PAK4-YAP siqnal oxu bu tədqiqatda aktivləşmiş hepatik stellat hüceyrələrdə p21-activated kinase 4-ün (PAK4) Yes-associated protein-i (YAP) insan zülalındakı T428 bölgəsində fosforilləşdirərək YAP-ın zülal sabitliyini, nüvədə toplanmasını və transkripsiya aktivliyini artırdığı; bunun nəticəsində hepatik stellat hüceyrə aktivləşməsini və qaraciyər fibrogenezini dəstəklədiyi tənzimləyici mexanizmdir. Tədqiqatçılar bu oxu insan qaraciyər toxumalarında, ilkin siçan hepatik stellat hüceyrələrində, LX-2 insan HSC xəttində, müxtəlif siçan fibroz modellərində, HSC-yə məxsus Pak4 gen silmə təcrübələrində, RNA-seq analizlərində, zülal-zülal qarşılıqlı təsiri və kinaz testlərində, mutagenezdə, LC-MS/MS-də, molekulyar modelləşdirmədə və PAK4 inhibitoru ND201651 ilə farmakoloji təcrübələrdə araşdırmışdır.

Tədqiqatın əsas tapıntısı PAK4-ün yalnız fibrotik qaraciyərlərdə artan bir zülal olmamasıdır. PAK4-ün YAP ilə fiziki olaraq qarşılıqlı təsir göstərdiyi, insan YAP-ını əvvəllər müəyyən edilməmiş T428 treonin qalığında birbaşa fosforilləşdirdiyi və bu dəyişikliyin YAP-ın ubikitin-proteazom sistemi vasitəsilə parçalanmasını azaldaraq zülalı sabitləşdirdiyi göstərilmişdir. Sabitləşən YAP nüvədə daha çox toplanmış, TEAD-asılı transkripsiya aktivliyi yüksəlmiş və CTGF, CCN1 və kollagenlə əlaqəli profibrotik gen proqramları güclənmişdir.

PAK4-ün genetik olaraq susdurulması ilkin HSC-lərdə α-SMA və COL1A1 kimi fibrogenik göstəriciləri azaltmış; hüceyrə proliferasiyası, miqrasiyası və kollagen gel kontraksiyası kimi aktivləşmiş HSC fenotiplərini zəiflətmişdir. HSC-yə məxsus Pak4 silinməsi həm karbon tetraklorid (CCl₄), həm də öd axacağı liqasiyası (BDL) ilə yaradılan siçan fibroz modellərində kollagen yığılmasını, hidroksiprolin miqdarını, α-SMA sahəsini və fibrogenik gen ekspressiyasını azaltmışdır.

Mexanizmin səbəb-nəticə baxımından əhəmiyyətini sınamaq üçün insan YAP-dakı T428-ə uyğun gələn siçan Yap T413 bölgəsi fosforilləşə bilməyəcək şəkildə alaninə çevrilmişdir. HSC-lərdə phospho-inactive Yap^T413A mutantının ekspressiyası, normal WT-Yap ekspressiyasından fərqli olaraq CCl₄-ilə əlaqəli qaraciyər fibrozisini gücləndirməmiş; əksinə kollagen yığılmasını və HSC aktivləşməsini azaltmışdır. Hüceyrə təcrübələrində insan YAP^T428A mutantı daha sürətlə ubikitinləşmiş və parçalanmış, nüvədə daha az toplanmış və daha aşağı transkripsiya aktivliyi göstərmişdir. Fosforilləşməni təqlid edən YAP^T428E isə əks istiqamətdə davranmışdır.

İnsan qaraciyər toxumalarında PAK4 və YAP ekspressiyası normal toxumadan fibrozis və sirroza doğru yüksəlmiş; T428-fosforilləşmiş YAP da xəstəliyin ağırlığı ilə birlikdə artmışdır. Bununla belə insan məlumatları müşahidə xarakterlidir. İnsanlarda PAK4 inhibisiyası tətbiq edilməmiş və klinik müalicə uğuru sınaqdan keçirilməmişdir. Tədqiqatın dərman müdaxiləsi CCl₄ ilə fibrozis yaradılmış siçanlarda oral ND201651 istifadə edilərək aparılmışdır. Buna görə nəticələr güclü preklinik mexanizm və hədəf doğrulaması təqdim etsə də, insanlarda sübut edilmiş antifibrotik müalicə kimi şərh edilə bilməz.

Qaraciyər fibrozisində hepatik stellat hüceyrə niyə mərkəzi hüceyrədir?

Hepatik stellat hüceyrələr (hepatic stellate cells, HSCs) sağlam qaraciyərdə əsasən sakit, yəni quiescent vəziyyətdə olan və başlıca vitamin A tərkibli lipid damcılarını saxlayan hüceyrələrdir. Qaraciyər davamlı və ya ağır zədələndikdə HSC-lər aktivləşir və myofibroblast-bənzər fenotipə çevrilir. Bu çevrilmədən sonra hüceyrədənkənar matriksin, xüsusilə kollagenin istehsalı nəzərəçarpacaq dərəcədə artır. Fibrozis bu matriksin normal toxuma arxitekturasını pozacaq şəkildə yığılmasıdır.

Aktivləşmiş HSC-lər yalnız kollagen istehsal edən hüceyrələr deyil. Onların proliferasiyası arta, zədələnmiş sahələrə miqrasiya edə və kontraktil xüsusiyyət qazana bilərlər. Buna görə tədqiqatçılar PAK4-ün təsirini yalnız bir kollagen göstəricisində deyil; fibrotik aktivlik, proliferasiya, miqrasiya və kontraktillik kimi bir neçə HSC fenotipində qiymətləndirmişdir.

α-SMA və COL1A1 nəyi göstərir?

α-SMA alpha-smooth muscle actin-in qısaltmasıdır və HSC-nin quiescent vəziyyətdən myofibroblast-bənzər aktivləşmiş vəziyyətə keçməsini izləmək üçün geniş istifadə olunan göstəricilərdən biridir. COL1A1 isə tip I kollagenin alfa-1 zəncirini kodlayan gen/zülaldır. Tip I kollagen fibrotik ekstraselulyar matriksin mühüm komponentlərindən biridir. Buna görə α-SMA-nın azalması HSC aktivləşməsinin; COL1A1 və digər kollagenlə əlaqəli genlərin azalması isə fibrogenik matriks istehsalının zəiflədiyinə işarə edir.

PAK4 nədir və S474 niyə ölçüldü?

PAK4 p21-activated kinase ailəsinin II qrup üzvü olan serin/treonin zülal kinazıdır. Zülal kinazları hədəf zülallardakı müəyyən amin turşusu qalıqlarına fosfat qrupu əlavə etməklə zülalların aktivliyini, sabitliyini, hüceyrədaxili yerləşməsini və ya digər zülallarla qarşılıqlı təsirini dəyişə bilər.

