Cuscutae Semen (CS) ni nyenzo ya mbegu zilizokaushwa iliyotumika katika utafiti huu kulinganisha kiwango ambacho maji na ethanoli zinaweza kutoa viambajengo tofauti vya kemikali kutoka katika malighafi ileile ya mmea na jinsi tofauti hiyo inavyojitokeza katika vipimo vya antioxidant na vya uchochezi katika seli. Watafiti walitayarisha dondoo ya maji (CSW; Cuscutae Semen water extract) na dondoo ya ethanoli (CSE; Cuscutae Semen ethanol extract) kutoka katika nyenzo hiyo hiyo; kisha wakafanya vipimo vya polifenoli jumla, flavonoidi jumla, DPPH, ABTS na FRAP. Baadaye walichunguza uwezo wa seli kuendelea kuishi, oksidi nitriki (NO), spishi tendaji za oksijeni (ROS), viwango vya TNF-α na IL-6, pamoja na usemi wa mRNA wa TLR4, MyD88, NF-κB, TNF-α, IL-6, iNOS na COX-2 katika seli za makrofaji za panya RAW 264.7 zilizoanzishiwa mwitikio wa uchochezi kwa LPS.

Uchimbaji kwa maji ulitoa matokeo ya juu zaidi kwa mavuno ya jumla ya dondoo kavu: mavuno ya uchimbaji yalikuwa %12.98 kwa CSW na %4.45 kwa CSE. Kwa upande mwingine, dondoo ya ethanoli ilikuwa na nguvu zaidi kuliko dondoo ya maji katika kiwango cha flavonoidi jumla na uwezo wa upunguzaji wa FRAP. Kiasi cha flavonoidi jumla kiliripotiwa kuwa 375.08 mg RE/g katika CSE na 158.31 mg RE/g katika CSW. Viwango vya kuondoa radikali za DPPH kwa CSW na CSE vilikuwa %84.66 na %87.52 mtawalia; viwango vya kuondoa radikali za ABTS vilikuwa %99.41 na %98.69 mtawalia. Shughuli ya FRAP katika CSE ilikuwa takribani mara 2.8 ya CSW. Utafiti uliripoti uwiano chanya wa r=0.991 kati ya FRAP na polifenoli jumla, na r=0.994 kati ya FRAP na flavonoidi jumla (P<0.01).

Katika modeli ya seli RAW 264.7, watafiti hawakuona sumu dhahiri kwa seli katika viwango vilivyochunguzwa baada ya matumizi ya 50, 100 na 200 µg/mL CSW au CSE. Uzalishaji wa NO na ROS ulioongezwa na LPS ulipunguzwa na dondoo zote mbili kwa kutegemea mkusanyiko; hasa, matokeo ya ROS katika CSE ya 200 µg/mL yalikuwa katika kundi lilelile la kitakwimu na kundi la udhibiti lisilopewa LPS. Utolewaji wa TNF-α ulipungua kwa dondoo zote mbili ikilinganishwa na kundi la LPS, na utolewaji wa IL-6 ulipungua kwa kiasi kikubwa katika matumizi ya CSE ikilinganishwa na kundi la LPS.

Matokeo ya RT-qPCR yanaonyesha mpaka muhimu wa kimkanika. Dondoo zilipunguza usemi wa mRNA wa iNOS, COX-2, TNF-α na IL-6 unaohusiana na uchochezi katika mkondo wa chini ambao ulikuwa umeongezwa na LPS; kinyume chake, hakuna mabadiliko makubwa yaliyoripotiwa katika viwango vya mRNA vya TLR4, MyD88 na NF-κB. Kwa hiyo, utafiti hauungi mkono hitimisho kwamba “usemi wa jeni la NF-κB ulikandamizwa moja kwa moja”. Zaidi ya hayo, kiwango cha protini cha NF-κB, fosforilesheni yake, uhamishaji wake kwenda kwenye kiini au shughuli yake ya kufungamana na DNA havikupimwa moja kwa moja katika utafiti huu.

Matokeo haya ni matokeo ya maabara ya in vitro. RAW 264.7 ni mstari wa seli za makrofaji za panya; utafiti haukuchunguza ufyonzwaji, umetaboli, upatikanaji wa kibayolojia, dozi salama, matibabu ya ugonjwa au ufanisi wa kliniki kwa binadamu. Kwa hiyo, haiwezi kuhitimishwa kutokana na utafiti huu kwamba dondoo za Cuscutae Semen hutoa matibabu ya kupunguza uchochezi kwa binadamu au kuzuia ugonjwa fulani.

Swali kuu la utafiti ni lipi?

Katika uchimbaji wa mimea, “ni mmea gani umetumika” ni muhimu sawa na “ni kiyeyusho gani kimetumika”. Si viambajengo vyote katika malighafi vina polariti na umumunyifu sawa. Kwa hiyo, kiasi cha jumla cha dutu kinachotolewa kwa maji kinaweza kutofautiana na kiasi cha jumla kinachotolewa kwa ethanoli; vilevile, muundo wa kemikali wa dondoo hizo mbili na tabia yake katika majaribio ya kibayolojia vinaweza kutofautiana.

Tatizo kuu la utafiti huu ni kulinganisha jinsi uchimbaji kwa maji na ethanoli wa Cuscutae Semen unavyobadilisha si tu kiasi cha jumla cha dondoo, bali pia maudhui ya polifenoli/flavonoidi, uwezo wa kemikali wa antioxidant na miitikio inayohusiana na uchochezi katika makrofaji zilizochochewa kwa LPS.

Cuscutae Semen ni nini?

Utafiti chanzo unatambulisha nyenzo hiyo kwa jina Cuscutae Semen (CS) na kuieleza kuwa nyenzo ya mbegu zilizokomaa na kukaushwa za mmea wa kila mwaka wa vimelea unaotokana na familia ya Convolvulaceae. Ingawa sehemu ya utangulizi ya chanzo inarejelea jenasi Cuscuta na tafiti za awali kuhusu Cuscuta chinensis, sehemu ya mbinu haitoi utambuzi huru wa spishi, nambari ya voucher specimen au uthibitisho wa DNA barcode kwa nyenzo ya CS iliyonunuliwa na kutumika katika jaribio hili. Kwa hiyo, maandishi ya Verianla yanahifadhi jina la nyenzo ya jaribio kama lilivyotumika katika chanzo, “Cuscutae Semen”, na hayafanyi utambulisho wa kitaksonomia usiothibitishwa katika kiwango cha spishi kuwa wa uhakika.

