PAK4-YAP сигналдык огу бул изилдөөдө активдешкен боордук жылдыз сымал клеткаларда p21-activated kinase 4 (PAK4) Yes-associated proteinди (YAP) адам белогундагы T428 аймагында фосфорлоп, YAP белогунун туруктуулугун, ядродо топтолушун жана транскрипциялык активдүүлүгүн жогорулатып; мунун натыйжасында боордук жылдыз сымал клеткалардын активдешүүсүн жана боор фиброгенезин колдогон жөнгө салуучу механизм болуп саналат. Изилдөөчүлөр бул окту адамдын боор ткандарында, баштапкы чычкан боордук жылдыз сымал клеткаларында, LX-2 адам HSC линиясында, ар түрдүү чычкан фиброз моделдеринде, HSCге мүнөздүү Pak4 генин өчүрүү тажрыйбаларында, RNA-seq анализдеринде, белок-белок өз ара аракеттенүүсү жана киназа тесттеринде, мутагенезде, LC-MS/MSде, молекулалык моделдөөдө жана PAK4 ингибитору ND201651 менен фармакологиялык тажрыйбаларда изилдешкен.

Изилдөөнүн негизги табылгасы PAK4 фиброздук боордо гана көбөйгөн белок эмес экендиги. PAK4 YAP менен физикалык өз ара аракеттенери, адамдын YAP белогун мурда аныкталбаган T428 треонин калдыгында түздөн-түз фосфорлору жана бул өзгөрүү YAPтын убиквитин-протеасома системасы аркылуу бузулушун азайтып, белокту туруктуу кылаары көрсөтүлгөн. Турукташкан YAP ядродо көбүрөөк топтолуп, TEADга көз каранды транскрипциялык активдүүлүгү жогорулап, CTGF, CCN1 жана коллагенге байланышкан профиброздук ген программалары күчөгөн.

PAK4тү генетикалык жол менен басаңдатуу баштапкы HSСлерде α-SMA жана COL1A1 сыяктуу фиброгендик көрсөткүчтөрдү азайткан; клеткалардын пролиферациясы, миграциясы жана коллаген гелинин жыйрылышы сыяктуу активдешкен HSC фенотиптерин баскан. HSCге мүнөздүү Pak4тү өчүрүү көмүртек тетрахлориди (CCl₄) жана өт түтүгүн байлоо (BDL) менен түзүлгөн чычкан фиброз моделдеринде коллагендин топтолушун, гидроксипролиндин көлөмүн, α-SMA аянтын жана фиброгендик гендердин экспрессиясын азайткан.

Механизмдин себептик маанисин текшерүү үчүн адам YAPындагы T428ге туура келген чычкан Yap T413 аймагы фосфорлонбой тургандай кылып аланинге алмаштырылган. HSСлерде phospho-inactive Yap^T413A мутантынын экспрессиясы кадимки WT-Yap экспрессиясынан айырмаланып CCl₄ менен байланышкан боор фиброзун күчөткөн эмес; тескерисинче, коллагендин топтолушун жана HSC активдешүүсүн азайткан. Клетка тажрыйбаларында адамдын YAP^T428A мутанты тезирээк убиквитинделип жана бузулуп, ядродо азыраак топтолгон жана төмөн транскрипциялык активдүүлүк көрсөткөн. Фосфорлоону тууроочу YAP^T428E болсо тескери багытта аракеттенген.

Адамдын боор ткандарында PAK4 жана YAP экспрессиясы нормалдуу ткандан фиброзго жана циррозго карай жогорулаган; T428-фосфорлонгон YAP да оорунун оордугу менен кошо көбөйгөн. Бирок адам маалыматтары байкоочулук мүнөздө. Адамдарда PAK4 ингибициясы колдонулган эмес жана клиникалык дарылоонун ийгилиги текшерилген эмес. Изилдөөдөгү дары аралашуусу CCl₄ менен фиброз түзүлгөн чычкандарда ооз аркылуу ND201651 колдонуу менен жүргүзүлгөн. Ошондуктан жыйынтыктар күчтүү преклиникалык механизмди жана бута ырастоосун сунуштаганы менен, адамдарда далилденген антифиброздук дарылоо катары түшүндүрүлбөйт.

Боор фиброзунда боордук жылдыз сымал клетка эмне үчүн борбордук клетка болуп саналат?

Боордук жылдыз сымал клеткалар (hepatic stellate cells, HSCs) ден соолуктагы боордо негизинен тынч, башкача айтканда quiescent абалда болуп, негизинен витамин A камтыган липид тамчыларын сактаган клеткалар. Боор узакка созулган же катуу жабыркаганда HSCлер активдешип, myofibroblast сымал фенотипке өтөт. Бул өзгөрүүдөн кийин клеткадан тышкаркы матрикстин, өзгөчө коллагендин өндүрүлүшү кыйла жогорулайт. Фиброз — ушул матрикстин кадимки ткандын архитектурасын буза тургандай топтолушу.

Активдешкен HSCлер коллаген чыгарган гана клеткалар эмес. Алардын пролиферациясы өсүшү, жабыркаган аймактарга көчүшү жана жыйрылуучу касиетке ээ болушу мүмкүн. Ошондуктан изилдөөчүлөр PAK4түн таасирин бир эле коллаген маркеринде эмес; фиброздук активдүүлүк, пролиферация, миграция жана жыйрылуучулук сыяктуу бир нече HSC фенотипинде баалашкан.

α-SMA жана COL1A1 эмнени көрсөтөт?

α-SMA alpha-smooth muscle actin дегендин кыскартылышы жана HSCнин quiescent абалдан myofibroblast сымал активдешкен абалга өтүшүн көзөмөлдөө үчүн кеңири колдонулган көрсөткүчтөрдүн бири. COL1A1 болсо I типтеги коллагендин альфа-1 чынжырын коддогон ген/белок. I типтеги коллаген фиброздук экстрацеллюлярдык матрикстин маанилүү курамдык бөлүктөрүнүн бири. Демек α-SMAнын азайышы HSC активдешүүсүнүн; COL1A1 жана коллагенге байланышкан башка гендердин азайышы болсо фиброгендик матрикс өндүрүшүнүн басаңдаганын көрсөтөт.

PAK4 деген эмне жана S474 эмне үчүн өлчөндү?

PAK4 — p21-activated kinase үй-бүлөсүнүн II тобуна кирген серин/треонин белок киназасы. Белок киназалары бута белоктордогу белгилүү аминокислота калдыктарына фосфат тобун кошуу аркылуу белоктордун активдүүлүгүн, туруктуулугун, клетка ичиндеги жайгашуусун же башка белоктор менен өз ара аракеттенүүсүн өзгөртө алат.

