Sembada Hitam qora guruch kepagining xloroform ekstrakti (chloroform extract of black rice bran; CBRB), ushbu tadqiqotda Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’ navining kepagini xloroform bilan ekstraksiya qilish orqali tayyorlangan va HepG2 jigar saratoni hujayralarida in vitro sharoitda sinovdan oʻtkazilgan oʻsimlik ekstraktidir. Tadqiqotchilar CBRB taʼsirini uchta tajriba yoʻnalishida oʻrgangan: MTT testi orqali hujayra yashovchanligi/sitotoksiklik, wound-healing testi orqali hujayra migratsiyasi va Annexin V-FITC flow cytometry orqali hujayra oʻlimi shakli. CBRBning sezilarli taʼsirlari umuman yuqori konsentratsiyalarda namoyon boʻlgan. CBRB uchun IC₅₀ 24 soatda 1.265 μg/mL va 48 soatda 1.868 μg/mL boʻlgan, doxorubicin uchun esa mos ravishda 0,44 va 0,18 μg/mL. CBRB 1.500 μg/mL da HepG2 migratsiyasini sezilarli kamaytirgan va flow cytometry tahlilida %60,35±0,01 erta apoptoz koʻrsatgan. Shunga qaramay, tadqiqot faqat HepG2 hujayra kulturasida oʻtkazilgan; u odamlarda saratonni oldini olishi yoki davolashini, klinik xavfsizligini yoki muayyan molekulyar yoʻlni isbotlamaydi.

48 soatlik MTT testida CBRB 2.000 μg/mL da HepG2 yashovchanligini %30,39±12,23 gacha, 3.000 μg/mL da esa %4,9±0,67 gacha tushirgan. Bunga qarshi ravishda doxorubicin ancha past konsentratsiyalarda kuchli sitotoksik taʼsir koʻrsatgan. Shu sababli manba CBRB doxorubicin bilan solishtirganda pastroq sitotoksik salohiyatga ega ekanini taʼkidlaydi.

Hujayra migratsiyasi tajribasida 250, 500, 1.000 va 1.500 μg/mL CBRB sinovdan oʻtkazilgan. Gap closure va migration velocity qiymatlari konsentratsiya oshgani sari kamayish tendensiyasini koʻrsatgan; aniq statistik migratsiya susayishi 1.500 μg/mL CBRB da kuzatilgan. Doxorubicin 2 μg/mL ham kuchli migration inhibition koʻrsatgan.

Flow cytometry tajribasida CBRBning 500, 1.000 va 1.500 μg/mL konsentratsiyalari 48 soat davomida sinovdan oʻtkazilgan. CBRB 1.500 μg/mL da erta apoptoz %60,35±0,01 ga yetgan; shu guruhda nekroz %2,45±0,06 deb qayd etilgan. Tadqiqotchilar hujayra oʻlimi asosan apoptosis bilan mos ekanini bildirgan boʻlsalar-da, intrinsic yoki extrinsic apoptotic pathway mavjud tajribalar bilan aniqlanmaganini ochiq tan oladilar.

Tadqiqotning asosiy muammosi

Tadqiqot Indoneziyada yetishtiriladigan mahalliy qora guruch navlaridan biri bo‘lgan ‘Sembada Hitam’ kepagidan olingan xloroform ekstrakti gepatosellyulyar karsinoma kelib chiqishli HepG2 hujayralarida biologik faollik koʻrsatadimi, degan savolni oʻrganadi.

Qora guruch kepagi manba adabiyoti kontekstida anthocyaninlar, γ-oryzanol, polyphenollar, vitamin E izoformlari va hydroxycinnamic acid kabi biologik jihatdan qiziqarli komponentlar bilan bogʻlanadi. Biroq ushbu tadqiqot CBRBning kimyoviy tarkibini bevosita tahlil qilmagan. Shu sababli kuzatilgan hujayraviy taʼsir uchun qaysi aniq birikma masʼul ekani tajribada koʻrsatilmagan.

Manbaning asosiy tadqiqot savoli uch qismga boʻlinadi:

• CBRB HepG2 hujayra yashovchanligini kamaytiradimi?
• CBRB HepG2 hujayralarining sirt boʻylab migratsiyasini kamaytiradimi?
• CBRB taʼsirida yuzaga kelgan hujayra oʻlimi apoptosis bilan bogʻliqmi?

HepG2 Hujayralari Ushbu Tadqiqotda Nimani Ifodalaydi?

HepG2 ushbu tadqiqotda qora guruch kepagi ekstraktining antikanser salohiyatini laboratoriya sharoitida baholash uchun ishlatilgan hepatoma/gepatosellyulyar karsinoma kelib chiqishli inson hujayra liniyasidir; HepG2da olingan natijalar hujayra kulturasi modelining javobini koʻrsatadi va bevosita inson bemorlarida davolash samaradorligi yoki xavfsizlikni anglatmaydi.

Tadqiqot muddati va biologik material

Tadqiqot 2022-yil dekabrdan 2023-yil oktyabrgacha oʻtkazilgan.

HepG2 hujayralari Laboratory of Parasitology, Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada tarkibida kultivatsiya qilingan.