Kwa nini msongo wa oksidishaji na uchochezi vilizingatiwa pamoja?

Katika mfumo wa kinadharia wa chanzo, msongo wa oksidishaji hufafanuliwa kama kuvurugika kwa uwiano kati ya uzalishaji wa spishi tendaji za oksijeni na radikali huru na mfumo wa ulinzi wa antioxidant. Makrofaji zinapoamilishwa na vichochezi vya uchochezi kama LPS, ROS, oksidi nitriki na njia mbalimbali za uashiriaji zinazohusiana na uchochezi zinaweza kuhusishwa. Kwa hiyo, watafiti kwanza walitathmini sifa za kemikali za antioxidant za dondoo, na kisha miitikio ya ROS, NO, saitokini na mRNA ya dondoo hizo hizo katika modeli ya uchochezi wa seli.

Kwa Nini Mavuno ya Juu Zaidi ya Uchimbaji Hayamaanishi Maudhui Yenye Nguvu Zaidi ya Antioxidant?

Mavuno ya uchimbaji yanaonyesha kiasi cha jumla cha dutu kavu kinachohama kutoka kwenye nyenzo ya kuanzia kwenda kwenye kiyeyusho; vipimo kama polifenoli, flavonoidi au FRAP vinaonyesha sifa fulani za kemikali za dutu hiyo kavu ya jumla. Katika utafiti huu, ingawa mavuno ya dutu kavu ya uchimbaji kwa maji ya %12.98 yalikuwa juu kwa kiasi kikubwa kuliko mavuno ya ethanoli ya %4.45, dondoo ya ethanoli ilikuwa na nguvu zaidi kwa maudhui ya flavonoidi na uwezo wa FRAP. Hali hii inaonyesha kuwa dhana ya “dondoo nyingi zaidi kwa jumla” si sawa na “kiambajengo lengwa cha antioxidant kingi zaidi”.

Waandishi wa chanzo wanahusisha tofauti hii na polariti ya kiyeyusho. Maji ni kiyeyusho chenye polariti ya juu; ethanoli ina polariti ya chini kuliko maji na pia ina uwezo tofauti wa kuingiliana na miundo ya hidrofili/hidrofobi. Kwa hiyo, hata kama viyeyusho viwili vinatumia mbegu ileile, si lazima vitoe dondoo yenye muundo sawa wa molekuli.

Utayarishaji wa sampuli

Malighafi ya Cuscutae Semen iliyotumika katika utafiti ilipatikana kibiashara kutoka kwenye nyenzo iliyokusanywa katika eneo la Chungju, Chungcheongbuk-do mnamo Agosti 2024. Sampuli zilioshwa mara tatu kwa maji yaliyodistiliwa, zikakaushwa kwa hewa ya moto katika 37°C kwa 24 saa na kusagwa.

Kwa kila uchimbaji, 20 g ya nyenzo ya unga iliunganishwa na 180 mL ya kiyeyusho. Maji yaliyodistiliwa yalitumiwa kwa kundi la maji na ethanoli kwa kundi la ethanoli; zote mbili zilichimbwa katika chupa ya koni kwa kuchanganywa katika halijoto ya chumba kwa 24 saa. Kisha yabisi yaliondolewa kwa karatasi ya kichujio ya Whatman No.2, mkusanyiko ulifanywa kwa rotary evaporator na dondoo zikakaushwa kwa kugandisha.

Polifenoli jumla ilipimwaje?

Uchambuzi wa polifenoli jumla ulifanywa kwa kutumia kitendanishi cha Folin-Ciocalteu. 160 µL ya dondoo iliyopunguzwa ilichanganywa na 160 µL ya kitendanishi cha Folin-Ciocalteu na kuachwa kuitikia kwa dakika tatu katika halijoto ya chumba. Kisha 160 µL ya suluhisho la %10 sodium carbonate iliongezwa na mchanganyiko ukaachwa gizani kwa saa moja. Absorbansi ilipimwa katika kisomaji cha microplate cha Versamax katika 700 nm.

Sehemu ya mbinu inaeleza wazi kuwa mkunjo sanifu wa gallic acid ulitumika na matokeo yakahesabiwa kama mg gallic acid equivalents per gram, yaani mg GAE/g. Kipimo hiki hakimaanishi kwamba dondoo ina kiasi hicho hicho cha gallic acid; kinaonyesha thamani sawia ya mwitikio wa jumla wa Folin-Ciocalteu wa sampuli dhidi ya kiwango sanifu cha gallic acid.

Flavonoidi jumla ilipimwaje?

Katika kipimo cha flavonoidi jumla, 16 µL ya %10 aluminum nitrate na 16 µL ya 1 M potassium acetate ziliongezwa kwa 40 µL ya sampuli iliyopunguzwa, na kisha 328 µL ya methanoli ikaongezwa. Baada ya mchanganyiko kuachwa kuitikia gizani kwa dakika 40, absorbansi ilipimwa katika 415 nm. Rutin ilitumika kama kiwango sanifu na matokeo yakaonyeshwa kama mg rutin equivalents per gram (mg RE/g).

Aya ya matokeo ya chanzo inaripoti thamani ya flavonoidi jumla ya 375.08 mg RE/g kwa CSE na 158.31 mg RE/g kwa CSW. Uwiano wa thamani hizi ni takribani 2.37 na unaendana na kauli ya waandishi ya “takribani mara 2.4”.

Kwa nini inahitajika dokezo maalumu kuhusu kipimo cha polifenoli jumla katika chanzo?