PAK үй-бүлөсү I топ PAK1-3 жана II топ PAK4-6 болуп классификацияланат. Изилдөөдө жалпы PAK4 көлөмү гана эмес, PAK4түн S474, башкача айтканда 474. аминокислотадагы серин калдыгынын фосфорлонуусу да өлчөнгөн. PAK4түн активдешүүсү менен байланышкан автофосфорлонуусуна байланыштуу p-PAK4(S474) PAK4 активдүүлүгүнүн көрсөткүчү катары колдонулган.

Биринчи табылга: PAK4 фиброздук жана активдешкен HSCлерде көбөйөт

CCl₄ менен түзүлгөн чычкан боор фиброзунда жалпы PAK4 жана p-PAK4(S474) HSC активдешүү көрсөткүчү α-SMA менен кошо көбөйгөн. Ошол эле тенденция өт түтүгүн байлоо (BDL) моделинде жана choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet (CDAHFD) моделинде да бааланган.

Иммунофлуоресценциялык анализдер PAK4 сигналы өзгөчө α-SMA-оң активдешкен HSC популяциясы менен бирге жогорулаганын көрсөткөн. Бул айырма маанилүү; анткени бүтүндөй боор тканында бир белоктун көбөйүшү ал белок сөзсүз жылдыз сымал клеткада көбөйдү дегенди билдирбейт. PAK4 менен α-SMAнын бир клеткаларда бирге көрсөтүлүшү HSC контекстин бекемдеген.

Адам үлгүлөрү кантип колдонулду?

Адамдын боор ткандары Jeonbuk National University Hospitalда боор резекциясы, трансплантациясы же биопсиясы жүргүзүлгөн адамдардан Ноябрь 2017-Май 2023 аралыгында чогултулган. Үлгүлөр баштапкы патологиялык отчеттордогу гистологиялык METAVIR стадиясына ылайык нормалдуу, фиброз жана цирроз топторуна бөлүнгөн.

Когорттун негизги этиологиясы өнөкөт гепатит B вирусунун инфекциясы; мындан тышкары гепатит C, метаболикалык дисфункцияга байланышкан стеатоздук боор оорусу жана алкоголь менен байланышкан боор оорусунун үлгүлөрү бар. Булак цирроз тобундагы бардык бейтаптарда компенсацияланган цирроз болгонун белгилейт.

Адам ткандарын анализдөөдө PAK4 жана α-SMA бирге оң болгон клеткалардын үлүшү фиброздун оордугу менен көбөйгөн. Андан кийин HSC деңгээлинде YAP жана PAK4 экспрессиясынын ортосунда оң байланыш көрсөтүлгөн; булак Figure 6iде PAK4-оң жана YAP-оң HSC популяциялары үчүн r=0.6666 жана P<0.0001 деп билдирген. Мындан тышкары p-YAP(T428) белогу нормалдуу ткандан фиброзго жана циррозго карай жогорулаган.

Бул жерде маанилүү илимий чек мындай: адам үлгүлөрүндө байкалган байланыш PAK4 бейтаптарда фиброзду жалгыз өзү себептик түрдө пайда кылат дегенди далилдебейт. Себептүүлүк жөнүндөгү пикирди бекемдеген негизги тажрыйбалар — генетикалык өчүрүү, киназа тести, мутация жана чычкандагы аралашуулар.

PAK4 эмне үчүн активдешкен HSCде көбөйөт?

Баштапкы чычкан HSCлери quiescent абалдан активдешкен абалга өткөндө PAK4 белогу гана эмес, Pak4 mRNAсы да көбөйгөн. Бул табылга көбөйүү жок дегенде жарым-жартылай транскрипциялык деңгээлде жүрүшү мүмкүн экенин көрсөткөн.

Изилдөөчүлөр Evolutionary Conserved Regions скрининги менен адам жана чычкан PAK4/Pak4 проксималдык promoter аймактарында транскрипция факторлору байланышышы мүмкүн болгон эки жерди аныкташкан: HIF-1α жана YY1.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) тажрыйбалары HIF-1α жана YY1 PAK4 promoter аймактарына байланышарын көрсөткөн. LX-2 клеткаларында HIF-1α же YY1ди siRNA менен басаңдатуу PAK4 экспрессиясын азайткан. Ошентип, изилдөө PAK4түн көбөйүшү активдешкен HSCнин транскрипциялык кайра программаланышы менен байланыштуу экенин колдойт.

ChIP тажрыйбасы эмнени көрсөтөт?

ChIP — белгилүү DNA-байланыштыруучу белок клетканын ичинде кайсы геномдук аймакка байланышарын текшерүү үчүн колдонулган ыкма. Бул тажрыйбадагы суроо “HIF-1α жана YY1 чындап эле PAK4 promoter аймагына байланышабы?” деген түрдө. ChIP жыйынтыгы эки ген бир учурда экспрессияланарын гана эмес, транскрипция факторунун тиешелүү promoter DNAсы менен физикалык байланышын текшерет.

PAK4 жоголгондо HSCде эмне болот?

Баштапкы чычкан HSCлеринде эки өзүнчө генетикалык ыкма колдонулган. Биринчи ыкмада Pak4^f/f чычкандарынан бөлүнүп алынган HSCлер үч күн өстүрүлүп, андан кийин Cre рекомбиназа алып жүргөн аденовирус менен жугузулуп, дагы үч күн өстүрүлгөн. Экинчи ыкма wild-type баштапкы HSCлерде siRNA менен Pak4 knockdown жүргүзүү.

Эки ыкмада тең PAK4түн жоголушу α-SMA жана I типтеги коллаген деңгээлдерин азайтып, Acta2, Des, Col1a1, Col1a2, Serpine1, Timp1 жана Col7 сыяктуу фиброгендик гендердин экспрессиясын төмөндөттү.

PAK4тү басаңдатуу HSC пролиферациясын жана миграциясын да азайтып, collagen gel contraction тажрыйбасында жыйрылуучу жөндөмдү баскан. Ошентип PAK4түн таасири коллаген экспрессиясындагы бир гана өзгөрүүгө кыскартылган эмес.

RNA-seq анализи эмне үчүн жүргүзүлдү?

Өзүнчө тандалган фиброз гендерин өлчөө изилдөөчүнүн алдын ала билген буталарына көңүл бурат. RNA sequencing (RNA-seq) болсо бүтүндөй транскриптом деңгээлиндеги өзгөрүүлөрдү бейтарапыраак кароого мүмкүнчүлүк берет.

PAK4 knockdown HSCлерде n=4 биологиялык кайталоо менен жүргүзүлгөн RNA-seqден кийин Gene Ontology анализи экстрацеллюлярдык матрикстин уюшулушу, клетка миграциясы жана пролиферация менен байланышкан ген программалары өзгөргөнүн көрсөткөн. Gene Set Enrichment Analysis болсо коллаген түзүлүшү менен байланышкан ген топтомдору PAK4 жоголгондо төмөн жөнгө салынганын көрсөткөн.