Sembada Hitam qora guruchi Ngaglik, Sleman, Special Region of Yogyakarta hududidagi mahalliy fermerlardan olingan. Manba navning nomenclature maʼlumotini Indonesian Minister of Agriculture Decree No. 125/HK.540/C/03/2019 bilan bogʻlaydi.

Xloroform ekstrakti qanday tayyorlandi?

Manbada ekstraksiya bosqichlari quyidagicha berilgan:

1. 10 g Sembada Hitam qora guruch kepagi kukuni ishlatildi.
2. Kepak 100 mL chloroform ichida eritildi/tarqatildi.
3. Aralashma davriy aralashtirish bilan 48 soat maceration jarayoniga qoldirildi.
4. Ekstrakt Whatman No.1 filter paper bilan filtrlandi.
5. Filtrat overnight remaceration jarayoniga olindi.
6. Keyin solvent chiqarib yuborilib, paste-like solid ekstrakt olindi.
7. Sinov eritmasi CBRBni %1 DMSO ichida eritish orqali tayyorlandi.

Maceration — oʻsimlik materialini maʼlum muddat solvent ichida saqlab, solventda eriydigan komponentlarni materialdan ekstraksiya qilish jarayoni.

Xloroform bu yerda ekstraksiya solventidir. Tadqiqotning discussion boʻlimi xloroformni nonpolar extraction solvent deb taʼriflaydi va polar solventlarga qaraganda ayrim phytochemical komponentlarni ekstraksiya qilishda kamroq samarali boʻlishi mumkinligini muhokama qiladi.

Manba extraction yield foizini bermaydi. Shuningdek, tayyorlangan CBRBning anthocyanin, cyanidin-3-glucoside, peonidin-3-glucoside yoki boshqa komponent konsentratsiyalari ushbu tadqiqotda analitik usullar bilan oʻlchanmagan.

MTT uchun ishlatilgan CBRB konsentratsiyalari

CBRB quyidagi konsentratsiyalarda tayyorlangan:

7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1.000; 1.500; 2.000 va 3.000 μg/mL.

Ushbu keng konsentratsiya oraligʻi hujayra yashovchanligining dozaga bogʻliq oʻzgarishini va IC₅₀ qiymatini oʻrganish uchun ishlatilgan.

MTT Testi va IC50 Nimani Oʻlchaydi?

MTT testi metabolik faol hujayralarning MTT deb ataladigan tetrazolium birikmasini rangli formazan mahsulotlariga aylantirish qobiliyatidan foydalanib tirik hujayralar miqdorini bilvosita baholovchi hujayra yashovchanligi testidir; IC₅₀ esa belgilangan tajriba sharoitida hujayra oʻsishi yoki yashovchanligini taxminan %50 kamaytirish uchun zarur bo‘lgan sinov moddasi konsentratsiyasini bildiradi va pastroq IC₅₀ odatda yuqoriroq sitotoksik salohiyatni anglatadi.

MTT tajriba qurilishi

HepG2 hujayralari 96-well plate ga:

\[ 1\times10^4\ \text{hücre/well} \]

zichlikda ekilgan.

Kultura muhiti Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) boʻlib:

• %10 fetal bovine serum (FBS),
• %2 penicillin–streptomycin,
• %0,5 amphotericin B

ni oʻz ichiga olgan.

Hujayralar avval %5 CO₂ incubator ichida 24 soat inkubatsiya qilingan.

Keyin kultura muhiti CBRB sinov eritmalari bilan almashtirilgan.

Nazorat guruhlari nega muhim?

MTT tajribasida uchta asosiy taqqoslash turi mavjud:

• Cell control: Davolanmagan hujayralarning bazaviy yashovchanlik darajasini koʻrsatadi.
• %1 DMSO control: Ekstraktni eritish uchun ishlatilgan DMSOning oʻz taʼsirini ajratishga yordam beradi.
• Doxorubicin: Antikanser taʼsiri maʼlum ijobiy taqqoslash moddasi sifatida ishlatilgan.

Doxorubicin:

0,25; 0,5; 1; 2; 4 va 8 μg/mL

konsentratsiyalarida sinovdan oʻtkazilgan.

Barcha treatment va control guruhlari 24 va 48 soatlik sharoitlarda baholangan.

MTT reaksiyasi qanday amalga oshirildi?

Inkubatsiya oxirida har bir well ga 100 μL MTT eritmasi qoʻshilib, toʻrt soat inkubatsiya qilingan.

Keyin reaksiya:

100 μL %10 sodium dodecyl sulfate (SDS)

qoʻshish bilan toʻxtatilgan va namunalar overnight inkubatsiya qilingan.

Natijalar inverted microscope bilan kuzatilgan, absorbance oʻlchovi ELISA microplate reader bilan:

\[ 595\ \text{nm} \]

toʻlqin uzunligida amalga oshirilgan.

Hujayra yashovchanligi formulasi

Manbada ishlatilgan formula:

\[ \%\ \text{Cell Viability} = \frac{ A_{\text{treatment}}-A_{\text{medium}} }{ A_{\text{cell control}}-A_{\text{medium}} } \times100 \]

Bu yerda:

• \(A_{\text{treatment}}\): treatment qudugʻining absorbance qiymati,
• \(A_{\text{medium}}\): hujayrasiz medium/background absorbance qiymati,
• \(A_{\text{cell control}}\): untreated cell-control absorbance qiymatidir.

