Mhimili wa ishara wa PAK4-YAP ni utaratibu wa udhibiti ambao katika utafiti huu p21-activated kinase 4 (PAK4) katika seli za hepatic stellate zilizoamilishwa hufosforilisha Yes-associated protein (YAP) kwenye eneo la T428 katika protini ya binadamu, na hivyo kuongeza uthabiti wa protini ya YAP, kujikusanya kwake ndani ya kiini na shughuli yake ya unakili; kwa matokeo hayo, mhimili huu huchochea uamilishaji wa hepatic stellate cells na fibrogenesis ya ini. Watafiti walichunguza mhimili huu katika tishu za ini za binadamu, primary mouse hepatic stellate cells, laini ya HSC ya binadamu LX-2, modeli mbalimbali za fibrosis katika panya, majaribio ya kufuta jeni Pak4 mahususi kwa HSC, uchanganuzi wa RNA-seq, majaribio ya mwingiliano wa protini-protini na kinase, mutagenesis, LC-MS/MS, uundaji wa modeli za molekuli na majaribio ya kifamasia kwa kutumia kizuizi cha PAK4 ND201651.

Ugunduzi mkuu wa utafiti ni kwamba PAK4 si protini inayoongezeka tu katika ini lenye fibrosis. Ilionyeshwa kwamba PAK4 huingiliana kimwili na YAP, hufosforilisha moja kwa moja YAP ya binadamu kwenye mabaki ya threonine T428 ambayo hayakuwa yameelezwa hapo awali, na kwamba mabadiliko haya huimarisha protini kwa kupunguza kuvunjwa kwa YAP kupitia mfumo wa ubiquitin-proteasome. YAP iliyostahimili zaidi ilijikusanya zaidi ndani ya kiini, shughuli yake ya unakili inayotegemea TEAD ikaongezeka, na programu za jeni za profibrotic zinazohusiana na CTGF, CCN1 na collagen zikaimarika.

Kunyamazisha PAK4 kijeni katika primary HSCs kulipunguza viashiria vya fibrogenic kama α-SMA na COL1A1; pia kulizuia fenotipu za HSC zilizoamilishwa kama kuongezeka kwa seli, uhamaji na contraction ya collagen gel. Kufutwa kwa Pak4 mahususi kwa HSC kulipunguza mkusanyiko wa collagen, kiasi cha hydroxyproline, eneo la α-SMA na usemi wa jeni za fibrogenic katika modeli za fibrosis za panya zilizoundwa kwa carbon tetrachloride (CCl₄) na kwa bile duct ligation (BDL).

Ili kupima umuhimu wa kisababishi wa utaratibu huu, eneo la Yap T413 katika panya, linalolingana na T428 ya YAP ya binadamu, lilibadilishwa kuwa alanine ili lisifosforilishwe. Uonyeshaji wa mutant phospho-inactive Yap^T413A katika HSC, tofauti na uonyeshaji wa kawaida wa WT-Yap, haukuongeza fibrosis ya ini inayohusiana na CCl₄; badala yake ulipunguza mkusanyiko wa collagen na uamilishaji wa HSC. Katika majaribio ya seli, mutant ya binadamu YAP^T428A iliubiquitiniwa na kuvunjwa haraka zaidi, ikajikusanya kidogo ndani ya kiini na ikaonyesha shughuli ndogo ya unakili. YAP^T428E, inayofanana na hali ya phosphorylation, ilionyesha mwenendo wa kinyume.

Katika tishu za ini za binadamu, usemi wa PAK4 na YAP uliongezeka kutoka tishu za kawaida kuelekea fibrosis na cirrhosis; YAP iliyofosforilishwa kwenye T428 pia iliongezeka pamoja na ukali wa ugonjwa. Hata hivyo, data za binadamu ni za uchunguzi. Kizuizi cha PAK4 hakikutumika kwa binadamu na mafanikio ya matibabu ya kliniki hayakujaribiwa. Uingiliaji wa dawa katika utafiti ulifanywa kwa panya waliotengenezewa fibrosis kwa CCl₄ kwa kutumia ND201651 kwa njia ya mdomo. Kwa hiyo, ingawa matokeo yanatoa utaratibu thabiti wa kabla ya kliniki na uthibitishaji wa lengo, hayawezi kutafsiriwa kuwa tiba ya antifibrotic iliyothibitishwa kwa binadamu.

Kwa nini hepatic stellate cell ni seli ya msingi katika fibrosis ya ini?

Hepatic stellate cells (HSCs) ni seli ambazo katika ini lenye afya kwa kiasi kikubwa huwa katika hali tulivu, yaani quiescent, na hasa huhifadhi matone ya lipid yenye vitamin A. Ini linapopata uharibifu wa muda mrefu au mkubwa, HSC huamilishwa na kubadilika kuwa fenotipu inayofanana na myofibroblast. Baada ya mabadiliko haya, uzalishaji wa extracellular matrix, hasa collagen, huongezeka kwa kiasi kikubwa. Fibrosis ni mkusanyiko wa matrix hii kwa kiwango kinachovuruga usanifu wa kawaida wa tishu.

HSC zilizoamilishwa si seli zinazozalisha collagen pekee. Kuongezeka kwao kunaweza kuongezeka, zinaweza kuhamia maeneo yaliyoharibika na kupata sifa za contraction. Kwa hiyo, watafiti walitathmini athari ya PAK4 si kwa kiashiria kimoja cha collagen pekee, bali katika fenotipu nyingi za HSC kama shughuli ya fibrotic, proliferation, migration na contractility.

α-SMA na COL1A1 zinaonyesha nini?

α-SMA ni kifupi cha alpha-smooth muscle actin na ni mojawapo ya viashiria vinavyotumiwa sana kufuatilia mpito wa HSC kutoka hali ya quiescent kwenda hali iliyoamilishwa inayofanana na myofibroblast. COL1A1 ni jeni/protini inayosimba mnyororo wa alpha-1 wa collagen aina ya I. Collagen aina ya I ni mojawapo ya sehemu muhimu za fibrotic extracellular matrix. Kwa hiyo, kupungua kwa α-SMA kunaashiria kupungua kwa uamilishaji wa HSC; kupungua kwa COL1A1 na jeni nyingine zinazohusiana na collagen kunaashiria kudhoofika kwa uzalishaji wa fibrogenic matrix.

PAK4 ni nini na kwa nini S474 ilipimwa?

PAK4 ni serine/threonine protein kinase ya kundi II la familia ya p21-activated kinase. Protein kinases zinaweza kubadilisha shughuli, uthabiti, eneo la protini ndani ya seli au mwingiliano wake na protini nyingine kwa kuongeza kundi la phosphate kwenye mabaki maalumu ya amino acid katika protini lengwa.