GO менен GSEAнын айырмасы эмнеде?

Gene Ontology анализи өзгөргөн гендер кайсы биологиялык процесстерде топтолгонун классификациялайт. GSEA болсо гендерди “маанилүү/маанилүү эмес” деп гана бөлбөстөн, толук иреттелген экспрессия тизмесиндеги белгилүү ген топтомдору тизменин жогорку же төмөнкү бөлүгүндө системалуу топтолобу же жокпу, ошону баалайт. Бул изилдөөдө эки ыкма тең PAK4 жоголушу фиброгендик HSC программасын басат деген багытта жыйынтык берген.

HSCге мүнөздүү Pak4 өчүрүү чычканда кантип жасалды?

Pak4-floxed чычкандары Pdgfr-β-CreERT2 чычкандары менен аргындаштырылып Pak4^ΔHSC модели түзүлгөн. CreERT2ни активдештирүү жана активдешкен HSCлерде Pak4 генин өчүрүү үчүн тамоксифен intraperitoneal түрдө 75 mg/kg/күн дозасында удаалаш беш күн берилген.

Бул ыкма бүт денедеги Pak4 генин өчүрүүнүн ордуна бута клетка популяциясына көбүрөөк багытталат. Ошентип байкалган фиброз өзгөрүүсүнүн HSC ичиндеги PAK4 функциясы менен байланышы системалык фармакологиялык ингибицияга караганда түзүрөөк текшерилиши мүмкүн.

CCl4 фиброз модели

Сегиз жумалык эркек чычкандарда CCl₄ corn oil vehicle менен салыштырылып, 0.6 mL/kg дозасында жумасына эки жолу, жалпысынан алты жума intraperitoneal берилген. CCl₄ боордо кайталанган гепатоцеллюлярдык жабыркоо жаратып, фиброздук жоопту козгогон эксперименттик модель.

BDL фиброз модели

Экинчи моделде сегиз жумалык эркек чычкандарга sham операция же bile duct ligation жасалып, жаныбарлар эки жумадан кийин бааланган. BDL өт агымын хирургиялык жол менен бөгөп, холестаздык боор жабыркоосун жана фиброзду жараткан, механизми боюнча CCl₄дөн айырмаланган модель.

CDAHFD эмне үчүн колдонулду?

Алты жумалык C57BL/6N эркек чычкандар normal chow diet же %60 kcal май жана %0.1 метионин камтыган, кошумча холини жок choline-deficient, L-amino acid-defined high-fat diet менен 12 жума багылган. Изилдөө бул моделди PAK4 экспрессиясы ар башка фиброз контексттеринде жогорулай турганын көрсөтүү үчүн колдонгон.

HSC-спецификалык Pak4 жоголушунун in vivo жыйынтыгы

CCl₄ тажрыйбасында LT-Vehicle n=6, LT-CCl₄ n=8, Pak4^ΔHSC-Vehicle n=4 жана Pak4^ΔHSC-CCl₄ n=6. BDL тажрыйбасында LT-Sham n=3, LT-BDL n=6, Pak4^ΔHSC-Sham n=3 жана Pak4^ΔHSC-BDL n=6.

HSC пролиферациясы да PCNA жана α-SMA кош-оң клеткалар боюнча азайган. Бирок cleaved caspase-3 жана α-SMA кош бойоосу HSC апоптозунда олуттуу өзгөрүү көрсөткөн эмес. Бул айырма фиброздун азайышы HSCлер көбүрөөк өлгөндөн гана эмес экенин; HSC активдешүүсү жана көбөйүшүнүн басылышы маанилүү экенин колдойт.

Сывороткадагы ALT жана AST активдүүлүктөрүнүн HSC-спецификалык Pak4 knockout моделдеринде олуттуу өзгөрбөшү да изилдөөчүлөрдүн HSCге мүнөздүү таасир жөнүндөгү түшүндүрмөсүн колдогон кошумча табылгалардын бири.

PAK4 менен YAPтын ортосундагы байланыш кантип табылды?

PAK4 жоголгон HSCлердин RNA-seq жыйынтыктарында KEGG pathway анализи Hippo signaling pathway өзгөргөнүн көрсөткөн. GeneMANIAга негизделген тармак анализи YAPты бул өзгөргөн тармак менен тыгыз байланышкан борбордук молекулалардын бири катары көрсөткөн.

Баштапкы HSC активдешүүсү учурунда YAP белогу PAK4кө параллелдүү көбөйгөн. WT-PAK4түн ашыкча экспрессиясы YAP-responsive luciferase активдүүлүгүн жана CTGF менен CYR61/CCN1 сыяктуу YAP бута гендерин көбөйткөн, ал эми каталитикалык активдүүлүгү бузулган PAK4^S474A мутанты мындай таасирлерди көрсөткөн эмес.

Бул жыйынтык PAK4 YAP менен бирге эле турган белок эмес экенин; PAK4түн киназа активдүүлүгү YAP функциясы үчүн зарыл экенин көрсөтөт.

YAP деген эмне?

Yes-associated protein (YAP) Hippo signaling pathwayнин негизги транскрипциялык коактиваторлорунун бири. YAP DNAга түздөн-түз байланышкан классикалык транскрипция фактору эмес; ядродо TEAD үй-бүлөсү сыяктуу DNA-байланыштыруучу өнөктөштөр менен комплекс түзүп, CTGF, CCN1 жана башка пролиферативдик/фиброгендик бута гендердин транскрипциясын колдойт.

YAPтын биологиялык таасири жалпы белок көлөмү менен гана аныкталбайт. Белоктун фосфорлонуу абалы, туруктуулугу, цитоплазма/ядро бөлүштүрүлүшү жана убиквитин-протеасома системасы тарабынан канчалык тез бузулары да маанилүү.

PAK4 YAPты T428де Фосфорлогондо Эмне Өзгөрөт?

PAK4 тарабынан адам YAPындагы T428 треонин калдыгынын фосфорлонуусу YAP убиквитинделишин азайтып, белоктун бузулушун жайлатат, YAP белогунун туруктуулугун жана ядродо топтолушун жогорулатат жана TEADга көз каранды транскрипциялык активдүүлүктү күчөтөт; изилдөөнүн клетка жана чычкан тажрыйбаларында бул чынжыр күчтүүрөөк HSC активдешүүсү жана фиброгенез менен байланышкан.

PAK4-YAP физикалык өз ара аракеттенүүсү кантип көрсөтүлдү?

Co-immunoprecipitation (Co-IP) бир белок антитело менен чөктүрүлгөндө ага байланышкан башка белок да комплекс ичинде кошо келеби же жокпу, ошону изилдейт. Co-IP тажрыйбаларында PAK4 жана YAP бир эле белок комплексинде табылган.

