5-FU/kitosan/β-siklodekstrin üçlü nanotaşıyıcısı, 5-fluorourasilin (5-FU) β-siklodekstrin ile inklüzyonunu ve kitosan tabanlı psödopolirotaksan matrisi birlikte kullanan, pH'ye duyarlı ilaç salımı amacıyla geliştirilen fiziksel olarak birleştirilmiş bir ilaç taşıma sistemidir. Çalışmada sistem X-ışını kırınımı (XRD), Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FTIR), dinamik ışık saçılımı (DLS), zeta potansiyeli ve taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ile karakterize edilmiş; 5-FU salımı pH 5,5 ve 7,4 koşullarında ölçülmüş; HCT-116 kolorektal kanser hücrelerinde sitotoksisite ve gen ekspresyonu değerlendirilmiştir. Ayrıca serbest 5-FU'ya ait bağımsız bir kamu transkriptom veri seti kullanılarak in silico protein–protein etkileşim ağı oluşturulmuştur.

Üçlü formülasyonun ortalama hidrodinamik çapı 187,3 ± 12,6 nm, polidispersite indeksi 0,214 ± 0,031 ve zeta potansiyeli +32,5 ± 4,2 mV olarak ölçülmüştür. İlaç yükleme içeriği kaynakta %18,6 ± 1,2, enkapsülasyon verimliliği %74,3 ± 3,5 olarak raporlanmıştır. 72 saat sonunda 5-FU salımı pH 7,4'te %67,37, pH 5,5'te %87,35 olmuştur. HCT-116 hücrelerinde serbest 5-FU için IC₅₀ 42,5 µM, 5-FU/β-CD ikili kompleks için sonuç metninde 27,75 µM ve üçlü 5-FU/Chs/β-CD formülasyon için 16,5 µM olarak bildirilmiştir.

RT-qPCR sonuçlarında üçlü formülasyon grubunda Caspase-3 ekspresyonu kontrolün 3,72 katına, P53 ekspresyonu 3,63 katına yükselirken BCL2 0,48 kata ve VEGF 0,32 kata düşmüştür. Bununla birlikte bu gruplar eşit 5-FU konsantrasyonlarında değil, her formülasyonun kendi IC₅₀ eşdeğer konsantrasyonunda test edilmiştir. Bu nedenle gen ekspresyonu karşılaştırması taşıyıcı etkisini ilaç dozundan tamamen bağımsız biçimde ayıran bir deney değildir.

Çalışmanın sonuçları in vitro hücre kültürü düzeyindedir. Nanotaşıyıcının insanlarda daha etkili veya daha güvenli bir kolorektal kanser tedavisi olduğu gösterilmemiştir. Hayvan farmakokinetiği, tümör birikimi, biyodağılım, sistemik toksisite, gerçek tümör hedefleme, uzun dönem kimyasal stabilite ve klinik etkinlik bu çalışmada test edilmemiştir.

Kitosan/β-Siklodekstrin Üçlü Nanotaşıyıcısı Nedir?

Kitosan/β-siklodekstrin üçlü nanotaşıyıcısı, β-siklodekstrinin 5-FU ile oluşturduğu inklüzyon etkileşimini kitosanın polimerik matrisiyle birleştiren ve 5-FU'yu fiziksel olarak tutarak çözünürlük, partikül kararlılığı ve pH'ye bağlı salım davranışını değiştirmeyi amaçlayan bir 5-FU/Chs/β-CD formülasyonudur.

5-Fluorourasil nedir?

5-Fluorourasil (5-FU), pirimidin analoğu olan bir antimetabolit kemoterapi ilacıdır. Çalışmanın biyolojik bağlamında 5-FU'nun temel etkilerinden biri timidilat sentazı baskılayarak DNA sentezini bozmasıdır. Kaynak, 5-FU'nun hızlı metabolizma, kısa plazma yarı ömrü, sistemik toksisite ve kemorezistans gibi klinik sınırlılıklarının daha kontrollü ilaç taşıma sistemlerine yönelik ilgiyi artırdığını belirtmektedir.

Bu çalışma 5-FU'nun yeni bir antikanser mekanizmasını keşfetmemektedir. Araştırmanın temel sorusu, bilinen ilacın fiziksel taşıma ve salım özelliklerinin kitosan ve β-siklodekstrin kullanılarak değiştirilip değiştirilemeyeceğidir.

β-Siklodekstrin nedir?

β-Siklodekstrin (β-CD), yedi glukopiranoz biriminden oluşan halkasal bir oligosakkarittir. Molekülün dış bölgesi hidrofilik karakter gösterirken iç boşluğu görece hidrofobik bir mikroçevre sağlar. Uygun moleküller bu boşluğa kısmen yerleşerek inklüzyon kompleksi oluşturabilir.

İnklüzyon kompleksinde konuk molekül ile β-CD arasında yeni bir kovalent bağ kurulması zorunlu değildir. Bu çalışmadaki FTIR değişimleri de hidrojen bağı, van der Waals etkileşimleri ve hidrofobik inklüzyon gibi kovalent olmayan etkileşimlerle uyumlu olarak yorumlanmıştır.

Kitosan nedir?

Kitosan, kitinin deasetilasyonundan elde edilen katyonik bir polisakkarittir. Bu çalışmada kullanılan kitosan orta molekül ağırlıklıdır; kaynak molekül ağırlığını 190–310 kDa, deasetilasyon derecesini %75–85 ve viskoziteyi 200–800 cP olarak vermektedir.

Kitosanın amin grupları protonlanabildiği için polimerin elektriksel yükü ve zincirler arası etkileşimleri pH'ye bağlı olarak değişebilir. Kaynak, asidik ortamda artan protonasyonu polimer matrisinin şişmesi ve 5-FU'nun daha hızlı difüzyonuyla ilişkilendirmektedir.

Psödopolirotaksan ne anlama gelir?

