5-FU/kitosan/β-siklodekstrin üçlü nanodaşıyıcısı, 5-fluorourasilin (5-FU) β-siklodekstrinlə inklüziyasını və kitosan əsaslı psevdopolirotaksan matrisini birlikdə istifadə edən, pH-yə həssas dərman buraxılması məqsədilə hazırlanmış fiziki şəkildə birləşdirilmiş dərman daşıma sistemidir. Tədqiqatda sistem rentgen şüalarının difraksiyası (XRD), Furye çevirməli infraqırmızı spektroskopiya (FTIR), dinamik işıq səpilməsi (DLS), zeta potensialı və skanedici elektron mikroskopiya (SEM) ilə xarakterizə edilmiş; 5-FU buraxılması pH 5,5 və 7,4 şəraitində ölçülmüş; HCT-116 kolorektal xərçəng hüceyrələrində sitotoksiklik və gen ekspressiyası qiymətləndirilmişdir. Bundan əlavə, sərbəst 5-FU-ya aid müstəqil açıq transkriptom məlumat dəsti istifadə edilərək in silico zülal–zülal qarşılıqlı təsir şəbəkəsi qurulmuşdur.

Üçlü formulun orta hidrodinamik diametri 187,3 ± 12,6 nm, polidisperslik indeksi 0,214 ± 0,031 və zeta potensialı +32,5 ± 4,2 mV olaraq ölçülmüşdür. Dərman yüklənmə məzmunu mənbədə %18,6 ± 1,2, enkapsulyasiya səmərəliliyi isə %74,3 ± 3,5 olaraq bildirilmişdir. 72 saatın sonunda 5-FU buraxılması pH 7,4-də %67,37, pH 5,5-də %87,35 olmuşdur. HCT-116 hüceyrələrində sərbəst 5-FU üçün IC₅₀ 42,5 µM, 5-FU/β-CD ikili kompleksi üçün nəticə mətnində 27,75 µM və üçlü 5-FU/Chs/β-CD formul üçün 16,5 µM olaraq bildirilmişdir.

RT-qPCR nəticələrində üçlü formul qrupunda Caspase-3 ekspressiyası nəzarətin 3,72 qatına, P53 ekspressiyası 3,63 qatına yüksələrkən BCL2 0,48 qata və VEGF 0,32 qata enmişdir. Bununla belə, bu qruplar eyni 5-FU konsentrasiyalarında deyil, hər formulun öz IC₅₀ ekvivalent konsentrasiyasında sınaqdan keçirilmişdir. Buna görə gen ekspressiyası müqayisəsi daşıyıcı təsirini dərman dozasından tam müstəqil şəkildə ayıran bir təcrübə deyil.

Tədqiqatın nəticələri in vitro hüceyrə kulturası səviyyəsindədir. Nanodaşıyıcının insanlarda daha effektiv və ya daha təhlükəsiz kolorektal xərçəng müalicəsi olduğu göstərilməmişdir. Heyvan farmakokinetikası, şişdə toplanma, biopaylanma, sistemik toksiklik, real şiş hədəflənməsi, uzunmüddətli kimyəvi sabitlik və klinik effektivlik bu tədqiqatda sınaqdan keçirilməmişdir.

Kitosan/β-Siklodekstrin Üçlü Nanodaşıyıcısı Nədir?

Kitosan/β-siklodekstrin üçlü nanodaşıyıcısı, β-siklodekstrinin 5-FU ilə yaratdığı inklüziya qarşılıqlı təsirini kitosanın polimer matrisi ilə birləşdirən və 5-FU-nu fiziki şəkildə saxlayaraq həllolma qabiliyyətini, hissəcik sabitliyini və pH-dan asılı buraxılma davranışını dəyişdirməyi hədəfləyən 5-FU/Chs/β-CD formuludur.

5-Fluorourasil nədir?

5-Fluorourasil (5-FU), pirimidin analoqu olan antimetabolit kimyaterapiya dərmanıdır. Tədqiqatın bioloji kontekstində 5-FU-nun əsas təsirlərindən biri timidilat sintazanı inhibə etməklə DNA sintezini pozmasıdır. Mənbə 5-FU-nun sürətli metabolizması, qısa plazma yarımparçalanma müddəti, sistemik toksiklik və kimyarezistentlik kimi klinik məhdudiyyətlərinin daha nəzarətli dərman daşıma sistemlərinə marağı artırdığını bildirir.

Bu tədqiqat 5-FU-nun yeni antixərçəng mexanizmini kəşf etmir. Araşdırmanın əsas sualı məlum dərmanın fiziki daşıma və buraxılma xüsusiyyətlərinin kitosan və β-siklodekstrin istifadə etməklə dəyişdirilib-dəyişdirilə bilməyəcəyidir.

β-Siklodekstrin nədir?

β-Siklodekstrin (β-CD), yeddi qlükopiranoz vahidindən ibarət halqavari oliqosaxariddir. Molekulun xarici hissəsi hidrofil xarakter göstərərkən daxili boşluğu nisbətən hidrofob mikroətraf mühit yaradır. Uyğun molekullar bu boşluğa qismən yerləşərək inklüziya kompleksi yarada bilər.

İnklüziya kompleksində qonaq molekulla β-CD arasında yeni kovalent rabitənin yaranması məcburi deyil. Bu tədqiqatdakı FTIR dəyişiklikləri də hidrogen rabitəsi, van der Waals qarşılıqlı təsirləri və hidrofob inklüziya kimi kovalent olmayan qarşılıqlı təsirlərlə uyğun şəkildə şərh edilmişdir.

Kitosan nədir?

Kitosan, xitinin deasetilləşdirilməsindən alınan kationik polisaxariddir. Bu tədqiqatda istifadə olunan kitosan orta molekulyar kütləlidir; mənbə molekulyar kütləni 190–310 kDa, deasetilləşmə dərəcəsini %75–85 və özlülüyü 200–800 cP olaraq verir.

Kitosanın amin qrupları protonlaşa bildiyi üçün polimerin elektrik yükü və zəncirlərarası qarşılıqlı təsirləri pH-dan asılı olaraq dəyişə bilər. Mənbə turş mühitdə artan protonlaşmanı polimer matrisinin şişməsi və 5-FU-nun daha sürətli diffuziyası ilə əlaqələndirir.

