қобилияти зиндамонии ҳуҷайра дар treatment нисбат ба control ба фоиз нормализатсия мешавад.

Масалан, агар натиҷа ба %100 наздик бошад, сигнали метаболикии гурӯҳи treatment ба untreated control наздик аст. Қиматҳои пасттар бо қобилияти зиндамонии пасттари ҳуҷайра дар шароити treatment мувофиқанд.

Аммо MTT ҳисобкунии мустақими “чанд ҳуҷайра мурд” нест; он ченаки viability дар асоси фаъолияти метаболикӣ мебошад.

IC50 чӣ гуна муайян шуд?

Манбаъ мегӯяд, ки қиматҳои IC₅₀ бо probit analysis ҳисоб шудаанд.

Probit analysis равиши оморист, ки барои моделсозии робитаи байни доза/консентратсияи муайян ва ҷавоби биологии бинарӣ ё таносубӣ истифода мешавад. Дар ин ҷо ҳадаф баҳодиҳии консентратсияи мувофиқ ба сатҳи тақрибан %50 growth inhibition мебошад.

Хеле пасттар будани қиматҳои IC₅₀-и doxorubicin нисбат ба CBRB нишон медиҳад, ки дар шароити таҷрибавии манбаъ doxorubicin барои коҳиш додани қобилияти зиндамонии HepG2 potency-и хеле баландтар дорад.

Чаро ду таснифи гуногуни ситотоксикӣ дар манбаъ диққат талаб мекунанд?

Бахши усул ду чорчӯбаи ҷудогонаи тафсирро пешниҳод мекунад.

Дар шарҳи бар асоси ISO 10993-5 синфҳои non-cytotoxic, slight, mild, moderate ва severe cytotoxicity аз рӯи дараҷаи cell-growth inhibition тавсиф мешаванд.

Дар ҳамин бахш манбаъ бо истинод ба US National Cancer Institute қиматҳои IC₅₀-ро чунин тасниф мекунад:

• <20 μg/mL: cytotoxicity баланд,
• 21–200 μg/mL: moderate cytotoxicity,
• 201–500 μg/mL: low cytotoxicity,
• >500 μg/mL: non-cytotoxic activity

ба ҳамин тарз тасниф мекунад.

Азбаски қиматҳои IC₅₀-и CBRB 1.265 ва 1.868 μg/mL мебошанд, дар ин системаи дуюми остона онҳо ба доираи >500 μg/mL рост меоянд. Бо вуҷуди ин, бахши Results коҳиши равшани қобилияти зиндамонии ҳуҷайраро дар 1.500–3.000 μg/mL ҳамчун “moderate cytotoxicity” ифода мекунад.

Азбаски ин ду ифода ба метрикаҳои гуногун асос ёфтаанд, онҳоро ба ҷои якдигар истифода бурдан дуруст нест: яке таснифи potency дар асоси IC₅₀ аст, дигаре дараҷаи viability inhibition дар консентратсияҳои мушаххаси баланд.

Натиҷаҳои асосии ададии санҷиши MTT

Санҷиши Wound-Healing Муҳоҷирати Ҳуҷайраро Чӣ Гуна Чен Мекунад?

Wound-healing ё scratch assay усули in vitro аст, ки дар қабати ҳуҷайраҳои ба ҳам наздик рӯида фосилаи сунъӣ эҷод карда, назорат мекунад, ки ин фосила бо гузашти вақт то чӣ андоза аз ҷониби ҳуҷайраҳо баста мешавад ва ба ин восита рафтори муҳоҷирати ҳуҷайраҳоро арзёбӣ мекунад; дар ин таҳқиқот паҳнои ибтидоии scratch бо паҳнои пас аз 24 ва 48 соат муқоиса шуда, фоизи gap closure ва migration velocity ҳисоб карда шуданд.

Тарҳи таҷрибаи scratch assay

Ҳуҷайраҳои HepG2 ба 24-well plate бо зичии:

\[ 7.5\times10^3\ \text{hücre/well} \]

кишт карда шуданд.

Ҳуҷайраҳо барои 24 соат ё то расидан ба тақрибан %80 confluence инкубатсия шуданд.