Psödopolirotaksan, halka biçimli moleküllerin bir polimer zinciri boyunca fiziksel olarak dizilebildiği supramoleküler bir düzeni ifade eder. Buradaki “psödo” ifadesi, klasik polirotaksanlarda halkaların zincirden çıkmasını engelleyen büyük uç grupların zorunlu olmamasını anlatır.

Çalışmada β-CD ve kitosan fiziksel karıştırmayla bir psödopolirotaksan kompleks oluşturmak için kullanılmıştır. Araştırmacılar daha sonra 5-FU'yu bu önceden oluşturulmuş Chs/β-CD yapısına solvent buharlaştırma/çöktürme yaklaşımıyla yüklemiştir.

Üç farklı formülasyon neden karşılaştırıldı?

Araştırmanın malzeme ve hücre deneylerinde üç temel durum karşılaştırılmıştır:

• Serbest 5-FU: taşıyıcı içermeyen ilaç.
• 5-FU/β-CD: 5-FU'nun β-siklodekstrin ile oluşturduğu ikili inklüzyon kompleksi.
• 5-FU/Chs/β-CD: β-CD ve kitosanı birlikte içeren üçlü formülasyon.

Bu sıra, β-CD'nin tek başına sağladığı değişimi ve buna kitosan eklendiğinde ortaya çıkan ek değişimi ayırabilmek için kullanılmıştır.

Üçlü formülasyon nasıl hazırlandı?

Önceden hazırlanan Chs/β-CD psödopolirotaksan kompleksinden 0,8 g alınarak 30 mL susuz N,N-dimetilformamid (DMF) içinde 60 °C'de, 600 rpm manyetik karıştırma altında iki saat dağıtılmıştır.

Ayrı olarak 0,5 g 5-FU, 10 mL susuz DMF içinde beş dakikalık kısa sonikasyonla çözülmüştür. 5-FU çözeltisi oda sıcaklığında Chs/β-CD dispersiyonuna 1 mL/dk hızla damla damla eklenmiştir.

Karışım daha sonra 60 °C'de 20 saat karıştırılmış ve ince beyaz bir çökelti oluşmuştur. Çökelti vakum filtrasyonu ile toplanmış, üç kez 50 mL damıtılmış suyla yıkanmış, oda sıcaklığında 24 saat havada kurutulmuş ve ardından silika jel üzerinde vakum desikatöründe 48 saat daha kurutulmuştur. Nihai toz kapalı amber cam şişelerde 4 °C'de saklanmıştır.

Hidrodinamik çap neyi ölçer?

Dinamik ışık saçılımıyla elde edilen hidrodinamik çap, parçacığın sıvı içinde hareket ederken sergilediği etkin boyutu ifade eder. Bu değer, kuru bir SEM görüntüsünden cetvelle ölçülen geometrik çapla aynı fiziksel büyüklük değildir; parçacığın çevresindeki çözücü etkileşimleri ve agregasyon durumu DLS sonucunu etkileyebilir.

PDI nedir?

Polidispersite indeksi (PDI), DLS ölçümünde parçacık boyutu dağılımının genişliği hakkında bilgi veren boyutsuz bir ölçüttür. Değer küçüldükçe dağılımın daha dar ve parçacık popülasyonunun boyut bakımından daha homojen olduğu kabul edilir. Bu çalışmada PDI serbest 5-FU'daki 0,416 değerinden üçlü formülasyonda 0,214'e düşmüştür.

Zeta potansiyeli neyi anlatır?

Zeta potansiyeli, sıvı içindeki parçacıkların elektrokinetik yüzey davranışını tanımlayan elektriksel potansiyel ölçümüdür ve mV cinsinden ifade edilir. Kaynak, üçlü formülasyondaki +32,5 mV değerini kitosanın protonlanmış amin gruplarıyla ilişkilendirmiş ve daha yüksek elektrostatik stabilizasyonla uyumlu olarak yorumlamıştır.

Zeta potansiyelinin yüksek mutlak değeri kolloidal kararlılık hakkında yararlı bilgi verir; ancak tek başına uzun dönem kimyasal kararlılığı, biyolojik güvenliği veya in vivo davranışı kanıtlamaz.

14 günlük kolloidal stabilite deneyi

Kaynak, 14 günde boyut artışının %8'in altında, zeta potansiyelindeki azalmanın %13'ün altında ve PDI'nın 0,3'ün altında kalmasını pratik kısa dönem kolloidal stabiliteyle uyumlu kabul etmektedir. Bu deney yalnız 4 °C'de 14 günlük depolamayı kapsamaktadır; uzun dönem raf ömrü değildir.

XRD sonuçları ne gösterdi?

Saf 5-FU'nun XRD deseninde keskin ve yoğun kırınım pikleri bulunması kristalin katı yapıyla uyumludur. 5-FU/β-CD kompleksinde 5-FU'ya özgü piklerin şiddeti azalmış ve pikler genişlemiştir. Kaynak bunu β-CD boşluğu içinde inklüzyon oluşumu ve kristal düzenin azalmasıyla ilişkilendirmektedir.

Üçlü sistemde 5-FU'nun kristalin pikleri daha da baskılanmıştır. Kitosana atfedilen yaklaşık 10,8° ve 20° civarındaki XRD özelliklerinin üçlü formülasyonda yaklaşık 12,5° ve 20,2°'ye kaydığı bildirilmiştir. Araştırmacılar bu değişimleri 5-FU, β-CD ve kitosan arasındaki moleküler etkileşimler ve 5-FU'nun polimerik matris içinde daha dağılmış/amorf karakter kazanmasıyla uyumlu görmektedir.

XRD'de pik baskılanması tek başına molekülün taşıyıcının neresinde bulunduğunu doğrudan görüntülemez. Çalışmanın yapısal yorumu XRD, FTIR ve diğer karakterizasyon bulgularının birlikte değerlendirilmesine dayanmaktadır.

FTIR sonuçları ne anlattı?