Kuna kutokulingana kwa uandishi/uripoti ndani ya chanzo. Katika sehemu ya nyenzo na mbinu, matokeo ya polifenoli jumla yanasemekana kuhesabiwa kama mg GAE/g kwa kutumia kiwango sanifu cha gallic acid, na mhimili y wa polifenoli jumla katika Mchoro 1 pia umeandikwa “mg GAE/g”. Hata hivyo, katika aya ya matokeo, wakati thamani ya 340.28 kwa CSE na 158.31 kwa CSW zinapotolewa, kipimo kinaandikwa “mg RE/g”. Aya hiyo hiyo inaeleza thamani hizi mbili kuwa takribani mara 2.4, ingawa uwiano wa 340.28/158.31 ni takribani 2.15. Verianla haisahihishi kimya kimya mkanganyiko huu; matokeo makuu kwamba kundi la ethanoli lina polifenoli jumla ya juu kwa kiasi kikubwa kuliko kundi la maji yanaweza kuhifadhiwa kwa uhakika, lakini mchanganyiko wenye utata wa kipimo/nambari haupaswi kuwasilishwa kama data mpya iliyothibitishwa.

Kipimo cha kuondoa radikali ya DPPH hupima nini?

DPPH ni kipimo cha kemikali cha antioxidant kinachotegemea badiliko la rangi/absorbansi wakati radikali huru thabiti inapopokea elektroni au hidrojeni kutoka kwenye sampuli. Katika utafiti, 100 µL ya sampuli iliyopunguzwa ilichanganywa na 100 µL ya suluhisho la 0.2 mM DPPH, na absorbansi ikapimwa katika 517 nm baada ya dakika 30 za mwitikio katika halijoto ya chumba.

Hesabu iliyotumika katika chanzo:

\(\text{DPPH süpürme (\%)} = \left(1-\frac{A_{\text{örnek}}}{A_{\text{kontrol}}}\right)\times100\)

Fomula huhesabu nini? Inaonyesha kwa asilimia kiasi ambacho absorbansi inayohusiana na radikali ya DPPH imepungua mbele ya sampuli ikilinganishwa na kundi la udhibiti.

Vigezo: \(A_{\text{örnek}}\), absorbansi ya mwitikio ulioongezewa sampuli; \(A_{\text{kontrol}}\), absorbansi ya mwitikio wa udhibiti.

Tabia ya kihisabati: \(A_{\text{örnek}}\) inapopungua, uwiano hupungua, \(1-\) huongezeka na asilimia iliyohesabiwa ya kuondoa radikali huongezeka.

Tafsiri: Katika hali zilezile za jaribio, asilimia kubwa ya kuondoa radikali humaanisha mwitikio wenye nguvu zaidi wa kuondoa radikali ya DPPH. Thamani hii si asilimia ya moja kwa moja ya athari ya antioxidant katika mwili wa binadamu.

Chanzo kiliripoti shughuli ya kuondoa DPPH ya %84.66 kwa CSW na %87.52 kwa CSE.

Kipimo cha ABTS kilifanywaje?

Katika kipimo cha ABTS, 500 µL ilichukuliwa kutoka kwa suluhisho za 70 mM ABTS na 24.5 mM potassium persulfate, 4 mL ya maji yaliyodistiliwa ikaongezwa, na mchanganyiko ukaachwa gizani kwa 12-16 saa ili radikali itengenezwe. Suluhisho la radikali ya ABTS lililoundwa lilipunguzwa kwa ethanoli ya %50 hadi absorbansi ya 734 nm iwe 0.70±0.05. Kisha 50 µL ya sampuli ilichanganywa na 100 µL ya suluhisho la ABTS na absorbansi ikapimwa katika 734 nm.

Chanzo kilitumia muundo huohuo wa jumla wa hesabu:

\(\text{ABTS süpürme (\%)} = \left(1-\frac{A_{\text{örnek}}}{A_{\text{kontrol}}}\right)\times100\)

Shughuli ya kuondoa radikali ya ABTS iliripotiwa kuwa %99.41 kwa CSW na %98.69 kwa CSE. Chanzo kinaeleza kuwa thamani hizi mbili zina shughuli ya juu iliyo karibu na udhibiti chanya wa ascorbic acid.

FRAP hupima nini?

Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) ni kipimo cha antioxidant kinachotegemea uhamishaji wa elektroni na hutathmini uwezo wa sampuli kupunguza chuma cha ferric kutoka umbo la Fe³⁺ hadi umbo la ferrous Fe²⁺. Katika chanzo, suluhisho za 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 10 mM TPTZ na 20 mM FeCl₃·6H₂O zilichanganywa kwa uwiano wa 10:1:1 na kuwekwa katika 37°C kwa dakika 30. 50 µL ya sampuli iliyopunguzwa na 150 µL ya kitendanishi cha FRAP zilitumika; baada ya mwitikio wa dakika 30 katika 37°C, absorbansi ilipimwa katika 593 nm.

Chanzo kinaripoti kuwa shughuli ya FRAP ya CSE ilikuwa takribani mara 2.8 ya CSW na kwamba CSE ilionyesha uwezo mkubwa wa upunguzaji katika kiwango kinachofanana na udhibiti chanya wa ascorbic acid. Ingawa mchoro una nguzo kamili za FRAP, kwa kuwa maandishi ya makala hayatoi thamani mahususi za FRAP za CSE na CSW kando, Verianla haifanyi thamani za kukadiria kutoka kwenye grafu kuwa za uhakika kwa usahihi wa bandia.

Ni uhusiano gani uliopatikana kati ya viambajengo vya antioxidant na FRAP?

Katika uchambuzi wa uwiano wa Pearson, ilipatikana r=0.991, P<0.01 kati ya shughuli ya FRAP na polifenoli jumla; na r=0.994, P<0.01 kati ya FRAP na flavonoidi jumla. Kuwa kwa thamani ya r karibu sana na +1 kunaonyesha kuwa vipimo katika kundi hili la majaribio vilibadilika pamoja kwa uwiano chanya wenye nguvu.

Hata hivyo, uwiano si usababishaji. Kuongezeka pamoja kwa vipimo vya polifenoli/flavonoidi na FRAP katika makundi mawili ya dondoo hakuthibitishi hitimisho kwamba “molekuli hii moja pekee ndiyo ilisababisha ongezeko la FRAP lililopimwa”. Dondoo ni mchanganyiko wa viambajengo vingi na utafiti haukutenganisha mchango huru wa kila kiambajengo.

Kwa Nini Modeli ya RAW 264.7 na LPS Ilitumika Katika Utafiti Huu?