Psevdopolirotaksan nə deməkdir?

Psevdopolirotaksan, halqa formalı molekulların polimer zənciri boyunca fiziki şəkildə düzülə bildiyi supramolekulyar quruluşu ifadə edir. Buradakı “psevdo” ifadəsi klassik polirotaksanlarda halqaların zəncirdən çıxmasına mane olan iri son qruplarının mütləq olmamasını bildirir.

Tədqiqatda β-CD və kitosan fiziki qarışdırma ilə psevdopolirotaksan kompleksi yaratmaq üçün istifadə edilmişdir. Tədqiqatçılar daha sonra 5-FU-nu əvvəlcədən hazırlanmış Chs/β-CD quruluşuna həlledicinin buxarlandırılması/çökdürmə yanaşması ilə yükləmişlər.

Niyə üç müxtəlif formul müqayisə edildi?

Araşdırmanın material və hüceyrə təcrübələrində üç əsas vəziyyət müqayisə edilmişdir:

• Sərbəst 5-FU: daşıyıcı olmayan dərman.
• 5-FU/β-CD: 5-FU-nun β-siklodekstrinlə yaratdığı ikili inklüziya kompleksi.
• 5-FU/Chs/β-CD: β-CD və kitosanı birlikdə ehtiva edən üçlü formul.

Bu ardıcıllıq β-CD-nin təkbaşına yaratdığı dəyişikliyi və buna kitosan əlavə edildikdə meydana çıxan əlavə dəyişikliyi ayırd etmək üçün istifadə edilmişdir.

Üçlü formul necə hazırlandı?

Əvvəlcədən hazırlanmış Chs/β-CD psevdopolirotaksan kompleksindən 0,8 g götürülərək 30 mL susuz N,N-dimetilformamid (DMF) içində 60 °C-də, 600 rpm maqnit qarışdırma altında iki saat dispersləşdirilmişdir.

Ayrı olaraq 0,5 g 5-FU 10 mL susuz DMF içində beş dəqiqəlik qısa sonikasiya ilə həll edilmişdir. 5-FU məhlulu otaq temperaturunda Chs/β-CD dispersiyasına 1 mL/dəq sürətlə damcı-damcı əlavə edilmişdir.

Qarışıq daha sonra 60 °C-də 20 saat qarışdırılmış və incə ağ çöküntü əmələ gəlmişdir. Çöküntü vakuum filtrasiyası ilə toplanmış, üç dəfə 50 mL distillə edilmiş su ilə yuyulmuş, otaq temperaturunda 24 saat havada qurudulmuş və sonra silikagel üzərində vakuum desikatorunda daha 48 saat qurudulmuşdur. Son toz qapalı kəhrəba şüşə flakonlarda 4 °C-də saxlanmışdır.

Hidrodinamik diametr nəyi ölçür?

Dinamik işıq səpilməsi ilə əldə edilən hidrodinamik diametr, hissəciyin maye içində hərəkət edərkən göstərdiyi effektiv ölçünü ifadə edir. Bu dəyər quru SEM təsvirindən xətkeşlə ölçülən həndəsi diametrlə eyni fiziki kəmiyyət deyil; hissəciyin ətrafındakı həlledici qarşılıqlı təsirləri və aqreqasiya vəziyyəti DLS nəticəsinə təsir edə bilər.

PDI nədir?

Polidisperslik indeksi (PDI), DLS ölçməsində hissəcik ölçüsü paylanmasının genişliyi haqqında məlumat verən ölçüsüz göstəricidir. Dəyər kiçildikcə paylanmanın daha dar və hissəcik populyasiyasının ölçü baxımından daha homogen olduğu qəbul edilir. Bu tədqiqatda PDI sərbəst 5-FU-dakı 0,416 dəyərindən üçlü formulda 0,214-ə enmişdir.

Zeta potensialı nəyi ifadə edir?

Zeta potensialı, mayedəki hissəciklərin elektrokinetik səth davranışını təsvir edən elektrik potensialı ölçüsüdür və mV ilə ifadə olunur. Mənbə üçlü formulda +32,5 mV dəyərini kitosanın protonlaşmış amin qrupları ilə əlaqələndirmiş və daha yüksək elektrostatik stabilləşmə ilə uyğun şərh etmişdir.

Zeta potensialının yüksək mütləq dəyəri kolloid sabitliyi barədə faydalı məlumat verir; lakin təkbaşına uzunmüddətli kimyəvi sabitliyi, bioloji təhlükəsizliyi və ya in vivo davranışı sübut etmir.

14 günlük kolloid sabitlik sınağı

Mənbə 14 gün ərzində ölçü artımının %8-dən aşağı, zeta potensialındakı azalmanın %13-dən aşağı və PDI-nın 0,3-dən aşağı qalmasını praktik qısamüddətli kolloid sabitliklə uyğun hesab edir. Bu sınaq yalnız 4 °C-də 14 günlük saxlanmanı əhatə edir; uzunmüddətli raf ömrü deyil.

XRD nəticələri nə göstərdi?

Saf 5-FU-nun XRD naxışında kəskin və intensiv difraksiya piklərinin olması kristal bərk quruluşla uyğundur. 5-FU/β-CD kompleksində 5-FU-ya məxsus piklərin intensivliyi azalmış və piklər genişlənmişdir. Mənbə bunu β-CD boşluğunda inklüziyanın yaranması və kristal nizamın azalması ilə əlaqələndirir.

Üçlü sistemdə 5-FU-nun kristal pikləri daha da zəiflədilmişdir. Kitosana aid edilən təxminən 10,8° və 20° ətrafındakı XRD xüsusiyyətlərinin üçlü formulda təxminən 12,5° və 20,2°-yə sürüşdüyü bildirilmişdir. Tədqiqatçılar bu dəyişiklikləri 5-FU, β-CD və kitosan arasındakı molekulyar qarşılıqlı təsirlər və 5-FU-nun polimer matrisində daha dispers/amorf xarakter qazanması ilə uyğun hesab edirlər.

XRD-də piklərin zəifləməsi təkbaşına molekulun daşıyıcının harasında yerləşdiyini birbaşa göstərmir. Tədqiqatın struktur şərhi XRD, FTIR və digər xarakterizasiya nəticələrinin birlikdə qiymətləndirilməsinə əsaslanır.