Proximity ligation assay (PLA) клетканын ичинде эки белок бири-бирине өтө жакын физикалык аралыкта жайгашканын флуоресценция сигналы аркылуу көрсөтүүчү ыкма. PLA да PAK4-YAP жакындыгын колдогон.

Маанилүү спецификалык контрол катары PAK4 YAPтын паралогу TAZ менен ошондой эле байланышкан эмес. Бул жыйынтык PAK4 бүт YAP/TAZ үй-бүлөсүн айырмасыз бутага албай турганын көрсөтөт.

PAK4 YAPты түздөн-түз фосфорлой турганы кантип көрсөтүлдү?

Рекомбинанттык адам PAK4 жана YAP колдонулган клеткасыз in vitro kinase assay PAK4 YAPты түздөн-түз фосфорлой аларын көрсөткөн. Тажрыйба учурунда PAK4түн өзүнүн автофосфорлонуусу да көзөмөлдөнгөн.

WT-PAK4 YAPтын треонин фосфорлонуусун көбөйткөн, ал эми kinase-dead PAK4^S474A мутанты ушундай көбөйүүнү жараткан эмес. Серин фосфорлонуусунда ошол эле көрүнүш болбогону изилдөөчүлөрдү треонин калдыктарына багыттаган.

T428 аймагы кантип табылды?

PhosphoNET жана PhosphoSitePlus сыяктуу in silico фосфорлонуу аймагын болжолдоочу куралдар YAPтын беш талапкер аймагын сунуштаган. Бул талапкерлерди камтыган олигопептиддер менен жүргүзүлгөн competition тажрыйбалары PAK4 өзгөчө T428 аймагын бутага аларын көрсөткөн.

T428 фосфорлонуусу кийин site-specific liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) анализи менен колдоого алынган. Бул ыкма белок/пептиддерди масса/заряд жүрүм-турумуна жараша бөлүп, белгилүү пептиддердеги post-translational modificationларды аныктоого мүмкүндүк берет.

Молекулалык моделдөө эмнени көрсөттү жана эмнени көрсөткөн жок?

Изилдөөчүлөр адам YAPындагы T428ди камтыган 423MDTGDTINQST433 пептид сегментин PAK4түн catalytic domainине dock кылып, андан соң стерикалык кагылышууларды азайтуу жана белок-пептид интерфейсин бошоңдатуу максатында backbone restraints камтыган кыска molecular dynamics симуляцияларын колдонушкан.

Алынган моделдерде YAP T428 аймагы PAK4түн каталитикалык чөнтөгүнө багытталып, треонин hydroxyl тобу каталитикалык калдыкка суутек байланышынын аралыгында жайгашкан.

Бул модель “PAK4-T428 фосфорлонуусунун өзү компьютерде далилденди” дегенди билдирбейт. Molecular docking жана MD реакция структуралык жактан мүмкүн экенине түшүндүрүүчү колдоо берет. Түз биохимиялык далил kinase assay, мутагенез, peptide competition жана LC-MS/MSден келип чыгат.

Жаңы p-T428-YAP антителосу эмне үчүн жасалды?

T428 мурда YAPтын жакшы аныкталган фосфорлонуу аймактарынын бири болбогондуктан, изилдөөчүлөр T428-фосфорлонгон YAPты атайын өлчөө үчүн жаңы polyclonal antibody жасашкан.

Адам YAP T428 аймагын камтыган EMDTGD[pT]INQSTL phosphopeptide синтезделип, keyhole limpet hemocyaninге байланыштырылган жана коёндорду иммундаштырууда колдонулган. Антитело титрлери фосфорлонгон жана фосфорлонбогон пептиддерге каршы ELISA менен бааланган.

Сыворотка protein A/G chromatography жана андан кийин фосфорлонгон peptideге өзгөчө affinity purification менен тазаланган. Антителонун T428-фосфорлонгон peptideге тандалмалуулугу ELISA жана peptide competition тажрыйбалары менен ырасталган.

PAK4 басаңдатылганда T428 фосфорлонуусу эмне үчүн толугу менен жок болгон жок?

LX-2 клеткаларында PAK4 knockdownдан кийин p-YAP(T428) сигналы олуттуу азайган, бирок толугу менен жоголгон эмес. Авторлор мунун эки мүмкүн түшүндүрмөсүн ачык көрсөтөт: тажрыйба шартында PAK4 басаңдатуусу толук болбогону жана/же T428ди фосфорлой алган азырынча аныкталбаган башка киназалардын болушу.

Ошондуктан изилдөө “YAP T428ди биологиялык жактан PAK4 гана фосфорлой алат” деген жыйынтыкты колдобойт. Колдоого алынган жыйынтык — PAK4 T428ди түздөн-түз фосфорлой алган жана бул аймакта маанилүү жөнгө салуучу ролу бар киназа.

PAK4 YAP көлөмүн mRNA аркылуу көбөйтөбү?

Баштапкы HSCлерде PAK4 knockdown YAP белогунун көлөмүн азайткан, бирок Yap mRNAсын олуттуу өзгөрткөн эмес. Бул PAK4түн YAPка негизги таасири транскрипция деңгээлинде жаңы YAP өндүрүшүн көбөйтүүдөн көрө белок туруктуулугуна байланыштуу экенин көрсөткөн.

CHX chase тести эмнени өлчөйт?

Cycloheximide (CHX) жаңы белок синтезин ингибирлейт. Жаңы YAP өндүрүшү токтотулгандан кийин бар болгон YAP убакыт өткөн сайын канчалык тез азайганы көзөмөлдөнсө, белоктун туруктуулугу жөнүндө маалымат алууга болот.

PAK4түн ашыкча экспрессиясы YAPтын CHX бар шартта узагыраак сакталышын камсыз кылган. Ал эми phospho-inactive YAP^T428A тезирээк жоголгон. Бул жыйынтык T428 фосфорлонуусу YAP белогунун өмүрүн узарткан функционалдык таасирге ээ экенин колдойт.

Убиквитинделүү эмне үчүн маанилүү?

Убиквитин — бута белокторду клетка ичинде, өзгөчө протеасомалык бузулууга жөнөтүүдө колдонулган кичинекей белги белогу. Белоктун жогорку деңгээлде polyubiquitinationга учурашы көп учурда аны протеасома тарабынан бузууга даярдоо менен байланыштуу.

PAK4 overexpression YAP убиквитинделишин азайткан. PAK4 knockdownдан улам пайда болгон YAP туруксуздугу E3 ubiquitin ligase β-TRCP басаңдатылганда кайра калыбына келген, ал эми FBXW7 knockdown мындай коргоону берген эмес. Ошондуктан изилдөө PAK4-YAP туруктуулук байланышында β-TRCPни өзгөчө белгилейт.

LATS1 менен PAK4 бирдей фосфорлоону аткарабы?