FTIR, moleküllerdeki bağların titreşimlerine karşılık gelen kızılötesi absorbsiyon bantlarını ölçer. Saf 5-FU için kaynak N–H gerilmesini 3567,66 cm⁻¹, alifatik C–H gerilmesini 2935,12 cm⁻¹ ve karbonil C=O gerilmesini 1715,37 cm⁻¹ olarak raporlamıştır.

Kaynak bu kaymaları yeni kovalent bağ oluşumunun kanıtı olarak değil, hidrojen bağları ve diğer kovalent olmayan moleküller arası etkileşimlerle uyumlu spektral değişimler olarak yorumlamaktadır.

SEM ne gösterdi?

Saf 5-FU'nun SEM görüntülerinde büyük ve düzensiz kristalin parçacıklar görülmüştür. 5-FU/β-CD ikili kompleksinde daha düzgün yüzeyli plaka benzeri ve uzamış yapılar raporlanmıştır. Üçlü formülasyonda ise pürüzlü, düzensiz ve agregat benzeri nanoskopik morfoloji gözlenmiştir.

Kaynak SEM mikrografları gerçek deneysel gözlem olduğundan Verianla içinde yapay bir SEM görüntüsü üretilmemiştir. DLS ve SEM sonuçlarının da aynı fiziksel ölçümü yapmadığı unutulmamalıdır: DLS sıvı içindeki hidrodinamik davranışı, SEM ise kurutulmuş ve altın kaplanmış numunenin yüzey morfolojisini değerlendirir.

Faz çözünürlüğü neyi ölçtü?

Faz çözünürlüğü deneyi β-CD ve Chs/β-CD sistemlerinin sulu ortamda 5-FU çözünürlüğünü ne ölçüde değiştirdiğini araştırmıştır. Saf 5-FU için kaynak yaklaşık 1,12 mg/mL sulu çözünürlük vermektedir.

β-CD konsantrasyonu arttıkça 5-FU çözünürlüğünün doğrusal arttığı ve bunun Higuchi sınıflandırmasına göre A₁-tipi davranışla uyumlu olduğu belirtilmiştir. Kaynak bunu yaklaşık 1:1 5-FU:β-CD inklüzyon stokiyometrisiyle ilişkilendirmiştir.

Kaynak, β-CD için görünür bağlanma/stabilite sabitini:

\[ K_s=\frac{\mathrm{Slope}}{S_0(1-\mathrm{Slope})} \]

denklemiyle hesapladığını belirtmektedir.

Burada Slope, faz çözünürlük doğrusunun eğimini; S₀, kompleks oluşturucu bulunmadığında 5-FU'nun başlangıç çözünürlüğünü; K_s ise görünür stabilite sabitini temsil eder.

Kaynak şu sayısal ifadeyi vermektedir:

\[ K_s=\frac{0.1315}{1.1124(1-0.1315)}=136.2\ \mathrm{M^{-1}} \]

Kaynak tutarlılık notu: Denklemde basılı 0,1315 ve 1,1124 sayıları birim dönüşümü açıklanmadan doğrudan aritmetik olarak kullanıldığında sağ taraftaki 136,2 M⁻¹ değerine ulaşılmamaktadır. Kaynak S₀'ın bu hesapta hangi molar birime dönüştürüldüğünü görünür biçimde açıklamamaktadır. Bu nedenle Verianla 136,2 M⁻¹ değerini kaynakta raporlanan sonuç olarak korur; eksik birim/normalizasyon adımını tahmin ederek yeni bir hesap üretmez.

Kaynak 136,2 M⁻¹ değerini 5-FU ile β-CD arasında görece zayıf kompleksleşme afinitesi olarak yorumlamaktadır.

pH 5,5'te Daha Hızlı 5-FU Salımı Ne Anlama Gelir?

pH 5,5'te daha hızlı salım, üçlü kitosan/β-siklodekstrin matrisinin asidik ortamda daha fazla 5-FU serbestleştirdiğini gösterir; bu çalışma açısından pH 5,5 kolon lümenini değil, asidik tümör mikroçevresi ile hücre içine alım sonrasındaki endozomal/lizozomal ortamı temsil eden in vitro koşuldur.

Salım deneyi nasıl yapıldı?

Üçlü formülasyondan 10 mg, yaklaşık 2,5 mg 5-FU eşdeğeri olacak şekilde 2 mL salım ortamında dağıtılmış ve 12–14 kDa moleküler ağırlık kesme sınırına sahip diyaliz torbasına yerleştirilmiştir.

Diyaliz torbası 37 °C'de 50 mL salım ortamına daldırılmış ve 100 rpm'de sürekli çalkalanmıştır. İki ortam karşılaştırılmıştır:

• pH 5,5 asetat tamponu,
• pH 7,4 fosfat tamponlu salin.

0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 24; 48 ve 72 saatlerde 1 mL örnek alınmış ve aynı miktarda taze ortam eklenmiştir. Salınan 5-FU UV–Vis spektrofotometresiyle 266 nm'de ölçülmüştür.

Kaynak, iki pH koşulu arasındaki farkın bütün ölçüm zamanlarında p < 0,001 olduğunu bildirmektedir.

Kitosan neden pH'ye duyarlıdır?

Kaynağın mekanizma yorumunda kitosanın amin grupları asidik ortamda daha fazla protonlanarak –NH₃⁺ biçimine geçer. Aynı işaretli pozitif yükler arasındaki elektrostatik itme polimer zincirlerini birbirinden uzaklaştırabilir; matrisin şişmesiyle 5-FU'nun dış ortama difüzyonu kolaylaşabilir.

Kaynak kitosanın pK_a değerini yaklaşık 6,5 olarak verir ve pH 7,4 koşulunda amin gruplarının yaklaşık %50–60'ının protonlanmış kaldığını belirtir. Ancak bu yüzde için ayrı bir deney veya hesaplama denklemi sunulmadığından Verianla bu oranı yeniden türetilmiş bir ölçüm değil, kaynak yazarlarının mekanizma açıklamasının parçası olarak aktarmaktadır.

pH 5,5 kolon içinin pH'sı mıdır?