Suratda mediumdan keladigan background signali treatment oʻlchovidan ayiriladi. Maxraj esa untreated cell controlning background-corrected signalidir. Shunday qilib treatment hujayra yashovchanligi controlga nisbatan foizda normallashtiriladi.

Masalan, natija %100 ga yaqin boʻlsa, treatment guruhining metabolik signali untreated controlga yaqin. Pastroq qiymatlar treatment sharoitida pastroq hujayra yashovchanligiga mos keladi.

Biroq MTT bevosita “qancha hujayra oʻldi” degan hisob emas; u metabolik faollikka asoslangan viability oʻlchovidir.

IC50 qanday aniqlandi?

Manba IC₅₀ qiymatlari probit analysis bilan hisoblanganini bildiradi.

Probit analysis maʼlum doza/konsentratsiya bilan ikkilik yoki nisbat shaklidagi biologik javob oʻrtasidagi munosabatni modellashtirish uchun ishlatiladigan statistik yondashuvdir. Bu yerda maqsad taxminan %50 growth inhibition darajasiga mos konsentratsiyani baholashdir.

Doxorubicinning IC₅₀ qiymatlari CBRBnikidan ancha past boʻlishi manba tajriba sharoitida doxorubicin HepG2 yashovchanligini kamaytirishda ancha yuqori potency koʻrsatganini bildiradi.

Manbadagi ikki xil sitotoksiklik tasnifi nega ehtiyotkorlik talab qiladi?

Usul boʻlimi ikki alohida talqin doirasini beradi.

ISO 10993-5 asosidagi izohda cell-growth inhibition darajasiga koʻra non-cytotoxic, slight, mild, moderate va severe cytotoxicity sinflari taʼriflanadi.

Xuddi shu boʻlimda manba US National Cancer Institute ga tayangan holda IC₅₀ qiymatlarini:

• <20 μg/mL: yuqori cytotoxicity,
• 21–200 μg/mL: moderate cytotoxicity,
• 201–500 μg/mL: low cytotoxicity,
• >500 μg/mL: non-cytotoxic activity

deb tasniflaydi.

CBRBning IC₅₀ qiymatlari 1.265 va 1.868 μg/mL boʻlgani sababli ushbu ikkinchi chegara tizimida >500 μg/mL oraligʻiga tushadi. Shunga qaramay, Results boʻlimi 1.500–3.000 μg/mL dagi yaqqol hujayra yashovchanligi pasayishini “moderate cytotoxicity” deb ifodalaydi.

Bu ikki ifoda turli metrikalarga asoslanganligi uchun bir-birining oʻrnida ishlatilmasligi kerak: biri IC₅₀ potency tasnifi, ikkinchisi esa muayyan yuqori konsentratsiyalarda kuzatilgan viability inhibition darajasidir.

MTT testining asosiy sonli natijalari

Wound-Healing Testi Hujayra Migratsiyasini Qanday Oʻlchaydi?

Wound-healing yoki scratch assay bir-biriga yaqin oʻsgan hujayra qatlamida sunʼiy boʻshliq hosil qilib, bu boʻshliq vaqt oʻtishi bilan hujayralar tomonidan qay darajada yopilishini kuzatish orqali hujayraviy migratsiya xatti-harakatini baholovchi in vitro usuldir; ushbu tadqiqotda boshlangʻich scratch kengligi bilan 24 va 48 soatdan keyingi kenglik taqqoslanib, gap closure foizi va migration velocity hisoblangan.

Scratch assay tajriba qurilishi

HepG2 hujayralari 24-well plate ga:

\[ 7.5\times10^3\ \text{hücre/well} \]

zichlikda ekilgan.

Hujayralar 24 soat yoki taxminan %80 confluence hosil boʻlguncha inkubatsiya qilingan.

Confluence hujayralar kultura yuzasining qancha qismini qoplaganini bildiradi. %80 confluence yuzaning katta qismi bir-biriga yaqin hujayralar bilan qoplangan, biroq toʻliq yopilmagan holatni anglatadi.

Keyin kultura yuzasida sterile yellow pipette tip yordamida tik scratch hosil qilingan.

Boshlangʻich tasvir 0 soat maʼlumoti sifatida inverted microscope ostida 4×10 magnification bilan qayd etilgan.

Tajriba sakkiz guruhni oʻz ichiga olgan:

• Control,
• %1 DMSO,
• Doxorubicin 1 μg/mL,
• Doxorubicin 2 μg/mL,
• CBRB 250 μg/mL,
• CBRB 500 μg/mL,
• CBRB 1.000 μg/mL,
• CBRB 1.500 μg/mL.

Tasvirlar 24 va 48 soat oxirida qayta olingan.

Gap closure formulasi

\[ \text{Gap Closure} = \frac{i_l-i_f}{i_l}\times100\% \]

Bu yerda:

• \(i_l\): 0 soatdagi boshlangʻich scratch/gap oʻlchami,
• \(i_f\): tegishli inkubatsiya muddati oxirida qolgan gap oʻlchamidir.

Boshlangʻich boʻshliq katta darajada yopilsa, \(i_f\) kichrayadi va gap closure foizi oshadi. Hujayralarning boʻshliqni yopishi susaysa, \(i_f\) kattaroq qoladi va gap closure past boʻladi.