RAW 264.7 ni mstari wa seli za makrofaji unaotokana na panya; LPS ni lipopolisakaridi inayopatikana katika utando wa nje wa bakteria Gram-hasi na inaweza kusababisha mwitikio mkubwa wa uchochezi katika makrofaji. Watafiti walitumia modeli hii kuchunguza athari za dondoo za Cuscutae Semen kwa NO, ROS, TNF-α, IL-6 na shabaha mbalimbali za mRNA zinazohusiana na uchochezi katika mazingira yaliyodhibitiwa ya utamaduni wa seli. Modeli ni muhimu kwa uchunguzi wa mekanizimu lakini haiwakilishi kikamilifu uchochezi wa kliniki kwa binadamu.

Hali za ukuzaji wa seli RAW 264.7

Seli RAW 264.7 zilipatikana kutoka Korean Cell Line Bank. Seli zilikuzwa katika Dulbecco's Modified Eagle's Medium yenye nyongeza ya %10 fetal bovine serum na %1 penicillin-streptomycin, katika hali ya %5 CO₂ na 37°C.

Kipimo cha MTT kilitathminije uwezo wa seli kuendelea kuishi?

Seli zilipandwa kwenye sahani zenye visima 96 kwa 5×10⁴ seli kwa kila kisima na kuachwa kwa 12-24 saa ili zishikamane. Katika kundi la uchochezi, 1 µg/mL LPS ilitumika kwa saa moja; kisha CSW au CSE iliongezwa katika viwango vya 50, 100 au 200 µg/mL kwa 24 saa. Baadaye 50 µL ya kitendanishi cha MTT iliongezwa katika kila kisima na mwitikio ukafanywa kwa saa nne katika 37°C, fuwele za formazan zilizoundwa zikayeyushwa kwa 200 µL DMSO na absorbansi ikasomwa katika 540 nm.

Hesabu ya uwezo wa seli kuendelea kuishi iliyotumika katika chanzo:

\(\text{Hücre canlılığı (\%)}=\frac{A_{\text{örnek grubu}}}{A_{\text{normal grup}}}\times100\)

Fomula hupima nini? Hueleza kwa asilimia ishara ya upunguzaji wa kimetaboliki wa MTT kwa kulinganisha absorbansi ya MTT ya kundi la sampuli na absorbansi ya kundi la kawaida lisilopewa LPS.

Kwa nini kundi la kawaida linakubaliwa kuwa %100? Ishara ya kundi la kawaida inayotumiwa kama kigawanyaji huchukuliwa kama rejea; kwa hiyo kundi la kawaida huwekwa kihisabati kwenye kiwango cha %100.

Mpaka wa tafsiri: Ishara ya MTT ni kiashiria cha uwezo wa seli kuendelea kuishi kinachotegemea uwezo wao wa upunguzaji wa kimetaboliki. Kutokuwepo kwa sumu dhahiri katika viwango vya 50-200 µg/mL katika utafiti huu kunatumika tu kwa mstari wa seli, muda wa mfiduo na hali za majaribio zilizochunguzwa.

Chanzo pia kinaeleza kuwa katika seli zisizopewa LPS, uwezo wa seli kuendelea kuishi ulisalia juu ya %98 baada ya matumizi ya CSW na CSE; kwa kuwa matokeo haya yaliripotiwa kama “data not shown”, grafu ghafi husika haikutolewa katika chanzo.

Oksidi nitriki ilipimwaje?

Ili kutathmini uzalishaji wa NO, seli zilipandwa kwa msongamano wa 5×10⁴ cells/well, zikachochewa kwa 1 µg/mL LPS kwa saa moja na kisha kutibiwa kwa 50, 100 au 200 µg/mL CSW/CSE kwa 24 saa. 100 µL ya kiowevu cha utamaduni ilichukuliwa na kuchanganywa na ujazo sawa, yaani 100 µL ya kitendanishi cha Griess; baada ya dakika 10 katika halijoto ya chumba gizani, absorbansi ilipimwa katika 550 nm. Kiasi cha Nitrite kilihesabiwa kutoka kwenye mkunjo sanifu wa sodium nitrite.

LPS iliongeza kwa kiasi kikubwa uzalishaji wa NO ikilinganishwa na kundi la udhibiti. Dondoo zote mbili zilipunguza uzalishaji wa NO kwa kutegemea mkusanyiko. Katika viwango vya 50 na 100 µg/mL, athari ya CSE ya kupunguza NO ilikuwa na nguvu zaidi kuliko CSW; katika 200 µg/mL, chanzo kinaeleza kuwa hakukuwa na tofauti kubwa kati ya dondoo za viyeyusho hivyo viwili.

ROS ilipimwaje?

Spishi tendaji za oksijeni ndani ya seli zilitathminiwa kwa mbinu ya 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA). Seli zilipandwa kwenye sahani yenye visima 12 kwa msongamano wa 5×10⁵ cells/well; 50, 100 au 200 µg/mL ya dondoo ilitumika pamoja na 1 µg/mL LPS na kuinkubishwa kwa 24 saa. Baada ya seli kuoshwa mara mbili kwa PBS, ziliwekwa na 10 µM DCF-DA katika 37°C gizani kwa dakika 30 kwa ajili ya mwitikio.

Picha zilichukuliwa katika darubini ya floresensi EVOS M5000 kwa ukuzaji wa 200×, na floresensi ikatathminiwa kwa kiasi katika kisomaji cha microplate Gemini EM kwenye urefu wa mawimbi wa msisimko 485 nm na utoaji 535 nm. Katika chanzo, Mchoro 4 floresensi ya kijani inawakilisha ishara ya ROS.

Kundi la LPS lilionyesha ongezeko kubwa la ROS ikilinganishwa na kundi la udhibiti. CSW na CSE zilipunguza uzalishaji wa ROS kwa kutegemea mkusanyiko. Hasa, herufi ya kitakwimu ya kundi la CSE la 200 µg/mL ilikuwa sawa na ya kundi la udhibiti lisilopewa LPS; waandishi wa chanzo walitafsiri hili kama mwitikio mkubwa wa CSE wa kukandamiza ROS katika mkusanyiko wa juu.

Kwa nini picha halisi ya mikroskopia ya floresensi haikuundwa upya hapa?