Hayır. Kaynak bunu özellikle açıklamaktadır. pH 5,5 koşulu kolon lümenini temsil etmek üzere seçilmemiştir; asidik tümör mikroçevresi ve hücresel alımdan sonraki endozomal/lizozomal bölmelerle ilişkilendirilmiştir.

Bu ayrım önemlidir; sonuç “ilaç kolona ulaştığında pH 5,5 nedeniyle otomatik olarak salınacaktır” biçiminde yorumlanmamalıdır.

IC₅₀ Değerinin 42,5 µM'den 16,5 µM'ye Düşmesi Ne Anlama Gelir?

IC₅₀'nin 42,5 µM'den 16,5 µM'ye düşmesi, HCT-116 hücrelerinde ve bu çalışmanın 72 saatlik SRB deney koşullarında üçlü formülasyonun hücre canlılığını %50 düzeyine düşürmek için serbest 5-FU'dan daha düşük 5-FU eşdeğer konsantrasyonuna ihtiyaç duyduğunu gösterir; bu sonuç insan hastalarda daha düşük klinik doz veya daha yüksek tedavi başarısını doğrudan kanıtlamaz.

SRB testi neyi ölçer?

Sulforhodamine B (SRB) testi, sabitlenmiş hücrelerdeki hücresel protein miktarına bağlı boya sinyalini kullanarak hücre biyokütlesi/canlılığı için dolaylı bir ölçüm sağlar. Çalışmada 540 nm absorbansı ölçülmüştür.

Kaynak hücre canlılığını:

\[ \mathrm{Cell\ viability}(\%)= \frac{A_{\mathrm{sample}}-A_{\mathrm{blank}}} {A_{\mathrm{control}}-A_{\mathrm{blank}}}\times100 \]

şeklinde hesaplamıştır.

Burada:

• A_sample: tedavi uygulanan kuyunun absorbansı,
• A_control: tedavi uygulanmamış kontrol kuyusunun absorbansı,
• A_blank: hücre içermeyen ortamın arka plan absorbansıdır.

Blank sinyalinin çıkarılması cihaz/ortam arka planını azaltır; kalan tedavi sinyali kontrol grubuna oranlanarak yüzde canlılık elde edilir.

HCT-116 sitotoksisite sonuçları

42,5 / 16,5 ≈ 2,58 olduğundan kaynak bunu yaklaşık 2,6 kat artmış in vitro sitotoksik potansiyel olarak ifade etmektedir.

Bu oran klinik etkinlik oranı değildir. IC₅₀ yalnız belirli hücre hattı, süre, kültür koşulları ve ölçüm yöntemi altındaki hücresel yanıttır.

Sitotoksisite deneyindeki kaynak içi birim farkı

Yöntem bölümü hücrelerin 0,05–500 µg/mL eşdeğer 5-FU aralığında tedavi edildiğini belirtmektedir. Buna karşılık hücre mikroskopisi şeklinin açıklamasında 0,05 ve 500 µM yazılmış ve doz–yanıt sonuçları da µM cinsinden IC₅₀ raporlamıştır.

Kaynak bu µg/mL–µM farkını açıklamamaktadır. Bu nedenle Verianla bu iki birimi birbirine dönüştürerek hangisinin “doğru” olduğuna karar vermemiştir.

RT-qPCR neden yapıldı?

RT-qPCR ile hücrelerin tedavi sonrasında dört gen için mRNA ekspresyonu ölçülmüştür:

• P53: hücresel stres, DNA hasarı, hücre döngüsü ve apoptoz düzenlenmesinde merkezi rolü olan tümör baskılayıcı yolun bir bileşeni.
• Caspase-3: apoptotik hücre ölümünün yürütücü kaspazlarından biri.
• BCL2: anti-apoptotik hücre sağkalım proteini ailesinin bir üyesi.
• VEGF: anjiyogenezle ilişkili sinyal molekülü.

RT-qPCR burada mRNA ekspresyonunu ölçmektedir. P53 veya Caspase-3 mRNA'sındaki artış, tek başına ilgili proteinin miktarını, proteinin aktivasyon durumunu veya gerçek apoptotik hücre sayısını doğrudan ölçmez. Kaynak bu gen değişikliklerini apoptozla uyumlu moleküler işaretler olarak yorumlamaktadır.

2^−ΔΔCt yöntemi neyi hesaplar?

Çalışmada göreli gen ekspresyonu karşılaştırmalı Ct yöntemiyle hesaplanmıştır:

\[ \mathrm{Relative\ expression}=2^{-\Delta\Delta C_t} \]

Standart karşılaştırmalı Ct mantığında önce hedef genin Ct değeri GAPDH veya β-Actin gibi referans genlere göre normalize edilir:

\[ \Delta C_t=C_{t,\mathrm{hedef}}-C_{t,\mathrm{referans}} \]

Daha sonra tedavi grubunun normalize edilmiş değeri kontrol grubuyla karşılaştırılır:

\[ \Delta\Delta C_t= \Delta C_{t,\mathrm{tedavi}}-\Delta C_{t,\mathrm{kontrol}} \]

Son adımda \(2^{-\Delta\Delta C_t}\) ifadesi kontrol grubuna göre göreli ekspresyon değişimini verir. Sonucun 1'in üzerinde olması göreli artış, 1'in altında olması göreli azalma anlamına gelir.

RT-qPCR grupları aynı 5-FU dozunu mu aldı?

Hayır. Kaynak her formülasyonu kendi IC₅₀ eşdeğer konsantrasyonunda uygulamıştır:

• serbest 5-FU: 42,5 µM,
• 5-FU/β-CD: 27,5 µM,
• 5-FU/Chs/β-CD: 16,5 µM.