Жок. Каноникалык Hippo signaling pathway ичинде LATS1дин YAPтагы белгилүү ингибирлөөчү аймактарынын бири S127. S127 фосфорлонуусу 14-3-3 байланышын, цитоплазмада кармалып турушун жана YAP ингибициясын колдойт.

PAK4 болсо бул изилдөөдө YAPты T428де активдештирүүчү багытта фосфорлогон башка киназа катары көрсөтүлгөн. PAK4 knockdown LATS1дин жалпы көлөмүн же T1079-фосфорлонгон активдүү LATS1 деңгээлин өзгөрткөн эмес. PAK4түн YAPты туруктуу кылуучу таасири LATS1 knockdown шартында да уланган.

Phosphomimetic YAP^T428E мутанты мындан тышкары LATS1 тарабынан козголгон YAP деградациясына туруктуураак болгон. Бул жыйынтыктар PAK4-T428 огу LATS1дин каноникалык ингибиция механизмин жогору жактан гана күйгүзүп-өчүргөн кыйыр таасирден айырмаланарын колдойт.

YAPT428A жана YAPT428E Мутациялары Эмнени Текшерет?

YAP^T428Aда фосфорлонуучу треонин аланинге алмаштырылып, T428 фосфорлонуусунун болушу токтотулат; YAP^T428Eде треонин глутаматка алмаштырылып, фосфорлонгон аймактын терс заряды жарым-жартылай тууралат. Бул карама-каршы мутанттар T428 фосфорлонуусу жөн гана кошо көрүнгөн белги же YAP туруктуулугуна, клетка ичиндеги жайгашуусуна жана транскрипциялык функциясына функционалдык жөнгө салуучу таасир береби, ошону текшерүү үчүн колдонулган.

T428A мутантынын жыйынтыгы

PAK4 бар учурда WT-YAPка салыштырмалуу YAP^T428A көбүрөөк убиквитинделип, CHX chase учурунда тезирээк бузулган. Ошол эле мутант клеткаларда көбүрөөк цитоплазмада кармалып, төмөн YAP-responsive luciferase активдүүлүгүн көрсөткөн.

T428E мутантынын жыйынтыгы

Фосфорлоону тууроочу YAP^T428E мутанты тескери багытта аракеттенген; YAP туруктуулугу жана транскрипциялык активдүүлүк боюнча phospho-inactive мутанттан башкача жыйынтык берген. Ошентип T428 фосфорлонуу абалы YAP функциясын чындап өзгөртө алары колдоого алынган.

Адам T428 менен чычкан T413 эмне үчүн башка номерде?

Бир эле функционалдык аймак адам жана чычкан белок тизмектеринде аминокислоталардын номерлениши айырмалуу болгондуктан ар башка номер менен аталат. Адам YAPындагы T428 калдыгынын чычкан Yapтагы ортологдук дал келүүсү T413. Ошондуктан адам клетка тажрыйбаларындагы YAP^T428A менен чычкан in vivo тажрыйбасындагы Yap^T413A бир эле биологиялык фосфорлонуу чекитинин түрлөр аралык дал келүүлөрү.

YapT413A мутанты чычкан боорунда эмне кылды?

WT-Yap же phospho-inactive Yap^T413A HSCлерде тандалма экспрессия үчүн Col1a1 promoter башкарган лентивирустук векторлор менен жеткирилген. CCl₄ колдонуунун алгачкы эки жумасынан кийин control LV, LV-Yap же LV-Yap^T413A чычкандарга ретро-орбиталдык түрдө вена ичине түрдө 1×10⁸ TU/чычкан дозасында берилген; CCl₄ дагы төрт жума улантылган.

WT-Yap overexpression коллаген топтолушун жана фиброгендик жоопту күчөткөн. Ал эми Yap^T413A ошол эле фиброздук таасирди түзө алган эмес жана CCl₄ тобуна салыштырмалуу коллаген топтолушун да азайткан.

Механизм чынжырынын көз карандысыз Verianla схемасы

LATS1, β-TRCP жана PAK4 бир эле жөнгө салуучу тармакта кантип байланышат?

Каноникалык Hippo жолунда LATS1 YAPты S127де фосфорлоп, цитоплазмада кармоо жана деградация багытына жылдырат. β-TRCP болсо YAPтын убиквитинделүү жана деградация механизмине катышкан E3 лигазалардын бири. Изилдөө PAK4-T428 фосфорлонуусу YAPка мунун тескерисинче, башкача айтканда туруктуу кылуу жана активдештирүү багытында таасир этерин көрсөтөт.

Ошондуктан YAPтын жүрүм-туруму бир эле “күйгүзүү/өчүрүү” фосфорлонуусунан турбайт. Бир эле белок ар башка аймактардан фосфорлонгондо ар башка, атүгүл карама-каршы биологиялык натыйжалар болушу мүмкүн. S127 ингибирлөөчү багыттагы белгилүү аймак болсо, T428 бул изилдөөдө активдештирүүчү багытта аныкталган.

Адам тканындагы p-YAP(T428) жыйынтыгы эмне үчүн маанилүү?

Механизм культура клеткасында же эксперименттик чычканда гана иштеши адам оорусунда ошол эле биологиялык ог активдүү дегенди билдирбейт. Изилдөөчүлөрдүн атайын p-T428-YAP антителосу менен адам боор тканында жүргүзгөн анализи T428-фосфорлонгон YAP фиброз жана цирроздо көбөйөрүн көрсөткөн.

Бул табылга PAK4-YAP огу адам боор фиброзунда биологиялык жактан маанилүү экенин колдойт. Бирок адам маалыматтары observational мүнөздө болгондуктан, PAK4 ингибициясы бейтаптарда фиброзду азайтат деген жыйынтыкты ушул маалыматтан гана чыгарууга болбойт.

YAP менен PAK4 ортосундагы адам тканындагы корреляция кантип түшүндүрүлүшү керек?

Булак Figure 6iде PAK4-экспрессия кылган жана YAP-экспрессия кылган HSC популяцияларынын ортосунда r=0.6666 жана P<0.0001 оң корреляция көрсөтүлгөн. Оң r мааниси PAK4-оң HSC үлүшү көбөйгөн сайын YAP-оң HSC үлүшү да көбөйүүгө умтуларын көрсөтөт.

P<0.0001 нөл байланыш гипотезасында байкалган же андан да күчтүү байланыштын жөн гана кокустуктан пайда болуу ыктымалдыгы тест моделинин ичинде өтө төмөн экенин көрсөтөт. Бирок төмөн p мааниси байланышты себептүүлүккө айлантпайт жана таасирдин клиникалык көлөмүн өзүнчө түшүндүрбөйт.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Изилдөөнүн далил катмарлары

PAK4 ингибитору ND201651 эмне кылды?