PAK ailəsi I qrup PAK1-3 və II qrup PAK4-6 kimi təsnif edilir. Tədqiqatda yalnız ümumi PAK4 miqdarı deyil, PAK4-ün S474, yəni 474. amin turşusundakı serin qalığının fosforilləşməsi də ölçülmüşdür. PAK4-ün aktivləşməsi ilə əlaqəli otofosforilləşməsi səbəbindən p-PAK4(S474), PAK4 aktivliyinin göstəricisi kimi istifadə edilmişdir.

İlk tapıntı: PAK4 fibrotik və aktivləşmiş HSC-lərdə artır

CCl₄ ilə yaradılan siçan qaraciyər fibrozisində ümumi PAK4 və p-PAK4(S474), HSC aktivləşmə göstəricisi α-SMA ilə birlikdə artmışdır. Eyni meyl öd axacağı liqasiyası (BDL) modelində və choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet (CDAHFD) modelində də qiymətləndirilmişdir.

İmmunoflüoresans analizləri PAK4 siqnalının xüsusilə α-SMA-müsbət aktivləşmiş HSC populyasiyası ilə birlikdə artdığını göstərmişdir. Bu fərq vacibdir; çünki bütün qaraciyər toxumasında bir zülalın artması həmin zülalın mütləq stellat hüceyrədə artdığını göstərmir. PAK4 ilə α-SMA-nın eyni hüceyrələrdə birlikdə göstərilməsi HSC kontekstini gücləndirmişdir.

İnsan nümunələrindən necə istifadə edildi?

İnsan qaraciyər toxumaları Jeonbuk National University Hospital-da qaraciyər rezeksiyası, transplantasiya və ya biopsiya aparılan şəxslərdən Noyabr 2017-May 2023 arasında toplanmışdır. Nümunələr orijinal patoloji hesabatlarındakı histoloji METAVIR mərhələlənməsinə görə normal, fibrozis və sirroz qruplarına ayrılmışdır.

Kohortun əsas etiologiyası xroniki hepatit B virusu infeksiyasıdır; əlavə olaraq hepatit C, metabolik disfunksiya ilə əlaqəli steatotik qaraciyər xəstəliyi və alkoqolla əlaqəli qaraciyər xəstəliyi nümunələri də mövcuddur. Mənbə sirroz qrupundakı bütün xəstələrin kompensə olunmuş sirroza malik olduğunu bildirir.

İnsan toxuma analizlərində PAK4 və α-SMA-nın birlikdə müsbət olduğu hüceyrələrin nisbəti fibrozisin ağırlığı ilə artmışdır. Daha sonra HSC səviyyəsində YAP və PAK4 ekspressiyası arasında müsbət əlaqə göstərilmiş; mənbə Figure 6i-də PAK4-müsbət və YAP-müsbət HSC populyasiyaları üçün r=0.6666 və P<0.0001 bildirilmişdir. Bundan əlavə p-YAP(T428) zülalı normal toxumadan fibrozis və sirroza doğru yüksəlmişdir.

Burada mühüm elmi sərhəd budur: insan nümunələrində müşahidə edilən əlaqə PAK4-ün xəstələrdə fibrozisi təkbaşına səbəb olaraq yaratdığını sübut etmir. Səbəb-nəticə iddiasını gücləndirən əsas təcrübələr genetik silmə, kinaz testi, mutasiya və siçan müdaxilələridir.

PAK4 niyə aktivləşmiş HSC-də yüksəlir?

İlkin siçan HSC-ləri quiescent vəziyyətdən aktivləşmiş vəziyyətə keçərkən yalnız PAK4 zülalı deyil, Pak4 mRNA-sı da artmışdır. Bu tapıntı artımın ən azı qismən transkripsiya səviyyəsində baş verə biləcəyini düşündürmüşdür.

Tədqiqatçılar Evolutionary Conserved Regions skrininqi ilə insan və siçan PAK4/Pak4 proksimal promoter bölgələrində iki mümkün transkripsiya faktoru bağlanma sahəsi müəyyən etmişdir: HIF-1α və YY1.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) təcrübələri HIF-1α və YY1-in PAK4 promoter bölgələrinə bağlandığını göstərmişdir. LX-2 hüceyrələrində HIF-1α və ya YY1-in siRNA ilə susdurulması PAK4 ekspressiyasını azaltmışdır. Beləliklə tədqiqat PAK4 artımının aktivləşmiş HSC-nin transkripsion yenidən proqramlaşdırılması ilə əlaqəli olduğunu dəstəkləyir.

ChIP təcrübəsi nəyi göstərir?

ChIP müəyyən DNA-bağlayıcı zülalın hüceyrə daxilində hansı genomik sahəyə bağlandığını sınamaq üçün istifadə olunan üsuldur. Bu təcrübədə sual “HIF-1α və YY1 həqiqətən PAK4 promoter bölgəsinə bağlanırmı?” şəklindədir. ChIP nəticəsi yalnız iki genin eyni vaxtda ekspressiya olunduğunu deyil, transkripsiya faktorunun müvafiq promoter DNA-sı ilə fiziki əlaqəsini sınayır.

PAK4 itirildikdə HSC-də nə baş verir?

İlkin siçan HSC-lərində iki ayrı genetik yanaşma istifadə edilmişdir. Birinci yanaşmada Pak4^f/f siçanlarından izolə olunan HSC-lər üç gün kultivasiya edilmiş, daha sonra Cre rekombinaz daşıyan adenovirusla yoluxdurulmuş və üç gün də kultivasiya edilmişdir. İkinci yanaşma wild-type ilkin HSC-lərdə siRNA ilə Pak4 knockdown aparılmasıdır.

Hər iki yanaşmada PAK4 itkisi α-SMA və tip I kollagen səviyyələrini azaltmış, Acta2, Des, Col1a1, Col1a2, Serpine1, Timp1 və Col7 kimi fibrogenik genlərin ekspressiyasını aşağı salmışdır.

PAK4-ün susdurulması həmçinin HSC proliferasiyasını və miqrasiyasını azaltmış, collagen gel contraction təcrübəsində kontraktil qabiliyyəti zəiflətmişdir. Beləliklə PAK4 təsiri yalnız kollagen ekspressiyasındakı tək bir dəyişikliyə endirilməmişdir.

RNA-seq analizi niyə aparıldı?

Ayrı-ayrılıqda seçilmiş fibrozis genlərini ölçmək tədqiqatçının əvvəlcədən bildiyi hədəflərə fokuslanır. RNA sequencing (RNA-seq) isə bütün transkriptom səviyyəsində dəyişiklikləri daha qərəzsiz şəkildə araşdırmağa imkan verir.

PAK4 knockdown HSC-lərdə n=4 bioloji təkrar üzərində aparılan RNA-seq-dən sonra Gene Ontology analizi ekstraselulyar matriks təşkilatlanması, hüceyrə miqrasiyası və proliferasiya ilə əlaqəli gen proqramlarının dəyişdiyini göstərmişdir. Gene Set Enrichment Analysis isə kollagen yaranması ilə əlaqəli gen dəstlərinin PAK4 itkisi zamanı aşağı tənzimləndiyini ortaya qoymuşdur.

GO ilə GSEA arasındakı fərq nədir?