Bu deney tasarımı her formülasyonun yaklaşık eşdeğer sitotoksik düzeyindeki moleküler yanıtını karşılaştırır. Fakat grupların 5-FU molar konsantrasyonu aynı değildir. Bu nedenle gen ekspresyonundaki farklar yalnız “taşıyıcı etkisi” olarak yorumlanamaz; formülasyon ve kullanılan IC₅₀ eşdeğer konsantrasyon birlikte değişmektedir.

Kaynak Caspase-3 ve P53 için üçlü formülasyonun serbest 5-FU ve ikili kompleks üzerindeki artışını; BCL2 ve VEGF için ise daha güçlü azalmayı istatistiksel olarak anlamlı farklılıklarla ilişkilendirmektedir (p < 0,05).

In Silico PPI Ağı Nanotaşıyıcının Mekanizmasını Doğrudan Kanıtlıyor mu?

Hayır. Çalışmanın in silico PPI analizi GSE183977 veri setindeki HT29 hücrelerinin serbest 5-FU'ya transkripsiyonel yanıtını inceler; kitosan, β-siklodekstrin veya üçlü nanotaşıyıcı için transkriptom verisi kullanılmadığından ağ analizi nanotaşıyıcıya özgü mekanizmanın doğrudan kanıtı değildir.

In silico veri seti laboratuvar deneyinden nasıl farklıdır?

Bu farklar nedeniyle iki veri bölümü birbirini tamamlayıcı biçimde yorumlanabilir ancak birbirlerinin doğrudan replikasyonu değildir.

Diferansiyel gen ekspresyonu nasıl belirlendi?

GEO2R ile kontrol ve 5-FU uygulanmış HT29 örnekleri karşılaştırılmıştır. Kaynak anlamlı diferansiyel ekspresyon için:

\[ |\log_2(\mathrm{Fold\ Change})| > 1.5 \]

ve:

\[ p_{\mathrm{adj}} < 0.05 \]

eşiklerini kullanmıştır.

log₂ fold-change, gen ekspresyonundaki değişimi iki tabanındaki logaritmik ölçekte ifade eder. Pozitif değer artışı, negatif değer azalmayı gösterir. Ayarlanmış p değeri ise çok sayıda gen aynı anda test edilirken yanlış pozitif sonuçların kontrol edilmesi amacıyla kullanılan düzeltilmiş istatistiksel anlamlılık ölçütüdür.

Kaynak toplam 33 yukarı düzenlenmiş ve 217 aşağı düzenlenmiş gen, yani 250 diferansiyel gen belirlemiştir.

PPI ağı nasıl kuruldu?

250 diferansiyel gen STRING veri tabanına aktarılmış ve etkileşim güven skoru >0,4 olan protein–protein etkileşimleri kullanılmıştır.

Sonuçta:

• 112 düğüm,
• 170 kenar,
• PPI enrichment p < 1,0 × 10⁻¹⁶

içeren bir ağ elde edilmiştir. Düğüm bir protein/gen ürününü, kenar ise STRING tarafından tanımlanan protein–protein ilişki bilgisini temsil eder.

PPI zenginleştirme p değerinin çok küçük olması, bu proteinlerin ağda rastgele seçilmiş aynı büyüklükteki bir gen grubundan beklenenden daha fazla bağlantılı olduğunu gösterir. Bu değer tek tek her etkileşimin biyolojik nedenselliğinin kanıtı değildir.

Hub gen nasıl belirlendi?

PPI ağı Cytoscape'e aktarılmış ve CytoHubba eklentisinin degree ölçütü kullanılmıştır. Degree, bir düğümün doğrudan bağlı olduğu ağ bağlantılarının sayısıdır.

IL6'nın degree skoru 30 ile en yüksek bulunmuştur. Bunun anlamı IL6'nın kullanılan PPI ağında en fazla bağlantıya sahip merkez düğüm olmasıdır; bu, IL6'nın nanotaşıyıcının deneysel olarak kanıtlanmış hedefi olduğu anlamına gelmez.

Fonksiyonel zenginleştirme ne gösterdi?

Kaynakta en güçlü zenginleşmiş biyolojik süreç sitokin aracılı sinyal yolu olarak verilmiştir:

\[ FDR=8.77\times10^{-5} \]

Bu terim EGR1, IFNL2, IL19, CXCL1, IL6, IFNL3 ve MYC olmak üzere yedi hub geni içermiştir.

Hücresel organik madde yanıtı, kimyasal madde yanıtı, hücre ölümünün pozitif düzenlenmesi, apoptotik sürecin pozitif düzenlenmesi, MAPK kaskadının düzenlenmesi, bağışıklık yanıtı ve JAK–STAT reseptör sinyal yolu gibi süreçler de zenginleşmiştir.

FDR, çoklu hipotez testlerinde beklenen yanlış keşif oranını kontrol eden düzeltilmiş istatistiksel ölçüttür. Daha küçük FDR, gözlenen gen listesinin ilgili fonksiyonel terimle ilişkisinin rastlantısal açıklamasına karşı daha güçlü istatistiksel destek sağlar.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Materyaller

5-FU en az %99 HPLC saflığında, β-CD en az %98 saflığında kullanılmıştır. β-CD'nin molekül ağırlığı kaynakta 1135 g/mol olarak verilmiştir. Kitosan orta molekül ağırlıklı, 190–310 kDa; deasetilasyon derecesi %75–85; viskozitesi 200–800 cP olarak belirtilmiştir.

HCT-116 insan kolorektal kanser hücre hattı Nawah Scientific Inc.'den temin edilmiştir. Hücre kültüründe RPMI-1640, fetal bovine serum, penisilin–streptomisin ve tripsin-EDTA kullanılmıştır.