FTIR nəticələri nə göstərdi?

FTIR molekullardakı rabitə vibrasiyalarına uyğun infraqırmızı udulma zolaqlarını ölçür. Saf 5-FU üçün mənbə N–H dartılmasını 3567,66 cm⁻¹, alifatik C–H dartılmasını 2935,12 cm⁻¹ və karbonil C=O dartılmasını 1715,37 cm⁻¹ olaraq bildirmişdir.

Mənbə bu sürüşmələri yeni kovalent rabitənin yaranmasına sübut kimi deyil, hidrogen rabitələri və digər kovalent olmayan molekullararası qarşılıqlı təsirlərlə uyğun spektral dəyişikliklər kimi şərh edir.

SEM nə göstərdi?

Saf 5-FU-nun SEM təsvirlərində iri və nizamsız kristal hissəciklər görülmüşdür. 5-FU/β-CD ikili kompleksində daha hamar səthli lövhəvari və uzunsov strukturlar bildirilmişdir. Üçlü formulda isə kobud, nizamsız və aqreqatabənzər nanoskopik morfologiya müşahidə olunmuşdur.

Mənbə SEM mikroqrafları real eksperimental müşahidə olduğuna görə Verianla daxilində süni SEM təsviri yaradılmamışdır. DLS və SEM nəticələrinin eyni fiziki ölçünü ölçmədiyi də nəzərə alınmalıdır: DLS mayedəki hidrodinamik davranışı, SEM isə qurudulmuş və qızılla örtülmüş nümunənin səth morfologiyasını qiymətləndirir.

Faza həllolma qabiliyyəti nəyi ölçdü?

Faza həllolma sınağı β-CD və Chs/β-CD sistemlərinin sulu mühitdə 5-FU həllolma qabiliyyətini nə dərəcədə dəyişdirdiyini araşdırmışdır. Saf 5-FU üçün mənbə təxminən 1,12 mg/mL sulu həllolma qabiliyyəti verir.

β-CD konsentrasiyası artdıqca 5-FU həllolma qabiliyyətinin xətti artdığı və bunun Higuchi təsnifatına görə A₁-tipli davranışla uyğun olduğu bildirilmişdir. Mənbə bunu təxminən 1:1 5-FU:β-CD inklüziya stexiometriyası ilə əlaqələndirir.

Mənbə β-CD üçün görünən bağlanma/sabitlik sabitini:

\[ K_s=\frac{\mathrm{Slope}}{S_0(1-\mathrm{Slope})} \]

tənliyi ilə hesabladığını bildirir.

Burada Slope faza həllolma düz xəttinin meylini; S₀ kompleksəmələgətirici olmadıqda 5-FU-nun başlanğıc həllolma qabiliyyətini; K_s isə görünən sabitlik sabitini ifadə edir.

Mənbə aşağıdakı sayısal ifadəni verir:

\[ K_s=\frac{0.1315}{1.1124(1-0.1315)}=136.2\ \mathrm{M^{-1}} \]

Mənbədaxili uyğunluq qeydi: Tənlikdə çap olunmuş 0,1315 və 1,1124 ədədləri vahid çevrilməsi izah edilmədən birbaşa arifmetik şəkildə istifadə edildikdə sağ tərəfdəki 136,2 M⁻¹ dəyəri alınmır. Mənbə S₀-ın bu hesablamada hansı molyar vahidə çevrildiyini aydın şəkildə izah etmir. Buna görə Verianla 136,2 M⁻¹ dəyərini mənbədə bildirilmiş nəticə kimi qoruyur; çatışmayan vahid/normallaşdırma addımını təxmin edərək yeni hesablama aparmır.

Mənbə 136,2 M⁻¹ dəyərini 5-FU ilə β-CD arasında nisbətən zəif kompleksləşmə affinitəsi kimi şərh edir.

pH 5,5-də Daha Sürətli 5-FU Buraxılması Nə Deməkdir?

pH 5,5-də daha sürətli buraxılma üçlü kitosan/β-siklodekstrin matrisinin turş mühitdə daha çox 5-FU sərbəstləşdirdiyini göstərir; bu tədqiqat baxımından pH 5,5 kolon lümenini deyil, turş şiş mikroətrafını və hüceyrədaxili qəbuldan sonrakı endosomal/lizosomal mühiti təmsil edən in vitro şəraitdir.

Buraxılma sınağı necə aparıldı?

Üçlü formuldan 10 mg, təxminən 2,5 mg 5-FU ekvivalentinə uyğun şəkildə 2 mL buraxılma mühitində dispersləşdirilmiş və 12–14 kDa molekulyar kütlə kəsim həddinə malik dializ torbasına yerləşdirilmişdir.

Dializ torbası 37 °C-də 50 mL buraxılma mühitinə salınmış və 100 rpm-də fasiləsiz çalxalanmışdır. İki mühit müqayisə edilmişdir:

• pH 5,5 asetat tamponu,
• pH 7,4 fosfat tamponlu şoran məhlul.

0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 24; 48 və 72 saatlarda 1 mL nümunə götürülmüş və eyni miqdarda təzə mühit əlavə edilmişdir. Buraxılan 5-FU UV–Vis spektrofotometri ilə 266 nm-də ölçülmüşdür.

Mənbə iki pH şəraiti arasındakı fərqin bütün ölçmə vaxtlarında p < 0,001 olduğunu bildirir.

Kitosan niyə pH-yə həssasdır?

Mənbənin mexanizm şərhində kitosanın amin qrupları turş mühitdə daha çox protonlaşaraq –NH₃⁺ formasına keçir. Eyni işarəli müsbət yüklər arasındakı elektrostatik itələnmə polimer zəncirlərini bir-birindən uzaqlaşdıra bilər; matrisin şişməsi ilə 5-FU-nun xarici mühitə diffuziyası asanlaşa bilər.

Mənbə kitosanın pK_a dəyərini təxminən 6,5 olaraq verir və pH 7,4 şəraitində amin qruplarının təxminən %50–60-nın protonlaşmış qaldığını bildirir. Lakin bu faiz üçün ayrıca təcrübə və ya hesablama tənliyi təqdim edilmədiyinə görə Verianla bu nisbəti yenidən çıxarılmış ölçmə kimi deyil, mənbə müəlliflərinin mexanizm izahının bir hissəsi kimi verir.

pH 5,5 kolon daxilinin pH-sıdır?