Confluence нишон медиҳад, ки ҳуҷайраҳо чӣ қадар аз сатҳи фарҳангро пӯшондаанд. %80 confluence ҳолатест, ки қисми зиёди сатҳ бо ҳуҷайраҳои ба ҳам наздик пӯшида шудааст, аммо ҳанӯз пурра баста нашудааст.

Сипас дар сатҳи фарҳанг бо sterile yellow pipette tip scratch-и амудӣ эҷод карда шуд.

Тасвири ибтидоӣ ҳамчун маълумоти 0 соат дар зери inverted microscope бо 4×10 magnification сабт карда шуд.

Таҷриба ҳашт гурӯҳро дар бар гирифт:

• Control,
• %1 DMSO,
• Doxorubicin 1 μg/mL,
• Doxorubicin 2 μg/mL,
• CBRB 250 μg/mL,
• CBRB 500 μg/mL,
• CBRB 1.000 μg/mL,
• CBRB 1.500 μg/mL.

Тасвирҳо дар охири 24 ва 48 соат дубора гирифта шуданд.

Формулаи gap closure

\[ \text{Gap Closure} = \frac{i_l-i_f}{i_l}\times100\% \]

Дар ин ҷо:

• \(i_l\): андозаи ибтидоии scratch/gap дар 0 соат,
• \(i_f\): андозаи боқимондаи gap дар охири вақти дахлдори инкубатсия.

Агар фосилаи ибтидоӣ ба андозаи зиёд баста шавад, \(i_f\) хурд мешавад ва фоизи gap closure меафзояд. Агар бастани фосила аз ҷониби ҳуҷайраҳо фурӯ нишонда шавад, \(i_f\) калонтар мемонад ва gap closure паст мешавад.

Формулаи migration velocity

\[ \text{Velocity} = \frac{i_l-i_f}{\text{total time}} \]

Ин формула тағйироти паҳнои scratch-ро ба вақти гузашта тақсим мекунад.

Манбаъ воҳиди velocity-ро дар график ҳамчун μm/h нишон медиҳад.

Натиҷаи муҳоҷирати ҳуҷайра

Дар гурӯҳи CBRB бо зиёд шудани консентратсия қиматҳои gap closure ва migration velocity тамоюли коҳишро нишон доданд.

Дар доираи 250–1.000 μg/mL манбаъ муқоисаҳои ғайриаҳамиятнокро гузориш медиҳад.

1.500 μg/mL CBRB бошад дар gap closure ва migration velocity коҳиши назаррас нишон дод:

\[ p\le0.05 \]

Doxorubicin 2 μg/mL низ дар шароити 24 ва 48 соат gap closure ва migration velocity-и паст ба вуҷуд овард.

Ин натиҷа нишон медиҳад, ки CBRB дар консентратсияи баланд метавонад рафтори муҳоҷиратии вобаста ба қобилияти ҳуҷайраҳои HepG2 барои бастани минтақаи scratch-ро коҳиш диҳад.

Аммо scratch assay танҳо ченаки холиси cell migration нест; тағйироти қавӣ дар қобилияти зиндамонӣ ва proliferatsiya-и ҳуҷайра низ метавонанд ба натиҷаи gap closure таъсир расонанд. Дар ин таҳқиқот CBRB 1.500 μg/mL ҳамзамон дар доираи консентратсияест, ки таъсири ситотоксикӣ оғоз мешавад. Аз ин рӯ migration inhibition ва cytotoxicity набояд ҳамчун механизмҳои комилан мустақил қабул шаванд.

Таҳлили Апоптоз Бо Flow Cytometry Чиро Нишон Медиҳад?

Таҳлили flow cytometry бо нишонагузории Annexin V-FITC популятсияи ҳуҷайраҳоро ба минтақаҳои viable, necrotic, early-apoptotic ва late-apoptotic ҷудо карда, арзёбӣ кардааст, ки пас аз treatment бо CBRB марги ҳуҷайра бо кадом фенотип алоқаманд аст; натиҷаи равшани манбаъ дар 1.500 μg/mL CBRB мушоҳида шудани %60,35±0,01 апоптози барвақт мебошад.

Шароити таҷрибаи flow cytometry

Ҳуҷайраҳои HepG2 ба 6-well plate бо зичии:

\[ 3\times10^5\ \text{hücre/well} \]

кишт карда шуданд.

Шароити аввалини инкубатсия:

• 37°C,
• %5 CO₂,
• 24 соат.