Picha za kijani za DCF-DA katika Mchoro 4 ya chanzo ni uchunguzi halisi wa utamaduni wa seli. Kutengeneza kwa njia ya bandia picha inayofanana na mikroskopia hiyo hakumaanishi kuzalisha upya ushahidi wa majaribio. Kwa hiyo, Verianla haiigi mikroskopia ya chanzo; inaeleza kwa maandishi ujumbe wa majaribio, mpangilio wa viwango na matokeo ya kitakwimu yaliyoripotiwa katika chanzo.

TNF-α na IL-6 zilipimwaje?

Kwa kipimo cha TNF-α na IL-6, seli zilipandwa kwenye sahani yenye visima 6 kwa 1×10⁶ seli kwa kila kisima na kuinkubishwa kwa 12-24 saa. Baada ya 1 µg/mL LPS kutumika kwa saa moja, kila dondoo iliongezwa katika 200 µg/mL na seli zikaachwa kwa 24 saa zaidi. TNF-α na IL-6 katika kiowevu cha juu cha utamaduni zilipimwa kwa vifaa vya mouse DuoSet ELISA.

Katika mchakato wa ELISA, capture antibody ilifungamanishwa kwenye sahani, kuosha kwa PBS-T na blocking kwa %1 bovine serum albumin kulifanywa; baada ya hatua za sampuli, detection antibody na streptavidin-horseradish peroxidase, suluhisho la substrate lilitumika. Mwitikio ulisimamishwa kwa 2 N H₂SO₄; mkusanyiko wa saitokini ukahesabiwa kwa msaada wa mkunjo sanifu kutoka kwa absorbansi za 450 na 540 nm.

Kiwango cha TNF-α kilikuwa cha chini kwa kiasi kikubwa kuliko kundi la LPS katika matumizi ya CSW na CSE. IL-6 pia ilipungua kwa kiasi kikubwa katika kundi la CSE ikilinganishwa na kundi la LPS. Herufi za kitakwimu katika mchoro wa chanzo zikizingatiwa, tofauti ya moja kwa moja ya CSW-CSE haipaswi kudhaniwa kando kwa kila kigezo.

Mbinu ya 2^-ΔΔCt Hulinganishaje Usemi wa Jeni?

Mbinu ya 2^-ΔΔCt huhesabu mabadiliko ya usemi wa jeni kwa kulinganisha kundi la majaribio na kundi la kalibrata/udhibiti baada ya kunormalisha kiwango cha mRNA cha jeni lengwa dhidi ya jeni rejea katika RT-qPCR. Katika utafiti huu, GAPDH ilitumika kama jeni rejea ya ndani na viwango vya mRNA vya TLR4, MyD88, NF-κB, IL-6, TNF-α, COX-2 na iNOS vilitathminiwa. Chanzo kinaeleza wazi mbinu ya mwisho ya 2^-ΔΔCt pekee; milinganyo ya ΔCt na ΔΔCt iliyo hapa chini ni upanuzi wa kihisabati wa mbinu hii sanifu, si matokeo mapya ya utafiti.

1. Normalizasheni:

\(\Delta Ct = Ct_{\text{hedef gen}} - Ct_{\text{GAPDH}}\)

2. Tofauti dhidi ya udhibiti:

\(\Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{\text{örnek}} - \Delta Ct_{\text{kalibratör}}\)

3. Usemi linganishi:

\(\text{Göreli ekspresyon} = 2^{-\Delta\Delta Ct}\)

Ct ni nini? Cycle threshold huonyesha mzunguko wa PCR ambapo ishara ya floresensi inapita kizingiti kilichowekwa. Kiasi cha awali cha asidi ya nukleiki lengwa kinapokuwa kikubwa zaidi, kizingiti hufikiwa mapema na thamani ya Ct kwa kawaida huwa ndogo zaidi.

Kwa nini GAPDH hutolewa kwanza? Thamani ya Ct ya jeni lengwa peke yake inaweza kubeba tofauti za idadi ya seli, kiasi cha RNA au ingizo la cDNA. Kupata ΔCt dhidi ya jeni rejea ya GAPDH kunalenga kunormalisha ishara lengwa kwa rejea ya ndani ya sampuli.

Kwa nini ΔΔCt inahitajika? Thamani ya ΔCt ya sampuli iliyotengenezwa kuwa ya kawaida hulinganishwa na thamani ya ΔCt ya kundi la kalibrata. Kwa njia hii, si uwiano wa lengwa/reference pekee unaohesabiwa, bali pia kiwango ambacho uwiano huo umebadilika ikilinganishwa na kundi la udhibiti.

2^-ΔΔCt inatafsiriwaje? Ikiwa thamani dhidi ya kalibrata iko karibu na 1, usemi linganishi huchukuliwa kuwa haujabadilika; thamani iliyo juu ya 1 huwakilisha ongezeko linganishi na thamani iliyo chini ya 1 huwakilisha upungufu linganishi. Kwa mfano, 0.5 kinadharia inalingana na usemi linganishi wa takribani nusu ya kiwango cha kalibrata. Mfano huu ni tafsiri ya kihisabati; si kipimo kipya cha jeni maalumu katika utafiti.

Dhana ni ipi? Katika tafsiri ya kawaida ya 2^-ΔΔCt, ni muhimu amplifikasheni za jeni lengwa na jeni rejea ziwe na ufanisi unaofaa na unaokaribiana vya kutosha wa PCR. PDF ya chanzo hutoa primer na halijoto zilizotumika lakini hairipoti uthibitishaji tofauti wa PCR amplification efficiency; kwa hiyo Verianla haichukulii kana kwamba uthibitishaji huo ulifanywa.

Mpangilio wa jaribio la RT-qPCR

Seli zilipandwa kwenye sahani yenye visima 6 kwa 1×10⁶ seli kwa kila kisima na kuinkubishwa kwa 12-24 saa. Kisha 1 µg/mL LPS ilitumika kwa saa moja, CSW au CSE ikaongezwa katika mkusanyiko wa 200 µg/mL na seli zikaendelea kuinkubishwa kwa 24 saa. Total RNA ilitolewa kwa TRIzol, ikatathminiwa kwa kiasi kwa NanoDrop 2000, cDNA ikatayarishwa kwa SuperiorScript III cDNA synthesis kit na uchambuzi wa mRNA ukafanywa kwa kutumia SYBR Green PCR kit.