Migration velocity formulasi

\[ \text{Velocity} = \frac{i_l-i_f}{\text{total time}} \]

Bu formula scratch kengligidagi oʻzgarishni oʻtgan vaqtga boʻladi.

Manba velocity grafikida birlikni μm/h sifatida koʻrsatadi.

Hujayra migratsiyasi natijasi

CBRB guruhida konsentratsiya oshgani sari gap closure va migration velocity qiymatlari kamayish tendensiyasini koʻrsatgan.

250–1.000 μg/mL oraligʻida manba ahamiyatli boʻlmagan taqqoslashlarni bildiradi.

1.500 μg/mL CBRB esa gap closure va migration velocity da sezilarli kamayish koʻrsatgan:

\[ p\le0.05 \]

Doxorubicin 2 μg/mL ham 24 va 48 soat sharoitida past gap closure va migration velocity hosil qilgan.

Bu natija CBRB yuqori konsentratsiyada HepG2 hujayralarining scratch maydonini yopish qobiliyati bilan bogʻliq migratsiya xatti-harakatini kamaytirishi mumkinligini koʻrsatadi.

Biroq scratch assay faqat sof cell migration oʻlchovi emas; hujayra yashovchanligi va proliferatsiyasidagi kuchli oʻzgarishlar ham gap closure natijasiga taʼsir qilishi mumkin. Ushbu tadqiqotda CBRB 1.500 μg/mL ayni paytda sitotoksik taʼsir boshlana boshlagan konsentratsiya oraligʻidadir. Shu sababli migration inhibition va cytotoxicity butunlay mustaqil mexanizmlar deb qabul qilinmasligi kerak.

Flow Cytometry Bilan Apoptoz Tahlili Nimani Koʻrsatadi?

Flow cytometry tahlili Annexin V-FITC belgilashi bilan hujayra populyatsiyasini viable, necrotic, early-apoptotic va late-apoptotic hududlarga ajratib, CBRB qoʻllangandan keyin hujayra oʻlimi qaysi fenotip bilan bogʻliqligini baholagan; manbaning eng yaqqol natijasi 1.500 μg/mL CBRB da %60,35±0,01 erta apoptoz kuzatilganidir.

Flow cytometry tajriba sharoitlari

HepG2 hujayralari 6-well plate ga:

\[ 3\times10^5\ \text{hücre/well} \]

zichlikda ekilgan.

Dastlabki inkubatsiya sharoitlari:

• 37°C,
• %5 CO₂,
• 24 soat.

Keyin kultura muhiti quyidagi treatment guruhlari bilan almashtirilgan:

• %1 DMSO,
• Doxorubicin 2 μg/mL,
• CBRB 500 μg/mL,
• CBRB 1.000 μg/mL,
• CBRB 1.500 μg/mL.

Treatment muddati 48 soat.

Hujayralarga taxminan 30 daqiqa Annexin V-FITC qoʻllanib, oʻlchovlar FACS Calibur flow cytometer bilan bajarilgan.

Toʻrtta flow-cytometry hududi

Manba toʻrtta quadrantni quyidagicha ataydi:

• Quadrant 1: Necrosis cells,
• Quadrant 2: Late apoptosis cells,
• Quadrant 3: Live cells,
• Quadrant 4: Early apoptosis cells.

Erta apoptoz

CBRB konsentratsiyasi oshgani sari early-apoptotic cell ulushining ortish tendensiyasi kuzatilgan.

1.500 μg/mL CBRB da:

\[ Early\ apoptosis=60.35\pm0.01\% \]

qayd etilgan va manba bu natijani boshqa guruhlardan sezilarli darajada farqli deb bergan:

\[ p\le0.05 \]

Nekroz

Manba:

Doxorubicin 2 μg/mL uchun:

\[ Necrosis=6.10\pm0.04\% \]

CBRB 1.500 μg/mL uchun:

\[ Necrosis=2.45\pm0.06\% \]

deb qayd etadi.

Biroq ayni paragraf bu natijalarni “significant differences (p>0.05)” deb ifodalaydi. Statistik terminologiya nuqtai nazaridan “significant” va p>0,05 bir-biriga mos kelmaydi. Manbada exact corrected p-value berilmaganligi sababli Verianla buni p≤0,05 ga oʻzgartirmaydi.

Kech apoptoz

Doxorubicin 2 μg/mL guruhi:

\[ Late\ apoptosis=32.5\pm0.13\% \]

bilan manbadagi eng yuqori qiymatni koʻrsatgan.

CBRB guruhlarida konsentratsiya oshgani sari late apoptosis qiymati oshgani bildiriladi; biroq Results boʻlimi guruhlar oʻrtasidagi late-apoptosis farqlari:

\[ p>0.05 \]

ekanini bildiradi.

Abstract va Results orasidagi apoptoz farqi

Abstract CBRB 1.000 μg/mL dan yuqori konsentratsiyalarda “enhanced late apoptosis” koʻrsatganini aytadi.

Bunga qarshi batafsil Results:

• 1.500 μg/mL da early apoptosis uchun kuchli va sezilarli oshish,
• late apoptosis uchun oshuvchi tendensiya, biroq p>0,05

ni bildiradi.