Gene Ontology analizi dəyişən genlərin hansı bioloji proseslərdə cəmləşdiyini təsnif edir. GSEA isə genləri yalnız “əhəmiyyətli/əhəmiyyətsiz” kimi ayırmaq əvəzinə bütün sıralanmış ekspressiya siyahısında müəyyən gen dəstlərinin siyahının yuxarı və ya aşağı hissəsində sistematik olaraq toplanıb-toplanmadığını qiymətləndirir. Bu tədqiqatda hər iki yanaşma PAK4 itkisinin fibrogenik HSC proqramını zəiflətdiyi istiqamətində nəticə vermişdir.

HSC-yə məxsus Pak4 silinməsi siçanda necə həyata keçirildi?

Pak4-floxed siçanları Pdgfr-β-CreERT2 siçanları ilə çarpazlaşdırılaraq Pak4^ΔHSC modeli yaradılmışdır. CreERT2-nin aktivləşdirilməsi və aktivləşmiş HSC-lərdə Pak4 geninin silinməsi üçün tamoksifen intraperitoneal olaraq 75 mg/kg/gün dozada beş ardıcıl gün verilmişdir.

Bu yanaşma bütün bədəndə Pak4 genini silmək əvəzinə hədəf hüceyrə populyasiyasına daha güclü fokuslanır. Beləliklə müşahidə olunan fibrozis dəyişikliyinin HSC daxilində PAK4 funksiyası ilə əlaqəsi farmakoloji sistemik inhibisiyaya nisbətən daha birbaşa sınaqdan keçirilə bilər.

CCl4 fibrozis modeli

Səkkiz həftəlik erkək siçanlarda CCl₄, corn oil vehicle ilə müqayisəli şəkildə 0.6 mL/kg dozada həftədə iki dəfə, ümumilikdə altı həftə intraperitoneal tətbiq edilmişdir. CCl₄ qaraciyərdə təkrarlanan hepatosellulyar zədə yaradaraq fibrotik cavabı başladan eksperimental modeldir.

BDL fibrozis modeli

İkinci modeldə səkkiz həftəlik erkək siçanlara sham əməliyyatı və ya bile duct ligation tətbiq edilmiş və heyvanlar iki həftə sonra qiymətləndirilmişdir. BDL öd axınının cərrahi yolla qarşısının alınması ilə xolestatik qaraciyər zədəsi və fibrozis yaradan, mexanizm baxımından CCl₄-dən fərqli modeldir.

CDAHFD nə üçün istifadə edildi?

Altı həftəlik C57BL/6N erkək siçanlar normal chow diet və ya %60 kcal yağ və %0.1 metionin tərkibli, əlavə xolin olmayan choline-deficient, L-amino acid-defined high-fat diet ilə 12 həftə qidalandırılmışdır. Tədqiqat bu modeli PAK4 ekspressiyasının müxtəlif fibrozis kontekstlərində artdığını göstərmək üçün istifadə etmişdir.

HSC-spesifik Pak4 itkisinin in vivo nəticəsi

CCl₄ təcrübəsində LT-Vehicle n=6, LT-CCl₄ n=8, Pak4^ΔHSC-Vehicle n=4 və Pak4^ΔHSC-CCl₄ n=6-dır. BDL təcrübəsində LT-Sham n=3, LT-BDL n=6, Pak4^ΔHSC-Sham n=3 və Pak4^ΔHSC-BDL n=6-dır.

HSC proliferasiyası da PCNA və α-SMA ikiqat-müsbət hüceyrələr üzrə azalmışdır. Bunun əksinə cleaved caspase-3 və α-SMA birgə boyanması HSC apoptozunda nəzərəçarpacaq dəyişiklik göstərməmişdir. Bu fərq daha aşağı fibrozisin yalnız HSC-lərin daha çox ölməsindən qaynaqlanmadığını; HSC aktivləşməsi və genişlənməsinin zəiflədilməsinin mühüm olduğunu dəstəkləyir.

Serum ALT və AST aktivliklərinin HSC-spesifik Pak4 knockout modellərində nəzərəçarpacaq dərəcədə dəyişməməsi də tədqiqatçıların HSC-yə məxsus təsir şərhini dəstəkləyən əlavə tapıntılardan biridir.

PAK4 ilə YAP arasındakı əlaqə necə aşkar edildi?

PAK4 itirilmiş HSC-lərin RNA-seq nəticələrində KEGG pathway analizi Hippo signaling pathway-nin dəyişdiyini göstərmişdir. GeneMANIA əsaslı şəbəkə analizi YAP-ı bu dəyişən şəbəkə ilə yaxından əlaqəli mərkəzi molekullardan biri kimi göstərmişdir.

İlkin HSC aktivləşməsi zamanı YAP zülalı PAK4-ə paralel şəkildə artmışdır. WT-PAK4-ün həddindən artıq ekspressiyası YAP-responsive luciferase aktivliyini və CTGF ilə CYR61/CCN1 kimi YAP hədəf genlərini artırarkən katalitik aktivliyi pozulmuş PAK4^S474A mutantı eyni təsirləri göstərməmişdir.

Bu nəticə PAK4-ün yalnız YAP-la birlikdə olan bir zülal olmadığını; PAK4-ün kinaz aktivliyinin YAP funksiyası üçün zəruri olduğunu düşündürmüşdür.

YAP nədir?

Yes-associated protein (YAP) Hippo signaling pathway-nin əsas transkripsion koaktivatorlarından biridir. YAP birbaşa DNA-ya bağlanan klassik transkripsiya faktoru deyil; nüvədə TEAD ailəsi kimi DNA-bağlayıcı tərəfdaşlarla kompleks yaradaraq CTGF, CCN1 və digər proliferativ/fibrogenik hədəf genlərin transkripsiyasını dəstəkləyir.

YAP-ın bioloji təsiri yalnız ümumi zülal miqdarı ilə müəyyən edilmir. Zülalın fosforilləşmə vəziyyəti, sabitliyi, sitoplazma/nüvə paylanması və ubikitin-proteazom sistemi tərəfindən nə qədər sürətlə parçalandığı da vacibdir.

PAK4 YAP-ı T428-də Fosforilləşdirdikdə Nə Dəyişir?

PAK4 tərəfindən insan YAP-ının T428 treonin qalığının fosforilləşdirilməsi YAP ubikitinləşməsini azaldaraq zülalın parçalanmasını ləngidir, YAP zülal sabitliyini və nüvədə toplanmasını artırır və TEAD-asılı transkripsiya aktivliyini gücləndirir; tədqiqatın hüceyrə və siçan təcrübələrində bu zəncir daha güclü HSC aktivləşməsi və fibrogenezlə əlaqəlidir.

PAK4-YAP fiziki qarşılıqlı təsiri necə göstərildi?

Co-immunoprecipitation (Co-IP) bir zülalın antikorla çökdürülməsi zamanı ona bağlı başqa bir zülalın da kompleksin tərkibində gəlib-gəlmədiyini araşdırır. Co-IP təcrübələrində PAK4 və YAP eyni zülal kompleksində aşkar edilmişdir.