Xeyr. Mənbə bunu xüsusi olaraq izah edir. pH 5,5 şəraiti kolon lümenini təmsil etmək üçün seçilməmişdir; turş şiş mikroətrafı və hüceyrə daxilinə qəbuldan sonrakı endosomal/lizosomal bölmələrlə əlaqələndirilmişdir.

Bu fərq vacibdir; nəticə “dərman kolona çatdıqda pH 5,5 səbəbilə avtomatik buraxılacaq” şəklində şərh edilməməlidir.

IC₅₀ Dəyərinin 42,5 µM-dən 16,5 µM-ə Enməsi Nə Deməkdir?

IC₅₀-nin 42,5 µM-dən 16,5 µM-ə enməsi HCT-116 hüceyrələrində və bu tədqiqatın 72 saatlıq SRB sınağı şəraitində üçlü formulun hüceyrə canlılığını %50 səviyyəsinə azaltmaq üçün sərbəst 5-FU-dan daha aşağı 5-FU ekvivalent konsentrasiyasına ehtiyac duyduğunu göstərir; bu nəticə insan xəstələrdə daha aşağı klinik dozanı və ya daha yüksək müalicə uğurunu birbaşa sübut etmir.

SRB testi nəyi ölçür?

Sulforhodamine B (SRB) testi, fiksə edilmiş hüceyrələrdə hüceyrə zülalı miqdarından asılı boya siqnalından istifadə etməklə hüceyrə biokütləsi/canlılığı üçün dolayı ölçü verir. Tədqiqatda 540 nm absorbans ölçülmüşdür.

Mənbə hüceyrə canlılığını:

\[ \mathrm{Cell\ viability}(\%)= \frac{A_{\mathrm{sample}}-A_{\mathrm{blank}}} {A_{\mathrm{control}}-A_{\mathrm{blank}}}\times100 \]

şəklində hesablamışdır.

Burada:

• A_sample: müalicə tətbiq olunan quyunun absorbansı,
• A_control: müalicə tətbiq edilməmiş nəzarət quyusunun absorbansı,
• A_blank: hüceyrə olmayan mühitin fon absorbansıdır.

Blank siqnalının çıxılması cihaz/mühit fonunu azaldır; qalan müalicə siqnalı nəzarət qrupuna nisbətlənərək faiz canlılıq əldə edilir.

HCT-116 sitotoksiklik nəticələri

42,5 / 16,5 ≈ 2,58 olduğuna görə mənbə bunu təxminən 2,6 qat artmış in vitro sitotoksik potensial kimi ifadə edir.

Bu nisbət klinik effektivlik nisbəti deyil. IC₅₀ yalnız müəyyən hüceyrə xətti, müddət, kultura şəraiti və ölçmə üsulu altındakı hüceyrə cavabıdır.

Sitotoksiklik sınağında mənbədaxili vahid fərqi

Metod bölməsi hüceyrələrin 0,05–500 µg/mL ekvivalent 5-FU aralığında müalicə edildiyini bildirir. Buna qarşılıq hüceyrə mikroskopiyası şəklinin izahında 0,05 və 500 µM yazılmış və doza–cavab nəticələri də µM ilə IC₅₀ olaraq bildirilmişdir.

Mənbə bu µg/mL–µM fərqini izah etmir. Buna görə Verianla bu iki vahidi bir-birinə çevirərək hansının “doğru” olduğuna qərar verməmişdir.

RT-qPCR niyə aparıldı?

RT-qPCR ilə hüceyrələrin müalicədən sonra dörd gen üzrə mRNA ekspressiyası ölçülmüşdür:

• P53: hüceyrə stresi, DNA zədələnməsi, hüceyrə dövrü və apoptozun tənzimlənməsində mərkəzi rol oynayan şiş supressoru yolunun komponenti.
• Caspase-3: apoptotik hüceyrə ölümünün icraedici kaspazlarından biri.
• BCL2: anti-apoptotik hüceyrə sağqalım zülalları ailəsinin üzvü.
• VEGF: angiogenezlə əlaqəli siqnal molekulu.

RT-qPCR burada mRNA ekspressiyasını ölçür. P53 və ya Caspase-3 mRNA-sındakı artım təkbaşına uyğun zülalın miqdarını, zülalın aktivləşmə vəziyyətini və ya real apoptotik hüceyrə sayını birbaşa ölçmür. Mənbə bu gen dəyişikliklərini apoptozla uyğun molekulyar işarələr kimi şərh edir.

2^−ΔΔCt üsulu nəyi hesablayır?

Tədqiqatda nisbi gen ekspressiyası müqayisəli Ct üsulu ilə hesablanmışdır:

\[ \mathrm{Relative\ expression}=2^{-\Delta\Delta C_t} \]

Standart müqayisəli Ct məntiqində əvvəlcə hədəf genin Ct dəyəri GAPDH və ya β-Actin kimi istinad genlərinə görə normallaşdırılır:

\[ \Delta C_t=C_{t,\mathrm{hedef}}-C_{t,\mathrm{referans}} \]

Daha sonra müalicə qrupunun normallaşdırılmış dəyəri nəzarət qrupu ilə müqayisə edilir:

\[ \Delta\Delta C_t= \Delta C_{t,\mathrm{tedavi}}-\Delta C_{t,\mathrm{kontrol}} \]

Son mərhələdə \(2^{-\Delta\Delta C_t}\) ifadəsi nəzarət qrupuna görə nisbi ekspressiya dəyişikliyini verir. Nəticənin 1-dən yuxarı olması nisbi artım, 1-dən aşağı olması nisbi azalma deməkdir.

RT-qPCR qrupları eyni 5-FU dozasını aldımı?

Xeyr. Mənbə hər formulu öz IC₅₀ ekvivalent konsentrasiyasında tətbiq etmişdir:

• sərbəst 5-FU: 42,5 µM,
• 5-FU/β-CD: 27,5 µM,
• 5-FU/Chs/β-CD: 16,5 µM.