Mhimili wa TLR4-MyD88-NF-κB unapaswa kutafsiriwaje?

Katika mfumo wa kibayolojia wa chanzo, LPS inaweza kuanzisha uashiriaji wa kinga ya asili unaohusiana na TLR4; MyD88 hufanya kazi kama protini adapta katika uwasilishaji wa ishara katika mkondo wa chini, na NF-κB ni mojawapo ya vipengele vya kati vinavyodhibiti unukuzi wa jeni zinazohusiana na uchochezi. iNOS, COX-2, TNF-α na IL-6 ni shabaha/vipatanishi muhimu katika mkondo wa chini wa mwitikio huu wa uchochezi.

Ni matokeo gani yaliyopatikana katika RT-qPCR?

Kundi la LPS lilionyesha ongezeko kubwa la usemi wa mRNA wa iNOS, COX-2, TNF-α na IL-6 ikilinganishwa na kundi la udhibiti. Matumizi ya CSW na CSE yalipunguza usemi wa shabaha hizi za mkondo wa chini. Kinyume chake, hakuna mabadiliko makubwa yanayohusiana na matumizi ya dondoo yaliyoonekana katika usemi wa mRNA wa TLR4, MyD88 na NF-κB.

Matokeo haya yanahitaji utofautishaji muhimu: kutobadilika kwa kiwango cha mRNA cha NF-κB hakuthibitishi kwamba shughuli ya uashiriaji wa NF-κB haikubadilika kwa namna yoyote; hata hivyo, kwa kuwa utafiti huu haukupima moja kwa moja shughuli ya NF-κB katika kiwango cha protini/fosforilesheni/uhamishaji kwenda kwenye kiini, kauli kwamba “uamilishaji wa NF-κB ulizuiwa kwa hakika” pia inazidi mpaka wa ushahidi wa moja kwa moja wa kipimo. Matokeo yanayoonyeshwa moja kwa moja na chanzo ni kupungua kwa viwango vya mRNA vya jeni za mkondo wa chini zinazohusiana na uchochezi.

Kutokulingana kwa kitakwimu kati ya Mchoro 6 na muhtasari wa maandishi wa utafiti

Sehemu ya muhtasari wa chanzo inaeleza kuwa CSE ilipunguza usemi wa jeni za IL-6 na COX-2 kwa kiasi kikubwa zaidi kuliko CSW. Hata hivyo, kulingana na maelezo ya Mchoro 6, makundi yasiyoshiriki herufi moja huchukuliwa kuwa tofauti katika kiwango cha P<0.05. Katika mchoro, kwa IL-6, CSW imeonyeshwa kama “bc” na CSE kama “ab”; kwa COX-2 pia CSW ni “bc” na CSE ni “ab”. Katika ulinganisho wote miwili, makundi yanashiriki herufi “b”. Kwa hiyo, uwekaji wa alama za kitakwimu wa mchoro wenyewe hauungi mkono wazi kwamba tofauti ya moja kwa moja ya CSW-CSE ni kubwa. Verianla haiwasilishi mkanganyiko huu kana kwamba umetatuliwa na haifanyi dai la umuhimu wa moja kwa moja kati ya viyeyusho kuwa la uhakika.

Matokeo ya uwiano wa Pearson yalionyesha nini?

Uwiano chanya wenye nguvu wa r=0.974, P<0.01 uliripotiwa kati ya ROS na NO. Uwiano chanya wa r=0.716, P<0.01 uliripotiwa kati ya ROS na IL-6, na r=0.796, P<0.01 kati ya ROS na TNF-α. Matokeo haya yanaonyesha kuwa katika hali zilezile za jaribio, viashiria vya juu zaidi vya msongo wa oksidishaji hubadilika pamoja na viashiria vya juu zaidi vinavyohusiana na uchochezi.

Hata hivyo, uwiano wa Pearson hupima mabadiliko ya pamoja ya vigezo; hauwezi peke yake kuthibitisha kwamba kigezo kimoja kinasababisha moja kwa moja kingine. Kwa mfano, thamani ya r=0.974 haimaanishi kwamba “ROS husababisha %97.4 ya NO”.

Je, Matokeo Haya Yanathibitisha Athari ya Matibabu ya Kupunguza Uchochezi Kwa Binadamu?

Hapana. Utafiti haukufanywa kwa washiriki wa kibinadamu na haukutathmini matumizi ya kinywa, farmakokinetiki, upatikanaji wa kibayolojia, toksikolojia au matokeo ya kliniki. Mfumo wa majaribio ni seli za makrofaji za panya RAW 264.7 na modeli iliyodhibitiwa ya uchochezi ya in vitro iliyoundwa kwa LPS. Kwa hiyo, hitimisho linaloungwa mkono na utafiti ni kwamba dondoo zilizopatikana chini ya hali mahususi za utayarishaji wa CSW na CSE zinaweza kupunguza baadhi ya viashiria vya oksidishaji na vinavyohusiana na uchochezi katika modeli hii ya seli; kuzuia au kutibu magonjwa ya binadamu kunahitaji utafiti wa kliniki tofauti.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• Maji na ethanoli zilitengeneza dondoo zenye sifa tofauti kutoka katika nyenzo ileile ya Cuscutae Semen.
• Mavuno ya jumla ya dondoo kavu ya uchimbaji kwa maji (%12.98) yalikuwa juu kuliko ya uchimbaji kwa ethanoli (%4.45).
• Maudhui ya flavonoidi jumla ya CSE yalikuwa juu kuliko CSW.
• Dondoo zote mbili zilionyesha thamani za juu za kuondoa radikali za DPPH na ABTS.
• Uwezo wa FRAP wa CSE ulikuwa takribani mara 2.8 ya CSW.
• Uwiano chanya wenye nguvu uliripotiwa kati ya FRAP na vipimo vya polifenoli jumla na flavonoidi jumla.
• Hakukuwa na sitotoksisiti dhahiri katika majaribio ya seli yaliyochunguzwa katika kiwango cha 50-200 µg/mL.
• CSW na CSE zilipunguza uzalishaji wa NO na ROS ulioongezwa na LPS kwa kutegemea mkusanyiko.
• Dondoo zote mbili zilipunguza utolewaji wa TNF-α ikilinganishwa na kundi la LPS.
• Dondoo zilipunguza usemi wa mRNA wa jeni za mkondo wa chini zinazohusiana na uchochezi kama iNOS, COX-2, TNF-α na IL-6.
• Hakukuwa na mabadiliko makubwa katika usemi wa mRNA wa TLR4, MyD88 na NF-κB.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono

