PAK4-YAP signal o‘qi ushbu tadqiqotda faollashgan gepatik stellat hujayralarda p21-activated kinase 4 (PAK4) Yes-associated protein (YAP)ni inson oqsilidagi T428 hududida fosforillab, YAP oqsilining barqarorligini, yadroda to‘planishini va transkripsion faolligini oshirishi; buning natijasida gepatik stellat hujayra faollashuvi va jigar fibrogenezini qo‘llab-quvvatlaydigan boshqaruv mexanizmidir. Tadqiqotchilar bu o‘qni inson jigar to‘qimalarida, birlamchi sichqon gepatik stellat hujayralarida, LX-2 inson HSC liniyasida, turli sichqon fibroz modellarida, HSCga xos Pak4 genini o‘chirish tajribalarida, RNA-seq tahlillarida, oqsil-oqsil o‘zaro ta’siri va kinaza testlarida, mutagenezda, LC-MS/MSda, molekulyar modellashtirishda va PAK4 ingibitori ND201651 bilan farmakologik tajribalarda tekshirgan.

Tadqiqotning asosiy topilmasi PAK4 faqat fibrotik jigar to‘qimalarida ko‘payadigan oqsil emasligidir. PAK4 YAP bilan jismonan o‘zaro ta’sirlashishi, inson YAPini ilgari tavsiflanmagan T428 treonin qoldig‘ida bevosita fosforillashi va bu o‘zgarish YAPning ubikvitin-proteazoma tizimi orqali parchalanishini kamaytirib oqsilni barqarorlashtirishi ko‘rsatildi. Barqarorlashgan YAP yadroda ko‘proq to‘plandi, TEADga bog‘liq transkripsion faolligi oshdi va CTGF, CCN1 hamda kollagen bilan bog‘liq profibrotik gen dasturlari kuchaydi.

PAK4ni genetik usulda susaytirish birlamchi HSClarda α-SMA va COL1A1 kabi fibrogenik ko‘rsatkichlarni kamaytirdi; hujayra proliferatsiyasi, migratsiyasi va kollagen gel kontraksiyasi kabi faollashgan HSC fenotiplarini bostirdi. HSCga xos Pak4ni o‘chirish ham karbon tetraklorid (CCl₄), ham o‘t yo‘li ligatsiyasi (BDL) bilan yaratilgan sichqon fibroz modellarida kollagen to‘planishini, gidroksiprolin miqdorini, α-SMA maydonini va fibrogenik gen ekspressiyasini kamaytirdi.

Mexanizmning sababiy ahamiyatini sinash uchun inson YAPidagi T428ga mos keladigan sichqon Yap T413 hududi fosforillanmaydigan qilib alaninga almashtirildi. HSClarda phospho-inactive Yap^T413A mutantining ekspressiyasi odatiy WT-Yap ekspressiyasidan farqli ravishda CCl₄ bilan bog‘liq jigar fibrozini kuchaytirmadi; aksincha, kollagen to‘planishi va HSC faollashuvini kamaytirdi. Hujayra tajribalarida inson YAP^T428A mutanti tezroq ubikvitinlandi va parchalandi, yadroda kamroq to‘plandi hamda pastroq transkripsion faollik ko‘rsatdi. Fosforillanishni taqlid qiluvchi YAP^T428E esa teskari yo‘nalishda harakat qildi.

Inson jigar to‘qimalarida PAK4 va YAP ekspressiyasi normal to‘qimadan fibroz va sirroz tomon oshdi; T428-fosforillangan YAP ham kasallik og‘irligi bilan birga ko‘paydi. Biroq inson ma’lumotlari kuzatuv xarakteriga ega. Insonlarda PAK4 ingibitsiyasi qo‘llanmagan va klinik davolash muvaffaqiyati sinovdan o‘tkazilmagan. Tadqiqotdagi dori aralashuvi CCl₄ bilan fibroz hosil qilingan sichqonlarda og‘iz orqali ND201651 qo‘llash bilan bajarilgan. Shu sababli natijalar kuchli preklinik mexanizm va nishon tasdig‘ini taqdim etsa-da, insonlarda isbotlangan antifibrotik davolash sifatida talqin qilinmaydi.