Bu eksperimental dizayn hər formulun təxminən ekvivalent sitotoksik səviyyəsindəki molekulyar cavabını müqayisə edir. Lakin qrupların 5-FU molyar konsentrasiyası eyni deyil. Buna görə gen ekspressiyasındakı fərqlər yalnız “daşıyıcı təsiri” kimi şərh edilə bilməz; formul və istifadə olunan IC₅₀ ekvivalent konsentrasiyası birlikdə dəyişir.

Mənbə Caspase-3 və P53 üçün üçlü formulun sərbəst 5-FU və ikili kompleks üzərindəki artımını; BCL2 və VEGF üçün isə daha güclü azalmanı statistik baxımdan əhəmiyyətli fərqlərlə əlaqələndirir (p < 0,05).

In Silico PPI Şəbəkəsi Nanodaşıyıcının Mexanizmini Birbaşa Sübut Edirmi?

Xeyr. Tədqiqatın in silico PPI analizi GSE183977 məlumat dəstində HT29 hüceyrələrinin sərbəst 5-FU-ya transkripsional cavabını araşdırır; kitosan, β-siklodekstrin və ya üçlü nanodaşıyıcı üçün transkriptom məlumatı istifadə edilmədiyi üçün şəbəkə analizi nanodaşıyıcıya xas mexanizmin birbaşa sübutu deyil.

In silico məlumat dəsti laboratoriya təcrübəsindən necə fərqlənir?

Bu fərqlərə görə iki məlumat bölməsi bir-birini tamamlayan şəkildə şərh oluna bilər, lakin bir-birinin birbaşa replikasiyası deyil.

Diferensial gen ekspressiyası necə müəyyən edildi?

GEO2R ilə nəzarət və 5-FU tətbiq olunmuş HT29 nümunələri müqayisə edilmişdir. Mənbə əhəmiyyətli diferensial ekspressiya üçün:

\[ |\log_2(\mathrm{Fold\ Change})| > 1.5 \]

və:

\[ p_{\mathrm{adj}} < 0.05 \]

hədlərindən istifadə etmişdir.

log₂ fold-change, gen ekspressiyasındakı dəyişikliyi iki əsaslı loqarifmik miqyasda ifadə edir. Müsbət dəyər artımı, mənfi dəyər azalmanı göstərir. Düzəldilmiş p dəyəri isə çoxsaylı genlər eyni vaxtda sınaqdan keçirilərkən yanlış müsbət nəticələrin nəzarətdə saxlanması üçün istifadə olunan düzəldilmiş statistik əhəmiyyət ölçüsüdür.

Mənbə ümumilikdə 33 yuxarı tənzimlənmiş və 217 aşağı tənzimlənmiş gen, yəni 250 diferensial gen müəyyən etmişdir.

PPI şəbəkəsi necə quruldu?

250 diferensial gen STRING məlumat bazasına ötürülmüş və qarşılıqlı təsir etibarlılıq skoru >0,4 olan zülal–zülal qarşılıqlı təsirlərindən istifadə edilmişdir.

Nəticədə:

• 112 düyün,
• 170 kənar,
• PPI enrichment p < 1,0 × 10⁻¹⁶

ehtiva edən şəbəkə əldə edilmişdir. Düyün zülalı/gen məhsulunu, kənar isə STRING tərəfindən müəyyən edilmiş zülal–zülal əlaqəsi məlumatını ifadə edir.

PPI zənginləşdirmə p dəyərinin çox kiçik olması bu zülalların şəbəkədə təsadüfi seçilmiş eyni ölçülü gen qrupundan gözləniləndən daha çox əlaqəli olduğunu göstərir. Bu dəyər ayrı-ayrılıqda hər qarşılıqlı təsirin bioloji səbəbiyyətinin sübutu deyil.

Hub gen necə müəyyən edildi?

PPI şəbəkəsi Cytoscape-ə ötürülmüş və CytoHubba əlavəsinin degree ölçüsündən istifadə edilmişdir. Degree bir düyünün birbaşa bağlı olduğu şəbəkə əlaqələrinin sayıdır.

IL6-nın degree skoru 30 ilə ən yüksək olmuşdur. Bunun mənası IL6-nın istifadə olunan PPI şəbəkəsində ən çox əlaqəyə malik mərkəzi düyün olmasıdır; bu, IL6-nın nanodaşıyıcının eksperimental olaraq sübut edilmiş hədəfi olduğu demək deyil.

Funksional zənginləşdirmə nə göstərdi?

Mənbədə ən güclü zənginləşmiş bioloji proses sitokin vasitəli siqnal yolu kimi verilmişdir:

\[ FDR=8.77\times10^{-5} \]

Bu termin EGR1, IFNL2, IL19, CXCL1, IL6, IFNL3 və MYC daxil olmaqla yeddi hub geni əhatə etmişdir.

Hüceyrənin üzvi maddəyə cavabı, kimyəvi maddəyə cavab, hüceyrə ölümünün müsbət tənzimlənməsi, apoptotik prosesin müsbət tənzimlənməsi, MAPK kaskadının tənzimlənməsi, immun cavab və JAK–STAT reseptor siqnal yolu kimi proseslər də zənginləşmişdir.

FDR çoxsaylı hipotez sınaqlarında gözlənilən yanlış kəşf nisbətini nəzarətdə saxlayan düzəldilmiş statistik göstəricidir. Daha kiçik FDR müşahidə olunan gen siyahısının müvafiq funksional terminlə əlaqəsinin təsadüfi izahına qarşı daha güclü statistik dəstək verir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Materiallar

5-FU ən azı %99 HPLC təmizliyində, β-CD isə ən azı %98 təmizliyində istifadə edilmişdir. β-CD-nin molekulyar kütləsi mənbədə 1135 g/mol olaraq verilmişdir. Kitosan orta molekulyar kütləli, 190–310 kDa; deasetilləşmə dərəcəsi %75–85; özlülüyü 200–800 cP olaraq göstərilmişdir.

HCT-116 insan kolorektal xərçəng hüceyrə xətti Nawah Scientific Inc.-dən alınmışdır. Hüceyrə kulturasında RPMI-1640, fetal iribuynuzlu serum, penisillin–streptomisin və tripsin-EDTA istifadə edilmişdir.