Proximity ligation assay (PLA) hüceyrə daxilində iki zülalın bir-birinə çox yaxın fiziki məsafədə olduğunu flüoresans siqnalı ilə göstərən üsuldur. PLA da PAK4-YAP yaxınlığını dəstəkləmişdir.

Mühüm spesifiklik nəzarəti kimi PAK4 YAP-ın paralogu TAZ ilə eyni şəkildə bağlanmamışdır. Bu nəticə PAK4-ün bütün YAP/TAZ ailəsini fərq qoymadan hədəfləmədiyini göstərir.

PAK4-ün YAP-ı birbaşa fosforilləşdirdiyi necə göstərildi?

Rekombinant insan PAK4 və YAP-ın istifadə edildiyi hüceyrəsiz in vitro kinase assay PAK4-ün YAP-ı birbaşa fosforilləşdirə bildiyini göstərmişdir. Təcrübə zamanı PAK4-ün öz otofosforilləşməsi də izlənmişdir.

WT-PAK4 YAP-ın treonin fosforilləşməsini artırdığı halda kinase-dead PAK4^S474A mutantı eyni artımı yaratmamışdır. Serin fosforilləşməsində eyni nümunənin görülməməsi tədqiqatçıları treonin qalıqlarına yönəltmişdir.

T428 bölgəsi necə tapıldı?

PhosphoNET və PhosphoSitePlus kimi in silico fosforilləşmə sahəsi proqnoz vasitələri beş namizəd YAP sahəsi təklif etmişdir. Bu namizədləri ehtiva edən oliqopeptidlərlə aparılan competition təcrübələri PAK4-ün xüsusilə T428 bölgəsini hədəflədiyini göstərmişdir.

T428 fosforilləşməsi daha sonra site-specific liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analizi ilə dəstəklənmişdir. Bu üsul zülal/peptidləri kütlə/yük davranışına görə ayıraraq müəyyən peptidlərdəki post-translational modification-ları aşkarlamağa imkan verir.

Molekulyar modelləşdirmə nəyi göstərdi və nəyi göstərmədi?

Tədqiqatçılar insan YAP-ın T428-i ehtiva edən 423MDTGDTINQST433 peptid seqmentini PAK4-ün catalytic domain-inə dock etmiş, sonra sterik toqquşmaları azaltmaq və zülal-peptid interfeysini rahatlaşdırmaq məqsədilə backbone restraints ehtiva edən qısamüddətli molecular dynamics simulyasiyaları tətbiq etmişdir.

Əldə edilən modellərdə YAP T428 bölgəsi PAK4-ün katalitik cibinə doğru yönəlmiş və treonin hydroxyl qrupu katalitik qalığa hidrogen rabitəsi məsafəsində yerləşmişdir.

Bu model “PAK4-T428 fosforilləşməsinin özü kompüterdə sübut edildi” demək deyil. Molecular docking və MD reaksiyanın struktur baxımdan mümkün olduğuna dair izahlı dəstək verir. Birbaşa biokimyəvi sübut kinase assay, mutagenez, peptide competition və LC-MS/MS-dən gəlir.

Yeni p-T428-YAP anticismi niyə hazırlandı?

T428 əvvəllər YAP-ın yaxşı xarakterizə olunmuş fosforilləşmə sahələrindən biri olmadığı üçün tədqiqatçılar T428-fosforilləşmiş YAP-ı xüsusi olaraq ölçmək məqsədilə yeni polyclonal antibody hazırlamışdır.

İnsan YAP T428 bölgəsini ehtiva edən EMDTGD[pT]INQSTL phosphopeptide sintez edilmiş, keyhole limpet hemocyanin-ə bağlanmış və dovşanların immunizasiyasında istifadə edilmişdir. Antikor titrləri fosforilləşmiş və fosforilləşməmiş peptidlərə qarşı ELISA ilə qiymətləndirilmişdir.

Serum protein A/G chromatography və ardınca fosforilləşmiş peptide-ə spesifik affinity purification ilə təmizlənmişdir. Antikorun T428-fosforilləşmiş peptide seçiciliyi ELISA və peptide competition təcrübələri ilə doğrulanmışdır.

PAK4 susdurulduqda T428 fosforilləşməsi niyə tamamilə sıfırlanmadı?

LX-2 hüceyrələrində PAK4 knockdown-dan sonra p-YAP(T428) siqnalı nəzərəçarpacaq dərəcədə azalmış, lakin tamamilə yox olmamışdır. Müəlliflər bunun iki mümkün izahını açıq şəkildə bildirirlər: təcrübə şəraitində PAK4 susdurulmasının tam olmaması və/və ya T428-i fosforilləşdirə bilən hələ müəyyən edilməmiş başqa kinazların mövcudluğu.

Buna görə tədqiqat “YAP T428-i bioloji olaraq yalnız PAK4 fosforilləşdirə bilər” nəticəsini dəstəkləmir. Dəstəklənən nəticə PAK4-ün T428-i birbaşa fosforilləşdirə bilən və bu bölgədə mühüm tənzimləyici rola malik kinaz olmasıdır.

PAK4 YAP miqdarını mRNA vasitəsilə artırırmı?

İlkin HSC-lərdə PAK4 knockdown YAP zülal miqdarını azaltdığı halda Yap mRNA-sını nəzərəçarpacaq dərəcədə dəyişdirməmişdir. Bu vəziyyət PAK4-ün YAP üzərindəki əsas təsirinin transkripsiya səviyyəsində yeni YAP istehsalını artırmaqdan daha çox zülal sabitliyi üzərində olduğunu düşündürmüşdür.

CHX chase testi nəyi ölçür?

Cycloheximide (CHX) yeni zülal sintezini inhibə edir. Yeni YAP istehsalı dayandırıldıqdan sonra mövcud YAP-ın zaman keçdikcə nə qədər sürətlə azaldığı izlənərsə, zülalın sabitliyi haqqında məlumat əldə etmək olar.

PAK4-ün həddindən artıq ekspressiyası YAP-ın CHX mövcudluğunda daha uzun müddət qorunmasını təmin etmişdir. Bunun əksinə phospho-inactive YAP^T428A daha sürətlə yox olmuşdur. Bu nəticə T428 fosforilləşməsinin YAP zülalının ömrünü uzadan funksional təsirini dəstəkləyir.

Ubikitinləşmə niyə vacibdir?

Ubikitin hədəf zülalların hüceyrə daxilində, xüsusilə proteazomal parçalanmaya göndərilməsində istifadə olunan kiçik işarə zülalıdır. Bir zülalın yüksək səviyyədə polyubiquitination-a məruz qalması əksər hallarda onun proteazom tərəfindən parçalanmağa hazırlanması ilə əlaqəlidir.

PAK4 overexpression YAP ubikitinləşməsini azaltmışdır. PAK4 knockdown səbəbindən yaranan YAP qeyri-sabitliyi E3 ubiquitin ligase β-TRCP susdurulduqda geri dönmüş, FBXW7 knockdown isə eyni qorumanı təmin etməmişdir. Buna görə tədqiqat PAK4-YAP sabitləşmə əlaqəsində β-TRCP-ni xüsusilə ön plana çıxarır.