ND201651 булакта ооз аркылуу колдонууга боло турган кичине молекулалуу тандалма PAK4 ингибитору катары сүрөттөлөт. Баштапкы чычкан HSCлеринде ND201651 YAP жана α-SMA белокторун, YAP буталары Ctgf жана Ccn1ди жана фиброгендик Acta2, Col1a1 жана Col1a2 экспрессиясын азайткан. Ошол эле клетка тажрыйбаларында булак колдонулган шарттарда клетка жашоого жөндөмдүүлүгү олуттуу таасирленбегенин билдирет.

In vivo тажрыйбада чычкандар алты жума CCl₄ колдонуу алып турганда, акыркы төрт жума бою ооз аркылуу ND201651 менен дарыланган.

ND201651 CCl₄ менен көбөйгөн p-PAK4, YAP жана p-YAP(T428) деңгээлдерин баскан; Ctgf/Ccn1 жана фиброгендик ген экспрессиясын азайткан. Sirius red жана Masson's trichrome гистологиясы менен hydroxyproline өлчөөсү коллаген/фиброз жүгү азайганын көрсөткөн.

30 mg/kg тобунда сывороткадагы ALT жана AST активдүүлүктөрү азайып, CCl₄ менен байланышкан дене салмагынын жоголушунда жакшыруу байкалган. Авторлор бул жыйынтыктарды дарылоонун пайдалуу таасирлери жана тажрыйба шартында көрүнүктүү системалык уулуулуктун жоктугу менен шайкеш деп түшүндүрүшөт.

Бирок ALT, AST, дене салмагы жана кыска мөөнөттүү клетка жашоого жөндөмдүүлүгү боюнча өлчөөлөр толук токсикология эмес. Клиникалык коопсуздук, бутадан тышкаркы таасирлер, узак мөөнөттүү дозалоо, фармакокинетика жана адамдагы биожеткиликтүүлүк бул тажрыйба менен чечилген эмес.

ND201651 Жыйынтыгы PAK4 Ингибитору Адамдарда Боор Фиброзун Дарылайт Дегенди Көрсөтөбү?

Жок. ND201651 менен түздөн-түз дарыланган тирүү организмдер чычкандар; адамдардан боор тканынын үлгүлөрү гана изилденген. Изилдөө PAK4тү күчтүү преклиникалык антифиброздук бута катары колдойт, бирок адамдарда эффективдүү доза, коопсуздук, фармакокинетика, узак мөөнөттүү терс таасир же клиникалык фиброздун артка кетиши көрсөтүлгөн эмес.

Фармакологиялык тажрыйба эмне үчүн HSC-спецификалык knockoutтан башкача түшүндүрүлүшү керек?

Pak4^ΔHSC модели Pak4 жоголушун атайын HSC популяциясына багыттаса, ооз аркылуу берилген ND201651 системалык тараган фармакологиялык ингибитор. Ошондуктан дары тажрыйбасы HSCдеги PAK4 таасирин гана бөлүп көрсөтпөйт.

Авторлор өздөрүнүн Discussion бөлүмүндө жабыркаган гепатоциттер HSC активдешүүсүнө таасир этүүчү сигналдарды бөлүп чыгарарын жана мурда гепатоциттердеги PAK4 ингибициясы оксидативдик жабыркоону жана липотоксикалуулукту азайта алары көрсөтүлгөнүн эске салат. Ошондуктан ND201651дин чычкандагы антифиброздук таасири HSC жана гепатоциттердеги биргелешкен PAK4 ингибициясынан келип чыгышы мүмкүн экенин ачык талкуулашат.

HSCге мүнөздүү жыйынтык менен системалык дарылоо жыйынтыгы эмне үчүн чогуу маанилүү?

HSC-спецификалык knockout PAK4 HSC ичинде фиброз үчүн чындап функционалдуу экенин көрсөткөн клетка түрүнө мүнөздүү далил берет. Системалык ингибитор тажрыйбасы болсо молекулалык бутага фармакологиялык кийлигишүү мүмкүн экенин көрсөтөт. Эки тажрыйбанын бир багытта жыйынтык бериши бута ырастоосун күчөтөт, бирок экөө бир эле биологиялык суроого жооп бербейт.

Статистикалык анализ кантип жүргүзүлдү?

Булак жыйынтыктарды башкача көрсөтүлбөсө орточо ± стандарттык ката (mean ± SEM) түрүндө берген. Сүрөттөрдөгү өзүнчө чекиттер биологиялык кайталоолорду билдирет жана жыйынтыктар кеминде үч көз карандысыз үлгү же тажрыйбадан алынганы көрсөтүлгөн.

Эки топтун ортосундагы салыштыруулар үчүн эки багыттуу эмес, two-tailed unpaired Student's t test колдонулган. Бир нече топту салыштыруу керек болгондо one-way ANOVA же тажрыйба дизайнына жараша two-way ANOVA колдонулуп, андан кийин Tukey post-hoc multiple comparisons тести жүргүзүлгөн.

Булак статистикалык маанилүүлүк босогосун P<0.05 деп аныктаган. Анализдер GraphPad Prism 10 программасында жүргүзүлгөн.

SEM эмнени билдирет?

SEM sample mean популяциянын орточо маанисин канчалык так баалаарын билдирген стандарттык ката өлчөмү. Стандарттык четтөө жеке үлгүлөр же биологиялык кайталоолор арасындагы таралууну сүрөттөсө, SEM орточо маанинин белгисиздиги менен байланыштуу. Булак графиктерде mean±SEM колдонгондуктан, ката тилкелери бардык биологиялык вариациянын стандарттык четтөөсү катары түздөн-түз түшүндүрүлбөшү керек.

Бул макалада математикалык формула барбы?

Негизги булак PDF илимий жыйынтыкты аныктаган өз алдынча математикалык теңдеме же формула бербейт. Ошондуктан Verianla булакта жок корреляция, ANOVA, t тести же SEM формулаларын изилдөөнүн өз теңдемеси сыяктуу жараткан эмес. Статистикалык ыкмалардын милдеттери окутуучу түрдө түшүндүрүлгөн, бирок булактан тышкаркы математикалык түзүлүш илимий табылга катмарына кошулган эмес.

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

• PAK4 активдешкен HSCлерде жана ар түрдүү фиброздук боор моделдеринде көбөйөт.
• HIF-1α жана YY1 PAK4 promoterи менен байланышып, HSC активдешүүсү учурунда PAK4түн транскрипциялык көбөйүшүнө салым кошот.
• PAK4 жоголушу HSCнин фиброгендик активдүүлүгүн, пролиферациясын, миграциясын жана жыйрылуучулугун басат.
• HSCге мүнөздүү Pak4 өчүрүү CCl4 жана BDL чычкан моделдеринде боор фиброзун азайтат.
• PAK4 YAP менен физикалык өз ара аракеттенет жана YAPты адам белогунда T428 аймагында түздөн-түз фосфорлой алат.
• T428 фосфорлонуусу YAP убиквитинделишин азайтып, YAP туруктуулугун, ядродо топтолушун жана транскрипциялык активдүүлүгүн жогорулатат.
• PAK4түн бул таасири LATS1 активдүүлүгүн жогорулатуу же төмөндөтүүдөн көз каранды эмес механизм катары колдоого алынат.
• YAPT428A/YapT413A тажрыйбалары T428/T413 фосфорлонуусунун функционалдык маанисин ырастайт.
• Адамдын фиброздук боор ткандарында PAK4, YAP жана p-YAP(T428) көбөйүшү байкалат.
• ND201651 чычкандын CCl4 моделинде HSC активдешүүсүн жана фиброздук ткань көрсөткүчтөрүн азайтат.