Shu sababli tadqiqotning eng kuchli va bevosita statistik apoptoz natijasi 1.500 μg/mL CBRB dagi early apoptosis oshishidir.

Flow cytometry qaysi yoʻlni isbotlamaydi?

Flow cytometry natijasi apoptosis bilan mos hujayra oʻlimini koʻrsatsa ham, tadqiqotda:

• Bax,
• Bcl-2,
• Bcl-xL,
• caspase-3,
• caspase-7,
• caspase-9,
• p53,
• PI3K/Akt,
• Erk

oʻlchanmagan.

Ushbu molekulyar mexanizmlar Discussion boʻlimida avvalgi tadqiqotlar orqali tushuntiriladi. Hozirgi tadqiqot CBRB intrinsic yoki extrinsic apoptosis pathway lardan qaysi birini faollashtirishini aniqlamagan.

Uch tajriba yoʻnalishini birgalikda qanday oʻqish kerak?

Manba uchta topilma orasida oʻxshash konsentratsiya naqshini koʻradi:

1. Yuqori CBRB konsentratsiyalarida hujayra yashovchanligi kamayadi.
2. 1.500 μg/mL atrofida cell migration kamayadi.
3. 1.500 μg/mL da early apoptosis sezilarli oshadi.

Ushbu natijalar biologik jihatdan bir-biriga mos.

Biroq manba alohida correlation coefficient yoki formal correlation analysis bermagan. Shuning uchun “correlation” bu yerda uch assaydagi oʻxshash naqshni ifodalovchi muallif talqini sifatida qaralishi kerak.

Statistik tahlil

Cytotoxicity, migration va apoptosis maʼlumotlari:

• One-way Analysis of Variance (ANOVA),
• ahamiyatlilik chegarasi p≤0,05,
• ahamiyatli ANOVAdan keyin Tukey Honestly Significant Difference (Tukey HSD),
• SPSS version 25

bilan tahlil qilingan.

One-way ANOVA bir nechta treatment guruhining oʻrtacha qiymatlari orasida umumiy sezilarli farq bor-yoʻqligini sinaydi.

Tukey HSD ANOVA umumiy farqni koʻrsatgandan keyin qaysi guruh juftlari bir-biridan farqlanishini baholovchi post-hoc multiple-comparison testidir.

Figure 1–3 captionlarida:

\[ n=3 \]

qayd etilgan va turli harflar p≤0,05 darajasidagi ahamiyatli guruh farqlarini koʻrsatadi.

Manba n=3 takrorlar biologik mustaqil takror, texnik takror yoki boshqa replication tuzilmasi ekanini batafsil tushuntirmaydi.

Ushbu Tadqiqot Qora Guruch Kepagi Odamlarda Saratonni Davolashini Koʻrsatadimi?

Yoʻq. Tadqiqot faqat laboratoriya sharoitidagi HepG2 hujayra liniyasida CBRB yuqori konsentratsiyalarda hujayra yashovchanligi, migratsiyasi va apoptotik hujayra ulushlarini oʻzgartira olishini koʻrsatadi; odamlarda soʻrilish, metabolizm, samarali doza, toksiklik, oʻsma javobi, klinik xavfsizlik yoki davolash muvaffaqiyati oʻrganilmaganligi sababli natijalar odamda saraton davosi yoki saratonning oldini olish dalili sifatida talqin qilinmaydi.

“Chemopreventive potential” nimani anglatadi?

Mualliflar natijalarni tabiiy chemopreventive-agent tadqiqoti doirasida muhokama qiladilar.

Biroq HepG2 kulturasidagi cytotoxic, antimigratory va apoptotic activity nomzod ekstraktning biologik faolligiga oid dastlabki laboratoriya dalilidir.

Ushbu tadqiqot:

• saraton rivojlanishining oldini olishni tirik organizmda oʻlchamagan,
• metastasis paydo boʻlishini hayvon yoki inson modelida oʻlchamagan,
• oral bioavailability ni oʻrganmagan,
• pharmacokinetic tadqiqot oʻtkazmagan,
• normal jigar hujayralari bilan selectivity testini qayd etmagan,
• inson xavfsizligini baholamagan.

Shuning uchun “potential” soʻzi juda muhim.

“Safe for further development” ifodasining chegarasi

Discussion boʻlimida apoptosis orqali hujayra oʻlimi ekstrakt tabiiy chemopreventive agent sifatida keyingi rivojlantirish uchun xavfsiz boʻlishi mumkinligiga ishora qiladi degan talqin mavjud.

Biroq mavjud tajriba:

• normal hepatocyte cytotoxicity,
• organ toxicity,
• genotoxicity,
• animal toxicity,
• human adverse effects

ni oʻlchamaydi.

Shu sababli Verianla nuqtai nazaridan mavjud maʼlumotlar “xavfsiz ekani koʻrsatildi” degan xulosani qoʻllab-quvvatlamaydi. Xavfsizlik alohida tajribalar bilan tasdiqlanishi kerak.

Ekstraktning qaysi komponenti taʼsir uchun masʼul?

Ushbu tadqiqot buni aniqlamagan.

Discussion anthocyanins va boshqa phytochemical compounds ni ehtimoliy izohlar sifatida muhokama qiladi; biroq CBRBning:

• anthocyanin concentration,
• cyanidin-3-glucoside miqdori,
• peonidin-3-glucoside miqdori,
• boshqa faol compound profili

oʻlchanmagan.