Familia ya PAK hugawanywa kuwa kundi I PAK1-3 na kundi II PAK4-6. Katika utafiti, si kiasi cha jumla cha PAK4 pekee kilichopimwa, bali pia phosphorylation ya S474 ya PAK4, yaani mabaki ya serine kwenye amino acid ya 474. Kwa sababu autophosphorylation hii inahusiana na uamilishaji wa PAK4, p-PAK4(S474) ilitumika kama kiashiria cha shughuli ya PAK4.

Ugunduzi wa kwanza: PAK4 huongezeka katika HSC zenye fibrosis na zilizoamilishwa

Katika fibrosis ya ini ya panya iliyoundwa kwa CCl₄, jumla ya PAK4 na p-PAK4(S474) ziliongezeka pamoja na α-SMA, kiashiria cha uamilishaji wa HSC. Mwelekeo huo pia ulitathminiwa katika modeli ya bile duct ligation (BDL) na modeli ya choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet (CDAHFD).

Uchanganuzi wa immunofluorescence ulionyesha kwamba ishara ya PAK4 iliongezeka hasa pamoja na idadi ya HSC zilizoamilishwa zenye α-SMA-chanya. Tofauti hii ni muhimu; kwa sababu kuongezeka kwa protini katika tishu nzima ya ini hakumaanishi lazima kuwa protini hiyo imeongezeka katika stellate cell. Kuonyesha PAK4 na α-SMA kwa pamoja katika seli zilezile kuliimarisha muktadha wa HSC.

Sampuli za binadamu zilitumikaje?

Tishu za ini za binadamu zilikusanywa kutoka kwa watu waliofanyiwa liver resection, transplantation au biopsy katika Jeonbuk National University Hospital kati ya Novemba 2017-Mei 2023. Sampuli ziligawanywa katika vikundi vya kawaida, fibrosis na cirrhosis kulingana na histological METAVIR staging katika ripoti zao za awali za pathology.

Etiolojia kuu ya cohort ilikuwa maambukizi sugu ya virusi vya hepatitis B; pia kulikuwa na sampuli za hepatitis C, metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease na alcohol-associated liver disease. Chanzo kinaeleza kwamba wagonjwa wote katika kundi la cirrhosis walikuwa na compensated cirrhosis.

Katika uchanganuzi wa tishu za binadamu, uwiano wa seli zilizokuwa chanya kwa PAK4 na α-SMA kwa pamoja uliongezeka kadiri fibrosis ilivyokuwa kali. Baadaye, uhusiano chanya kati ya usemi wa YAP na PAK4 ulionyeshwa katika kiwango cha HSC; katika Figure 6i ya chanzo, r=0.6666 na P<0.0001 ziliripotiwa kwa idadi za HSC zenye PAK4-chanya na YAP-chanya. Aidha, protini ya p-YAP(T428) iliongezeka kutoka tishu za kawaida kuelekea fibrosis na cirrhosis.

Kuna mpaka muhimu wa kisayansi hapa: uhusiano unaoonekana katika sampuli za binadamu hauthibitishi kwamba PAK4 peke yake husababisha fibrosis kwa wagonjwa. Majaribio makuu yanayoimarisha dai la kisababishi ni gene deletion, kinase assay, mutation na interventions katika panya.

Kwa nini PAK4 huongezeka katika HSC iliyoamilishwa?

Primary mouse HSC zilipobadilika kutoka hali ya quiescent kwenda hali iliyoamilishwa, si protini ya PAK4 pekee iliyoongezeka bali pia Pak4 mRNA. Ugunduzi huu ulipendekeza kwamba ongezeko hilo linaweza kutokea angalau kwa sehemu katika kiwango cha transcription.

Kwa kutumia uchunguzi wa Evolutionary Conserved Regions, watafiti walibaini maeneo mawili yanayowezekana ya transcription factor binding katika maeneo ya proximal promoter ya PAK4/Pak4 ya binadamu na panya: HIF-1α na YY1.

Majaribio ya Chromatin immunoprecipitation (ChIP) yalionyesha kwamba HIF-1α na YY1 hufungamana na maeneo ya PAK4 promoter. Katika seli za LX-2, kunyamazisha HIF-1α au YY1 kwa siRNA kulipunguza usemi wa PAK4. Hivyo, utafiti unaunga mkono kwamba kuongezeka kwa PAK4 kunahusiana na transcriptional reprogramming ya HSC iliyoamilishwa.

Jaribio la ChIP linaonyesha nini?

ChIP ni mbinu inayotumika kupima ni eneo gani la genomic ambalo protini maalumu inayofunga DNA imefungamana nalo ndani ya seli. Katika jaribio hili swali ni “Je, HIF-1α na YY1 kweli hufungamana na eneo la PAK4 promoter?” Matokeo ya ChIP hayapimi tu iwapo jeni mbili zinaonyeshwa kwa wakati mmoja, bali hupima uhusiano wa kimwili wa transcription factor na DNA ya promoter husika.

Nini hutokea katika HSC PAK4 inapopotea?

Mbinu mbili tofauti za kijeni zilitumika katika primary mouse HSCs. Katika mbinu ya kwanza, HSC zilizotengwa kutoka panya Pak4^f/f zililimwa kwa siku tatu, kisha zikaambukizwa adenovirus inayobeba Cre recombinase na kulimwa kwa siku nyingine tatu. Mbinu ya pili ilikuwa kufanya Pak4 knockdown kwa siRNA katika primary HSCs za wild-type.

Katika mbinu zote mbili, kupotea kwa PAK4 kulipunguza viwango vya α-SMA na collagen aina ya I, na kupunguza usemi wa jeni za fibrogenic kama Acta2, Des, Col1a1, Col1a2, Serpine1, Timp1 na Col7.

Kunyamazisha PAK4 pia kulipunguza HSC proliferation na migration, na katika jaribio la collagen gel contraction kulizuia uwezo wa contractile. Hivyo, athari ya PAK4 haikupunguzwa kuwa mabadiliko moja tu katika usemi wa collagen.

Kwa nini uchanganuzi wa RNA-seq ulifanywa?

Kupima jeni maalumu za fibrosis zilizochaguliwa moja moja kunalenga malengo ambayo mtafiti tayari anayajua. RNA sequencing (RNA-seq), kwa upande mwingine, huruhusu mabadiliko katika kiwango cha transcriptome nzima kuchunguzwa kwa njia isiyoegemea sana.

Baada ya RNA-seq katika PAK4 knockdown HSCs kwa n=4 biological replicates, uchanganuzi wa Gene Ontology ulionyesha mabadiliko katika programu za jeni zinazohusiana na extracellular matrix organization, cell migration na proliferation. Gene Set Enrichment Analysis ilionyesha kwamba gene sets zinazohusiana na collagen formation zilidhibitiwa kwenda chini wakati PAK4 ilipopotea.

Tofauti kati ya GO na GSEA ni nini?

