Baikalin (baicalin), Scutellaria baicalensis Georgi köklerinde bulunan bir flavon glukuronididir ve bu çalışmada domuz üreme ve solunum sendromu virüsüne (porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) karşı antiviral ve hastalık şiddetini azaltıcı potansiyeli incelenmiştir. Araştırma önce primer domuz alveolar makrofajlarında (porcine alveolar macrophages, PAMs) aşama-özgül in vitro deneyler, ardından deneysel olarak PRRSV ile enfekte edilmiş 20 domuz yavrusunda profilaktik besleme deneyi kullanmıştır. Baikalin 80 µg/mL'ye kadar PAM canlılığını belirgin biçimde azaltmamış ve PRRSV enfeksiyon döngüsünde en güçlü saptanabilir antiviral aktivite virüsün hücre yüzeyine tutunma aşamasında görülmüştür. Enfekte domuz yavrularında virüs yükü ve solunum yolu saçılımı daha düşük, ateş ve klinik bulgular daha hafif bulunmuştur. Ancak baikalin virüs uygulamasından iki gün önce başlanarak verildiğinden çalışma yerleşmiş PRRSV enfeksiyonunun tedavi edildiğini göstermez.

Hücre deneyinde baikalin konsantrasyonu 20'den 80 µg/mL'ye yükseldikçe enfeksiyöz virüs titresi ve PRRSV nsp9 mRNA düzeyi düşmüştür. Attachment aşamasındaki konsantrasyon–yanıt modelinde EC50 9,021 µg/mL olarak hesaplanmıştır. Hücre canlılığı deneyinde CC50 197,2 µg/mL'dir.

Aşama-özgül deneyler kritik bir ayrım ortaya koymuştur: test edilen koşullarda baikalin virüsü doğrudan inaktive etmemiş; viral giriş, hücre içi replikasyon veya progeny virüs salınımı üzerinde anlamlı etki göstermemiştir. Etkinin en belirgin olduğu koşul baikalinin PRRSV'nin PAM yüzeyine bağlandığı sırada bulunmasıdır. Ancak çalışma baikalinin doğrudan bir viral zarf proteinine mi, hücre yüzeyindeki bir attachment faktörüne mi yoksa başka bir erken enfeksiyon bileşenine mi etki ettiğini belirlememiştir.

Hayvan deneyinde PRRSV + baikalin grubunda beş hayvandan dördü, yalnız PRRSV grubunda beş hayvandan biri deney sonuna ulaşmıştır. Bu sayısal fark belirgin görünse de Kaplan–Meier karşılaştırması \(p=0{,}082\), Fisher exact testi ise \(p=0{,}206\) olduğundan sağkalım farkı istatistiksel olarak anlamlı değildir. Bu nedenle sağkalım sonucu ön bulgu olarak değerlendirilmelidir.

PRRSV neden zor kontrol edilen bir domuz patojenidir?

PRRSV, damızlık hayvanlarda üreme kayıpları, genç domuzlarda solunum hastalığı ve büyüme geriliği oluşturabilen; ayrıca doğuştan ve kazanılmış bağışıklık yanıtlarını bozarak ikincil enfeksiyonlara duyarlılığı artırabilen önemli bir domuz patojenidir.

Aşılama, biyogüvenlik, sürü stabilizasyonu ve patojen izlemi PRRS kontrolünün temel bileşenleridir. Bununla birlikte PRRSV'nin genetik ve antijenik çeşitliliği farklı saha suşlarına karşı heterolog aşı korumasını sınırlayabilir. Çalışmanın amacı aşıların yerine yeni bir seçenek koymak değil, mevcut kontrol programlarını destekleyebilecek tamamlayıcı antiviral bileşikleri değerlendirmektir.

Baikalin nedir?

Baikalin, Scutellaria baicalensis Georgi köklerinin başlıca biyoaktif bileşenlerinden biri olan flavon glukuronididir. Önceki deneysel çalışmalarda farklı viral enfeksiyonlar ve inflamatuvar modellerde antiviral, antioksidan ve immün düzenleyici aktiviteler bildirilmiştir.