Shu sababli mualliflar solvent fractionation, phytochemical characterization va molecular-mechanism studies ni tavsiya qiladi.

Ekstraksiya usuli nega cheklov yaratadi?

Discussion boʻlimida xloroform nonpolar solvent boʻlgani sababli ayrim phytochemical komponentlarni polar solventlarga qaraganda kamroq samaradorlik bilan ajratishi mumkinligi muhokama qilinadi.

Manba shuningdek ekstrakt 4°C da saqlanganini, extraction jarayoni room temperature da va havo bilan bevosita aloqa sharoitida bajarilganini bildiradi.

Mualliflar anthocyaninlar yorugʻlik, namlik, pH, harorat va kisloroddan taʼsirlanishi mumkinligini; extraction va storage sharoitlari phytochemical stability ga taʼsir qilgan boʻlishi mumkinligini muhokama qiladi.

Biroq anthocyanin miqdori tajribadan oldin va keyin bevosita oʻlchanmaganligi uchun bu tushuntirish oʻlchangan degradation natijasi emas, adabiyotga asoslangan talqindir.

Tadqiqot Usuli va Natijalari

Tajriba dizaynining umumiy koʻrinishi

Figure 1 nimani koʻrsatadi?

Manba Figure 1 HepG2 cell viability ni 24 soatlik panel A va 48 soatlik panel B sifatida ikki panelda koʻrsatadi.

Grafikda:

• Control,
• %1 DMSO,
• olti doxorubicin concentration,
• oʻn bir CBRB concentration

taqqoslanadi.

Y oʻqi Cell Viability (%) qiymatidir.

Barlar mean±standard deviation shaklida.

n=3.

Barlar ustidagi turli harflar p≤0,05 darajasidagi statistik farqlarni ifodalaydi.

Figure 1 ning asosiy ilmiy xabari CBRBning past va oʻrta konsentratsiyalari HepG2 viability ga cheklangan taʼsir koʻrsatishi, yaqqol yashovchanlik pasayishi ayniqsa 1.500–3.000 μg/mL hududida paydo boʻlishidir. Doxorubicin esa μg/mL darajasida ancha past konsentratsiyalarda yashovchanlikni kamaytiradi.

Figure 2 nimani koʻrsatadi?

Manba Figure 2 toʻrtta panelni oʻz ichiga oladi:

• A: 24 soat Gap closure (%),
• B: 24 soat Velocity (μm/h),
• C: 48 soat Gap closure (%),
• D: 48 soat Velocity (μm/h).

Control va %1 DMSO guruhlarida scratch maydonining yopilishi yuqoriroq.

Doxorubicin 2 μg/mL va CBRB 1.500 μg/mL past gap closure va velocity koʻrsatadi.

CBRB konsentratsiyasi oshgani sari hujayra migration koʻrsatkichlarida kamayish tendensiyasi kuzatiladi.

Figure 2 dagi barcha barlarning aniq sonli qiymatlari Results prose da berilmagani sababli Verianla grafikdan taxminiy qiymatlarni aniq oʻlchov sifatida qayta yaratmaydi.

Figure 3 nimani koʻrsatadi?

Figure 3 flow-cytometry natijalarining toʻrtta alohida chiqishini koʻrsatadi:

• A: viable cells,
• B: necrosis,
• C: early apoptosis,
• D: late apoptosis.

Figure 3 tasvirida CBRB 1.500 μg/mL guruhida viable-cell bari past, early-apoptosis bari esa eng yuqori darajada.

Manba prose ushbu erta-apoptoz qiymatini aniq:

\[ 60.35\pm0.01\% \]

deb qayd etadi.

Tadqiqot qoʻllab-quvvatlaydigan natijalar

• CBRB HepG2 hujayralarida past konsentratsiyalarda doxorubicin ga qaraganda ancha past cytotoxic potency koʻrsatgan.
• CBRBning yaqqol cell-viability kamayishi ayniqsa 1.500–3.000 μg/mL kabi yuqori konsentratsiyalarda yuzaga kelgan.
• 48 soatda 2.000 μg/mL CBRB viability ni %30,39±12,23 gacha tushirgan.
• 48 soatda 3.000 μg/mL CBRB viability %4,9±0,67 gacha tushgan.
• CBRB IC50 qiymati 24 soatda 1.265 μg/mL, 48 soatda 1.868 μg/mL.
• Doxorubicin IC50 qiymati 24 soatda 0,44 μg/mL, 48 soatda 0,18 μg/mL.
• 1.500 μg/mL CBRB HepG2 gap closure va migration velocity qiymatlarini sezilarli kamaytirgan.
• 1.500 μg/mL CBRB da early apoptosis %60,35±0,01 bilan yaqqol oshgan.
• CBRB qoʻllangandagi cell death pattern apoptosis bilan mos.