Uchanganuzi wa Gene Ontology huainisha ni michakato gani ya kibaiolojia ambamo jeni zilizobadilika zimejikusanya zaidi. GSEA, badala ya kugawanya jeni kuwa “significant/non-significant” pekee, hutathmini kama gene sets fulani katika orodha nzima iliyopangwa ya expression hujikusanya kwa utaratibu katika sehemu ya juu au chini ya orodha. Katika utafiti huu, mbinu zote mbili zilitoa matokeo yanayoonyesha kwamba kupotea kwa PAK4 hukandamiza programu ya fibrogenic ya HSC.

Pak4 ilifutwaje kwa namna mahususi kwa HSC katika panya?

Panya Pak4-floxed walivushwa na panya Pdgfr-β-CreERT2 ili kuunda modeli ya Pak4^ΔHSC. Ili kuamilisha CreERT2 na kufuta jeni Pak4 katika HSC zilizoamilishwa, tamoxifen ilitolewa intraperitoneal kwa dozi ya 75 mg/kg/siku kwa siku tano mfululizo.

Mbinu hii inalenga kwa nguvu zaidi idadi ya seli lengwa badala ya kufuta jeni Pak4 katika mwili mzima. Hivyo, uhusiano kati ya mabadiliko ya fibrosis yaliyoonekana na kazi ya PAK4 ndani ya HSC unaweza kupimwa moja kwa moja zaidi kuliko kwa systemic pharmacological inhibition.

Modeli ya fibrosis ya CCl4

Katika panya dume wenye umri wa wiki nane, CCl₄ ilitolewa kwa kulinganisha na corn oil vehicle kwa dozi ya 0.6 mL/kg, mara mbili kwa wiki, kwa jumla ya wiki sita, kwa njia ya intraperitoneal. CCl₄ ni modeli ya majaribio inayochochea mwitikio wa fibrotic kwa kusababisha majeraha ya hepatocellular yanayojirudia katika ini.

Modeli ya fibrosis ya BDL

Katika modeli ya pili, panya dume wenye umri wa wiki nane walifanyiwa sham operation au bile duct ligation na kutathminiwa baada ya wiki mbili. BDL ni modeli tofauti kimekanizimu na CCl₄, ambayo husababisha cholestatic liver injury na fibrosis kwa kuzuia mtiririko wa bile kwa upasuaji.

CDAHFD ilitumika kwa nini?

Panya dume C57BL/6N wenye umri wa wiki sita walilishwa normal chow diet au choline-deficient, L-amino acid-defined high-fat diet yenye %60 kcal ya mafuta na %0.1 methionine bila choline ya ziada kwa wiki 12. Utafiti ulitumia modeli hii kuonyesha kwamba usemi wa PAK4 huongezeka katika mazingira tofauti ya fibrosis.

Matokeo ya in vivo ya kupotea kwa Pak4 mahususi kwa HSC

Katika jaribio la CCl₄, LT-Vehicle n=6, LT-CCl₄ n=8, Pak4^ΔHSC-Vehicle n=4 na Pak4^ΔHSC-CCl₄ n=6. Katika jaribio la BDL, LT-Sham n=3, LT-BDL n=6, Pak4^ΔHSC-Sham n=3 na Pak4^ΔHSC-BDL n=6.

HSC proliferation pia ilipungua kwa kuzingatia seli zenye PCNA na α-SMA double-positive. Kinyume chake, co-staining ya cleaved caspase-3 na α-SMA haikuonyesha mabadiliko makubwa katika HSC apoptosis. Tofauti hii inaunga mkono kwamba fibrosis iliyopungua haikutokana tu na HSC nyingi zaidi kufa; kukandamizwa kwa uamilishaji na upanuzi wa HSC ni muhimu.

Kutokuwepo kwa mabadiliko makubwa katika shughuli za serum ALT na AST katika modeli za HSC-specific Pak4 knockout pia ni moja ya matokeo ya ziada yanayounga mkono tafsiri ya watafiti kuhusu athari mahususi kwa HSC.

Uhusiano kati ya PAK4 na YAP ulipatikana vipi?

Katika matokeo ya RNA-seq ya HSC zilizopoteza PAK4, uchanganuzi wa KEGG pathway ulionyesha kwamba Hippo signaling pathway ilibadilika. Uchanganuzi wa mtandao unaotegemea GeneMANIA uliitambua YAP kama mojawapo ya molekuli kuu zinazohusiana kwa karibu na mtandao huu uliobadilika.

Wakati wa uamilishaji wa primary HSC, protini ya YAP iliongezeka sambamba na PAK4. Overexpression ya WT-PAK4 iliongeza YAP-responsive luciferase activity na jeni lengwa za YAP kama CTGF na CYR61/CCN1, huku mutant PAK4^S474A yenye shughuli ya catalytic iliyoharibika haikuonyesha athari hizo.

Matokeo haya yalipendekeza kwamba PAK4 si protini inayokuwepo tu pamoja na YAP; shughuli ya kinase ya PAK4 ni muhimu kwa kazi ya YAP.

YAP ni nini?

Yes-associated protein (YAP) ni mojawapo ya transcriptional coactivators kuu za Hippo signaling pathway. YAP si transcription factor ya kawaida inayofunga DNA moja kwa moja; ndani ya kiini huunda complex na washirika wanaofunga DNA kama familia ya TEAD na kuunga mkono transcription ya CTGF, CCN1 na jeni nyingine lengwa za proliferative/fibrogenic.

Athari ya kibaiolojia ya YAP haiamuliwi na kiasi cha jumla cha protini pekee. Hali ya phosphorylation, uthabiti, usambazaji kati ya cytoplasm/kiini na kasi ya kuvunjwa na mfumo wa ubiquitin-proteasome pia ni muhimu.

Nini Hubadilika PAK4 Inapofosforilisha YAP kwenye T428?

Phosphorylation ya mabaki ya threonine T428 ya YAP ya binadamu na PAK4 hupunguza ubiquitination ya YAP na hivyo kupunguza kasi ya kuvunjwa kwa protini, huongeza uthabiti wa protini ya YAP na kujikusanya kwake ndani ya kiini, na huimarisha shughuli ya unakili inayotegemea TEAD; katika majaribio ya seli na panya ya utafiti huu, mlolongo huu ulihusishwa na uamilishaji mkubwa zaidi wa HSC na fibrogenesis.

Mwingiliano wa kimwili wa PAK4-YAP ulionyeshwaje?

Co-immunoprecipitation (Co-IP) huchunguza iwapo, protini moja inaposhushwa kwa kutumia antikodi, protini nyingine iliyofungamana nayo pia huja ndani ya complex hiyo. Katika majaribio ya Co-IP, PAK4 na YAP zilipatikana katika complex moja ya protini.

Proximity ligation assay (PLA) ni mbinu inayoonyesha kwa ishara ya fluorescence kwamba protini mbili ziko katika umbali wa karibu sana wa kimwili ndani ya seli. PLA pia iliunga mkono ukaribu wa PAK4-YAP.