PRRSV bakımından önceki araştırmalar baikalinin bazı suşlara karşı in vitro aktivitesini göstermiş olsa da hangi viral yaşam döngüsü aşamasının başlıca hedef olduğu, enfekte domuz yavrularındaki koruyucu etkinliğin derecesi ve antiviral etki ile inflamatuvar değişim arasındaki ilişki tam olarak çözülmemiştir.

Araştırmanın hipotezi

Yazarlar baikalinin PRRSV'ye karşı iki tamamlayıcı süreç üzerinden koruma sağlayabileceğini öne sürmüştür: erken virüs–hücre etkileşimine müdahale edilmesi ve ardından ortaya çıkan pro-inflamatuvar yanıtın zayıflaması.

Bu hipotezin birinci bölümü doğrudan aşama-özgül hücre deneyleriyle araştırılmıştır. İkinci bölüm ise hayvanlarda IL-1β, IL-6, IL-8 ve TNF-α ölçümleriyle değerlendirilmiştir. Ancak çalışmanın kovaryans analizi inflamatuvar değişimin doğrudan baikalinden mi yoksa daha düşük viral yükün ikincil sonucu olarak mı ortaya çıktığını ayıramamıştır.

Baikalin PRRSV enfeksiyonunun hangi aşamasında en güçlü antiviral etkiyi gösterdi?

Baikalin, test edilen aşama-özgül in vitro koşullar içinde en güçlü saptanabilir antiviral aktiviteyi PRRSV'nin PAM hücre yüzeyine tutunma aşamasında gösterdi; doğrudan virüs inaktivasyonu, viral giriş, hücre içi replikasyon ve progeny virüs salınımı koşullarında ise anlamlı antiviral etki saptanmadı. Bu sonuç attachment aşamasını işaret eder, ancak baikalinin doğrudan moleküler hedefini belirlemez.

Aşama-özgül deney mantığı

Bir antiviral bileşiğin “virüsü azalttığını” göstermek, hangi biyolojik aşamada etkili olduğunu tek başına açıklamaz. Bu nedenle araştırmacılar PRRSV yaşam döngüsünün farklı aşamalarını ayrı deney düzeneklerinde test etmiştir.

4 °C neden kullanıldı?

Attachment deneyinde düşük sıcaklık, virüsün hücre yüzeyine bağlanmasına izin verirken enerjiye bağımlı hücre içi giriş süreçlerini büyük ölçüde sınırlandırmak için kullanılmıştır. Böylece bağlanma aşaması ile sonraki internalizasyon süreci deneysel olarak ayrılabilmiştir.

Attachment sonucu hedef proteini belirliyor mu?

Hayır. PRRSV'nin ilk hücre teması heparan sülfat ve CD169 gibi çeşitli yüzey bileşenleriyle ilişkili olabilir; CD163 ise üretken enfeksiyon için kritik olmakla birlikte daha çok internalizasyon, membran füzyonu ve uncoating süreçlerinde işlev görür.

Baikalin attachment aşamasında etkili olduğundan bir viral zarf proteinine veya hücre yüzeyi bileşenine müdahale etmesi biyolojik olarak mümkündür; ancak kaynak doğrudan bağlanma, reseptör bağımlılığı veya moleküler etkileşim deneyi yapmamıştır. Belirli bir moleküler hedef atamak mevcut verinin sınırını aşar.

Baikalin ve baicalein aynı molekül değildir

Kaynak, baikalinin aglikon formu olan baicalein için literatürde doğrudan PRRSV bağlanması ve EGFR/PI3K–AKT ilişkili etkiler bildirildiğini tartışmaktadır. Ancak glukuronidasyon polariteyi, membran geçirgenliğini ve protein bağlanmasını değiştirdiğinden baicalein için gösterilmiş bir mekanizma baikaline doğrudan aktarılamaz.

Bu çalışma baikalinin PRRSV tedavisi olduğunu gösteriyor mu?

Hayır. Hayvan deneyinde baikalin PRRSV challenge'ından iki gün önce başlanmış ve enfeksiyon boyunca yemde verilmiştir; enfeksiyondan sonra tedavinin başlatıldığı ayrı bir grup bulunmadığı için çalışma yerleşmiş PRRSV enfeksiyonunun tedavi edildiğini göstermez. Kaynak hayvan bulgularını profilaktik besinsel takviye için proof-of-concept kanıt olarak sınırlandırmaktadır.