• Haijaonyeshwa kwamba dondoo ya Cuscutae Semen hutibu magonjwa ya uchochezi kwa binadamu.
• Mkusanyiko wa utamaduni wa seli wa 200 µg/mL si dozi ya matumizi kwa binadamu.
• Utafiti si utafiti wa usalama wa muda mrefu au toksikolojia.
• Fosforilesheni ya protini ya NF-κB au uhamishaji wake kwenda kwenye kiini haukupimwa.
• Haijabainishwa ni kiambajengo kipi kimoja cha dondoo kinachohusika na athari ya seli iliyoonekana.
• Matokeo ya uwiano si ushahidi wa usababishaji.
• Kwa kuwa uthibitisho wa voucher/DNA wa nyenzo iliyotumika katika chanzo katika kiwango cha spishi haukuripotiwa, uhakika wa kitaksonomia usiotokana na chanzo haupaswi kuundwa kwa nyenzo ya jaribio.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Muhtasari wa nyenzo ya jaribio na uchimbaji

Ulinganisho wa vipimo vya kemikali vya antioxidant

Dozi na muda wa majaribio ya seli

Muhtasari wa matokeo ya seli unaofuata chanzo

Uchambuzi wa kitakwimu

Majaribio yote yalirudiwa mara tatu chini ya hali zilezile na data ziliwasilishwa kama wastani±kosa sanifu (mean±SE, n=3). Uchambuzi wa kitakwimu ulifanywa kwa SPSS version 27.0 na kiwango cha umuhimu kikawekwa kuwa P<0.05.

Student's t-test ilitumika katika ulinganisho kati ya makundi mawili. Kwa ulinganisho wa makundi mengi, ilielezwa kuwa mbinu ya Tukey post-hoc ilitumika. Maandishi ya mbinu katika chanzo hayataji kando jina la kipimo cha omnibus kilichotumika kabla ya Tukey; kwa hiyo Verianla haiongezi moja kwa moja kauli kwamba “ANOVA ilitumika”.

Mahusiano kati ya vigezo yalitathminiwa kwa Pearson correlation coefficient. Chanzo pia kinatoa P<0.01 kwa baadhi ya matokeo ya uwiano. Kadiri mgawo wa uwiano unavyokaribia +1 huashiria mabadiliko ya pamoja yenye nguvu chanya, kukaribia -1 huashiria mabadiliko ya pamoja yenye nguvu hasi, na kukaribia 0 huashiria uhusiano hafifu wa mstari; hata hivyo, hakuna thamani ya r inayothibitisha usababishaji peke yake.

Nguvu za utafiti

Nguvu muhimu ya utafiti ni kwamba athari ya kiyeyusho haikutathminiwa kwa kipimo kimoja tu cha kemikali cha antioxidant; matokeo ya polifenoli jumla, flavonoidi jumla, DPPH, ABTS na FRAP yaliunganishwa na uchambuzi wa NO, ROS, saitokini na mRNA unaotegemea seli. Hivyo, ndani ya utafiti mmoja, ilichunguzwa jinsi uchaguzi wa kiyeyusho unavyojitokeza katika matokeo ya kemikali yanayohusiana na muundo wa dondoo na pia katika miitikio ya kibayolojia ya modeli ya makrofaji iliyochochewa kwa LPS.

Nguvu ya pili ni kwamba matokeo ya kupunguza uchochezi yaliyoonekana katika seli hayakuachwa katika kiwango cha NO au ROS pekee; TNF-α, IL-6 na jeni mbalimbali zinazohusiana na uchochezi pia zilipimwa. Muundo huu wa ngazi nyingi hupunguza hatari ya tafsiri inayotegemea matokeo ya assay moja tu.

Vikwazo vikuu

Kikwazo cha kwanza na muhimu zaidi ni kwamba utafiti ni modeli ya in vitro ya seli za makrofaji za panya. Matokeo hayawezi kuhamishwa moja kwa moja kwa matibabu ya binadamu.

Kikwazo cha pili ni kwamba ingawa chanzo na eneo la ukusanyaji wa nyenzo ya Cuscutae Semen vimetolewa, uthibitisho katika kiwango cha spishi/taarifa ya voucher specimen haukuripotiwa katika sehemu ya mbinu.

Kikwazo cha tatu ni kwamba ingawa maudhui ya polifenoli jumla na flavonoidi jumla ya dondoo yalipimwa, viambajengo vya kemikali vya pekee vinavyohusika na athari hiyo havikutenganishwa kwa kiasi katika jaribio. Chanzo kinataja katika fasihi ya awali viambajengo kama chlorogenic acids, hyperoside, quercetin na kaempferol; hata hivyo, utafiti huu haukupima kila kimoja kwa kiasi katika dondoo zake kwa HPLC/LC-MS.

Kikwazo cha nne ni kwamba mekanizimu ya NF-κB haikuthibitishwa kwa hatua za moja kwa moja za uamilishaji wa protini. Ingawa hakuna mabadiliko makubwa yaliyoonekana katika mRNA ya TLR4, MyD88 na NF-κB, kuna upungufu katika jeni za mkondo wa chini. Fosforilesheni ya NF-κB, uharibifu wa IκB, uhamishaji wa p65 kwenda kwenye kiini au kufungamana kwa DNA havikupimwa.

Kikwazo cha tano ni kwamba ingawa n=3 iliripotiwa kwa kila jaribio, haijaelezwa kwa kina kama marudio haya yalikuwa makundi huru ya uchimbaji wa kibayolojia au marudio ya kiufundi/majaribio kwenye nyenzo ileile.

Kikwazo cha sita ni kuwepo kwa kutokulingana kwa ndani katika kipimo na maelezo ya nambari ya polifenoli jumla kati ya Mchoro 1 ya chanzo na maandishi ya matokeo.