Сипас муҳити фарҳанг бо гурӯҳҳои зерини treatment иваз шуд:

• %1 DMSO,
• Doxorubicin 2 μg/mL,
• CBRB 500 μg/mL,
• CBRB 1.000 μg/mL,
• CBRB 1.500 μg/mL.

Давомнокии treatment 48 соат аст.

Ба ҳуҷайраҳо тақрибан 30 дақиқа Annexin V-FITC татбиқ шуда, ченкуниҳо бо FACS Calibur flow cytometer анҷом дода шуданд.

Чор минтақаи flow-cytometry

Манбаъ чор quadrant-ро чунин ном мебарад:

• Quadrant 1: Necrosis cells,
• Quadrant 2: Late apoptosis cells,
• Quadrant 3: Live cells,
• Quadrant 4: Early apoptosis cells.

Апоптози барвақт

Бо зиёд шудани консентратсияи CBRB тамоюли афзоиши ҳиссаи early-apoptotic cell мушоҳида шудааст.

Дар 1.500 μg/mL CBRB:

\[ Early\ apoptosis=60.35\pm0.01\% \]

гузориш шудааст ва манбаъ ин натиҷаро аз гурӯҳҳои дигар ба таври назаррас фарқкунанда додааст:

\[ p\le0.05 \]

Некроз

Манбаъ:

Барои Doxorubicin 2 μg/mL:

\[ Necrosis=6.10\pm0.04\% \]

Барои CBRB 1.500 μg/mL:

\[ Necrosis=2.45\pm0.06\% \]

гузориш медиҳад.

Аммо ҳамон параграф ин натиҷаҳоро ҳамчун “significant differences (p>0.05)” ифода мекунад. Аз нигоҳи истилоҳоти оморӣ, “significant” бо p>0,05 мувофиқ нест. Азбаски дар манбаъ exact corrected p-value дода нашудааст, Verianla онро ба p≤0,05 тағйир намедиҳад.

Апоптози дер

Гурӯҳи Doxorubicin 2 μg/mL:

\[ Late\ apoptosis=32.5\pm0.13\% \]

бо баландтарин қимати манбаъ мебошад.

Гуфта мешавад, ки дар гурӯҳҳои CBRB бо зиёд шудани консентратсия қимати late apoptosis меафзояд; аммо бахши Results фарқияти late-apoptosis байни гурӯҳҳоро:

\[ p>0.05 \]

гузориш медиҳад.

Фарқи апоптоз байни Abstract ва Results

Abstract мегӯяд, ки CBRB дар консентратсияҳои болотар аз 1.000 μg/mL “enhanced late apoptosis” нишон медиҳад.

Дар муқобил, Results-и муфассал:

• афзоиши қавӣ ва назарраси early apoptosis дар 1.500 μg/mL,
• тамоюли афзоиши late apoptosis, вале p>0,05

гузориш медиҳад.

Аз ин рӯ, қавитарин ва мустақимтарин натиҷаи омории апоптозии таҳқиқот афзоиши early apoptosis дар 1.500 μg/mL CBRB мебошад.

Flow cytometry кадом роҳро исбот намекунад?

Гарчанде натиҷаи flow cytometry марги ҳуҷайраҳои мувофиқ ба apoptosis-ро нишон медиҳад, дар таҳқиқот:

• Bax,
• Bcl-2,
• Bcl-xL,
• caspase-3,
• caspase-7,
• caspase-9,
• p53,
• PI3K/Akt,
• Erk

чен карда нашудаанд.

Ин механизмҳои молекулавӣ дар бахши Discussion дар асоси таҳқиқоти қаблӣ шарҳ дода мешаванд. Таҳқиқоти мавҷуда муайян накардааст, ки CBRB кадоме аз intrinsic ё extrinsic apoptosis pathway-ҳоро фаъол мекунад.

Се самти таҷрибавиро чӣ гуна якҷоя бояд хонд?

Манбаъ байни се натиҷа намунаи монанди консентратсионӣ мебинад:

1. Дар консентратсияҳои баланди CBRB қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳо кам мешавад.
2. Дар атрофи 1.500 μg/mL cell migration коҳиш меёбад.
3. Дар 1.500 μg/mL early apoptosis ба таври назаррас меафзояд.

Ин натиҷаҳо аз ҷиҳати биологӣ бо ҳам мувофиқанд.