Profilaksi ve terapi arasındaki fark

Profilaktik tasarımda bileşik patojenle karşılaşmadan önce organizmada bulunmaktadır. Tedavi tasarımında ise müdahale enfeksiyon kurulduktan, virüs saptandıktan veya klinik belirtiler başladıktan sonra başlatılır.

Baikalinin ana in vitro aktivitesinin erken attachment aşamasında görülmesi bu ayrımı daha da önemli kılar. Bileşiğin en güçlü saptanabilir etkisi virüs–hücre temasının erken noktasındaysa, bileşiğin challenge öncesinde bulunması deneysel olarak avantajlı bir koşuldur.

Baikalinin oral kullanımındaki başka bir sınırlılık

Kaynak baikalinin oral biyoyararlanımının intestinal emilim, metabolizma ve enterohepatik işlenme nedeniyle sınırlı olduğunu belirtmektedir. Bu nedenle yem içindeki nominal doz ile hedef dokudaki aktif maruziyet aynı kavram değildir.

Yazarlar gelecekte fosfolipit kompleksleri, nanopartiküller veya başka taşıma sistemleri gibi formülasyon stratejilerinin değerlendirilmesini önermektedir; bunlar mevcut çalışmada test edilmiş uygulamalar değildir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Hücre ve virüs sistemi

Primer porcine alveolar macrophages (PAMs) ve yüksek patojeniteli PRRSV-2 suşu SCSN2020, Chengdu Agricultural College Animal Disease Diagnostic Center tarafından sağlanmıştır.

PAM'lar PRRSV'nin doğal hedef hücreleriyle biyolojik olarak ilişkili primer hücre sistemi sağladığı için çalışmanın antiviral değerlendirmesinde temel hücresel model olarak kullanılmıştır.

Hücre canlılığı deneyi

Baikalin DMSO içinde çözülmüş, 0,22 µm filtreden sterilize edilmiş ve kültür ortamında aşağıdaki konsantrasyonlara seyreltilmiştir:

10, 20, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400 ve 500 µg/mL.

Tüm baikalin kuyularında DMSO son konsantrasyonu %0,1 olarak korunmuştur. Her koşulda sekiz teknik tekrar kullanılmış ve 48 saatlik inkübasyondan sonra CCK-8 ile OD450 ölçülmüştür.

Kaynakta verilen denklem:

\[ \text{Cell viability inhibition rate}(\%)= \left( 1- \frac{OD_{450,\ treatment}-OD_{450,\ blank}} {OD_{450,\ mock}-OD_{450,\ blank}} \right)\times100 \]

şeklindedir.

Kaynak içi metrik notu: yöntem bu ifadeyi “cell viability inhibition rate” olarak adlandırırken Şekil 1 sonuçları hücre canlılığını Mock yüzdesi olarak göstermektedir. İki adlandırma kaynak içinde aynı ifadeyle sunulmadığı için Verianla bu farkı gizlememektedir.

Hücre toksisitesi sonucu

10–80 µg/mL aralığında 48 saat sonunda hücre canlılığı %80'in üzerinde kalmıştır. 200 µg/mL ve daha yüksek konsantrasyonlarda canlılık belirgin biçimde azalmış; dört parametreli lojistik regresyon:

\[ CC_{50}=197{,}2\ \mu g/mL \]

sonucunu vermiştir.

Bu nedenle aşama-özgül antiviral deneylerde 80 µg/mL, kaynak tarafından test edilen non-sitotoksik aralığın üst sınırlarından biri olarak kullanılmıştır.

RT-qPCR

Hücre, doku ve sürüntülerden toplam RNA çıkarılmış; RNA saflığı ve konsantrasyonu ScanDrop spektrofotometresi ile ölçülmüş ve PrimeScript RT Kit kullanılarak cDNA sentezlenmiştir.

PRRSV kopya sayısı ve PRRSV nsp9 düzeyleri qPCR ile değerlendirilmiştir. Göreli gen ekspresyonu β-actin referans genine göre:

\[ 2^{-\Delta\Delta C_t} \]

yöntemiyle hesaplanmıştır.