Jigar fibrozida gepatik stellat hujayra nega markaziy hujayra hisoblanadi?

Gepatik stellat hujayralar (hepatic stellate cells, HSCs) sog‘lom jigarda asosan tinch, ya’ni quiescent holatda bo‘lib, asosan vitamin A saqlovchi lipid tomchilarini to‘playdigan hujayralardir. Jigar uzluksiz yoki kuchli shikastlanganda HSClar faollashadi va myofibroblastga o‘xshash fenotipga aylanadi. Bu o‘zgarishdan keyin hujayradan tashqari matriks, ayniqsa kollagen ishlab chiqarilishi sezilarli oshadi. Fibroz — ushbu matriksning normal to‘qima arxitekturasini buzadigan darajada to‘planishidir.

Faollashgan HSClar faqat kollagen ishlab chiqaruvchi hujayralar emas. Ularning proliferatsiyasi oshishi, shikastlangan hududlarga ko‘chishi va kontraktil xususiyat kasb etishi mumkin. Shu sababli tadqiqotchilar PAK4 ta’sirini faqat bitta kollagen markerida emas; fibrotik faollik, proliferatsiya, migratsiya va kontraktillik kabi bir nechta HSC fenotipida baholagan.

α-SMA va COL1A1 nimani ko‘rsatadi?

α-SMA alpha-smooth muscle actin qisqartmasi bo‘lib, HSCning quiescent holatdan myofibroblastga o‘xshash faollashgan holatga o‘tishini kuzatishda ko‘p ishlatiladigan ko‘rsatkichlardan biridir. COL1A1 esa I tip kollagenning alfa-1 zanjirini kodlovchi gen/oqsildir. I tip kollagen fibrotik ekstrasellyulyar matriksning muhim tarkibiy qismlaridan biridir. Shuning uchun α-SMAning kamayishi HSC faollashuvining; COL1A1 va boshqa kollagen bilan bog‘liq genlarning kamayishi esa fibrogenik matriks ishlab chiqarilishi susayganini ko‘rsatadi.

PAK4 nima va S474 nega o‘lchandi?

PAK4 p21-activated kinase oilasining II guruhiga kiruvchi serin/treonin oqsil kinazasidir. Oqsil kinazalar nishon oqsillardagi muayyan aminokislota qoldiqlariga fosfat guruhini qo‘shish orqali oqsillarning faolligi, barqarorligi, hujayra ichidagi joylashuvi yoki boshqa oqsillar bilan o‘zaro ta’sirini o‘zgartirishi mumkin.

PAK oilasi I guruh PAK1-3 va II guruh PAK4-6 sifatida tasniflanadi. Tadqiqotda faqat umumiy PAK4 miqdori emas, PAK4ning S474, ya’ni 474. aminokislotadagi serin qoldig‘ining fosforillanishi ham o‘lchandi. PAK4 faollashuvi bilan bog‘liq avtofosforillanish sababli p-PAK4(S474) PAK4 faolligining ko‘rsatkichi sifatida ishlatildi.

Birinchi topilma: PAK4 fibrotik va faollashgan HSClarda ortadi

CCl₄ bilan hosil qilingan sichqon jigar fibrozida umumiy PAK4 va p-PAK4(S474) HSC faollashuv ko‘rsatkichi α-SMA bilan birga oshdi. Xuddi shu yo‘nalish o‘t yo‘li ligatsiyasi (BDL) modelida va choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet (CDAHFD) modelida ham baholandi.

Immunofloresans tahlillari PAK4 signali ayniqsa α-SMA-musbat faollashgan HSC populyatsiyasi bilan birga oshganini ko‘rsatdi. Bu farq muhim; chunki butun jigar to‘qimasida bir oqsilning ko‘payishi uning albatta stellat hujayrada oshganini anglatmaydi. PAK4 va α-SMAning bir xil hujayralarda birga ko‘rsatilishi HSC kontekstini kuchaytirdi.

Inson namunalari qanday ishlatildi?