LATS1 ilə PAK4 eyni fosforilləşməni həyata keçirirmi?

Xeyr. Kanonik Hippo signaling pathway daxilində LATS1-in YAP üzərindəki yaxşı məlum olan inhibitəedici sahələrindən biri S127-dir. S127 fosforilləşməsi 14-3-3 bağlanmasını, sitoplazmada saxlanmanı və YAP inhibisiyasını dəstəkləyir.

PAK4 isə bu tədqiqatda YAP-ı T428-də aktivləşdirici istiqamətdə fosforilləşdirən fərqli kinaz kimi göstərilmişdir. PAK4 knockdown LATS1-in ümumi miqdarını və ya T1079-fosforilləşmiş aktiv LATS1 səviyyəsini dəyişdirməmişdir. PAK4-ün YAP sabitləşdirmə təsiri LATS1 knockdown şəraitində də davam etmişdir.

Phosphomimetic YAP^T428E mutantı əlavə olaraq LATS1 ilə stimullaşdırılan YAP deqradasiyasına daha davamlı davranmışdır. Bu nəticələr PAK4-T428 oxunun LATS1-in kanonik inhibisiya mexanizmini yalnız yuxarıdan açıb-bağlayan dolayı təsirdən fərqli olduğunu dəstəkləyir.

YAPT428A və YAPT428E Mutasiyaları Nəyi Sınayır?

YAP^T428A-da fosforilləşə bilən treonin alaninlə əvəz edilərək T428 fosforilləşməsinin baş verməsi əngəllənir; YAP^T428E-də treonin glutamatla əvəz edilərək fosforilləşmiş bölgənin mənfi yükü qismən təqlid edilir. Bu əks mutantlar T428 fosforilləşməsinin yalnız birlikdə görünən bir işarə olub-olmadığını, yoxsa YAP sabitliyi, hüceyrədaxili yerləşməsi və transkripsiya funksiyası üzərində funksional tənzimləyici olub-olmadığını sınamaq üçün istifadə edilmişdir.

T428A mutantının nəticəsi

PAK4 mövcudluğunda WT-YAP-la müqayisədə YAP^T428A daha çox ubikitinləşmiş və CHX chase zamanı daha sürətlə parçalanmışdır. Eyni mutant hüceyrələrdə daha çox sitoplazmik saxlanma və daha aşağı YAP-responsive luciferase aktivliyi göstərmişdir.

T428E mutantının nəticəsi

Fosforilləşməni təqlid edən YAP^T428E mutantı əks istiqamətdə davranmış; YAP sabitliyi və transkripsiya aktivliyi baxımından phospho-inactive mutantdan fərqli nəticə göstərmişdir. Beləliklə T428 fosforilləşmə vəziyyətinin YAP funksiyasını həqiqətən dəyişə bildiyi dəstəklənmişdir.

İnsan T428 ilə siçan T413 niyə fərqli nömrəyə malikdir?

Eyni funksional bölgə insan və siçan zülal ardıcıllıqlarında amin turşusu nömrələnməsinin fərqli olması səbəbindən fərqli nömrə ilə adlandırılır. İnsan YAP-dakı T428 qalığının siçan Yap-dakı ortoloq qarşılığı T413-dür. Buna görə insan hüceyrə təcrübələrindəki YAP^T428A ilə siçan in vivo təcrübəsindəki Yap^T413A eyni bioloji fosforilləşmə nöqtəsinin növlərarası qarşılıqlarıdır.

YapT413A mutantı siçan qaraciyərində nə etdi?

WT-Yap və ya phospho-inactive Yap^T413A HSC-lərdə selektiv ekspressiya məqsədilə Col1a1 promoter idarə olunan lentiviral vektorlarla daşınmışdır. CCl₄ tətbiqinin ilk iki həftəsindən sonra nəzarət LV, LV-Yap və ya LV-Yap^T413A siçanlara retro-orbital intravenöz olaraq 1×10⁸ TU/siçan dozada verilmiş; CCl₄ daha dörd həftə davam etdirilmişdir.

WT-Yap overexpression kollagen yığılmasını və fibrogenik cavabı gücləndirmişdir. Bunun əksinə Yap^T413A eyni fibrotik təsiri yarada bilməmiş və CCl₄ qrupu ilə müqayisədə kollagen yığılmasını da azaltmışdır.

Mexanizm zəncirinin müstəqil Verianla sxemi

LATS1, β-TRCP və PAK4 eyni tənzimləyici şəbəkədə necə əlaqələndirilir?

Kanonik Hippo yolunda LATS1 YAP-ı S127-də fosforilləşdirərək sitoplazmada saxlanma və deqradasiya istiqamətinə yönəldir. β-TRCP isə YAP-ın ubikitinləşmə və deqradasiya mexanizminə qatılan E3 liqazlardan biridir. Tədqiqat PAK4-T428 fosforilləşməsinin YAP-a bunun əks istiqamətində, yəni sabitləşmə və aktivləşmə istiqamətində təsir etdiyini göstərir.

Buna görə YAP-ın davranışı tək bir “aç/bağla” fosforilləşməsindən ibarət deyil. Eyni zülal müxtəlif bölgələrdən fosforilləşdirildikdə fərqli, hətta bir-birinə zidd bioloji nəticələr yarana bilər. S127 inhibitəedici istiqamətdə tanınan bölgə olduğu halda T428 bu tədqiqatda aktivləşdirici istiqamətdə müəyyən edilmişdir.

İnsan toxumasındakı p-YAP(T428) nəticəsi niyə vacibdir?

Bir mexanizmin yalnız kultivasiya edilmiş hüceyrədə və ya eksperimental siçanda işləməsi insan xəstəliyində eyni bioloji oxun aktiv olduğu demək deyil. Tədqiqatçıların xüsusi p-T428-YAP anticismi ilə insan qaraciyər toxumasında apardığı analiz T428-fosforilləşmiş YAP-ın fibrozis və sirrozda artdığını göstərmişdir.

Bu tapıntı PAK4-YAP oxunun insan qaraciyər fibrozisində bioloji baxımdan əlaqəli olduğunu dəstəkləyir. Buna baxmayaraq insan məlumatları observational xarakterli olduğundan PAK4 inhibisiyasının xəstələrdə fibrozisi azaldacağı nəticəsi təkcə bu məlumatdan çıxarıla bilməz.

YAP və PAK4 arasındakı insan toxuma korrelyasiyası necə şərh edilməlidir?

Mənbə Figure 6i-də PAK4-ekspressiya edən və YAP-ekspressiya edən HSC populyasiyaları arasında r=0.6666 və P<0.0001 müsbət korrelyasiya göstərilir. Müsbət r dəyəri PAK4-müsbət HSC nisbəti artdıqca YAP-müsbət HSC nisbətinin də artmağa meylli olduğunu göstərir.