Virüs titrasyonu

PRRSV örnekleri 10 kat seri seyreltilmiş ve her seyreltme sekiz teknik kuyuya uygulanmıştır. Sitopatik etki üç gün boyunca izlenmiş; %50 doku kültürü enfeksiyöz dozu Reed–Muench yöntemiyle hesaplanarak:

log10 TCID50/mL

olarak ifade edilmiştir.

Her virüs titrasyonu üç bağımsız deneyden oluşmuş ve her seyreltmede sekiz teknik tekrar kullanılmıştır. İstatistiksel deney birimi tek tek teknik kuyular değil, bağımsız deneylerdir.

Attachment konsantrasyon–yanıt sonucu

Attachment deneyinde baikalin 20, 40 ve 80 µg/mL konsantrasyonlarında virüs titrelerini kontrole göre anlamlı biçimde azaltmış ve en büyük azalma 80 µg/mL'de görülmüştür.

5, 10, 20, 40, 60 ve 80 µg/mL konsantrasyonlarından oluşturulan dört parametreli lojistik konsantrasyon–yanıt modelinde:

\[ EC_{50}=9{,}021\ \mu g/mL \]

hesaplanmıştır.

nsp9 mRNA düzeyi de aynı attachment koşulunda konsantrasyon arttıkça azalmıştır.

Hayvan deneyinin tasarımı

Dört hayvan grubu

1. Mock: standart yem, PRRSV yok.
2. Baikalin: 0,1 g/kg baikalinli yem, PRRSV yok.
3. PRRSV: standart yem + PRRSV challenge.
4. PRRSV + baikalin: 0,1 g/kg baikalinli yem + PRRSV challenge.

Gruplar çapraz bulaşmayı önlemek için ayrı barındırılmıştır. RT-qPCR, ELISA, klinik skorlama ve histopatolojik değerlendirmeyi yapan araştırmacılar ilgili ölçümler tamamlanana kadar grup atamasına körlenmiştir.

Barınma koşulları

Hayvanlar üç günlük aklimatizasyonun ardından yaklaşık 28 ± 1 °C ve %60 ± 5 bağıl nem koşullarında barındırılmış; yem ve suya serbest erişim sağlanmıştır. Çalışmaya alınmadan önce tüm hayvanların PRRSV antijeni ve PRRSV'ye özgü antikorlar bakımından negatif olduğu doğrulanmıştır.

Örnekleme

Gün 3, 7, 14, 17 ve 21'de kan, orofaringeal sürüntü ve nazal sürüntü alınmıştır. Ölmek üzere olan veya ölen hayvanlardan; ayrıca deney sonunda hayatta kalanlardan akciğer, karaciğer, böbrek, hilar lenf düğümü, dalak ve ilgili diğer dokular toplanmıştır.

Viremi ve viral saçılım qRT-PCR ile değerlendirilmiştir.

Hayatta kalma farkı istatistiksel olarak anlamlı mıydı?

Hayır. PRRSV + baikalin grubunda 4/5, yalnız PRRSV grubunda 1/5 hayvan deney sonuna ulaşmış olsa da Kaplan–Meier log-rank testi \(p=0{,}082\) ve gün 26 sağkalım oranlarının Fisher exact testi \(p=0{,}206\) vermiştir; küçük grup büyüklüğü nedeniyle bu sonuç kesin bir sağkalım yararı kanıtı değil, ön tanımlayıcı bulgudur.

Klinik seyir

Mock ve yalnız baikalin gruplarında rektal sıcaklık deney boyunca normal aralıkta kalmıştır. PRRSV grubunda sıcaklık enfeksiyondan yaklaşık beş gün sonra yükselmiş, uzun süre 40 °C'nin üzerinde seyretmiş ve tepe noktada 41 °C'yi aşmıştır.

PRRSV + baikalin grubunda da geçici ateş gelişmiş; ancak sıcaklık artışının büyüklüğü daha düşük olmuş ve değerler genel olarak 39–40 °C aralığında kalmıştır.

Vücut ağırlığı ve klinik skorlar

Mock ve yalnız baikalin grupları düzenli kilo almıştır. PRRSV grubunda kilo artışı güçlü biçimde baskılanmış ve enfeksiyonun geç döneminde vücut ağırlığı düşme eğilimi göstermiştir.