5-FU/β-CD fiziksel karışımı

Kontrol amaçlı fiziksel karışım, inklüzyon kompleksindekiyle aynı 1:50 ağırlık oranında 5-FU ve β-CD kullanılarak hazırlanmış ve bileşenler kompleks oluşumunu zorlamadan homojen karışım sağlamak için havanda 10 dakika hafifçe öğütülmüştür.

5-FU/β-CD inklüzyon kompleksinin hazırlanması

0,04 g 5-FU 30 mL DMF içinde çözülmüş, 2 g β-CD kademeli olarak eklenmiş ve süspansiyon 80 °C'de sürekli manyetik karıştırma altında sekiz saat tutulmuştur.

Çözelti steril Petri kaplarına aktarılmış ve oda sıcaklığında yedi gün kurutulmuştur. Kuruyan katı kazınmış, hafifçe öğütülmüş ve oda sıcaklığında hava geçirmez kaplarda saklanmıştır.

Chs/β-CD psödopolirotaksanının hazırlanması

1,1 g β-CD 50 mL damıtılmış suda 50 °C'de 600 rpm karıştırmayla çözülmüş ve oda sıcaklığına soğutulmuştur.

Ayrı olarak 0,25 g kitosan 50 mL %1 v/v sulu asetik asit içinde çözülmüş ve 12 saat karıştırılmıştır. Kitosan çözeltisi oda sıcaklığındaki β-CD çözeltisine 1 mL/dk hızla eklenmiştir.

Karışım 24 saat daha 600 rpm'de karıştırılmıştır. Oluşan süt beyazı çökelti 12.000 × g'de 20 dakika santrifüjlenmiş, üç kez damıtılmış su ve bir kez 0,1 M amonyum hidroksit ile yıkanmış, 48 saat liyofilize edilmiş ve desikatörde saklanmıştır.

DLS ölçüm koşulları

Üçlü formülasyon 1 mg/mL derişimde deiyonize suda dağıtılmış, 10 dakika sonike edilmiş ve Zetasizer Nano ZS cihazında 25 °C'de, 173° saçılma açısında üçlü tekrar olarak ölçülmüştür.

FTIR koşulları

FTIR ölçümleri Jasco Model 4100 spektrometreyle 4000–400 cm⁻¹ dalga sayısı aralığında ve 4 cm⁻¹ çözünürlükte yapılmıştır. Numuneler KBr pelletleri olarak hazırlanmıştır.

XRD koşulları

Bruker D8 Advance difraktometre, Cu Kα ışınımı ve λ=1,5406 Å kullanılmıştır. Cihaz 40 kV ve 40 mA'de çalıştırılmış; tarama 2θ=5–80° aralığında, 0,02° adım ve 2°/dk tarama hızıyla gerçekleştirilmiştir.

SEM koşulları

Zeiss Sigma 500 VP FESEM kullanılmıştır. Numuneler 0,1 mg/mL olacak biçimde deiyonize suda dağıtılmış, alüminyum stub üzerine damlatılmış, vakum altında kurutulmuş ve iletkenliği artırmak için ince altın tabakasıyla kaplanmıştır. Görüntüler 5 kV hızlandırma geriliminde 10.000× ve 50.000× büyütmede alınmıştır.

İlaç yükleme içeriği ve enkapsülasyon verimliliği

Kaynak iki temel formülü kullanmıştır:

\[ DLC(\%)= \frac{\text{Formülasyondaki ilaç ağırlığı}} {\text{Formülasyon ağırlığı}}\times100 \]

DLC (drug loading content), elde edilen formülasyonun toplam kütlesinin yüzde kaçının ilaç olduğunu ifade eder.

\[ EE(\%)= \frac{\text{Formülasyondaki ilaç ağırlığı}} {\text{Başlangıçta eklenen ilaç ağırlığı}}\times100 \]

EE (encapsulation efficiency), başlangıçta kullanılan ilacın hangi oranının nihai taşıyıcı sistem içinde tutulduğunu ifade etmek üzere kullanılan metriktir.

Kaynak ortalama:

• DLC = %18,6 ± 1,2,
• EE = %74,3 ± 3,5

raporlamıştır.

Tablo 5'in EE hesabındaki kaynak içi belirsizlik

Kaynak Tablo 5'te ortalama formülasyon ağırlığını 5,12 mg, “Drug Added” değerini 500 mg ve bu 5,12 mg örnekte ölçülen ilacı 0,95 mg olarak vermektedir.

DLC açısından:

\[ \frac{0.95}{5.12}\times100\approx18.6\% \]

olduğu için basılı DLC değeri tabloyla aritmetik olarak uyumludur.

Buna karşılık 0,95 mg ölçülen ilaç ve tabloda basılı 500 mg başlangıç ilacı aynı formülde doğrudan kullanılırsa kaynakta verilen %74,3 EE elde edilmez. Buradaki olası örnek-ölçeği/batch-ölçeği normalizasyon adımı veya sütun tanımı makalede açıklanmamaktadır.

Bu nedenle %74,3 kaynak sonucu aynen korunmuştur; fakat tablo değerlerinden bağımsız biçimde yeniden doğrulanmış bir EE hesabı gibi sunulmamıştır.

Faz çözünürlüğü yöntemindeki konsantrasyon farkı

Materyal ve yöntem bölümü Chs/β-CD psödopolirotaksanı için 0–10 mg/mL aralığını belirtmektedir. Sonuç bölümü ise en yüksek test düzeyini 20 mg/mL Chs/β-CD olarak tanımlamakta ve burada 5-FU çözünürlüğünü 6,84 ± 0,20 mg/mL olarak vermektedir.

Kaynak bu iki konsantrasyon aralığı arasındaki farkı açıklamamıştır. Verianla sonuçları 20 mg/mL'den 10 mg/mL'ye düşürmemiş veya yöntem bölümünü 20 mg/mL olarak sessizce değiştirmemiştir.