P<0.0001 sıfır əlaqə fərziyyəsi altında müşahidə olunan və ya daha ekstremal əlaqənin yalnız təsadüf nəticəsində yaranmasının test modeli daxilində çox aşağı ehtimallı olduğuna işarə edir. Lakin aşağı p dəyəri əlaqəni səbəb-nəticəyə çevirmir və təsirin klinik böyüklüyünü təkbaşına izah etmir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Tədqiqatın sübut qatları

PAK4 inhibitoru ND201651 nə etdi?

ND201651 mənbədə ağızdan istifadə oluna bilən kiçik molekullu selektiv PAK4 inhibitoru kimi təsvir edilir. İlkin siçan HSC-lərində ND201651 YAP və α-SMA zülallarını, YAP hədəfləri Ctgf və Ccn1-i və fibrogenik Acta2, Col1a1 və Col1a2 ekspressiyasını azaltmışdır. Eyni hüceyrə təcrübələrində mənbə istifadə olunan şəraitdə hüceyrə canlılığının nəzərəçarpacaq dərəcədə təsirlənmədiyini bildirir.

In vivo təcrübədə siçanlar altı həftə CCl₄ tətbiqi alarkən son dörd həftə ərzində oral ND201651 ilə müalicə edilmişdir.

ND201651 CCl₄ ilə artan p-PAK4, YAP və p-YAP(T428) səviyyələrini zəiflətmiş; Ctgf/Ccn1 və fibrogenik gen ekspressiyasını azaltmışdır. Sirius red və Masson's trichrome histologiyası ilə hydroxyproline ölçümü kollagen/fibrozis yükünün azaldığını göstərmişdir.

30 mg/kg qrupunda serum ALT və AST aktivlikləri azalmış və CCl₄ ilə əlaqəli bədən çəkisi itkisində yaxşılaşma görülmüşdür. Müəlliflər bu nəticələri müalicənin faydalı təsirləri və təcrübə şəraitində nəzərəçarpacaq sistemik toksikliyin olmaması ilə uyğun şərh edirlər.

Lakin ALT, AST, bədən çəkisi və qısamüddətli hüceyrə canlılığı ölçmələri hərtərəfli toksikologiya deyil. Klinik təhlükəsizlik, hədəfdənkənar təsirlər, uzunmüddətli dozalama, farmakokinetika və insan bioloji əlçatanlığı bu təcrübə ilə həll edilməmişdir.

ND201651 Nəticəsi PAK4 İnhibitorunun İnsanlarda Qaraciyər Fibrozisini Müalicə Etdiyini Göstərirmi?

Xeyr. ND201651 ilə birbaşa müalicə olunan canlı orqanizmlər siçanlardır; insanlardan yalnız qaraciyər toxuma nümunələri araşdırılmışdır. Tədqiqat PAK4-ü güclü preklinik antifibrotik hədəf kimi dəstəkləyir, lakin insanlarda effektiv doza, təhlükəsizlik, farmakokinetika, uzunmüddətli yan təsir və ya klinik fibrozis geriləməsi göstərmir.

Farmakoloji təcrübə niyə HSC-spesifik knockout-dan fərqli şərh edilməlidir?

Pak4^ΔHSC modeli Pak4 itkisini xüsusilə HSC populyasiyasına yönəltdiyi halda, ağızdan verilən ND201651 sistemik olaraq yayılan farmakoloji inhibitordur. Buna görə dərman təcrübəsi yalnız HSC-dəki PAK4 təsirini izolə etmir.

Müəlliflər öz Discussion bölməsində zədələnmiş hepatositlərin HSC aktivləşməsinə təsir edən siqnallar ifraz etdiyini və daha əvvəl hepatosit PAK4 inhibisiyasının oksidləşdirici zədələnmə ilə lipotoksikliyi azalda bildiyini xatırladırlar. Buna görə ND201651-in siçandakı antifibrotik təsirinin HSC və hepatositlər üzərindəki birləşmiş PAK4 inhibisiyasından qaynaqlana biləcəyini açıq şəkildə müzakirə edirlər.

HSC-yə məxsus nəticə ilə sistemik müalicə nəticəsi niyə birlikdə vacibdir?

HSC-spesifik knockout PAK4-ün HSC daxilində fibrozis üçün həqiqətən funksional olduğunu göstərən hüceyrə-tipinə məxsus sübut verir. Sistemik inhibitor təcrübəsi isə molekulyar hədəfə farmakoloji müdaxilənin mümkün olduğunu göstərir. İki təcrübənin eyni istiqamətdə nəticə verməsi hədəf doğrulamasını gücləndirir, lakin iki təcrübə eyni bioloji suala cavab vermir.

Statistik analiz necə aparıldı?

Mənbə nəticələri əksi göstərilmədikcə orta ± standart xəta (mean ± SEM) kimi təqdim etmişdir. Şəkillərdəki ayrı nöqtələr bioloji təkrarları təmsil edir və nəticələrin ən azı üç müstəqil nümunə və ya təcrübədən əldə edildiyi bildirilir.

İki qrup arasındakı müqayisələr üçün ikitərəfli deyil, two-tailed unpaired Student's t test istifadə edilmişdir. Birdən çox qrupun müqayisəsi tələb olunduqda one-way ANOVA və ya təcrübə dizaynına görə two-way ANOVA tətbiq edilmiş və ardınca Tukey post-hoc multiple comparisons testi aparılmışdır.

Mənbə statistik əhəmiyyət həddini P<0.05 kimi müəyyən etmişdir. Analizlər GraphPad Prism 10 proqramında aparılmışdır.

SEM nə deməkdir?

SEM sample mean-in populyasiya ortalamasını nə qədər dəqiq qiymətləndirdiyini ifadə edən standart xəta ölçüsüdür. Standart sapma fərdlər və ya bioloji təkrarlar arasındakı yayılmanı təsvir etdiyi halda SEM ortalamanın qeyri-müəyyənliyi ilə əlaqəlidir. Mənbə qrafiklərdə mean±SEM istifadə etdiyinə görə xəta çubuqları bütün bioloji variasiyanın standart sapması kimi birbaşa şərh edilməməlidir.

Bu məqalədə riyazi formul varmı?

Əsas mənbə PDF elmi nəticəni müəyyən edən müstəqil riyazi tənlik və ya formul təqdim etmir. Buna görə Verianla mənbədə olmayan korrelyasiya, ANOVA, t testi və ya SEM formullarını tədqiqatın öz tənliyi kimi yaratmamışdır. Statistik metodların funksiyaları öyrədici şəkildə izah edilmiş, lakin mənbədənkənar riyazi struktur elmi tapıntı qatına əlavə edilməmişdir.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• PAK4 aktivləşmiş HSC-lərdə və müxtəlif fibrotik qaraciyər modellərində artır.
• HIF-1α və YY1 PAK4 promoter-i ilə əlaqə quraraq HSC aktivləşməsi zamanı PAK4-ün transkripsion artımına töhfə verir.
• PAK4 itkisi HSC-nin fibrogenik aktivliyini, proliferasiyasını, miqrasiyasını və kontraktilliyini zəiflədir.
• HSC-yə məxsus Pak4 silinməsi CCl4 və BDL siçan modellərində qaraciyər fibrozisini azaldır.
• PAK4 YAP ilə fiziki qarşılıqlı təsir göstərir və YAP-ı insan zülalında T428 bölgəsində birbaşa fosforilləşdirə bilir.
• T428 fosforilləşməsi YAP ubikitinləşməsini azaldır, YAP sabitliyini, nüvədə toplanmasını və transkripsiya aktivliyini artırır.
• PAK4-ün bu təsiri LATS1 aktivliyini artırıb-azaltmasından asılı olmayan mexanizm kimi dəstəklənir.
• YAPT428A/YapT413A təcrübələri T428/T413 fosforilləşməsinin funksional əhəmiyyətini doğrulayır.
• İnsan fibrotik qaraciyər toxumalarında PAK4, YAP və p-YAP(T428) artımı müşahidə edilir.
• ND201651 siçan CCl4 modelində HSC aktivləşməsini və fibrotik toxuma göstəricilərini azaldır.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