PRRSV + baikalin grubunda kilo kazanımı erken dönemde yavaş olmakla birlikte orta ve geç dönemde yeniden artmıştır. Klinik skorlar da yalnız PRRSV grubuna kıyasla daha düşük seyretmiş ve geç dönemde başlangıç düzeylerine yaklaşmıştır.

Viremi

Yalnız PRRSV grubunda serum viral yükü gün 3'te saptanabilir hale gelmiş, gün 14–17 arasında yüksek seviyelere ulaşmış ve gün 21'de azalmasına rağmen yüksek kalmıştır.

PRRSV + baikalin grubunda serum PRRSV kopyaları bütün örnekleme döneminde daha düşük seyretmiş; gün 7, 14 ve 17'de güçlü, gün 3 ve 21'de de anlamlı azalmalar raporlanmıştır.

Orofaringeal ve nazal saçılım

PRRSV grubunda orofaringeal viral yük gün 14 civarında tepe yapmıştır. Baikalin verilen enfekte hayvanlarda orofaringeal PRRSV kopyaları daha düşük bulunmuştur.

Nazal sürüntülerde de gün 3'ten başlayan, gün 14 civarında yükselen ve daha sonra azalan saçılım örüntüsü gözlenmiş; PRRSV + baikalin grubundaki değerler PRRSV grubundan daha düşük seyretmiştir.

Makroskopik patoloji

PRRSV grubundaki akciğerlerde koyu kırmızı renk değişikliği, belirgin konjesyon, hemoraji ve konsolidasyon alanları görülmüştür. Hilar ve inguinal lenf düğümlerinde de belirgin renk değişiklikleri ve hemorajik odaklar gözlenmiştir.

PRRSV + baikalin grubunda pulmoner konjesyon, hemoraji ve konsolidasyon daha hafif görünmüş, lobüler mimari daha iyi korunmuştur. Bununla birlikte bazı fokal lezyonlar ve hafif konjesyon tamamen ortadan kalkmamıştır.

Histopatoloji

PRRSV grubunun akciğerlerinde interstisyel pnömoni; alveolar septalarda kalınlaşma, alveolar boşluklarda daralma, bronş ve damar çevresinde inflamatuvar hücre infiltrasyonu ve fokal doku mimarisi bozukluğu görülmüştür.

Hilar ve inguinal lenf düğümlerinde lenfoid organizasyonda bozulma, lenfosit azalması ve fokal hücresel hasar gözlenmiştir.

PRRSV + baikalin grubunda alveolar yapı daha iyi korunmuş; septal kalınlaşma ve inflamatuvar infiltrasyon daha hafif görünmüştür. Lenf düğümlerinde de doku organizasyonu daha iyi korunmuştur.

Bununla birlikte nicel makroskopik ve histopatolojik skorlar PRRSV + baikalin grubunda aşağı yönlü eğilim gösterse de PRRSV grubuna karşı farklar istatistiksel anlamlılık düzeyine ulaşmamıştır.

Histopatoloji yöntemi

Dokular %4 paraformaldehitte fikse edilmiş, dereceli etanol serisinden geçirilmiş, parafine gömülmüş ve 4 µm kesitler hazırlanmıştır. Kesitler hematoksilen-eozin (H&E) ile boyanmış ve Nikon Eclipse 50i mikroskopla değerlendirilmiştir.

Serum inflamatuvar sitokinleri

IL-1β, IL-6, IL-8 ve TNF-α serum konsantrasyonları ELISA ile ölçülmüştür. PRRSV enfeksiyonu dört sitokini de yükseltmiştir.

PRRSV + baikalin grubunda dört sitokin gün 7 ve 14'te PRRSV grubuna göre anlamlı biçimde daha düşük bulunmuştur.

Şekil 9 analizinde grup, zaman ve grup × zaman etkileşimini sabit etkiler; bireysel domuz yavrusunu tekrarlı ölçüm faktörü olarak içeren mixed-effects model kullanılmış ve önceden tanımlanmış zaman noktası karşılaştırmaları Šídák düzeltmesiyle yapılmıştır.

Baikalin inflamatuvar sitokinleri doğrudan mı baskıladı?