Çözünürlük sonuçları

Tablo başlığı bu verileri “eşdeğer β-CD konsantrasyonlarında” karşılaştırma olarak sunmaktadır. Bununla birlikte metinde 20 mg/mL Chs/β-CD sisteminin yaklaşık 4,4 mM β-CD içeriğine karşılık geldiği yönünde ayrı bir ifade bulunduğundan, konsantrasyon eksenlerinin nasıl eşleştirildiği kaynakta bütünüyle açık değildir. Bu nedenle tablo kaynak değerleriyle aynen korunmuş, yeni bir konsantrasyon dönüşümü oluşturulmamıştır.

İstatistiksel analiz

Deneysel sonuçlar üçlü tekrar olarak gerçekleştirilmiş ve ortalama ± standart sapma biçiminde ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz GraphPad Prism kullanılarak yapılmıştır.

Gruplar arasındaki farklar için tek yönlü varyans analizi (one-way ANOVA), ardından Tukey post hoc testi uygulanmıştır. İstatistiksel anlamlılık sınırı:

\[ p<0.05 \]

olarak belirlenmiştir.

ANOVA, birden fazla grubun ortalamaları arasında genel bir fark olup olmadığını test eder. Tukey post hoc testi ise ANOVA sonrasında hangi grup çiftlerinin birbirinden farklı olduğunu değerlendirmek için kullanılır.

In silico analiz adımları

1. NCBI Gene Expression Omnibus içinde 5-FU ve kolorektal kanserle ilişkili veri setleri aranmıştır.
2. GSE183977 içinden iki kontrol ve iki 100 µM 5-FU uygulanmış HT29 örneği seçilmiştir.
3. GEO2R ile diferansiyel ekspresyon analizi yapılmıştır.
4. |log₂FC| >1,5 ve adjusted p<0,05 eşikleri uygulanmıştır.
5. 250 diferansiyel gen STRING'e aktarılmıştır.
6. STRING etkileşimlerinde confidence score >0,4 kullanılmıştır.
7. Ağ Cytoscape'e aktarılmıştır.
8. CytoHubba degree yöntemiyle ilk 10 hub gen seçilmiştir.
9. ShinyGO ile fonksiyonel zenginleştirme yapılmıştır.

Çalışmanın doğrudan desteklediği sonuçlar

• 5-FU, β-CD ve kitosan fiziksel yöntemlerle üçlü bir katı formülasyonda birleştirilebilmiştir.
• Üçlü formülasyon DLS'de 187,3 ± 12,6 nm ortalama hidrodinamik çap ve +32,5 ± 4,2 mV zeta potansiyeli göstermiştir.
• XRD ve FTIR verileri 5-FU'nun kristal düzeninde azalma ve bileşenler arası kovalent olmayan etkileşimlerle uyumlu değişimler göstermiştir.
• 5-FU salımı pH 5,5 koşulunda pH 7,4'e göre daha hızlı gerçekleşmiştir.
• HCT-116 hücrelerinde üçlü formülasyon serbest 5-FU'ya göre daha düşük IC₅₀ göstermiştir.
• Üçlü formülasyonun kendi IC₅₀ eşdeğer konsantrasyonundaki RT-qPCR deneyinde P53 ve Caspase-3 ekspresyonu daha yüksek, BCL2 ve VEGF ekspresyonu daha düşük raporlanmıştır.
• Serbest 5-FU'nun bağımsız HT29 transkriptom verisinde IL6, MYC, EGR1, BMP4 ve ATF3 dahil merkezi ağ düğümleri belirlenmiştir.

Çalışmanın doğrudan desteklemediği sonuçlar

• Nanotaşıyıcının insan hastalarda daha etkili olduğu gösterilmemiştir.
• Nanotaşıyıcının insanlarda 5-FU toksisitesini azalttığı gösterilmemiştir.
• 187 nm parçacık boyutunun gerçek insan tümörüne seçici biçimde ulaştığı gösterilmemiştir.
• EPR etkisine uygun boyut aralığında olmak gerçek in vivo tümör hedeflenmesinin kanıtı değildir.
• Farmakokinetik, biyodağılım veya tümör içi ilaç konsantrasyonu ölçülmemiştir.
• Hayvan modeli kullanılmamıştır.
• Klinik örnek veya hasta kullanılmamıştır.
• 14 günlük 4 °C kolloidal ölçüm uzun dönem raf ömrü kanıtı değildir.
• RT-qPCR sonuçları protein seviyesini veya protein aktivitesini doğrudan ölçmemektedir.
• In silico IL6, MYC, EGR1 ve ATF3 sonuçları kitosan/β-CD taşıyıcısına özgü doğrudan mekanistik kanıt değildir.

Çalışmanın başlıca yöntemsel sınırlılıkları

En önemli sınırlılık in vitro ve in silico deneylerin farklı hücre hatlarını, farklı tedavi sürelerini ve farklı 5-FU koşullarını kullanmasıdır. HCT-116 hücreleri 72 saat formülasyonlarla test edilirken GSE183977 analizi HT29 hücrelerinde 100 µM serbest 5-FU'nun yalnız iki saatlik yanıtına dayanmaktadır.

Kaynak bu nedenle in silico analizi nanotaşıyıcı mekanizmasının doğrudan kanıtı olarak değil, 5-FU farmakolojisine korelatif sistem düzeyi bağlam olarak tanımlamaktadır.

İkinci önemli sınır, gen ekspresyonu gruplarının aynı 5-FU dozunda karşılaştırılmamasıdır. Her formülasyon kendi IC₅₀ konsantrasyonunda uygulanmıştır. Bu nedenle taşıyıcı yapısının etkisi ile farklı 5-FU konsantrasyonlarının etkisi bu deney tasarımında tamamen ayrıştırılmış değildir.