• PAK4 inhibitorunun insanlarda qaraciyər fibrozisini müalicə etdiyi göstərilməmişdir.
• ND201651 üçün klinik doza, insan farmakokinetikası və ya uzunmüddətli insan təhlükəsizliyi müəyyən edilməmişdir.
• T428-in yalnız PAK4 tərəfindən fosforilləşdirilə bildiyi sübut edilməmişdir; PAK4 knockdown-dan sonra qalıq p-T428 siqnalı qalmışdır.
• İnsan toxumasında PAK4-YAP korrelyasiyası təkbaşına səbəbiyyət sübutu deyil.
• PAK4 inhibisiyasının bütün təsirlərinin yalnız HSC vasitəsilə yarandığı farmakoloji təcrübədə göstərilməmişdir.
• PAK4 inhibisiyasının bütün fibrozis səbəblərində eyni effektivliklə işləyəcəyi sübut edilməmişdir.
• PAK4-ün TAZ ilə eyni mexanizmi həyata keçirdiyi göstərilməmişdir; tədqiqat əksinə PAK4-ün YAP-a selektivliyini dəstəkləyir.
• Erkək siçanlardakı nəticələrin dişi siçanlarda eyni olacağı birbaşa sınaqdan keçirilməmişdir.
• Qısamüddətli hüceyrə canlılığı, ALT/AST və bədən çəkisi nəticələri hərtərəfli dərman toksikologiyasını əvəz etmir.

Tədqiqatın əsas məhdudiyyətləri və açıq sualları

Birinci mühüm məhdudiyyət klinik translasiya ilə bağlıdır. Tədqiqat güclü insan toxuma əlaqələri göstərsə də, terapevtik müdaxilənin özü insanlarda deyil, siçanlarda aparılmışdır.

İkinci məhdudiyyət mövcud PAK4 inhibitorlarının inkişaf etdirilməsidir. Müəlliflər PAK4 inhibitorları üçün zəif bioloji əlçatanlıq və potensial off-target təsirlərin hələ də problem ola biləcəyini açıq şəkildə bildirir; yeni kimyəvi scaffold-ların və targeted protein degradation kimi alternativ yanaşmaların araşdırılmasını təklif edirlər.

Üçüncü açıq sual YAP T428 fosforilləşməsinin digər post-translational modifications və mexaniki stres kimi YAP tənzimləyiciləri ilə necə birlikdə işləməsidir. YAP eyni zülal üzərində çoxlu müxtəlif tənzimləyici siqnallar alır və T428-in bu geniş şəbəkədəki çəkisi hələ tam məlum deyil.

Dördüncü açıq sual PAK4-YAP oxunun HSC-nin yalnız patoloji fibrogenik funksiyalarında deyil, getdikcə daha çox tanınan fizioloji/homeostatic funksiyalarında necə davranacağıdır.

Beşinci açıq sual aktivləşmiş HSC-də HIF-1α və YY1 artımını başladan yuxarı səviyyəli mexanizmlərin və bu faktorların PAK4-dən başqa kritik hədəflərinin tam izah edilməmiş olmasıdır.

Altıncı məhdudiyyət heyvan təcrübələrinin erkək siçanlarda aparılmasıdır. Buna görə tədqiqat cinsiyyətə bağlı mümkün bioloji fərqləri birbaşa sınamır.

Tədqiqatın klinik mənası necə məhdudlaşdırılmalıdır?

PAK4-YAP T428 oxu terapevtik hədəf inkişafı baxımından güclü mexanistik namizəddir. Bunun səbəbi hədəfin yalnız ekspressiya korrelyasiyası ilə deyil; genetik silmə, birbaşa kinase assay, site-specific LC-MS/MS, mutagenez, zülal sabitliyi təcrübələri, in vivo hədəf bölgə mutasiyası və farmakoloji inhibisiya kimi müstəqil sübut qatları ilə dəstəklənməsidir.

Bununla belə “yaxşı dərman hədəfi” olmaq ilə “təsdiqlənmiş təhlükəsiz dərman” olmaq eyni anlayış deyil. Klinik inkişaf üçün selektiv molekul, farmakokinetika, bioloji əlçatanlıq, hədəfdənkənar təsirlər, doza-cavab, xroniki toksiklik, müxtəlif fibrozis etiologiyaları və insan klinik tədqiqatları ayrıca tələb olunur.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal başlıq: p21-activated kinase 4 drives hepatic stellate cell activation and liver fibrosis through the phosphorylation of YAP at T428.

Müəlliflər və sıra: Gil-Hwan Kim, Hyunsoo Rho, Chang Hun Lee, You-Jung Hong, Yongdo Park, Hwang Chan Yu, Mi-Young Song, Hye Jin Jo, Eun Joo Kang, Ri Han, Song Yi Yu, Ekihiro Seki, Yoonji Lee, Sangkyu Lee, Eun Ju Bae, Byung-Hyun Park, Chang Yeob Han.

Bərabər töhfə: Gil-Hwan Kim, Hyunsoo Rho və Chang Hun Lee bərabər töhfə verən müəlliflərdir.

Məsul müəlliflər: Eun Ju Bae, Byung-Hyun Park və Chang Yeob Han.

Qurumlar: School of Pharmacy and Institute of New Drug Development, Jeonbuk National University; College of Pharmacy, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Ewha Womans University; Graduate Program in Innovative Biomaterials Convergence, Ewha Womans University; Division of Gastroenterology, Department of Internal Medicine, Jeonbuk National University Medical School; Research Institute of Clinical Medicine of Jeonbuk National University-Biomedical Research Institute of Jeonbuk National University Hospital; Graduate School of Medical Science and Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Jeonbuk National University Medical School; School of Pharmacy, Sungkyunkwan University; College of Pharmacy, Chung-Ang University; Karsh Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center.

Jurnal: Signal Transduction and Targeted Therapy.

Cild / məqalə nömrəsi: 11 / 297.

Nəşr ili: 2026.

Qəbul üçün daxilolma tarixi: 19 Noyabr 2025.

Reviziya tarixi: 19 Mart 2026.

Qəbul tarixi: 11 May 2026.

Version of Record nəşr tarixi: 30 İyul 2026.

DOI: 10.1038/s41392-026-02796-0.