Bu çalışma bunu belirleyemedi. PRRSV + baikalin grubunda IL-1β, IL-6, IL-8 ve TNF-α daha düşük olsa da aynı hayvanlarda viral yük de belirgin biçimde daha düşüktü; viral yük kovaryat olarak eklendiğinde düzeltilmiş grup etkileri anlamlı kalmadı ve grupların viral yük dağılımları örtüşmediği için güçlü kollinearite oluştu. Sonuçlar doğrudan bir immünomodülatör mekanizma ile daha düşük viral yüke bağlı ikincil inflamasyon azalmasını güvenilir biçimde ayıramaz.

Bu ayrım neden önemlidir?

Daha az virüs, daha az enfekte makrofaj ve dolayısıyla daha düşük inflamatuvar uyarı oluşturabilir. Bu durumda sitokinlerin düşmesi için baikalinin inflamatuvar sinyal yoluna bağımsız olarak doğrudan müdahale etmesi gerekmez.

Öte yandan baikalin farklı inflamasyon modellerinde NF-κB, MAPK, oksidatif stres ve inflammazom sinyaliyle ilişkilendirilmiştir. Mevcut çalışma bu biyolojik olasılığı dışlamaz, ancak PRRSV modelinde doğrudan nedensel immünomodülasyonu kanıtlamaz.

İstatistiksel analiz

Analizler GraphPad Prism 9.5.1 ile yapılmıştır. Hayvan deneylerinde deney birimi tek bir domuz yavrusudur. Hücre deneylerinde deney birimi teknik kuyu değil bağımsız deneydir; teknik tekrarlar istatistiksel analizden önce bağımsız deney içinde ortalanmıştır.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• Baikalin, PAM'larda test edilen non-sitotoksik aralıkta PRRSV enfeksiyöz titrelerini ve nsp9 mRNA düzeylerini konsantrasyona bağlı olarak azaltmıştır.
• Test edilen yaşam döngüsü koşulları arasında en güçlü saptanabilir antiviral aktivite attachment aşamasında görülmüştür.
• Attachment deneyindeki EC50 9,021 µg/mL olarak hesaplanmıştır.
• Hücre canlılığı deneyindeki CC50 197,2 µg/mL olarak hesaplanmıştır.
• Profilaktik diyet baikalini alan enfekte domuz yavrularında serum viral yükü ve respiratuvar viral saçılım daha düşük bulunmuştur.
• Ateş, klinik skorlar ve kilo kaybı eğilimi PRRSV + baikalin grubunda daha hafif seyretmiştir.
• Akciğer ve lenf düğümü hasarı histolojik olarak daha hafif görünmüştür; ancak toplam lezyon skorlarında PRRSV grubuna karşı istatistiksel anlamlı fark gösterilmemiştir.
• IL-1β, IL-6, IL-8 ve TNF-α gün 7 ve 14'te PRRSV + baikalin grubunda daha düşük bulunmuştur.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• Baikalinin enfeksiyon kurulduktan sonra etkili bir PRRSV tedavisi olduğunu göstermez.
• Baikalinin aşıların yerini alabileceğini göstermez; kaynak onu potansiyel tamamlayıcı müdahale olarak konumlandırır.
• Baikalinin attachment aşamasındaki doğrudan moleküler hedefini belirlemez.
• Baikalinin viral partiküle mi yoksa hücresel attachment faktörüne mi bağlandığını belirlemez.
• Baikalinin sitokinleri viral yükten bağımsız doğrudan mekanizmayla düşürdüğünü kanıtlamaz.
• 4/5'e karşı 1/5 sağkalım farkının istatistiksel olarak kesin olduğunu göstermez.
• Tek SCSN2020 suşundaki sonuçların bütün PRRSV-1 ve PRRSV-2 varyantlarında geçerli olduğunu göstermez.
• 0,1 g/kg yem dozunun optimum doz olduğunu göstermez.
• Uzun dönem ticari sürü güvenliği veya performansını doğrulamaz.