Изилдөө колдобогон жыйынтыктар

• PAK4 ингибитору адамдарда боор фиброзун дарылай турганы көрсөтүлгөн эмес.
• ND201651 үчүн клиникалык доза, адам фармакокинетикасы же узак мөөнөттүү адам коопсуздугу аныкталган эмес.
• T428ди PAK4 гана фосфорлой алары далилденген эмес; PAK4 knockdownдан кийин калган p-T428 сигналы сакталган.
• Адам тканындагы PAK4-YAP корреляциясы өзү эле себептүүлүктүн далили эмес.
• PAK4 ингибициясынын бардык таасири HSC аркылуу гана пайда болору фармакологиялык тажрыйбада көрсөтүлгөн эмес.
• PAK4 ингибициясы бардык фиброз себептеринде бирдей натыйжалуулукта иштей турганы далилденген эмес.
• PAK4 TAZ менен бирдей механизмди жүргүзөрү көрсөтүлгөн эмес; тескерисинче, изилдөө PAK4түн YAPка тандалмалуулугун колдойт.
• Эркек чычкандардагы жыйынтыктар ургаачы чычкандарда да ошондой болору түздөн-түз текшерилген эмес.
• Кыска мөөнөттүү клетка жашоого жөндөмдүүлүгү, ALT/AST жана дене салмагы боюнча жыйынтыктар толук дары токсикологиясынын ордун баспайт.

Изилдөөнүн негизги чектөөлөрү жана ачык суроолору

Биринчи маанилүү чектөө — клиникалык котормо. Изилдөө адам ткандарында күчтүү байланыштарды көрсөтсө да, терапиялык кийлигишүү өзү адамдарда эмес, чычкандарда жүргүзүлгөн.

Экинчи чектөө — азыркы PAK4 ингибиторлорун өнүктүрүү. Авторлор PAK4 ингибиторлору үчүн төмөн биожеткиликтүүлүк жана потенциалдуу off-target таасирлер дагы деле көйгөй болушу мүмкүн экенин ачык белгилеп, жаңы химиялык scaffoldдар жана targeted protein degradation сыяктуу альтернативдүү ыкмаларды изилдөөнү сунушташат.

Үчүнчү ачык суроо — YAP T428 фосфорлонуусу башка post-translational modifications жана механикалык стресс сыяктуу YAP жөнгө салуучулары менен кантип бирге иштейт. YAP бир эле белоктун үстүндө ар түрдүү көптөгөн жөнгө салуучу сигналдарды алат жана T428дин бул кең тармактагы салмагы азырынча толук белгилүү эмес.

Төртүнчү ачык суроо — PAK4-YAP огу HSCнин патологиялык фиброгендик функцияларында гана эмес, барган сайын көбүрөөк таанылып жаткан физиологиялык/homeostatic функцияларында кандай иштейт.

Бешинчи ачык суроо — активдешкен HSCде HIF-1α жана YY1 көбөйүшүн баштаган жогорку деңгээлдеги механизмдер жана бул факторлордун PAK4төн башка маанилүү буталары толук түшүндүрүлбөгөнү.

Алтынчы чектөө — жаныбар тажрыйбалары эркек чычкандарда жүргүзүлгөн. Ошондуктан изилдөө жыныска байланышкан мүмкүн болгон биологиялык айырмачылыктарды түздөн-түз текшербейт.

Изилдөөнүн клиникалык мааниси кантип чектелиши керек?

PAK4-YAP T428 огу терапиялык бута иштеп чыгуу жагынан күчтүү механисттик талапкер. Мунун себеби бута экспрессия корреляциясы менен гана эмес; генетикалык өчүрүү, түз kinase assay, site-specific LC-MS/MS, мутагенез, белок туруктуулугу боюнча тажрыйбалар, in vivo бута аймак мутациясы жана фармакологиялык ингибиция сыяктуу көз карандысыз далил катмарлары менен колдоого алынган.

Бирок “жакшы дары бута” болуу менен “бекитилген коопсуз дары” болуу бир эле түшүнүк эмес. Клиникалык өнүктүрүү үчүн тандалма молекула, фармакокинетика, биожеткиликтүүлүк, бутадан тышкаркы таасирлер, доза-жооп, өнөкөт уулуулук, ар башка фиброз этиологиялары жана адамдагы клиникалык изилдөөлөр өзүнчө талап кылынат.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска аталыш: p21-activated kinase 4 drives hepatic stellate cell activation and liver fibrosis through the phosphorylation of YAP at T428.

Авторлор жана ирети: Gil-Hwan Kim, Hyunsoo Rho, Chang Hun Lee, You-Jung Hong, Yongdo Park, Hwang Chan Yu, Mi-Young Song, Hye Jin Jo, Eun Joo Kang, Ri Han, Song Yi Yu, Ekihiro Seki, Yoonji Lee, Sangkyu Lee, Eun Ju Bae, Byung-Hyun Park, Chang Yeob Han.

Тең салым: Gil-Hwan Kim, Hyunsoo Rho жана Chang Hun Lee тең салым кошкон авторлор.

Жооптуу авторлор: Eun Ju Bae, Byung-Hyun Park жана Chang Yeob Han.

Мекемелер: School of Pharmacy and Institute of New Drug Development, Jeonbuk National University; College of Pharmacy, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Ewha Womans University; Graduate Program in Innovative Biomaterials Convergence, Ewha Womans University; Division of Gastroenterology, Department of Internal Medicine, Jeonbuk National University Medical School; Research Institute of Clinical Medicine of Jeonbuk National University-Biomedical Research Institute of Jeonbuk National University Hospital; Graduate School of Medical Science and Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Jeonbuk National University Medical School; School of Pharmacy, Sungkyunkwan University; College of Pharmacy, Chung-Ang University; Karsh Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center.

Журнал: Signal Transduction and Targeted Therapy.

Том / макала номери: 11 / 297.

Жарыяланган жыл: 2026.

Кабыл алынган дата: 19 Ноябрь 2025.

Кайра кароо датасы: 19 Март 2026.

Кабыл алуу датасы: 11 Май 2026.

Version of Record жарыяланган дата: 30 Июль 2026.

DOI: 10.1038/s41392-026-02796-0.