Tadqiqot bevosita qoʻllab-quvvatlamaydigan natijalar

• CBRB odamda jigar saratonini davolashi koʻrsatilmagan.
• CBRB odamda saratonni oldini olishi koʻrsatilmagan.
• Xavfsiz inson dozasi aniqlanmagan.
• Normal jigar hujayralariga nisbatan selectivity bevosita sinovdan oʻtkazilmagan.
• Hayvon modeli ishlatilmagan.
• Clinical pharmacokinetics yoki bioavailability oʻrganilmagan.
• CBRBning qaysi chemical compound i taʼsir uchun masʼul ekani aniqlanmagan.
• Anthocyanin concentration ushbu tadqiqotda oʻlchanmagan.
• Intrinsic yoki extrinsic apoptosis pathway tasdiqlanmagan.
• Microtubule disruption bevosita oʻlchanmagan.
• RAS/RAF/MAPK, PI3K/Akt, Erk yoki caspase pathways mavjud tajriba bilan tasdiqlanmagan.
• “Correlation” ifodasi uchun alohida correlation coefficient chop etilmagan.

Manbadagi ehtiyotkorlik talab qiladigan hisobot nuqtalari

Tadqiqotning asosiy kuchli tomonlari

Tadqiqot bitta assay bilan cheklanmagan; hujayra yashovchanligi, cell migration va cell-death phenotype kabi uch biologik darajani birgalikda baholagan.

Doxorubicin va solvent-control guruhlari ishlatilgan.

24 va 48 soatlik vaqt nuqtalari cytotoxicity va migration tajribalarida birgalikda oʻrganilgan.

Viability uchun IC₅₀, migration uchun gap closure/velocity va apoptosis uchun flow-cytometric cell-state taqsimoti kabi turli oʻlchov turlari qoʻllangan.

Asosiy cheklovlar

Bitta hujayra liniyasi: Natijalar faqat HepG2 hujayra liniyasida olingan.

Normal hujayra taqqoslash yoʻq: Cancer-cell selectivity haqida bevosita xulosa chiqarib boʻlmaydi.

Yuqori CBRB konsentratsiyalari: Sezilarli activity asosan 1.500 μg/mL va undan yuqori konsentratsiyalarda yuzaga kelgan.

Phytochemical characterization yoʻq: Ekstraktdagi faol komponentlar miqdoriy aniqlanmagan.

Nonpolar extraction: Mualliflar xloroform ekstraksiyasi ayrim phytochemicals uchun cheklovchi boʻlishi mumkinligini bildiradi.

Molecular pathway analysis yoʻq: Apoptosis va migration uchun qaysi aniq molekulyar yoʻl masʼul ekani aniqlanmagan.

In vitro chegarasi: Absorption, metabolism, systemic toxicity va in vivo tumor response baholanmagan.

Replication tafsiloti: Figuralar n=3 deydi, biroq takrorlarning texnik/biologik tuzilishi toʻliq tushuntirilmagan.

Extract yield berilmagan: 10 g kepakdan olingan yakuniy ekstrakt miqdori/foizi berilmagan.

Cell-line reproducibility tafsilotlari: Manba HepG2 culture location maʼlumotini beradi; cell-line catalog number, authentication yoki mycoplasma-testing maʼlumoti qayd etilmagan.

Manba ichidagi statistik til: Necrosis boʻlimida “significant” va p>0,05 bir jumlada ishlatilgan.

Kelajakdagi tadqiqot yoʻnalishi

Mualliflarning bevosita tavsiya qilgan keyingi tadqiqotlari:

• solvent fractionation,
• active compound isolation,
• phytochemical characterization,
• molecular mechanism analysis

ga qaratilgan.

Maqsad CBRB ichida kuzatilgan biological activity uchun qaysi komponentlar masʼul ekanini aniqlash va Sembada Hitam qora guruch kepagining chemopreventive potential ini nazoratliroq tarzda baholashdir.

Manba va Usul Haqida Izoh

Asl tadqiqot: Anticancer Potential of Chloroform Extract from Black Rice (Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’) Bran Against HepG2 Liver Cancer Cells.

Mualliflar: Bima Mahendra, Nabila Ramiza Puteri, Yekti Asih Purwestri, Sekar Rahayu, Ardaning Nuriliani.

Mualliflar tartibi: Manba PDF va joriy rasmiy jurnal metadata sidagi tartib saqlangan.

Teng hissa: Manbada equal-contribution bayonoti yoʻq.

Masʼul muallif: Ardaning Nuriliani.

Muassasa 1: Department of Tropical Biology, Faculty of Biology, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Muassasa 2: Department of Biomedical Science, Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Muassasa 3: Master Program, Faculty of Biology, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Jurnal: HAYATI Journal of Biosciences.

Nashriyot tuzilmasi: Department of Biology, Bogor Agricultural University/IPB University va Indonesian Society for Biology.

Jild / son: Vol. 33 No. 6.

Son sanasi: November 2026.

Sahifalar: 1403–1413.

DOI: 10.4308/hjb.33.6.1403-1413.

ISSN: 1978-3019.

EISSN: 2086-4094.

Manba turi: Short Communication.

Taqriz: HAYATI Journal of Biosciences double-blind peer review qoʻllaydi. Jurnal siyosati Short Communication turi Research Article bilan bir xil chuqurlikda review olishini bildiradi.

Received: September 19, 2025.

Received in revised form: July 17, 2026.

Accepted: September 8, 2026.

PDF Available Online: October 1, 2026.

Rasmiy web metadata sidagi Published sanasi: November 1, 2026.

Sana izohi: PDF dagi Available Online sanasi bilan jurnalning issue/publication metadata sanasi turli nashr bosqichlarini koʻrsatadi.