Kama udhibiti muhimu wa specificity, PAK4 haikufungamana kwa namna ileile na TAZ, paralog ya YAP. Matokeo haya yanaonyesha kwamba PAK4 hailengi familia nzima ya YAP/TAZ bila kutofautisha.

Ilionyeshwaje kwamba PAK4 hufosforilisha YAP moja kwa moja?

Cell-free in vitro kinase assay iliyotumia PAK4 na YAP recombinant za binadamu ilionyesha kwamba PAK4 inaweza kufosforilisha YAP moja kwa moja. Wakati wa jaribio, autophosphorylation ya PAK4 yenyewe pia ilifuatiliwa.

WT-PAK4 iliongeza phosphorylation ya threonine ya YAP, huku mutant kinase-dead PAK4^S474A haikusababisha ongezeko lilelile. Kutokuwepo kwa muundo huo katika phosphorylation ya serine kuliwaelekeza watafiti kwenye mabaki ya threonine.

Eneo la T428 lilipatikana vipi?

Zana za in silico za kutabiri maeneo ya phosphorylation kama PhosphoNET na PhosphoSitePlus zilipendekeza maeneo matano ya YAP yaliyokuwa candidates. Majaribio ya competition yaliyotumia oligopeptides zenye candidates hawa yalionyesha kwamba PAK4 hulenga hasa eneo la T428.

Phosphorylation ya T428 baadaye iliungwa mkono kwa uchanganuzi wa site-specific liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Mbinu hii hutenganisha protini/peptidi kulingana na tabia ya mass/charge na kuruhusu kugunduliwa kwa post-translational modifications katika peptidi maalumu.

Uundaji wa modeli za molekuli ulionyesha nini na haukuonyesha nini?

Watafiti wali-dock segment ya peptidi 423MDTGDTINQST433 ya YAP ya binadamu yenye T428 kwenye catalytic domain ya PAK4, kisha wakatumia simulations fupi za molecular dynamics zenye backbone restraints ili kupunguza steric clashes na kulegeza interface ya protini-peptidi.

Katika modeli zilizopatikana, eneo la YAP T428 lilielekezwa kwenye catalytic pocket ya PAK4 na kikundi cha hydroxyl cha threonine kilikaa katika umbali wa hydrogen bond kutoka kwenye catalytic residue.

Modeli hii haimaanishi kwamba “phosphorylation ya PAK4-T428 yenyewe imethibitishwa kwenye kompyuta”. Molecular docking na MD hutoa msaada wa maelezo kwamba reaction inawezekana kimuundo. Ushahidi wa moja kwa moja wa kibiokemia unatokana na kinase assay, mutagenesis, peptide competition na LC-MS/MS.

Kwa nini antikodi mpya ya p-T428-YAP ilitengenezwa?

Kwa sababu T428 haikuwa mojawapo ya maeneo ya YAP yaliyokuwa yameelezwa vizuri ya phosphorylation hapo awali, watafiti walitengeneza polyclonal antibody mpya ili kupima mahsusi YAP iliyofosforilishwa kwenye T428.

EMDTGD[pT]INQSTL phosphopeptide yenye eneo la T428 la YAP ya binadamu ilitengenezwa, ikaunganishwa na keyhole limpet hemocyanin na kutumika katika immunization ya sungura. Titer za antikodi zilitathminiwa kwa ELISA dhidi ya peptidi zilizofosforilishwa na zisizofosforilishwa.

Serum ilisafishwa kwa protein A/G chromatography na baadaye affinity purification mahususi kwa peptide iliyofosforilishwa. Uteuzi wa antikodi kwa peptide iliyofosforilishwa kwenye T428 ulithibitishwa kwa ELISA na majaribio ya peptide competition.

Kwa nini phosphorylation ya T428 haikutoweka kabisa PAK4 iliponyamazishwa?

Katika seli za LX-2, ishara ya p-YAP(T428) ilipungua sana baada ya PAK4 knockdown lakini haikutoweka kabisa. Waandishi wanaeleza wazi uwezekano mbili: kunyamazishwa kwa PAK4 hakukuwa kamili katika hali za jaribio na/au kuna kinases nyingine ambazo bado hazijatambuliwa zinazoweza kufosforilisha T428.

Kwa hiyo, utafiti hauungi mkono hitimisho kwamba “kibiolojia, YAP T428 inaweza kufosforilishwa na PAK4 pekee”. Hitimisho linaloungwa mkono ni kwamba PAK4 ni kinase inayoweza kufosforilisha T428 moja kwa moja na ina jukumu muhimu la udhibiti katika eneo hilo.

Je, PAK4 huongeza kiasi cha YAP kupitia mRNA?

Katika primary HSCs, PAK4 knockdown ilipunguza kiasi cha protini ya YAP bila kubadilisha kwa kiasi kikubwa Yap mRNA. Hali hii ilipendekeza kwamba athari kuu ya PAK4 kwa YAP iko zaidi kwenye uthabiti wa protini kuliko kuongeza uzalishaji wa YAP mpya katika kiwango cha transcription.

Jaribio la CHX chase hupima nini?

Cycloheximide (CHX) huzuia utengenezaji wa protini mpya. Baada ya uzalishaji wa YAP mpya kusimamishwa, kufuatilia jinsi YAP iliyopo inavyopungua haraka kadiri muda unavyopita kunaweza kutoa taarifa kuhusu uthabiti wa protini.

Overexpression ya PAK4 ilifanya YAP idumu kwa muda mrefu zaidi mbele ya CHX. Kinyume chake, phospho-inactive YAP^T428A ilitoweka haraka zaidi. Matokeo haya yanaunga mkono athari ya kiutendaji ya phosphorylation ya T428 katika kuongeza muda wa maisha wa protini ya YAP.

Kwa nini ubiquitination ni muhimu?

Ubiquitin ni protini ndogo ya kuwekea alama inayotumika kupeleka protini lengwa kwenye kuvunjwa ndani ya seli, hasa proteasomal degradation. Kiwango kikubwa cha polyubiquitination ya protini mara nyingi huhusishwa na kuitayarisha protini hiyo kuvunjwa na proteasome.

PAK4 overexpression ilipunguza ubiquitination ya YAP. Destabilization ya YAP iliyosababishwa na PAK4 knockdown ilirejea E3 ubiquitin ligase β-TRCP iliponyamazishwa, huku FBXW7 knockdown haikutoa ulinzi huo. Kwa hiyo, utafiti unaonyesha hasa β-TRCP katika uhusiano wa uthabiti wa PAK4-YAP.

Je, LATS1 na PAK4 hufanya phosphorylation ileile?

Hapana. Katika canonical Hippo signaling pathway, moja ya maeneo ya kuzuia yanayojulikana vizuri ya LATS1 kwenye YAP ni S127. Phosphorylation ya S127 huunga mkono binding ya 14-3-3, retention katika cytoplasm na inhibition ya YAP.