Üçüncü sınır, sonuçların yalnız hücre kültürü ve hesaplamalı ağ analizine dayanmasıdır. Kaynak sonuç bölümünde in vivo farmakokinetik ve etkinlik çalışmaları, uzun dönem stabilite deneyleri ve önerilen moleküler yolların hedefli gen susturma veya inhibisyon deneyleriyle doğrulanmasını gelecek çalışmalar arasında göstermektedir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma: Chitosan/β-cyclodextrin nanocarriers enhance 5-fluorouracil efficacy against colorectal cancer via pH-responsive release and apoptosis modulation

Yazarlar: Amr M. A. Mohamed; Hemat M. Dardeer; Ali M. A. Ahmed; M. Yasser Alsedfy; Amr E. Abd Elhadi; Abdelmoniem M. A. Elsanosy; Abdelhakam Esmaeil Mohamed Ahmed; Alaa Hassan Said.

Sorumlu yazar: Alaa Hassan Said.

Sorumlu yazar e-postası: alaa.elkareem@sci.svu.edu.eg

Kurum 1: Department of Zoology, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Kurum 2: Department of Chemistry, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Kurum 3: Molecular Biotechnology Program, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Kurum 4: Electronics and Nano Devices Lab, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Kurum 5: Radiology Department, Applied Health Sciences Faculty, Sphinx University, New Assiut, Egypt.

Kurum 6: Faculty of Agriculture, Food Sciences and Environmental Management, Institute of Food Science, University of Debrecen, Debrecen, Hungary.

Kurum 7: Faculty of Forestry, University of Khartoum, Khartoum North, Sudan.

Dergi: Scientific Reports.

Yayınevi/platform: Nature Portfolio / Springer Nature.

Cilt: 16.

Makale numarası: 20981.

ISSN: 2045-2322.

DOI: 10.1038/s41598-026-60468-z.

Makale alındı: 12 Mayıs 2026.

Kabul tarihi: 29 Haziran 2026.

Yayın tarihi: 7 Temmuz 2026.

Kaynak türü: Deneysel in vitro ilaç taşıma/nanomalzeme çalışması ile tamamlayıcı in silico ağ farmakolojisi ve fonksiyonel zenginleştirme analizini birleştiren özgün araştırma makalesi.

Hakemlik: Scientific Reports'ta yayımlanmış hakemli dergi makalesidir.

Lisans: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Etik onay: Qena University Faculty of Science Ethics Committee, Permit Number 005/07/25. Kaynak insan veya hayvan deneği kullanılmadığını belirtmektedir.

Veri erişilebilirliği: Çalışmayı destekleyen verilerin makale içinde bulunduğu; ek verilerin sorumlu yazardan talep edilebileceği belirtilmiştir.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmiştir.

Finansman: Kaynak, açık erişim finansmanının Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) ile Egyptian Knowledge Bank (EKB) işbirliğinde sağlandığını belirtmekte ve aynı bölümde “No funding” ifadesini kullanmaktadır. Bu nedenle açık erişim yayın maliyeti desteği ile araştırma projesi finansmanı birbirine karıştırılmamalıdır.

Teşekkür: Yazarlar Qena University Faculty of Science bünyesindeki Genetic & Molecular Biology ve Organic Chemistry laboratuvarlarına işbirliği ve destek için teşekkür etmektedir.

Yazar katkıları: Amr M. A. Mohamed: kavramsallaştırma, yöntem, formal analiz ve ilk taslak. Hemat M. Dardeer: kavramsallaştırma ve yöntem. Ali M. A. Ahmed: yöntem, formal analiz ve ilk taslak. M. Yasser Alsedfy: yazılım, formal analiz ve ilk taslak. Amr E. Abd Elhadi: yöntem. Abdelmoniem M. A. Elsanosy: yöntem. Abdelhakam Esmaeil Mohamed Ahmed: gözden geçirme ve düzenleme. Alaa Hassan Said: formal analiz, görselleştirme, ilk taslak, gözden geçirme ve düzenleme. Bütün yazarların nihai metni okuyup onayladığı belirtilmektedir.

Eşit katkı: Kaynakta eşit katkı veya eş birinci yazarlık beyanı bulunmamaktadır.

Kaynak içi tutarlılık notu 1: Faz çözünürlüğü yönteminde Chs/β-CD için 0–10 mg/mL yazılırken sonuç bölümünde 20 mg/mL koşulu raporlanmıştır.

Kaynak içi tutarlılık notu 2: Faz çözünürlük sabiti denkleminde basılı sayısal yerleştirme ile raporlanan 136,2 M⁻¹ sonucu arasındaki birim/normalizasyon adımı görünür biçimde açıklanmamaktadır.

Kaynak içi tutarlılık notu 3: Tablo 5'te 0,95 mg ölçülen ilaç, 500 mg “Drug Added” ve %74,3 EE birlikte verilmiştir; tabloda görünen iki kütle doğrudan EE formülünde kullanıldığında basılı EE sonucu elde edilmediği için örnek-batch normalizasyonu açık değildir.

Kaynak içi tutarlılık notu 4: Sitotoksisite yönteminde konsantrasyon aralığı µg/mL olarak yazılırken hücre mikroskopisi şekil açıklamasında µM birimi kullanılmıştır.

Kaynak içi tutarlılık notu 5: İkili 5-FU/β-CD kompleksinin IC₅₀ değeri özette 27,5 µM, sonuç metninde 27,75 µM olarak verilmektedir. Bu fark kaynak içinde korunmuştur.

Temel yorum sınırı: Bu çalışma klinik çalışma değildir. HCT-116 sonuçları hücre kültürü düzeyindedir. Nanotaşıyıcının insanlarda tümör hedeflemesi, farmakokinetiği, güvenliği, doz azaltıcı etkisi veya tedavi başarısı gösterilmemiştir.

In silico yorum sınırı: GSE183977 analizi HT29 hücrelerinde serbest 5-FU'ya ait 2 saatlik transkripsiyonel yanıtı kullanır. Kitosan, β-CD veya üçlü formülasyona özgü transkriptom verisi bulunmadığından hub gen ağı nanotaşıyıcıya özgü doğrudan moleküler kanıt değildir.