Аммо манбаъ correlation coefficient-и ҷудогона ё formal correlation analysis намедиҳад. Аз ин рӯ, истилоҳи “correlation” дар ин ҷо бояд ҳамчун тафсири муаллиф дар бораи намунаи монанд дар се assay фаҳмида шавад.

Таҳлили оморӣ

Маълумоти Cytotoxicity, migration ва apoptosis бо:

• One-way Analysis of Variance (ANOVA),
• ҳадди аҳамиятнокӣ p≤0,05,
• пас аз ANOVA-и аҳамиятнок Tukey Honestly Significant Difference (Tukey HSD),
• SPSS version 25

таҳлил шуданд.

One-way ANOVA месанҷад, ки байни миёнаҳои чанд гурӯҳи treatment дар маҷмӯъ фарқи аҳамиятнок вуҷуд дорад ё не.

Tukey HSD post-hoc multiple-comparison тестест, ки пас аз нишон додани фарқи умумӣ аз ҷониби ANOVA муайян мекунад, ки кадом ҷуфтҳои гурӯҳҳо аз ҳам фарқ мекунанд.

Дар caption-ҳои Figure 1–3:

\[ n=3 \]

гузориш шудааст ва ҳарфҳои гуногун фарқиятҳои аҳамиятноки гурӯҳиро дар сатҳи p≤0,05 нишон медиҳанд.

Манбаъ муфассал шарҳ намедиҳад, ки такрорҳои n=3 такрори мустақили биологӣ, такрори техникӣ ё сохтори дигари replication мебошанд.

Оё Ин Таҳқиқот Нишон Медиҳад, Ки Сабӯси Биринҷи Сиёҳ Саратонро Дар Инсон Табобат Мекунад?

Не. Таҳқиқот танҳо нишон медиҳад, ки CBRB дар хатти ҳуҷайравии HepG2 дар шароити лабораторӣ ва дар консентратсияҳои баланд метавонад қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳо, муҳоҷират ва ҳиссаи ҳуҷайраҳои apoptotic-ро тағйир диҳад; азбаски ҷаббиш, метаболизм, вояи муассир, заҳролудӣ, ҷавоби варам, бехатарии клиникӣ ё муваффақияти табобат дар инсон омӯхта нашудаанд, натиҷаҳоро ҳамчун далели табобати саратон ё пешгирии саратон дар инсон тафсир кардан мумкин нест.

“Chemopreventive potential” чӣ маъно дорад?

Муаллифон натиҷаҳоро дар чорчӯбаи таҳқиқи natural chemopreventive-agent муҳокима мекунанд.

Аммо cytotoxic, antimigratory ва apoptotic activity дар фарҳанги HepG2 далели ибтидоии лабораторӣ дар бораи фаъолияти биологии экстракти номзад мебошад.

Ин таҳқиқот:

• пешгирии рушди саратонро дар организми зинда чен накардааст,
• пайдоиши metastasis-ро дар модели ҳайвон ё инсон чен накардааст,
• oral bioavailability-ро наомӯхтааст,
• таҳқиқоти pharmacokinetic анҷом надодааст,
• санҷиши selectivity бо ҳуҷайраҳои муқаррарии ҷигарро гузориш накардааст,
• бехатарии инсонро арзёбӣ накардааст.

Аз ин рӯ, калимаи “potential” аҳамияти калидӣ дорад.

Ҳадди ифодаи “Safe for further development”

Дар бахши Discussion тафсире мавҷуд аст, ки марги ҳуҷайра тавассути apoptosis ба бехатар будани экстракт барои рушди минбаъда ҳамчун natural chemopreventive agent ишора мекунад.

Аммо таҷрибаи мавҷуда:

• normal hepatocyte cytotoxicity,
• organ toxicity,
• genotoxicity,
• animal toxicity,
• human adverse effects

чен намекунад.

Аз ин рӯ, аз нигоҳи Verianla маълумоти мавҷуда хулосаи “бехатар будан нишон дода шуд”-ро дастгирӣ намекунад. Бехатарӣ бояд бо таҷрибаҳои алоҳида тасдиқ шавад.

Кадом компоненти экстракт барои таъсир масъул аст?

Ин таҳқиқот инро муайян накардааст.