Rəsmi qeyd: Nature / Signal Transduction and Targeted Therapy; DOI vasitəsilə əlçatandır.

Mənbə növü: Original Article / rəyli tədqiqat məqaləsi.

Preprint statusu: Bu mənbə preprint deyil; rəsmi Version of Record-dur.

Lisenziya: Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International (CC BY-NC-ND 4.0).

Lisenziya/təsvir qeydi: CC BY-NC-ND lisenziyası uyğunlaşdırılmış mənbə materialının paylaşılmasına icazə vermədiyi üçün mənbə Figure 1-8-in kompozisiyası yenidən yaradılmamışdır. Məqalədə verilən SVG mənbə mətndəki faktiki mexanizm əlaqələrindən sıfırdan hazırlanmış müstəqil tədris sxemidir.

İnsan tədqiqatı etik təsdiqi: Jeonbuk National University Hospital Institutional Review Board, IRB No. JUH 2023-11-024-001. Tədqiqat Helsinki Bəyannaməsinə uyğun aparılmış və iştirakçılardan yazılı informed consent alınmışdır.

Heyvan tədqiqatı etik təsdiqi: Jeonbuk National University Institutional Animal Care and Use Committee, No. NON2023-099.

Heyvanlar: Wild-type C57BL/6N və C57BL/6J erkək siçanlar; Pak4-floxed və Pdgfr-β-CreERT2 xətləri istifadə edilmişdir.

HSC-spesifik Pak4 knockout: Pak4flox/flox × Pdgfr-β-CreERT2 çarpazlaşdırılması; CreERT2 aktivləşməsi üçün 75 mg/kg/gün tamoksifen, beş ardıcıl gün intraperitoneal.

CCl4 modeli: Səkkiz həftəlik erkək siçanlarda CCl4 0.6 mL/kg intraperitoneal, həftədə iki dəfə, altı həftə.

BDL modeli: Səkkiz həftəlik erkək siçanlarda bile duct ligation; iki həftə sonra nümunə götürülməsi.

CDAHFD modeli: Altı həftəlik C57BL/6N erkək siçanlarda %60 kcal yağ, %0.1 metionin və əlavə xolin olmayan pəhriz; 12 həftə.

Hüceyrə sistemləri: LX-2 immortalized human HSC line və ilkin siçan HSC-ləri.

İlkin HSC kulturası: Collagenase type IV perfusion və Percoll gradient centrifugation ilə izolə edilməsi; DMEM + %10 fetal bovine serum + 100 U/mL penicillin + 100 μg/mL streptomycin; 37 °C və %5 CO2.

Əsas molekulyar metodlar: Western blot, immunofluorescence/co-immunofluorescence, qPCR, ChIP, RNA-seq, Gene Ontology, GSEA, Co-IP, PLA, in vitro kinase assay, immunoprecipitation/ubiquitination assay, cycloheximide chase, YAP-responsive luciferase assay, peptide competition, LC-MS/MS, molecular docking və qısa molecular dynamics refinement.

Yeni p-T428-YAP anticismi: İnsan YAP T428-i ehtiva edən EMDTGD[pT]INQSTL phosphopeptide istifadə edilərək xüsusi polyclonal antibody hazırlanmış; ELISA və peptide competition ilə spesifiklik yoxlanmışdır.

Mouse Yap T413 mutantı: İnsan YAP T428-in siçan ortoloqu T413-dür. YapT413A mutasiyası ACC → GCC kimi yaradılmış və Col1a1 promoter idarə olunan lentiviral sistem istifadə edilmişdir.

Lentiviral in vivo tətbiq: CCl4 müalicəsinin ilk iki həftəsindən sonra nəzarət LV, LV-Yap və ya LV-YapT413A retro-orbital intravenöz olaraq 1×10⁸ TU/siçan tətbiq edilmiş və CCl4 daha dörd həftə davam etdirilmişdir.

Farmakoloji müdaxilə: ND201651 oral PAK4 inhibitoru; CCl4 modelinin son dörd həftəsində 10 və ya 30 mg/kg.

Statistika: Nəticələr mean±SEM; nöqtələr bioloji təkrar; iki qrup üçün two-tailed unpaired Student's t test; çoxsaylı qruplar üçün one-way və ya two-way ANOVA və Tukey post-hoc test; əhəmiyyətlilik P<0.05; GraphPad Prism 10.

Riyazi formul vəziyyəti: Əsas PDF müstəqil elmi tənlik/formul təqdim etmir. Mənbədənkənar tənlik yaradılmamışdır.

RNA-seq məlumatlarına çıxış: Raw və processed RNA-seq məlumatları NCBI Gene Expression Omnibus daxilində GSE308719 giriş nömrəsi ilə saxlanılmışdır.

Məlumatların əlçatanlığı: Tədqiqatda yaradılmış və ya analiz edilmiş məlumatların məqalə daxilində mövcud olduğu və RNA-seq məlumatlarının GEO-ya yerləşdirildiyi bildirilmişdir.

Maliyyələşdirmə: National Research Foundation of Korea tərəfindən 2020R1C1C1003652, 2021R1I1A3041149, RS-2024-00344251, RS-2026-25476540, RS-2023-NR077221 və RS-2024-00357518 qrantları; Bio & Medical Technology Development Program çərçivəsində 2022M3E5F2017607, RS-2026-25517589 və RS-2025-02214748; əlavə olaraq Yuhan Innovation Program, Jeonbuk National University Hospital Biomedical Research Institute Fund və Jeonbuk National University Glocal University 30 Project dəstəyi bildirilmişdir.

Maraqların toqquşması: Müəlliflər competing interests olmadığını bəyan etmişdir.

Müəllif töhfələri: G.H.K., H.R., E.J.B., B.H.P. və C.Y.H. tədqiqatı dizayn etmişdir. G.H.K., H.R., Y.J.H., Y.P., H.C.Y., M.Y.S., H.J.J. və S.Y.Y. təcrübələri aparmış və məlumatları analiz etmişdir. C.H.L. insan toxuma nümunələrini toplamışdır. E.J.K. və S.L. LC-MS/MS analizini; R.H. və Y.L. molecular docking analizini həyata keçirmişdir. E.S. texniki dəstək və elmi məsləhət vermişdir. E.J.B., B.H.P. və C.Y.H. tədqiqata nəzarət etmişdir.

Əsas elmi sərhəd: İnsan toxuma analizləri klinik əlaqə göstərir, lakin müalicə təcrübəsi deyil. Səbəbiyyət və terapevtik sübutların mühüm hissəsi hüceyrə və siçan modellərinə əsaslanır.

Dərman inkişafı sərhədi: Mənbə PAK4 inhibitorları üçün zəif bioloji əlçatanlıq və potensial off-target təsirlərin həll edilməli problemlər olduğunu bildirir.

Mexanizm sərhədi: PAK4 knockdown T428 fosforilləşməsini tamamilə aradan qaldırmamışdır; natamam knockdown və/və ya hələ müəyyən edilməmiş digər kinazlar mümkün izahlar kimi mənbədə qorunur.