5-FU/β-CD fiziki qarışığı

Nəzarət məqsədli fiziki qarışıq inklüziya kompleksindəki ilə eyni 1:50 kütlə nisbətində 5-FU və β-CD istifadə edilməklə hazırlanmış, komponentlər kompleks əmələ gəlməsini məcbur etmədən homogen qarışıq əldə etmək üçün həvəngdə 10 dəqiqə yüngül şəkildə üyüdülmüşdür.

5-FU/β-CD inklüziya kompleksinin hazırlanması

0,04 g 5-FU 30 mL DMF içində həll edilmiş, 2 g β-CD tədricən əlavə olunmuş və suspenziya 80 °C-də fasiləsiz maqnit qarışdırma altında səkkiz saat saxlanmışdır.

Məhlul steril Petri qablarına köçürülmüş və otaq temperaturunda yeddi gün qurudulmuşdur. Qurumuş bərk maddə qaşınıb götürülmüş, yüngülcə üyüdülmüş və otaq temperaturunda hermetik qablarda saxlanmışdır.

Chs/β-CD psevdopolirotaksanın hazırlanması

1,1 g β-CD 50 mL distillə edilmiş suda 50 °C-də 600 rpm qarışdırma ilə həll edilmiş və otaq temperaturuna soyudulmuşdur.

Ayrı olaraq 0,25 g kitosan 50 mL %1 v/v sulu sirkə turşusunda həll edilmiş və 12 saat qarışdırılmışdır. Kitosan məhlulu otaq temperaturundakı β-CD məhluluna 1 mL/dəq sürətlə əlavə edilmişdir.

Qarışıq daha 24 saat 600 rpm-də qarışdırılmışdır. Əmələ gələn südü ağ çöküntü 12.000 × g-də 20 dəqiqə sentrifuqalanmış, üç dəfə distillə edilmiş su və bir dəfə 0,1 M ammonium hidroksidlə yuyulmuş, 48 saat liyofilizə edilmiş və desikatorda saxlanmışdır.

DLS ölçmə şəraiti

Üçlü formul 1 mg/mL konsentrasiyada deionlaşdırılmış suda dispersləşdirilmiş, 10 dəqiqə sonikasiya edilmiş və Zetasizer Nano ZS cihazında 25 °C-də, 173° səpilmə bucağında üç təkrar olaraq ölçülmüşdür.

FTIR şəraiti

FTIR ölçmələri Jasco Model 4100 spektrometri ilə 4000–400 cm⁻¹ dalğa ədədi aralığında və 4 cm⁻¹ ayırdetmə qabiliyyətində aparılmışdır. Nümunələr KBr peletləri şəklində hazırlanmışdır.

XRD şəraiti

Bruker D8 Advance difraktometri, Cu Kα şüalanması və λ=1,5406 Å istifadə edilmişdir. Cihaz 40 kV və 40 mA-da işlədilmiş; skan 2θ=5–80° aralığında, 0,02° addım və 2°/dəq skan sürəti ilə aparılmışdır.

SEM şəraiti

Zeiss Sigma 500 VP FESEM istifadə edilmişdir. Nümunələr 0,1 mg/mL olmaqla deionlaşdırılmış suda dispersləşdirilmiş, alüminium stub üzərinə damızdırılmış, vakuum altında qurudulmuş və keçiriciliyi artırmaq üçün nazik qızıl təbəqə ilə örtülmüşdür. Təsvirlər 5 kV sürətləndirici gərginlikdə 10.000× və 50.000× böyütmədə alınmışdır.

Dərman yüklənmə məzmunu və enkapsulyasiya səmərəliliyi

Mənbə iki əsas formuldan istifadə etmişdir:

\[ DLC(\%)= \frac{\text{Formülasyondaki ilaç ağırlığı}} {\text{Formülasyon ağırlığı}}\times100 \]

DLC (drug loading content), əldə olunan formulun ümumi kütləsinin neçə faizinin dərman olduğunu ifadə edir.

\[ EE(\%)= \frac{\text{Formülasyondaki ilaç ağırlığı}} {\text{Başlangıçta eklenen ilaç ağırlığı}}\times100 \]

EE (encapsulation efficiency), başlanğıcda istifadə olunan dərmanın hansı hissəsinin son daşıyıcı sistem daxilində saxlandığını ifadə edən göstəricidir.

Mənbə orta:

• DLC = %18,6 ± 1,2,
• EE = %74,3 ± 3,5

bildirmişdir.

Cədvəl 5-in EE hesabındakı mənbədaxili qeyri-müəyyənlik

Mənbə Cədvəl 5-də orta formul kütləsini 5,12 mg, “Drug Added” dəyərini 500 mg və bu 5,12 mg nümunədə ölçülən dərmanı 0,95 mg olaraq verir.

DLC baxımından:

\[ \frac{0.95}{5.12}\times100\approx18.6\% \]

olduğu üçün çap olunmuş DLC dəyəri cədvəllə arifmetik baxımdan uyğundur.

Lakin 0,95 mg ölçülmüş dərman və cədvəldə çap olunmuş 500 mg başlanğıc dərmanı eyni formulda birbaşa istifadə edilərsə mənbədə verilən %74,3 EE alınmır. Buradakı mümkün nümunə-miqyası/batch-miqyası normallaşdırma addımı və ya sütun tərifi məqalədə açıqlanmır.

Buna görə %74,3 mənbə nəticəsi olduğu kimi qorunmuşdur; lakin cədvəl dəyərlərindən müstəqil şəkildə yenidən təsdiqlənmiş EE hesabı kimi təqdim edilməmişdir.

Faza həllolma üsulundakı konsentrasiya fərqi

Material və metod bölməsi Chs/β-CD psevdopolirotaksanı üçün 0–10 mg/mL aralığını bildirir. Nəticə bölməsi isə ən yüksək sınaq səviyyəsini 20 mg/mL Chs/β-CD olaraq müəyyən edir və burada 5-FU həllolma qabiliyyətini 6,84 ± 0,20 mg/mL olaraq verir.

Mənbə bu iki konsentrasiya aralığı arasındakı fərqi izah etməmişdir. Verianla nəticələri 20 mg/mL-dən 10 mg/mL-ə endirməmiş və metod bölməsini səssizcə 20 mg/mL olaraq dəyişdirməmişdir.