Discussion anthocyanins ва дигар phytochemical compounds-ро ҳамчун шарҳҳои эҳтимолӣ муҳокима мекунад; аммо:

• anthocyanin concentration,
• миқдори cyanidin-3-glucoside,
• миқдори peonidin-3-glucoside,
• профили дигар active compound-ҳои CBRB

чен карда нашудаанд.

Аз ин рӯ, муаллифон solvent fractionation, phytochemical characterization ва molecular-mechanism studies-ро пешниҳод мекунанд.

Чаро усули экстраксия маҳдудият ба вуҷуд меорад?

Дар бахши Discussion муҳокима мешавад, ки хлороформ ҳамчун nonpolar solvent метавонад баъзе компонентҳои phytochemical-ро нисбат ба polar solventҳо бо самаранокии пасттар хориҷ кунад.

Манбаъ инчунин мегӯяд, ки экстракт дар 4°C нигоҳ дошта шуда, раванди extraction дар room temperature ва дар тамоси мустақим бо ҳаво анҷом дода шудааст.

Муаллифон муҳокима мекунанд, ки anthocyaninҳо метавонанд аз рӯшноӣ, намӣ, pH, ҳарорат ва оксиген таъсир гиранд; шароити extraction ва storage эҳтимол ба phytochemical stability таъсир расонида бошад.

Аммо азбаски миқдори anthocyanin пеш ва баъд аз таҷриба мустақиман чен нашудааст, ин шарҳ натиҷаи ченшудаи degradation нест, балки тафсири бар асоси адабиёт аст.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Намуди умумии тарҳи таҷриба

Figure 1 чиро нишон медиҳад?

Манбаъ Figure 1 HepG2 cell viability-ро дар ду панел — panel A барои 24 соат ва panel B барои 48 соат — нишон медиҳад.

Дар график:

• Control,
• %1 DMSO,
• шаш doxorubicin concentration,
• ёздаҳ CBRB concentration

муқоиса мешаванд.

Меҳвари Y қимати Cell Viability (%) мебошад.

Barҳо дар шакли mean±standard deviation мебошанд.

n=3 аст.

Ҳарфҳои гуногун болои barҳо фарқиятҳои омории сатҳи p≤0,05-ро ифода мекунанд.

Паёми асосии илмии Figure 1 ин аст, ки консентратсияҳои паст ва миёнаи CBRB ба HepG2 viability таъсири маҳдуд доранд, ва коҳиши равшани зиндамонӣ махсусан дар минтақаи 1.500–3.000 μg/mL пайдо мешавад. Doxorubicin бошад дар консентратсияҳои хеле пасттар дар сатҳи μg/mL зиндамониро кам мекунад.

Figure 2 чиро нишон медиҳад?

Манбаъ Figure 2 чор панел дорад:

• A: 24 соат Gap closure (%),
• B: 24 соат Velocity (μm/h),
• C: 48 соат Gap closure (%),
• D: 48 соат Velocity (μm/h).

Дар гурӯҳҳои Control ва %1 DMSO басташавии минтақаи scratch баландтар аст.

Doxorubicin 2 μg/mL ва CBRB 1.500 μg/mL gap closure ва velocity-и паст нишон медиҳанд.

Бо зиёд шудани консентратсияи CBRB тамоюли коҳиш дар нишондиҳандаҳои cell migration дида мешавад.

Азбаски қиматҳои ададии дақиқи ҳамаи barҳои Figure 2 дар Results prose дода нашудаанд, Verianla қиматҳои тахминиро аз график ҳамчун ченаки дақиқ бозсозӣ намекунад.

Figure 3 чиро нишон медиҳад?

Figure 3 чор натиҷаи ҷудогонаи flow-cytometry-ро нишон медиҳад:

• A: viable cells,
• B: necrosis,
• C: early apoptosis,
• D: late apoptosis.

Дар тасвири Figure 3, дар гурӯҳи CBRB 1.500 μg/mL bar-и viable-cell паст ва bar-и early-apoptosis дар сатҳи баландтарин аст.