PAK4, kwa upande mwingine, katika utafiti huu ilionyeshwa kuwa kinase tofauti inayofosforilisha YAP kwenye T428 kwa mwelekeo wa kuamsha. PAK4 knockdown haikubadilisha kiasi cha jumla cha LATS1 wala kiwango cha LATS1 hai iliyofosforilishwa kwenye T1079. Athari ya PAK4 ya kuimarisha YAP iliendelea hata chini ya hali ya LATS1 knockdown.

Mutant phosphomimetic YAP^T428E pia ilionyesha upinzani zaidi dhidi ya YAP degradation iliyochochewa na LATS1. Matokeo haya yanaunga mkono kwamba mhimili wa PAK4-T428 ni tofauti na athari isiyo ya moja kwa moja inayowasha au kuzima tu utaratibu wa canonical inhibition wa LATS1 kutoka juu.

Mutations za YAPT428A na YAPT428E Zinapima Nini?

Katika YAP^T428A, threonine inayoweza kufosforilishwa hubadilishwa kuwa alanine ili kuzuia phosphorylation ya T428; katika YAP^T428E, threonine hubadilishwa kuwa glutamate ili kuiga kwa kiasi fulani chaji hasi ya eneo lililofosforilishwa. Mutant hizi zinazokinzana zilitumika kupima kama phosphorylation ya T428 ni alama inayotokea pamoja tu au ni kidhibiti cha kiutendaji cha uthabiti wa YAP, eneo lake ndani ya seli na kazi yake ya transcription.

Matokeo ya mutant T428A

Mbele ya PAK4, YAP^T428A iliubiquitiniwa zaidi na kuvunjwa haraka zaidi wakati wa CHX chase ikilinganishwa na WT-YAP. Mutant hiyohiyo ilionyesha retention kubwa zaidi katika cytoplasm na shughuli ndogo ya YAP-responsive luciferase katika seli.

Matokeo ya mutant T428E

Mutant YAP^T428E inayofanana na phosphorylation ilitenda kwa mwelekeo wa kinyume; ilitoa matokeo tofauti na mutant phospho-inactive kwa uthabiti wa YAP na shughuli ya transcription. Hivyo, iliungwa mkono kwamba hali ya phosphorylation ya T428 inaweza kweli kubadilisha kazi ya YAP.

Kwa nini T428 ya binadamu na T413 ya panya zina namba tofauti?

Eneo lilelile la kiutendaji hupewa namba tofauti kwa sababu numbering ya amino acid hutofautiana katika mfuatano wa protini za binadamu na panya. Mlingano wa ortholog wa mabaki ya T428 katika YAP ya binadamu ni T413 katika Yap ya panya. Kwa hiyo, YAP^T428A katika majaribio ya seli za binadamu na Yap^T413A katika jaribio la in vivo la panya ni milingano ya spishi tofauti ya sehemu ileile ya biological phosphorylation.

Mutant YapT413A ilifanya nini katika ini la panya?

WT-Yap au phospho-inactive Yap^T413A ziliwasilishwa kwa lentiviral vectors zinazodhibitiwa na Col1a1 promoter kwa lengo la selective expression katika HSC. Baada ya wiki mbili za kwanza za matumizi ya CCl₄, control LV, LV-Yap au LV-Yap^T413A zilitolewa kwa panya kwa njia ya kwa njia ya retro-orbital intravenous kwa dozi ya 1×10⁸ TU/panya; CCl₄ iliendelea kwa wiki nyingine nne.

WT-Yap overexpression iliimarisha mkusanyiko wa collagen na mwitikio wa fibrogenic. Kinyume chake, Yap^T413A haikuweza kutoa athari ileile ya fibrotic na pia ilipunguza mkusanyiko wa collagen ikilinganishwa na kundi la CCl₄.

Mchoro huru wa Verianla wa mlolongo wa utaratibu

LATS1, β-TRCP na PAK4 zinahusianaje katika mtandao mmoja wa udhibiti?

Katika njia ya canonical Hippo, LATS1 hufosforilisha YAP kwenye S127 na kuisukuma kuelekea retention katika cytoplasm na degradation. β-TRCP ni mojawapo ya E3 ligases zinazoshiriki katika utaratibu wa ubiquitination na degradation ya YAP. Utafiti unaonyesha kwamba phosphorylation ya PAK4-T428 huathiri YAP katika mwelekeo wa kinyume, yaani kuelekea uthabiti na uamilishaji.

Kwa hiyo, tabia ya YAP haijumuishi phosphorylation moja tu ya “kuwasha/kuzima”. Protini ileile inapofosforilishwa katika maeneo tofauti, matokeo tofauti na hata yanayokinzana ya kibaiolojia yanaweza kutokea. S127 ni eneo linalojulikana kwa mwelekeo wa kuzuia, huku T428 likitambuliwa katika utafiti huu kwa mwelekeo wa kuamsha.

Kwa nini matokeo ya p-YAP(T428) katika tishu za binadamu ni muhimu?

Utaratibu kufanya kazi katika seli za culture au katika panya wa majaribio pekee haumaanishi kwamba mhimili uleule wa kibaiolojia unafanya kazi katika ugonjwa wa binadamu. Uchanganuzi wa watafiti kwa kutumia antikodi maalumu ya p-T428-YAP katika tishu za ini za binadamu ulionyesha kwamba YAP iliyofosforilishwa kwenye T428 huongezeka katika fibrosis na cirrhosis.

Ugunduzi huu unaunga mkono kwamba mhimili wa PAK4-YAP una umuhimu wa kibaiolojia katika fibrosis ya ini ya binadamu. Hata hivyo, kwa sababu data ya binadamu ni observational, haiwezekani kuhitimisha kutokana na data hii pekee kwamba inhibition ya PAK4 itapunguza fibrosis kwa wagonjwa.

Uhusiano wa YAP na PAK4 katika tishu za binadamu unapaswa kutafsiriwaje?

Katika Figure 6i ya chanzo, correlation chanya ya r=0.6666 na P<0.0001 imeonyeshwa kati ya idadi za HSC zinazoonyesha PAK4 na zinazonyesha YAP. Thamani chanya ya r inaonyesha kwamba kadiri uwiano wa HSC zenye PAK4-chanya unavyoongezeka, uwiano wa HSC zenye YAP-chanya pia huwa na mwelekeo wa kuongezeka.

P<0.0001 inaashiria kwamba, chini ya dhana ya kutokuwepo kwa uhusiano, uwezekano wa uhusiano uliotazamwa au wenye ukali zaidi kutokea kwa bahati pekee ni mdogo sana ndani ya modeli ya jaribio. Hata hivyo, p value ndogo haibadilishi uhusiano kuwa kisababishi na haielezi yenyewe ukubwa wa athari ya kliniki.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Tabaka za ushahidi za utafiti

Kizuizi cha PAK4 ND201651 kilifanya nini?