Temel sınırlılıklar

1. Profilaktik başlangıç: Baikalin challenge'dan iki gün önce verilmiştir.
2. Post-challenge tedavi grubu yoktur: Yerleşmiş enfeksiyon üzerindeki terapötik etkinlik bilinmemektedir.
3. Küçük hayvan grubu: Her grupta yalnız beş domuz yavrusu bulunmaktadır.
4. Tek doz: Hayvan deneyinde yalnız 0,1 g/kg yem dozu kullanılmıştır.
5. Tek viral suş: SCSN2020 değerlendirilmiş, genetik olarak farklı PRRSV suşları test edilmemiştir.
6. Tek primer hücre sistemi: İn vitro analiz PAM'larla yapılmış; MARC-145 gibi başka sistemler kullanılmamıştır.
7. Moleküler hedef bilinmiyor: Binding ve receptor-dependency deneyleri yapılmamıştır.
8. İmmün mekanizma sınırlı: Tip I interferonlar, interferon-stimulated genes, NK aktivitesi, PRRSV'ye özgü T hücreleri ve nötralizan antikorlar ölçülmemiştir.
9. Oral biyoyararlanım: Baikalinin oral emilimi sınırlıdır ve formülasyon optimizasyonu yapılmamıştır.

Kaynak içi raporlama notları

İn vitro sonuçların 3.2 bölümünde hücre kültürü uygulaması için “prophylactic dietary baicalin supplementation” ifadesi kullanılmıştır; buna karşılık yöntem bölümü PAM'lara kültür ortamında baikalin uygulandığını açıkça tanımlamaktadır. Verianla in vitro yöntemi Methods 2.4'e göre aktarmakta ve “dietary” sözcüğünü hücre deneyinin gerçek prosedürü gibi çoğaltmamaktadır.

Ayrıca yöntem bölümündeki CCK-8 denklemi “cell viability inhibition rate” olarak adlandırılırken sonuç grafiği “cell viability (% of Mock)” gösterir. Verianla bu kaynak içi terminoloji farkını yeni bir formülle düzeltmemektedir.

Gelecek araştırmalar

Kaynağa göre gelecekteki çalışmalar post-challenge tedavi zamanlarını, doz–yanıt ilişkisini ve terapötik pencereyi doğrudan değerlendirmelidir.

Antiviral genişlik HP-PRRSV, NADC30-like, NADC34-like ve genetik olarak farklı PRRSV-1/PRRSV-2 suşlarında sınanmalıdır.

Baikalinin virüse veya hücresel attachment faktörlerine doğrudan bağlanıp bağlanmadığını belirlemek için nicel binding yöntemleri ve receptor-dependency deneyleri gereklidir.

Oral biyoyararlanımı yükseltmeyi amaçlayan formülasyon stratejileri ve ticari üretim koşullarında bağımsız doğrulamalar, yem katkısı olarak standartlaştırma öncesinde ayrıca değerlendirilmelidir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: Antiviral Activity of Baicalin Against PRRSV In Vitro and in Infected Piglets

Yazarlar: Zhiping Lu; Lei Xu; Dike Jiang; Ruijiao Jiang; Tianxiang Chen; Chunlin Fang; Hongli Jiang; Zili Li

Eş katkı: Zhiping Lu ve Lei Xu

Sorumlu yazar: Zili Li

Kurum 1: Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine of Hubei Province, College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

Kurum 2: College of Animal Science and Veterinary Medicine, Chengdu Agricultural College, Chengdu 611130, China

Dergi: Veterinary Sciences

Yayınevi: MDPI

Yayın türü: Hakemli, açık erişim deneysel araştırma makalesi

Bibliyografik kayıt: Veterinary Sciences, 2026, 13(9), 915

DOI: 10.3390/vetsci13090915

Gönderim: 11 Ağustos 2026

Revizyon: 31 Ağustos 2026

Kabul: 2 Eylül 2026

Yayın: 6 Eylül 2026

Lisans: Creative Commons Attribution (CC BY).

Ana araştırma türü: Primer hücre kültüründe aşama-özgül antiviral deneyler + deneysel PRRSV enfeksiyonlu domuz yavrusu çalışması.

Virüs: Yüksek patojeniteli PRRSV-2 SCSN2020.

Hücre sistemi: Primer porcine alveolar macrophages (PAMs).

Ana in vitro yöntemler: CCK-8 hücre canlılığı; TCID50 virüs titrasyonu; qRT-PCR; direct virucidal, attachment, entry, intracellular replication ve progeny-release aşama testleri.