Манбаъ prose ин қимати апоптози барвақтро дақиқ чунин гузориш медиҳад:

\[ 60.35\pm0.01\% \]

ба ҳамин шакл гузориш шудааст.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

• CBRB дар ҳуҷайраҳои HepG2 дар консентратсияҳои паст нисбат ба doxorubicin cytotoxic potency-и хеле пасттар нишон дод.
• Коҳиши равшани cell-viability аз CBRB махсусан дар консентратсияҳои баланд, ба мисли 1.500–3.000 μg/mL, пайдо шуд.
• Дар 48 соат 2.000 μg/mL CBRB viability-ро то %30,39±12,23 коҳиш дод.
• Дар 48 соат 3.000 μg/mL CBRB viability то %4,9±0,67 коҳиш ёфт.
• Қимати IC50-и CBRB дар 24 соат 1.265 μg/mL ва дар 48 соат 1.868 μg/mL аст.
• Қимати IC50-и Doxorubicin дар 24 соат 0,44 μg/mL ва дар 48 соат 0,18 μg/mL аст.
• 1.500 μg/mL CBRB қиматҳои HepG2 gap closure ва migration velocity-ро ба таври назаррас коҳиш дод.
• Дар 1.500 μg/mL CBRB early apoptosis то %60,35±0,01 ба таври равшан зиёд шуд.
• Cell death pattern дар treatment бо CBRB бо apoptosis мувофиқ аст.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот мустақиман дастгирӣ намекунад

• Нишон дода нашудааст, ки CBRB саратони ҷигарро дар инсон табобат мекунад.
• Нишон дода нашудааст, ки CBRB саратонро дар инсон пешгирӣ мекунад.
• Вояи бехатари инсон муайян нашудааст.
• Selectivity нисбат ба ҳуҷайраҳои муқаррарии ҷигар мустақиман санҷида нашудааст.
• Модели ҳайвонот истифода нашудааст.
• Clinical pharmacokinetics ё bioavailability омӯхта нашудааст.
• Муайян нашудааст, ки кадом chemical compound-и CBRB барои таъсир масъул аст.
• Anthocyanin concentration дар ин таҳқиқот чен нашудааст.
• Intrinsic ё extrinsic apoptosis pathway тасдиқ нашудааст.
• Microtubule disruption мустақиман чен нашудааст.
• RAS/RAF/MAPK, PI3K/Akt, Erk ё caspase pathways бо таҷрибаи мавҷуда тасдиқ нашудаанд.
• Барои ифодаи “Correlation” correlation coefficient-и алоҳида нашр нашудааст.

Нуқтаҳои гузоришдиҳии манбаъ, ки диққат талаб мекунанд

Ҷиҳатҳои асосии қавии таҳқиқот

Таҳқиқот танҳо ба як assay маҳдуд нашуда, се сатҳи биологиро — қобилияти зиндамонии ҳуҷайра, cell migration ва cell-death phenotype — якҷоя арзёбӣ кардааст.

Гурӯҳҳои Doxorubicin ва solvent-control истифода шудаанд.

Нуқтаҳои вақти 24 ва 48 соат дар таҷрибаҳои cytotoxicity ва migration якҷоя омӯхта шудаанд.

Барои viability IC₅₀, барои migration gap closure/velocity ва барои apoptosis тақсимоти flow-cytometric cell-state истифода шудааст.

Маҳдудиятҳои асосӣ

Танҳо як хатти ҳуҷайра: Натиҷаҳо танҳо дар хатти ҳуҷайравии HepG2 гирифта шудаанд.

Муқоисаи ҳуҷайраи муқаррарӣ нест: Дар бораи Cancer-cell selectivity хулосаи мустақим баровардан мумкин нест.

Консентратсияҳои баланди CBRB: Activity-и равшан асосан дар 1.500 μg/mL ва консентратсияҳои баландтар пайдо шудааст.

Phytochemical characterization нест: Компонентҳои фаъоли экстракт ба таври миқдорӣ муайян нашудаанд.

Nonpolar extraction: Муаллифон қайд мекунанд, ки экстраксияи хлороформ метавонад барои баъзе phytochemicals маҳдудкунанда бошад.

Molecular pathway analysis нест: Муайян нашудааст, ки кадом роҳи мушаххаси молекулавӣ барои apoptosis ва migration масъул аст.

Ҳадди In vitro: Absorption, metabolism, systemic toxicity ва in vivo tumor response арзёбӣ нашудаанд.

Тафсилоти Replication: Figure-ҳо n=3-ро нишон медиҳанд, аммо сохтори техникию биологии такрорҳо пурра шарҳ дода нашудааст.