Расмий жазуу: Nature / Signal Transduction and Targeted Therapy; DOI аркылуу жеткиликтүү.

Булак түрү: Original Article / рецензияланган изилдөө макаласы.

Preprint абалы: Бул булак preprint эмес; расмий Version of Record.

Лицензия: Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International (CC BY-NC-ND 4.0).

Лицензия/сүрөт эскертүүсү: CC BY-NC-ND лицензиясы ылайыкташтырылган булак материалын бөлүшүүгө уруксат бербегендиктен, булак Figure 1-8дин композициясы кайра чыгарылган эмес. Макаладагы SVG булак тексттеги фактылык механизм байланыштарынан нөлдөн жасалган көз карандысыз окутуучу схема.

Адам изилдөөсүнүн этикалык жактыруусу: Jeonbuk National University Hospital Institutional Review Board, IRB No. JUH 2023-11-024-001. Изилдөө Helsinki Декларациясына ылайык жүргүзүлүп, катышуучулардан жазуу түрүндөгү informed consent алынган.

Жаныбар изилдөөсүнүн этикалык жактыруусу: Jeonbuk National University Institutional Animal Care and Use Committee, No. NON2023-099.

Жаныбарлар: Wild-type C57BL/6N жана C57BL/6J эркек чычкандар; Pak4-floxed жана Pdgfr-β-CreERT2 линиялары колдонулган.

HSC-спецификалык Pak4 knockout: Pak4flox/flox × Pdgfr-β-CreERT2 аргындаштыруу; CreERT2 активдешүүсү үчүн 75 mg/kg/күн тамоксифен, удаалаш беш күн intraperitoneal.

CCl4 модели: Сегиз жумалык эркек чычкандарда CCl4 0.6 mL/kg intraperitoneal, жумасына эки жолу, алты жума.

BDL модели: Сегиз жумалык эркек чычкандарда bile duct ligation; эки жумадан кийин үлгү алуу.

CDAHFD модели: Алты жумалык C57BL/6N эркек чычкандарда %60 kcal май, %0.1 метионин жана кошумча холини жок диета; 12 жума.

Клетка системалары: LX-2 immortalized human HSC line жана баштапкы чычкан HSCлери.

Баштапкы HSC культурасы: Collagenase type IV perfusion жана Percoll gradient centrifugation менен бөлүп алуу; DMEM + %10 fetal bovine serum + 100 U/mL penicillin + 100 μg/mL streptomycin; 37 °C жана %5 CO2.

Негизги молекулалык ыкмалар: Western blot, immunofluorescence/co-immunofluorescence, qPCR, ChIP, RNA-seq, Gene Ontology, GSEA, Co-IP, PLA, in vitro kinase assay, immunoprecipitation/ubiquitination assay, cycloheximide chase, YAP-responsive luciferase assay, peptide competition, LC-MS/MS, molecular docking жана кыска molecular dynamics refinement.

Жаңы p-T428-YAP антителосу: Адам YAP T428ди камтыган EMDTGD[pT]INQSTL phosphopeptide колдонулуп атайын polyclonal antibody иштелип чыккан; ELISA жана peptide competition менен өзгөчөлүгү текшерилген.

Mouse Yap T413 мутанты: Адам YAP T428дин чычкан ортологу T413. YapT413A мутациясы ACC → GCC түрүндө түзүлүп, Col1a1 promoter башкарган лентивирустук система колдонулган.

Лентивирустук in vivo колдонуу: CCl4 дарылоосунун алгачкы эки жумасынан кийин control LV, LV-Yap же LV-YapT413A ретро-орбиталдык түрдө вена ичине 1×10⁸ TU/чычкан берилген жана CCl4 дагы төрт жума улантылган.

Фармакологиялык кийлигишүү: ND201651 ооз аркылуу PAK4 ингибитору; CCl4 моделинин акыркы төрт жумасында 10 же 30 mg/kg.

Статистика: Жыйынтыктар mean±SEM; чекиттер биологиялык кайталоо; эки топ үчүн two-tailed unpaired Student's t test; көп топтор үчүн one-way же two-way ANOVA жана Tukey post-hoc test; маанилүүлүк P<0.05; GraphPad Prism 10.

Математикалык формула абалы: Негизги PDF өз алдынча илимий теңдеме/формула бербейт. Булактан тышкаркы теңдеме жаратылган эмес.

RNA-seq маалыматтарына жетүү: Raw жана processed RNA-seq маалыматтары NCBI Gene Expression Omnibus ичинде GSE308719 жетүү номери менен сакталган.

Маалыматтардын жеткиликтүүлүгү: Изилдөөдө түзүлгөн же анализделген маалыматтар макаланын ичинде бар экени жана RNA-seq маалыматтары GEOго жайгаштырылганы көрсөтүлгөн.

Каржылоо: National Research Foundation of Korea тарабынан 2020R1C1C1003652, 2021R1I1A3041149, RS-2024-00344251, RS-2026-25476540, RS-2023-NR077221 жана RS-2024-00357518 гранттары; Bio & Medical Technology Development Program алкагында 2022M3E5F2017607, RS-2026-25517589 жана RS-2025-02214748; ошондой эле Yuhan Innovation Program, Jeonbuk National University Hospital Biomedical Research Institute Fund жана Jeonbuk National University Glocal University 30 Project колдоосу көрсөтүлгөн.

Кызыкчылыктардын кагылышы: Авторлор competing interests жок экенин билдиришкен.

Авторлордун салымы: G.H.K., H.R., E.J.B., B.H.P. жана C.Y.H. изилдөөнү долбоорлошкон. G.H.K., H.R., Y.J.H., Y.P., H.C.Y., M.Y.S., H.J.J. жана S.Y.Y. тажрыйбаларды жүргүзүп, маалыматтарды анализдешкен. C.H.L. адам ткань үлгүлөрүн чогулткан. E.J.K. жана S.L. LC-MS/MS анализин; R.H. жана Y.L. molecular docking анализин жүргүзгөн. E.S. техникалык колдоо жана илимий кеңеш берген. E.J.B., B.H.P. жана C.Y.H. изилдөөнү көзөмөлдөгөн.

Негизги илимий чек: Адам ткань анализдери клиникалык байланыш берет, бирок дарылоо тажрыйбасы эмес. Себептик жана терапиялык далилдердин маанилүү бөлүгү клетка жана чычкан моделдерине негизделген.

Дары иштеп чыгуу чеги: Булак PAK4 ингибиторлору үчүн төмөн биожеткиликтүүлүк жана потенциалдуу off-target таасирлер чечилиши керек болгон көйгөйлөр экенин белгилейт.

Механизм чеги: PAK4 knockdown T428 фосфорлонуусун толугу менен жок кылган эмес; толук эмес knockdown жана/же азырынча аныкталбаган башка киназалар мүмкүн түшүндүрмөлөр катары булакта сакталган.