ND201651 inaelezwa katika chanzo kama kizuizi teule cha PAK4 cha molekuli ndogo kinachoweza kutumika kwa njia ya mdomo. Katika primary mouse HSCs, ND201651 ilipunguza protini za YAP na α-SMA, malengo ya YAP Ctgf na Ccn1, pamoja na usemi wa fibrogenic Acta2, Col1a1 na Col1a2. Katika majaribio hayohayo ya seli, chanzo kinaripoti kwamba uhai wa seli haukuathiriwa kwa kiasi kikubwa katika hali zilizotumika.

Katika jaribio la in vivo, panya walipokea CCl₄ kwa wiki sita na katika wiki nne za mwisho walitibiwa kwa ND201651 kwa njia ya mdomo.

ND201651 ilikandamiza viwango vya p-PAK4, YAP na p-YAP(T428) vilivyoongezwa na CCl₄; pia ilipunguza Ctgf/Ccn1 na usemi wa jeni za fibrogenic. Histology ya Sirius red na Masson's trichrome pamoja na kipimo cha hydroxyproline vilionyesha kupungua kwa mzigo wa collagen/fibrosis.

Katika kundi la 30 mg/kg, shughuli za serum ALT na AST zilipungua na kulikuwa na uboreshaji wa kupungua kwa uzito wa mwili kulikohusishwa na CCl₄. Waandishi wanatafsiri matokeo haya kuwa yanaendana na athari zenye manufaa za matibabu na kutokuwepo kwa systemic toxicity iliyo wazi katika hali za jaribio.

Hata hivyo, vipimo vya ALT, AST, uzito wa mwili na uhai wa seli wa muda mfupi si toxicology ya kina. Usalama wa kliniki, athari zisizo lengwa, dozi za muda mrefu, pharmacokinetics na bioavailability kwa binadamu havijatatuliwa na jaribio hili.

Je, Matokeo ya ND201651 Yanaonyesha kwamba Kizuizi cha PAK4 Hutibu Fibrosis ya Ini kwa Binadamu?

Hapana. Viumbe hai waliotibiwa moja kwa moja kwa ND201651 walikuwa panya; kutoka kwa binadamu, sampuli za tishu za ini pekee ndizo zilizochunguzwa. Utafiti unaunga mkono PAK4 kama lengo lenye nguvu la kabla ya kliniki la antifibrotic, lakini hauonyeshi dozi yenye ufanisi, usalama, pharmacokinetics, athari za muda mrefu au kupungua kwa fibrosis kliniki kwa binadamu.

Kwa nini jaribio la kifamasia linapaswa kutafsiriwa tofauti na HSC-specific knockout?

Modeli ya Pak4^ΔHSC huelekeza upotevu wa Pak4 hasa kwenye idadi ya HSC, wakati ND201651 inayotolewa kwa mdomo ni kizuizi cha kifamasia kinachosambaa kwa mfumo mzima. Kwa hiyo, jaribio la dawa halitengi athari ya PAK4 katika HSC pekee.

Katika sehemu yao ya Discussion, waandishi wanakumbusha kwamba hepatocytes zilizojeruhiwa hutoa ishara zinazoathiri uamilishaji wa HSC na kwamba hapo awali imeonyeshwa kuwa inhibition ya PAK4 katika hepatocytes inaweza kupunguza oxidative injury na lipotoxicity. Kwa hiyo, wanajadili wazi kwamba athari ya antifibrotic ya ND201651 katika panya inaweza kutokana na inhibition ya pamoja ya PAK4 katika HSC na hepatocytes.

Kwa nini matokeo mahususi kwa HSC na matokeo ya matibabu ya mfumo mzima ni muhimu kwa pamoja?

HSC-specific knockout hutoa ushahidi mahususi kwa aina ya seli kwamba PAK4 ni functional kweli ndani ya HSC kwa fibrosis. Jaribio la systemic inhibitor linaonyesha kwamba lengo la molekuli linaweza kuingiliwa kifamasia. Matokeo ya majaribio haya mawili kwenda katika mwelekeo mmoja huimarisha uthibitishaji wa lengo, lakini majaribio haya hayajibu swali lilelile la kibaiolojia.

Uchanganuzi wa takwimu ulifanywaje?

Chanzo kiliwasilisha matokeo, isipokuwa pale ilipoelezwa vinginevyo, kama wastani ± hitilafu ya kawaida (mean ± SEM). Nukta tofauti katika vielelezo zinawakilisha biological replicates na imeelezwa kwamba matokeo yalipatikana kutoka angalau sampuli au majaribio matatu huru.

Kwa kulinganisha vikundi viwili, ilitumika two-tailed unpaired Student's t test, si one-tailed test. Wakati vikundi zaidi ya kimoja vilihitaji kulinganishwa, one-way ANOVA au kulingana na muundo wa jaribio two-way ANOVA ilitumika, ikifuatiwa na Tukey post-hoc multiple comparisons test.

Chanzo kiliweka kiwango cha statistical significance kuwa P<0.05. Uchanganuzi ulifanywa katika programu ya GraphPad Prism 10.

SEM ina maana gani?

SEM ni kipimo cha standard error kinachoeleza jinsi sample mean inavyokadiria kwa usahihi wastani wa population. Wakati standard deviation inaeleza mtawanyiko kati ya watu binafsi au biological replicates, SEM inahusiana na kutokuwa na uhakika kwa wastani. Kwa kuwa chanzo kilitumia mean±SEM katika grafu, error bars hazipaswi kutafsiriwa moja kwa moja kama standard deviation ya variation yote ya kibaiolojia.

Je, kuna formula ya kihisabati katika makala hii?

PDF kuu ya chanzo haitoi equation au formula ya kihisabati iliyo huru inayofafanua matokeo ya kisayansi. Kwa hiyo, Verianla haijaunda formula za correlation, ANOVA, t test au SEM ambazo hazipo kwenye chanzo kana kwamba ni equations za utafiti wenyewe. Kazi za mbinu za takwimu zimeelezwa kwa madhumuni ya kufundisha, lakini muundo wa kihisabati usio katika chanzo haujaongezwa kwenye safu ya matokeo ya kisayansi.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• PAK4 huongezeka katika HSC zilizoamilishwa na katika modeli mbalimbali za fibrosis ya ini.
• HIF-1α na YY1 huchangia kuongezeka kwa transcription ya PAK4 wakati wa uamilishaji wa HSC kwa kuhusiana na PAK4 promoter.
• Kupotea kwa PAK4 hukandamiza shughuli ya fibrogenic, proliferation, migration na contractility ya HSC.
• Kufuta Pak4 mahususi kwa HSC hupunguza fibrosis ya ini katika modeli za panya za CCl4 na BDL.
• PAK4 huingiliana kimwili na YAP na inaweza kufosforilisha YAP moja kwa moja kwenye eneo la T428 katika protini ya binadamu.
• Phosphorylation ya T428 hupunguza ubiquitination ya YAP na huongeza uthabiti wa YAP, kujikusanya ndani ya kiini na shughuli ya transcription.
• Athari hii ya PAK4 inaungwa mkono kama utaratibu usiotegemea kuongeza au kupunguza shughuli ya LATS1.
• Majaribio ya YAPT428A/YapT413A yanathibitisha umuhimu wa kiutendaji wa phosphorylation ya T428/T413.
• Kuongezeka kwa PAK4, YAP na p-YAP(T428) huonekana katika tishu za ini za binadamu zenye fibrosis.
• ND201651 hupunguza uamilishaji wa HSC na viashiria vya tishu za fibrotic katika modeli ya panya ya CCl4.