Litsenziya: Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC 4.0).

Preprint: Manba PDF va tekshirilgan rasmiy qaydda alohida preprint koʻrsatilmagan.

Tadqiqot muddati: December 2022 – October 2023.

Tadqiqot turi: Experimental in vitro cell-culture study.

Hujayra liniyasi: HepG2.

Oʻsimlik materiali: Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’ black rice bran.

Material manbasi: Local farmers, Ngaglik, Sleman, Special Region of Yogyakarta, Indonesia.

Ekstraksiya: 10 g bran powder + 100 mL chloroform; 48 soat maceration; Whatman No.1 filtration; overnight remaceration; evaporation to paste-like solid.

Sinov solventi: %1 DMSO.

MTT CBRB konsentratsiyalari: 7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1.000; 1.500; 2.000; 3.000 μg/mL.

Doxorubicin MTT konsentratsiyalari: 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 μg/mL.

MTT cell seeding: 1×10⁴ cells/well, 96-well plate.

MTT culture medium: DMEM + %10 FBS + %2 penicillin–streptomycin + %0,5 amphotericin B.

MTT reaction: 100 μL MTT, 4 soat; 100 μL %10 SDS, overnight.

Absorbance: 595 nm, ELISA microplate reader.

IC50 usuli: Probit analysis.

CBRB IC50: 1.265 μg/mL at 24 h; 1.868 μg/mL at 48 h.

Doxorubicin IC50: 0,44 μg/mL at 24 h; 0,18 μg/mL at 48 h.

48 h CBRB viability: 2.000 μg/mL → %30,39±12,23; 3.000 μg/mL → %4,9±0,67.

Wound-healing cell seeding: 7,5×10³ cells/well, 24-well plate.

Wound-healing CBRB: 250, 500, 1.000, 1.500 μg/mL.

Wound-healing doxorubicin: 1 va 2 μg/mL.

Migration oʻlchovlari: Gap closure (%) va velocity (μm/h).

Migration natijasi: 1.500 μg/mL CBRB da ahamiyatli reduction; p≤0,05.

Flow-cytometry cell seeding: 3×10⁵ cells/well, 6-well plate.

Flow-cytometry treatment: %1 DMSO, doxorubicin 2 μg/mL va CBRB 500, 1.000, 1.500 μg/mL.

Flow-cytometry treatment muddati: 48 soat.

Reagent: Annexin V-FITC; taxminan 30 daqiqa.

Qurilma: FACS Calibur flow cytometer.

CBRB 1.500 μg/mL early apoptosis: %60,35±0,01.

CBRB 1.500 μg/mL necrosis: %2,45±0,06.

Doxorubicin 2 μg/mL necrosis: %6,10±0,04.

Doxorubicin 2 μg/mL late apoptosis: %32,5±0,13.

Statistika: One-way ANOVA, p≤0,05; significant result dan keyin Tukey HSD; SPSS version 25.

Replication: Figure 1–3 captionlari n=3 ni koʻrsatadi; texnik yoki biologik takror tuzilmasi batafsil tushuntirilmagan.

Funding: Doctoral Competency Grant (Hibah Kompetensi Doktor) 2023, Universitas Gadjah Mada; Assignment Letter No. 7743/UN1.P.II/Dit-Lit/PT.01.03/2023.

Ethical approval: Ethics Committee of the Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada; Ref. No. KE/FK/1299/EC/2022.

Data Availability: Manba PDF da alohida data-availability statement yoʻq.

Conflict of Interest: Manba PDF da alohida conflict-of-interest statement yoʻq.

CRediT / Author Contributions: Manba PDF da alohida author-contribution/CRediT boʻlimi yoʻq.

Phytochemical quantification: Tadqiqotda CBRBning anthocyanin yoki boshqa faol compound miqdorlari bevosita oʻlchanmagan.

Molecular pathway analysis: Bajarilmagan; intrinsic/extrinsic apoptosis pathway aniqlanmagan.

Normal-cell selectivity: Manbada normal hepatocyte comparison qayd etilmagan.

In vivo / clinical validation: Yoʻq.

Asosiy talqin chegarasi: Natijalar faqat ishlatilgan HepG2 in vitro sharoitlari uchun amal qiladi; odamlarda saraton davosi, saratondan himoya yoki xavfsiz isteʼmol/doza xulosasini bermaydi.

Manba ichidagi hisobot izohi 1: Abstract late-apoptosis oshishini taʼkidlaydi, Results esa eng kuchli ahamiyatli natijani early apoptosis uchun beradi; late apoptosis uchun p>0,05 qayd etilgan.

Manba ichidagi hisobot izohi 2: Necrosis Results jumlasida “significant differences (p>0.05)” ifodasi mavjud.

Manba ichidagi hisobot izohi 3: CBRB yuqori konsentratsiyalardagi viability inhibition nuqtai nazaridan “moderate cytotoxicity” deb tavsiflanadi, manba keltirgan IC50 tasnifida esa >500 μg/mL alohida potency kategoriyasiga mos keladi.

Manba ichidagi hisobot izohi 4: Discussion bir joyda HeLani “breast cancer cells” deb ataydi, Introduction esa HeLani human cervical cancer cell line deb taʼriflaydi.