Extract yield гузориш нашудааст: Миқдор/фоизи ниҳоии экстракт аз 10 g сабӯс дода нашудааст.

Тафсилоти Cell-line reproducibility: Манбаъ маълумоти HepG2 culture location-ро медиҳад; cell-line catalog number, authentication ё mycoplasma-testing гузориш нашудааст.

Забони омории дохили манбаъ: Дар бахши Necrosis “significant” ва p>0,05 дар як ҷумла истифода шудаанд.

Самти таҳқиқоти оянда

Таҳқиқоти минбаъдае, ки муаллифон мустақиман пешниҳод мекунанд:

• solvent fractionation,
• active compound isolation,
• phytochemical characterization,
• molecular mechanism analysis

мебошанд.

Ҳадаф муайян кардани компонентҳое мебошад, ки барои biological activity-и мушоҳидашуда дар CBRB масъуланд, ва арзёбии chemopreventive potential-и сабӯси биринҷи сиёҳи Sembada Hitam дар шароити назоратшавандаи бештар.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Таҳқиқоти аслӣ: Anticancer Potential of Chloroform Extract from Black Rice (Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’) Bran Against HepG2 Liver Cancer Cells.

Муаллифон: Bima Mahendra, Nabila Ramiza Puteri, Yekti Asih Purwestri, Sekar Rahayu, Ardaning Nuriliani.

Тартиби муаллифон: Тартиби манбаъ PDF ва metadata-и расмии ҷории маҷалла нигоҳ дошта шудааст.

Саҳми баробар: Дар манбаъ equal-contribution statement вуҷуд надорад.

Муаллифи масъул: Ardaning Nuriliani.

Муассиса 1: Department of Tropical Biology, Faculty of Biology, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Муассиса 2: Department of Biomedical Science, Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Муассиса 3: Master Program, Faculty of Biology, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Маҷалла: HAYATI Journal of Biosciences.

Сохтори нашр: Department of Biology, Bogor Agricultural University/IPB University ва Indonesian Society for Biology.

Ҷилд / шумора: Vol. 33 No. 6.

Санаи шумора: November 2026.

Саҳифаҳо: 1403–1413.

DOI: 10.4308/hjb.33.6.1403-1413.

ISSN: 1978-3019.

EISSN: 2086-4094.

Навъи манбаъ: Short Communication.

Баррасии ҳамтоён: HAYATI Journal of Biosciences double-blind peer review-ро истифода мебарад. Сиёсати маҷалла мегӯяд, ки навъи Short Communication ҳамон сатҳи амиқи review-ро ҳамчун Research Article мегирад.

Received: September 19, 2025.

Received in revised form: July 17, 2026.

Accepted: September 8, 2026.

PDF Available Online: October 1, 2026.

Санаи Published дар metadata-и расмии web: November 1, 2026.

Ёддошти сана: Санаи Available Online дар PDF ва санаи issue/publication metadata-и маҷалла марҳилаҳои гуногуни нашрро нишон медиҳанд.

Иҷозатнома: Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC 4.0).

Preprint: Дар PDF-и манбаъ ва сабти расмии тасдиқшуда preprint-и алоҳида нишон дода нашудааст.

Давомнокии таҳқиқот: December 2022 – October 2023.

Навъи таҳқиқот: Experimental in vitro cell-culture study.

Хатти ҳуҷайра: HepG2.

Маводи растанӣ: Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’ black rice bran.

Манбаи мавод: Local farmers, Ngaglik, Sleman, Special Region of Yogyakarta, Indonesia.

Экстраксия: 10 g bran powder + 100 mL chloroform; 48 соат maceration; Whatman No.1 filtration; overnight remaceration; evaporation to paste-like solid.

Solvent-и санҷишӣ: %1 DMSO.

Консентратсияҳои MTT CBRB: 7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1.000; 1.500; 2.000; 3.000 μg/mL.

Консентратсияҳои Doxorubicin MTT: 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 μg/mL.

MTT cell seeding: 1×10⁴ cells/well, 96-well plate.

MTT culture medium: DMEM + %10 FBS + %2 penicillin–streptomycin + %0,5 amphotericin B.

MTT reaction: 100 μL MTT, 4 соат; 100 μL %10 SDS, overnight.

Absorbance: 595 nm, ELISA microplate reader.

Усули IC50: Probit analysis.