Həllolma nəticələri

Cədvəl başlığı bu məlumatları “ekvivalent β-CD konsentrasiyalarında” müqayisə kimi təqdim edir. Bununla belə, mətndə 20 mg/mL Chs/β-CD sisteminin təxminən 4,4 mM β-CD tərkibinə uyğun gəldiyi barədə ayrıca ifadə olduğuna görə konsentrasiya oxlarının necə uyğunlaşdırıldığı mənbədə tam aydın deyil. Buna görə cədvəl mənbə dəyərləri ilə olduğu kimi qorunmuş, yeni konsentrasiya çevrilməsi yaradılmamışdır.

Statistik analiz

Eksperimental nəticələr üç təkrar olaraq aparılmış və orta ± standart sapma şəklində ifadə edilmişdir. Statistik analiz GraphPad Prism istifadə edilməklə aparılmışdır.

Qruplar arasındakı fərqlər üçün bir istiqamətli dispersiya analizi (one-way ANOVA), daha sonra Tukey post hoc testi tətbiq edilmişdir. Statistik əhəmiyyət həddi:

\[ p<0.05 \]

olaraq müəyyən edilmişdir.

ANOVA birdən çox qrupun orta dəyərləri arasında ümumi fərq olub-olmadığını sınaqdan keçirir. Tukey post hoc testi isə ANOVA-dan sonra hansı qrup cütlərinin bir-birindən fərqli olduğunu qiymətləndirmək üçün istifadə olunur.

In silico analiz mərhələləri

1. NCBI Gene Expression Omnibus daxilində 5-FU və kolorektal xərçənglə əlaqəli məlumat dəstləri axtarılmışdır.
2. GSE183977 daxilindən iki nəzarət və iki 100 µM 5-FU tətbiq olunmuş HT29 nümunəsi seçilmişdir.
3. GEO2R ilə diferensial ekspressiya analizi aparılmışdır.
4. |log₂FC| >1,5 və adjusted p<0,05 hədləri tətbiq edilmişdir.
5. 250 diferensial gen STRING-ə ötürülmüşdür.
6. STRING qarşılıqlı təsirlərində confidence score >0,4 istifadə edilmişdir.
7. Şəbəkə Cytoscape-ə ötürülmüşdür.
8. CytoHubba degree üsulu ilə ilk 10 hub gen seçilmişdir.
9. ShinyGO ilə funksional zənginləşdirmə aparılmışdır.

Tədqiqatın birbaşa dəstəklədiyi nəticələr

• 5-FU, β-CD və kitosan fiziki üsullarla üçlü bərk formulda birləşdirilə bilmişdir.
• Üçlü formul DLS-də 187,3 ± 12,6 nm orta hidrodinamik diametr və +32,5 ± 4,2 mV zeta potensialı göstərmişdir.
• XRD və FTIR məlumatları 5-FU-nun kristal nizamının azalması və komponentlərarası kovalent olmayan qarşılıqlı təsirlərlə uyğun dəyişikliklər göstərmişdir.
• 5-FU buraxılması pH 5,5 şəraitində pH 7,4-lə müqayisədə daha sürətli olmuşdur.
• HCT-116 hüceyrələrində üçlü formul sərbəst 5-FU ilə müqayisədə daha aşağı IC₅₀ göstərmişdir.
• Üçlü formulun öz IC₅₀ ekvivalent konsentrasiyasındakı RT-qPCR təcrübəsində P53 və Caspase-3 ekspressiyası daha yüksək, BCL2 və VEGF ekspressiyası daha aşağı bildirilmişdir.
• Sərbəst 5-FU-nun müstəqil HT29 transkriptom məlumatında IL6, MYC, EGR1, BMP4 və ATF3 daxil olmaqla mərkəzi şəbəkə düyünləri müəyyən edilmişdir.

Tədqiqatın birbaşa dəstəkləmədiyi nəticələr

• Nanodaşıyıcının insan xəstələrdə daha effektiv olduğu göstərilməmişdir.
• Nanodaşıyıcının insanlarda 5-FU toksikliyini azaltdığı göstərilməmişdir.
• 187 nm hissəcik ölçüsünün real insan şişinə seçici şəkildə çatdığı göstərilməmişdir.
• EPR təsirinə uyğun ölçü aralığında olmaq real in vivo şiş hədəflənməsinin sübutu deyil.
• Farmakokinetika, biopaylanma və ya şişdaxili dərman konsentrasiyası ölçülməmişdir.
• Heyvan modeli istifadə edilməmişdir.
• Klinik nümunə və ya xəstə istifadə edilməmişdir.
• 14 günlük 4 °C kolloid ölçmə uzunmüddətli raf ömrünün sübutu deyil.
• RT-qPCR nəticələri zülal səviyyəsini və ya zülal aktivliyini birbaşa ölçmür.
• In silico IL6, MYC, EGR1 və ATF3 nəticələri kitosan/β-CD daşıyıcısına xas birbaşa mexanistik sübut deyil.

Tədqiqatın əsas metodoloji məhdudiyyətləri

Ən mühüm məhdudiyyət in vitro və in silico təcrübələrin fərqli hüceyrə xətlərindən, fərqli müalicə müddətlərindən və fərqli 5-FU şəraitindən istifadə etməsidir. HCT-116 hüceyrələri formulalarla 72 saat sınaqdan keçirilərkən GSE183977 analizi HT29 hüceyrələrində 100 µM sərbəst 5-FU-nun yalnız iki saatlıq cavabına əsaslanır.

Mənbə buna görə in silico analizi nanodaşıyıcı mexanizminin birbaşa sübutu kimi deyil, 5-FU farmakologiyası üçün korrelyativ sistem səviyyəli kontekst kimi müəyyən edir.

İkinci mühüm məhdudiyyət gen ekspressiyası qruplarının eyni 5-FU dozasında müqayisə edilməməsidir. Hər formul öz IC₅₀ konsentrasiyasında tətbiq edilmişdir. Buna görə daşıyıcı quruluşunun təsiri ilə fərqli 5-FU konsentrasiyalarının təsiri bu eksperimental dizaynda tam ayrılmamışdır.