Matokeo yasiyoungwa mkono na utafiti

• Haijaonyeshwa kwamba kizuizi cha PAK4 hutibu fibrosis ya ini kwa binadamu.
• Dozi ya kliniki, pharmacokinetics ya binadamu au usalama wa muda mrefu kwa binadamu kwa ND201651 haujabainishwa.
• Haijathibitishwa kwamba T428 inaweza kufosforilishwa na PAK4 pekee; ishara iliyobaki ya p-T428 iliendelea baada ya PAK4 knockdown.
• Correlation ya PAK4-YAP katika tishu za binadamu si ushahidi wa kisababishi peke yake.
• Haijaonyeshwa katika jaribio la kifamasia kwamba athari zote za inhibition ya PAK4 hutokea kupitia HSC pekee.
• Haijathibitishwa kwamba inhibition ya PAK4 itafanya kazi kwa ufanisi uleule katika sababu zote za fibrosis.
• Haijaonyeshwa kwamba PAK4 hutumia utaratibu uleule na TAZ; badala yake utafiti unaunga mkono uteuzi wa PAK4 kwa YAP.
• Haijajaribiwa moja kwa moja kwamba matokeo katika panya dume yatakuwa sawa katika panya jike.
• Matokeo ya uhai wa seli wa muda mfupi, ALT/AST na uzito wa mwili hayachukui nafasi ya toxicology ya kina ya dawa.

Vikwazo vikuu na maswali wazi ya utafiti

Kizuizi cha kwanza muhimu ni tafsiri ya kliniki. Ingawa utafiti unaonyesha uhusiano wenye nguvu katika tishu za binadamu, uingiliaji wa matibabu wenyewe ulifanywa kwa panya, si kwa binadamu.

Kizuizi cha pili ni maendeleo ya vizuizi vya PAK4 vilivyopo. Waandishi wanaeleza wazi kwamba poor bioavailability na potential off-target effects bado zinaweza kuwa matatizo kwa PAK4 inhibitors; wanapendekeza kuchunguza chemical scaffolds mpya na mbinu mbadala kama targeted protein degradation.

Swali la tatu lililo wazi ni jinsi phosphorylation ya YAP T428 inavyofanya kazi pamoja na post-translational modifications nyingine na vidhibiti vya YAP kama mechanical stress. YAP hupokea ishara nyingi tofauti za udhibiti kwenye protini ileile, na uzito wa T428 ndani ya mtandao huu mpana bado haujulikani kikamilifu.

Swali la nne lililo wazi ni jinsi mhimili wa PAK4-YAP unavyofanya kazi si tu katika majukumu ya pathologic fibrogenic ya HSC, bali pia katika majukumu yake ya physiologic/homeostatic yanayotambuliwa zaidi.

Swali la tano lililo wazi ni kwamba mechanisms za kiwango cha juu zinazoanzisha kuongezeka kwa HIF-1α na YY1 katika HSC iliyoamilishwa, pamoja na malengo muhimu ya factors hizi mbali na PAK4, bado hazijaelezwa kikamilifu.

Kizuizi cha sita ni kwamba majaribio ya wanyama yalifanywa kwa panya dume. Kwa hiyo, utafiti haujapima moja kwa moja tofauti za kibaiolojia zinazoweza kutegemea jinsia.

Maana ya kliniki ya utafiti inapaswa kuwekwa mipaka vipi?

Mhimili wa PAK4-YAP T428 ni mgombea mwenye nguvu wa kimakanika kwa maendeleo ya therapeutic target. Sababu ni kwamba lengo hili haliungwi mkono na expression correlation pekee, bali pia na tabaka huru za ushahidi kama gene deletion, direct kinase assay, site-specific LC-MS/MS, mutagenesis, majaribio ya protein stability, mutation ya target site in vivo na pharmacological inhibition.

Hata hivyo, kuwa “lengo zuri la dawa” si sawa na kuwa “dawa salama iliyoidhinishwa”. Maendeleo ya kliniki yanahitaji selective molecule, pharmacokinetics, bioavailability, off-target effects, dose-response, chronic toxicity, etiologies mbalimbali za fibrosis na majaribio ya kliniki kwa binadamu kwa kila kipengele.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Kichwa asili: p21-activated kinase 4 drives hepatic stellate cell activation and liver fibrosis through the phosphorylation of YAP at T428.

Waandishi na mpangilio: Gil-Hwan Kim, Hyunsoo Rho, Chang Hun Lee, You-Jung Hong, Yongdo Park, Hwang Chan Yu, Mi-Young Song, Hye Jin Jo, Eun Joo Kang, Ri Han, Song Yi Yu, Ekihiro Seki, Yoonji Lee, Sangkyu Lee, Eun Ju Bae, Byung-Hyun Park, Chang Yeob Han.

Mchango sawa: Gil-Hwan Kim, Hyunsoo Rho na Chang Hun Lee ni waandishi wenye mchango sawa.

Waandishi wa mawasiliano: Eun Ju Bae, Byung-Hyun Park na Chang Yeob Han.

Taasisi: School of Pharmacy and Institute of New Drug Development, Jeonbuk National University; College of Pharmacy, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Ewha Womans University; Graduate Program in Innovative Biomaterials Convergence, Ewha Womans University; Division of Gastroenterology, Department of Internal Medicine, Jeonbuk National University Medical School; Research Institute of Clinical Medicine of Jeonbuk National University-Biomedical Research Institute of Jeonbuk National University Hospital; Graduate School of Medical Science and Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Jeonbuk National University Medical School; School of Pharmacy, Sungkyunkwan University; College of Pharmacy, Chung-Ang University; Karsh Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center.

Jarida: Signal Transduction and Targeted Therapy.

Juzuu / namba ya makala: 11 / 297.

Mwaka wa uchapishaji: 2026.

Tarehe ya kupokelewa: 19 Novemba 2025.

Tarehe ya marekebisho: 19 Machi 2026.

Tarehe ya kukubaliwa: 11 Mei 2026.

Tarehe ya uchapishaji wa Version of Record: 30 Julai 2026.

DOI: 10.1038/s41392-026-02796-0.