Kikwazo cha saba ni kutokulingana kati ya dai la umuhimu wa moja kwa moja wa CSE-CSW kwa IL-6 na COX-2 katika muhtasari wa chanzo na herufi za kitakwimu za Mchoro 6.

Matokeo yanapaswa kutafsiriwaje kwa usahihi?

Utafiti unaonyesha kwamba uchaguzi wa kiyeyusho unaweza kubadilisha kwa kiasi kikubwa muundo na utendaji wa majaribio wa dondoo ya Cuscutae Semen. Uchimbaji kwa maji hutoa mavuno ya juu zaidi ya dondoo jumla, huku uchimbaji kwa ethanoli ukionekana kuwa na faida zaidi kwa viambajengo lengwa vya antioxidant na hasa FRAP. Katika modeli ya seli, dondoo zote mbili zilipunguza viashiria mbalimbali vya oksidishaji na vinavyohusiana na uchochezi vilivyoongezwa na LPS, na CSE ilionyesha mwitikio wenye nguvu zaidi katika baadhi ya vipimo.

Hata hivyo, hitimisho kwamba “dondoo ya ethanoli ni dawa bora zaidi ya kupunguza uchochezi kwa binadamu” haliwezi kutolewa kutoka kwa data hizi. Hitimisho sahihi la kisayansi la utafiti ni kwamba dondoo ya ethanoli ilionyesha wasifu wenye nguvu zaidi wa kuwa mgombea kwa tafiti za nyenzo tendaji chini ya hali za maabara zilizochunguzwa. Kwa matumizi ya binadamu, usalama, usanifishaji wa viambajengo, upatikanaji wa kibayolojia, mahusiano ya dozi-mwitikio, farmakokinetiki na uthibitishaji wa kliniki vinahitaji tafiti tofauti.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Kichwa asili: Comparison of Antioxidant and Anti-Inflammatory Activities of Cuscutae Semen Extracts with Different Solvents.

Kichwa cha Kikorea: 용매를 달리한 토사자 추출물의 항산화 및 항염증 활성 비교.

Aina ya chapisho: Utafiti wa majaribio uliowekwa alama kama “Research Note / 연구노트” katika PDF ya chanzo.

Waandishi na mpangilio: Seo-Yeon Yoon, Yu-Jin Heo, Mi-Kyung Lee, Hae-In Lee.

Mchango sawa: Hakuna alama ya mchango sawa au taarifa ya waandishi wa kwanza wenye mchango sawa inayoonekana katika PDF ya chanzo.

Mwandishi wa mawasiliano: Hae-In Lee.

Taasisi: Department of Food and Nutrition, Sunchon National University, Republic of Korea.

Jarida: Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition.

Taasisi ya uchapishaji: The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Juzuu / toleo / kurasa: 55(1), 65-73.

Mwaka wa kuchapishwa na tarehe ya toleo: 2026; katika rekodi ya bibliografia 30 Januari 2026.

DOI: 10.3746/jkfn.2026.55.1.65.

Kiungo rasmi cha DOI: https://doi.org/10.3746/jkfn.2026.55.1.65

Tarehe za ushughulikiaji wa makala: Ilipokelewa 16 Oktoba 2025; ikafanyiwa marekebisho 17 Novemba 2025; ikakubaliwa 17 Novemba 2025.

Aina ya chanzo na dokezo la mapitio ya kitaalamu: Utafiti ni Research Note iliyochapishwa katika jarida la kitaaluma na imeorodheshwa kama makala ya jarida katika rekodi za KCI. Kwa kuwa PDF yenyewe haina kauli tofauti ya “peer-reviewed”, kauli hiyo haijapanuliwa kwa maelezo yasiyopo katika chanzo.

Leseni: PDF ya chanzo inaeleza utafiti kuwa wa ufikiaji wazi chini ya Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 (CC BY-NC 4.0).

Ufadhili: Hakuna taarifa tofauti ya ufadhili iliyotambuliwa katika maandishi ya PDF yaliyokaguliwa; chanzo cha ufadhili hakikudhaniwa.

Upatikanaji wa data: Hakuna taarifa tofauti ya Data Availability iliyotambuliwa katika PDF. Haikudhaniwa kwamba vipimo ghafi vya seli, thamani za RT-qPCR Ct au data ghafi za grafu zinapatikana kwa umma.

Mgongano wa maslahi: Hakuna taarifa tofauti ya mgongano wa maslahi iliyotambuliwa katika PDF iliyokaguliwa; hali hii haijapanuliwa kuwa kauli kwamba “hakuna mgongano wa maslahi”.

Michango ya waandishi: Hakuna taarifa tofauti ya CRediT/mchango wa waandishi inayoonekana katika PDF.

Kutokulingana muhimu ndani ya chanzo 1: Mbinu ya polifenoli jumla na mhimili y wa Mchoro 1 hutumia mg GAE/g, huku aya ya matokeo ikiandika thamani za 340.28 na 158.31 kama mg RE/g; zaidi ya hayo, uwiano wa nambari hizi hauendani kikamilifu na kauli ya “takribani mara 2.4” katika maandishi. Kwa hiyo, Verianla haijaandika upya kipimo au thamani kimya kimya.

Kutokulingana muhimu ndani ya chanzo 2: Muhtasari wa chanzo unaeleza kuwa CSE ilipunguza mRNA ya IL-6 na COX-2 kwa kiasi kikubwa zaidi kuliko CSW, lakini katika herufi za kitakwimu za Mchoro 6, CSW iko katika kundi “bc” na CSE katika kundi “ab”. Kulingana na kanuni katika maelezo ya mchoro kwamba “makundi yasiyoshiriki herufi moja ni tofauti kwa kiasi kikubwa”, tofauti ya moja kwa moja ya CSE-CSW haiwezi kufanywa kuwa ya uhakika kutoka kwenye mchoro huu.

Mpaka mkuu wa kimbinu: Utafiti unajumuisha vipimo vya kemikali vya antioxidant na majaribio ya in vitro kwenye seli za makrofaji za panya RAW 264.7 zilizochochewa kwa LPS; si utafiti wa ufanisi wa kliniki, usalama au dozi kwa binadamu.