Üçüncü məhdudiyyət nəticələrin yalnız hüceyrə kulturası və hesablama şəbəkə analizinə əsaslanmasıdır. Mənbə nəticə bölməsində in vivo farmakokinetika və effektivlik tədqiqatlarını, uzunmüddətli sabitlik sınaqlarını və təklif olunan molekulyar yolların hədəfli gen susdurulması və ya inhibisiya sınaqları ilə təsdiqlənməsini gələcək işlər arasında göstərir.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal tədqiqat: Chitosan/β-cyclodextrin nanocarriers enhance 5-fluorouracil efficacy against colorectal cancer via pH-responsive release and apoptosis modulation

Müəlliflər: Amr M. A. Mohamed; Hemat M. Dardeer; Ali M. A. Ahmed; M. Yasser Alsedfy; Amr E. Abd Elhadi; Abdelmoniem M. A. Elsanosy; Abdelhakam Esmaeil Mohamed Ahmed; Alaa Hassan Said.

Məsul müəllif: Alaa Hassan Said.

Məsul müəllifin e-poçtu: alaa.elkareem@sci.svu.edu.eg

Qurum 1: Department of Zoology, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Qurum 2: Department of Chemistry, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Qurum 3: Molecular Biotechnology Program, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Qurum 4: Electronics and Nano Devices Lab, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Qurum 5: Radiology Department, Applied Health Sciences Faculty, Sphinx University, New Assiut, Egypt.

Qurum 6: Faculty of Agriculture, Food Sciences and Environmental Management, Institute of Food Science, University of Debrecen, Debrecen, Hungary.

Qurum 7: Faculty of Forestry, University of Khartoum, Khartoum North, Sudan.

Jurnal: Scientific Reports.

Nəşriyyat/platforma: Nature Portfolio / Springer Nature.

Cild: 16.

Məqalə nömrəsi: 20981.

ISSN: 2045-2322.

DOI: 10.1038/s41598-026-60468-z.

Məqalə daxil olub: 12 may 2026.

Qəbul tarixi: 29 iyun 2026.

Nəşr tarixi: 7 iyul 2026.

Mənbə növü: Eksperimental in vitro dərman daşıma/nanomaterial tədqiqatını tamamlayıcı in silico şəbəkə farmakologiyası və funksional zənginləşdirmə analizi ilə birləşdirən orijinal tədqiqat məqaləsi.

Resenziya: Scientific Reports-da dərc olunmuş resenziyalı jurnal məqaləsidir.

Lisenziya: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Etik təsdiq: Qena University Faculty of Science Ethics Committee, Permit Number 005/07/25. Mənbə insan və ya heyvan subyektlərindən istifadə olunmadığını bildirir.

Məlumatların əlçatanlığı: Tədqiqatı dəstəkləyən məlumatların məqalə daxilində olduğu; əlavə məlumatların məsul müəllifdən tələb oluna biləcəyi bildirilmişdir.

Maraqların toqquşması: Müəlliflər maraqların toqquşması olmadığını bəyan etmişlər.

Maliyyələşdirmə: Mənbə açıq giriş maliyyələşdirməsinin Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) və Egyptian Knowledge Bank (EKB) əməkdaşlığı ilə təmin edildiyini bildirir və eyni bölmədə “No funding” ifadəsindən istifadə edir. Buna görə açıq giriş nəşr xərclərinə dəstək ilə tədqiqat layihəsinin maliyyələşdirilməsi bir-birinə qarışdırılmamalıdır.

Təşəkkür: Müəlliflər Qena University Faculty of Science daxilindəki Genetic & Molecular Biology və Organic Chemistry laboratoriyalarına əməkdaşlıq və dəstəyə görə təşəkkür edirlər.

Müəllif töhfələri: Amr M. A. Mohamed: konseptuallaşdırma, metod, formal analiz və ilkin qaralama. Hemat M. Dardeer: konseptuallaşdırma və metod. Ali M. A. Ahmed: metod, formal analiz və ilkin qaralama. M. Yasser Alsedfy: proqram təminatı, formal analiz və ilkin qaralama. Amr E. Abd Elhadi: metod. Abdelmoniem M. A. Elsanosy: metod. Abdelhakam Esmaeil Mohamed Ahmed: nəzərdən keçirmə və redaktə. Alaa Hassan Said: formal analiz, vizuallaşdırma, ilkin qaralama, nəzərdən keçirmə və redaktə. Bütün müəlliflərin son mətni oxuyub təsdiqlədiyi bildirilir.

Bərabər töhfə: Mənbədə bərabər töhfə və ya bərabər birinci müəlliflik bəyanatı yoxdur.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 1: Faza həllolma üsulunda Chs/β-CD üçün 0–10 mg/mL yazıldığı halda nəticə bölməsində 20 mg/mL şəraiti bildirilmişdir.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 2: Faza həllolma sabiti tənliyində çap olunmuş sayısal yerləşdirmə ilə bildirilən 136,2 M⁻¹ nəticəsi arasındakı vahid/normallaşdırma addımı aydın şəkildə izah edilmir.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 3: Cədvəl 5-də 0,95 mg ölçülmüş dərman, 500 mg “Drug Added” və %74,3 EE birlikdə verilmişdir; cədvəldə görünən iki kütlə birbaşa EE formulunda istifadə edildikdə çap olunmuş EE nəticəsi alınmadığı üçün nümunə-batch normallaşdırması aydın deyil.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 4: Sitotoksiklik metodunda konsentrasiya aralığı µg/mL olaraq yazıldığı halda hüceyrə mikroskopiyası şəkil izahında µM vahidi istifadə edilmişdir.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 5: İkili 5-FU/β-CD kompleksinin IC₅₀ dəyəri xülasədə 27,5 µM, nəticə mətnində 27,75 µM olaraq verilir. Bu fərq mənbə daxilində qorunmuşdur.

Əsas şərh həddi: Bu tədqiqat klinik tədqiqat deyil. HCT-116 nəticələri hüceyrə kulturası səviyyəsindədir. Nanodaşıyıcının insanlarda şiş hədəflənməsi, farmakokinetikası, təhlükəsizliyi, dozanı azaltma təsiri və ya müalicə uğuru göstərilməmişdir.

In silico şərh həddi: GSE183977 analizi HT29 hüceyrələrində sərbəst 5-FU-ya aid 2 saatlıq transkripsional cavabdan istifadə edir. Kitosan, β-CD və ya üçlü formula xas transkriptom məlumatı olmadığı üçün hub gen şəbəkəsi nanodaşıyıcıya xas birbaşa molekulyar sübut deyil.