Hayvan örneklemi: 20 adet 21 günlük dişi Yorkshire domuz yavrusu; dört grup, n=5.

Hayvan baikalin dozu: 0,1 g/kg yem; challenge'dan iki gün önce başlayarak deney boyunca.

Challenge: 3 mL SCSN2020, \(10^6\) TCID50/mL, intranazal.

Temel örnekleme günleri: 3, 7, 14, 17 ve 21.

Histopatoloji: %4 paraformaldehit fiksasyonu; 4 µm parafin kesit; H&E; Nikon Eclipse 50i.

Sitokinler: Serum IL-1β, IL-6, IL-8 ve TNF-α; ELISA.

İstatistik yazılımı: GraphPad Prism 9.5.1.

Etik: Chengdu Agricultural College Ethics Committee; protokol 2025030001001; onay tarihi 11 Mart 2025.

Bilgilendirilmiş onam: Uygulanabilir değil.

Finansman: Tianfu Qingcheng Project (Tianfu Agricultural Master), grant 20221226; Rongcheng Talent Program, grant 20250925.

Veri erişilebilirliği: Özgün katkıların makale içinde bulunduğu; ek soruların ilk yazarlara yöneltilebileceği belirtilmiştir.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması bildirmemiştir.

Yazar katkıları: Kavramsallaştırma Zili Li ve Zhiping Lu; metodoloji Zhiping Lu, Dike Jiang ve Lei Xu; yazılım Zhiping Lu ve Lei Xu; doğrulama Ruijiao Jiang, Tianxiang Chen ve Hongli Jiang; formel analiz Zhiping Lu ve Zili Li; araştırma Zhiping Lu ve Chunlin Fang; kaynaklar Zhiping Lu ve Zili Li; veri düzenleme Zhiping Lu ve Dike Jiang; ilk taslak Zhiping Lu, Lei Xu ve Dike Jiang; gözden geçirme/düzenleme Tianxiang Chen ve Chunlin Fang; görselleştirme Zhiping Lu ve Lei Xu; gözetim Zili Li; proje yönetimi Zhiping Lu ve Hongli Jiang; fon edinimi Zhiping Lu tarafından yürütülmüştür.

En önemli yorum sınırı: Hayvan deneyindeki baikalin uygulaması enfeksiyondan önce başlatıldığı için bulgular profilaktik besinsel müdahale için proof-of-concept niteliğindedir; yerleşmiş PRRSV enfeksiyonunun tedavisine ilişkin kanıt değildir.

Sağkalım sınırı: 4/5'e karşı 1/5 gözlenen sağkalım farkı log-rank ve Fisher testlerinde istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır.

İmmün mekanizma sınırı: Daha düşük sitokin düzeyleri doğrudan baikalin immünomodülasyonu ile daha düşük viral yükün ikincil etkisi arasında güvenilir biçimde ayrıştırılamamıştır.

Moleküler hedef sınırı: Attachment aşaması ana saptanabilir etki noktasıdır; ancak doğrudan viral veya hücresel hedef belirlenmemiştir.

Kaynak içi terminoloji notu: İn vitro sonuçlarda geçen “dietary” ifadesi hücre kültürü yönteminin gerçek uygulama biçimiyle uyumlu değildir; ayrıca CCK-8 denklem adı ile Şekil 1'in “cell viability” sunumu farklı terminoloji kullanmaktadır.

Görsel yeniden çizim: PRRSV yaşam döngüsü ve attachment odaklı etki şeması, hücre konsantrasyon–yanıt mantığı, hayvan deney tasarımı, viremi/saçılım zaman serileri ve klinik/patolojik karşılaştırmalar Verianla için özgün biçimde yeniden kurulabilir. Histopatoloji görüntülerinin kendisi deneysel kanıt olduğundan sahte H&E/mikroskopi üretmek yerine kaynak görüntüsünün lisanslı kullanımı veya açıklayıcı şema tercih edilmelidir.

Verianla Live uygunluğu: Live Process, Live Line, Live Compare ve Live Data için yüksek derecede uygundur. Kaynak dışı doz–yanıt veya tedavi sonucu hesaplayan kullanıcı kontrollü simülasyon uygun değildir.