CBRB IC50: 1.265 μg/mL at 24 h; 1.868 μg/mL at 48 h.

Doxorubicin IC50: 0,44 μg/mL at 24 h; 0,18 μg/mL at 48 h.

48 h CBRB viability: 2.000 μg/mL → %30,39±12,23; 3.000 μg/mL → %4,9±0,67.

Wound-healing cell seeding: 7,5×10³ cells/well, 24-well plate.

Wound-healing CBRB: 250, 500, 1.000, 1.500 μg/mL.

Wound-healing doxorubicin: 1 ва 2 μg/mL.

Ченкуниҳои Migration: Gap closure (%) ва velocity (μm/h).

Натиҷаи Migration: дар 1.500 μg/mL CBRB коҳиши аҳамиятнок; p≤0,05.

Flow-cytometry cell seeding: 3×10⁵ cells/well, 6-well plate.

Flow-cytometry treatment: %1 DMSO, doxorubicin 2 μg/mL ва CBRB 500, 1.000, 1.500 μg/mL.

Давомнокии Flow-cytometry treatment: 48 соат.

Reagent: Annexin V-FITC; тақрибан 30 дақиқа.

Дастгоҳ: FACS Calibur flow cytometer.

CBRB 1.500 μg/mL early apoptosis: %60,35±0,01.

CBRB 1.500 μg/mL necrosis: %2,45±0,06.

Doxorubicin 2 μg/mL necrosis: %6,10±0,04.

Doxorubicin 2 μg/mL late apoptosis: %32,5±0,13.

Омор: One-way ANOVA, p≤0,05; пас аз significant result Tukey HSD; SPSS version 25.

Replication: Caption-ҳои Figure 1–3 n=3-ро нишон медиҳанд; сохтори такрори техникӣ ё биологӣ муфассал шарҳ дода нашудааст.

Funding: Doctoral Competency Grant (Hibah Kompetensi Doktor) 2023, Universitas Gadjah Mada; Assignment Letter No. 7743/UN1.P.II/Dit-Lit/PT.01.03/2023.

Ethical approval: Ethics Committee of the Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada; Ref. No. KE/FK/1299/EC/2022.

Data Availability: Дар PDF-и манбаъ data-availability statement-и алоҳида вуҷуд надорад.

Conflict of Interest: Дар PDF-и манбаъ conflict-of-interest statement-и алоҳида вуҷуд надорад.

CRediT / Author Contributions: Дар PDF-и манбаъ бахши алоҳидаи author-contribution/CRediT вуҷуд надорад.

Phytochemical quantification: Дар таҳқиқот миқдори anthocyanin ё дигар active compound-ҳои CBRB мустақиман чен нашудаанд.

Molecular pathway analysis: Анҷом дода нашудааст; intrinsic/extrinsic apoptosis pathway муайян нашудааст.

Normal-cell selectivity: Дар манбаъ normal hepatocyte comparison гузориш нашудааст.

In vivo / clinical validation: Нест.

Ҳадди асосии тафсир: Натиҷаҳо танҳо барои шароити истифодашудаи HepG2 in vitro эътибор доранд; онҳо натиҷае дар бораи табобати саратон, пешгирии саратон ё истеъмол/вояи бехатар дар инсон ба вуҷуд намеоранд.

Ёддошти гузоришдиҳии дохили манбаъ 1: Abstract афзоиши late-apoptosis-ро таъкид мекунад, дар ҳоле ки Results қавитарин натиҷаи аҳамиятнокро барои early apoptosis медиҳад; барои late apoptosis p>0,05 гузориш шудааст.

Ёддошти гузоришдиҳии дохили манбаъ 2: Дар ҷумлаи Necrosis Results ифодаи “significant differences (p>0.05)” вуҷуд дорад.

Ёддошти гузоришдиҳии дохили манбаъ 3: CBRB аз рӯи viability inhibition дар консентратсияҳои баланд ҳамчун “moderate cytotoxicity” тавсиф мешавад, дар ҳоле ки дар таснифи IC50-и овардаи манбаъ >500 μg/mL ба категорияи алоҳидаи potency мувофиқ аст.

Ёддошти гузоришдиҳии дохили манбаъ 4: Discussion дар як ҷой HeLa-ро “breast cancer cells” меномад, дар ҳоле ки Introduction HeLa-ро human cervical cancer cell line тавсиф мекунад.