Rekodi rasmi: Nature / Signal Transduction and Targeted Therapy; inapatikana kupitia DOI.

Aina ya chanzo: Original Article / makala ya utafiti iliyopitiwa na wataalamu.

Hali ya preprint: Chanzo hiki si preprint; ni Version of Record rasmi.

Leseni: Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International (CC BY-NC-ND 4.0).

Maelezo ya leseni/picha: Kwa kuwa leseni ya CC BY-NC-ND hairuhusu kushiriki nyenzo za chanzo zilizorekebishwa, composition ya Figure 1-8 ya chanzo haijazalishwa upya. SVG iliyotolewa ndani ya makala ni mchoro huru wa kielimu uliotengenezwa kutoka mwanzo kwa kutumia uhusiano wa kweli wa utaratibu katika maandishi ya chanzo.

Idhini ya kimaadili ya utafiti wa binadamu: Jeonbuk National University Hospital Institutional Review Board, IRB No. JUH 2023-11-024-001. Utafiti ulifanywa kwa mujibu wa Helsinki Declaration na written informed consent ilipatikana kutoka kwa washiriki.

Idhini ya kimaadili ya utafiti wa wanyama: Jeonbuk National University Institutional Animal Care and Use Committee, No. NON2023-099.

Wanyama: Panya dume wa Wild-type C57BL/6N na C57BL/6J; mistari ya Pak4-floxed na Pdgfr-β-CreERT2 ilitumika.

HSC-specific Pak4 knockout: Msalaba wa Pak4flox/flox × Pdgfr-β-CreERT2; kwa uamilishaji wa CreERT2 tamoxifen 75 mg/kg/siku, intraperitoneal kwa siku tano mfululizo.

Modeli ya CCl4: Katika panya dume wenye umri wa wiki nane, CCl4 0.6 mL/kg intraperitoneal, mara mbili kwa wiki, kwa wiki sita.

Modeli ya BDL: Katika panya dume wenye umri wa wiki nane, bile duct ligation; kuchukua sampuli baada ya wiki mbili.

Modeli ya CDAHFD: Katika panya dume C57BL/6N wenye umri wa wiki sita, lishe yenye %60 kcal mafuta, %0.1 methionine na bila choline ya ziada; wiki 12.

Mifumo ya seli: LX-2 immortalized human HSC line na primary mouse HSCs.

Utamaduni wa primary HSC: Kutenga kwa Collagenase type IV perfusion na Percoll gradient centrifugation; DMEM + %10 fetal bovine serum + 100 U/mL penicillin + 100 μg/mL streptomycin; 37 °C na %5 CO2.

Mbinu kuu za molekuli: Western blot, immunofluorescence/co-immunofluorescence, qPCR, ChIP, RNA-seq, Gene Ontology, GSEA, Co-IP, PLA, in vitro kinase assay, immunoprecipitation/ubiquitination assay, cycloheximide chase, YAP-responsive luciferase assay, peptide competition, LC-MS/MS, molecular docking na short molecular dynamics refinement.

Antikodi mpya ya p-T428-YAP: Polyclonal antibody maalumu ilitengenezwa kwa kutumia EMDTGD[pT]INQSTL phosphopeptide yenye T428 ya YAP ya binadamu; specificity ilidhibitiwa kwa ELISA na peptide competition.

Mutant ya Mouse Yap T413: Ortholog ya panya ya T428 ya YAP ya binadamu ni T413. Mutation ya YapT413A iliundwa kama ACC → GCC na mfumo wa lentiviral unaodhibitiwa na Col1a1 promoter ulitumika.

Matumizi ya lentiviral in vivo: Baada ya wiki mbili za kwanza za matibabu ya CCl4, control LV, LV-Yap au LV-YapT413A zilitolewa kwa njia ya retro-orbital intravenous kwa 1×10⁸ TU/panya na CCl4 ikaendelea kwa wiki nyingine nne.

Uingiliaji wa kifamasia: ND201651, kizuizi cha PAK4 cha mdomo; 10 au 30 mg/kg katika wiki nne za mwisho za modeli ya CCl4.

Takwimu: Matokeo mean±SEM; nukta ni biological replicates; kwa vikundi viwili two-tailed unpaired Student's t test; kwa vikundi vingi one-way au two-way ANOVA na Tukey post-hoc test; umuhimu P<0.05; GraphPad Prism 10.

Hali ya formula ya kihisabati: PDF kuu haitoi equation/formula huru ya kisayansi. Hakuna equation ya nje ya chanzo iliyoundwa.

Upatikanaji wa data ya RNA-seq: Raw na processed RNA-seq data zimehifadhiwa katika NCBI Gene Expression Omnibus kwa accession number GSE308719.

Upatikanaji wa data: Imeelezwa kwamba data zilizozalishwa au kuchanganuliwa katika utafiti zinapatikana ndani ya makala na RNA-seq data zimewekwa kwenye GEO.

Ufadhili: Grants za 2020R1C1C1003652, 2021R1I1A3041149, RS-2024-00344251, RS-2026-25476540, RS-2023-NR077221 na RS-2024-00357518 kutoka National Research Foundation of Korea; kupitia Bio & Medical Technology Development Program, 2022M3E5F2017607, RS-2026-25517589 na RS-2025-02214748; pia msaada kutoka Yuhan Innovation Program, Jeonbuk National University Hospital Biomedical Research Institute Fund na Jeonbuk National University Glocal University 30 Project uliripotiwa.

Mgongano wa maslahi: Waandishi walitangaza kwamba hakuna competing interests.

Michango ya waandishi: G.H.K., H.R., E.J.B., B.H.P. na C.Y.H. walibuni utafiti. G.H.K., H.R., Y.J.H., Y.P., H.C.Y., M.Y.S., H.J.J. na S.Y.Y. walifanya majaribio na kuchanganua data. C.H.L. alikusanya sampuli za tishu za binadamu. E.J.K. na S.L. walifanya uchanganuzi wa LC-MS/MS; R.H. na Y.L. walifanya uchanganuzi wa molecular docking. E.S. alitoa msaada wa kiufundi na ushauri wa kisayansi. E.J.B., B.H.P. na C.Y.H. walisimamia utafiti.

Mpaka mkuu wa kisayansi: Uchanganuzi wa tishu za binadamu hutoa uhusiano wa kliniki lakini si jaribio la matibabu. Sehemu muhimu ya ushahidi wa kisababishi na matibabu inategemea modeli za seli na panya.

Mpaka wa maendeleo ya dawa: Chanzo kinaeleza kwamba poor bioavailability na potential off-target effects ni matatizo yanayohitaji kutatuliwa kwa PAK4 inhibitors.

Mpaka wa utaratibu: PAK4 knockdown haikuondoa kabisa phosphorylation ya T428; incomplete knockdown na/au kinases nyingine ambazo bado hazijatambuliwa zimehifadhiwa katika chanzo kama maelezo yanayowezekana.