Inson jigar to‘qimalari Jeonbuk National University Hospitalda jigar rezeksiyasi, transplantatsiyasi yoki biopsiyasi o‘tkazilgan shaxslardan Noyabr 2017-May 2023 oralig‘ida to‘plandi. Namunalar dastlabki patologiya hisobotlaridagi gistologik METAVIR bosqichlashiga ko‘ra normal, fibroz va sirroz guruhlariga ajratildi.

Kohortning asosiy etiologiyasi surunkali gepatit B virusi infeksiyasidir; shuningdek gepatit C, metabolik disfunksiya bilan bog‘liq steatotik jigar kasalligi va alkogol bilan bog‘liq jigar kasalligi namunalari mavjud. Manba sirroz guruhidagi barcha bemorlarda kompensatsiyalangan sirroz bo‘lganini bildiradi.

Inson to‘qima tahlillarida PAK4 va α-SMA birga musbat bo‘lgan hujayralar ulushi fibroz og‘irligi bilan oshdi. Keyinchalik HSC darajasida YAP va PAK4 ekspressiyasi o‘rtasida musbat bog‘liqlik ko‘rsatildi; manba Figure 6ida PAK4-musbat va YAP-musbat HSC populyatsiyalari uchun r=0.6666 va P<0.0001 berilgan. Bundan tashqari p-YAP(T428) oqsili normal to‘qimadan fibroz va sirroz tomon oshgan.

Bu yerda muhim ilmiy chegara shuki: inson namunalarida kuzatilgan bog‘liqlik PAK4 bemorlarda fibrozni yakka o‘zi sababiy ravishda yuzaga keltirishini isbotlamaydi. Sababiylik da’vosini kuchaytiradigan asosiy tajribalar genetik o‘chirish, kinaza testi, mutatsiya va sichqon aralashuvlaridir.

PAK4 nega faollashgan HSCda oshadi?

Birlamchi sichqon HSClari quiescent holatdan faollashgan holatga o‘tayotganda nafaqat PAK4 oqsili, balki Pak4 mRNAsi ham oshdi. Bu topilma ko‘payish kamida qisman transkripsion darajada sodir bo‘lishi mumkinligini ko‘rsatdi.

Tadqiqotchilar Evolutionary Conserved Regions skriningi orqali inson va sichqon PAK4/Pak4 proksimal promoter hududlarida transkripsiya faktorlarining ikkita ehtimoliy bog‘lanish joyini aniqladi: HIF-1α va YY1.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) tajribalari HIF-1α va YY1 PAK4 promoter hududlariga bog‘lanishini ko‘rsatdi. LX-2 hujayralarida HIF-1α yoki YY1ni siRNA bilan susaytirish PAK4 ekspressiyasini kamaytirdi. Shu tariqa tadqiqot PAK4 oshishi faollashgan HSCning transkripsion qayta dasturlanishi bilan bog‘liqligini qo‘llab-quvvatlaydi.

ChIP tajribasi nimani ko‘rsatadi?

ChIP muayyan DNA-bog‘lovchi oqsil hujayra ichida qaysi genomik hududga bog‘langanini sinash uchun ishlatiladigan usuldir. Bu tajribadagi savol “HIF-1α va YY1 haqiqatan ham PAK4 promoter hududiga bog‘lanadimi?” shaklidadir. ChIP natijasi faqat ikki gen bir vaqtda ekspressiya qilinishini emas, transkripsiya faktorining tegishli promoter DNA bilan jismoniy aloqasini sinaydi.

PAK4 yo‘qotilganda HSCda nima sodir bo‘ladi?

Birlamchi sichqon HSClarida ikki alohida genetik yondashuv ishlatildi. Birinchi yondashuvda Pak4^f/f sichqonlardan ajratilgan HSClar uch kun kultivatsiya qilindi, so‘ng Cre rekombinaza tashuvchi adenovirus bilan infeksiyalandi va yana uch kun kultivatsiya qilindi. Ikkinchi yondashuv wild-type birlamchi HSClarda siRNA bilan Pak4 knockdown qilishdir.

Har ikki yondashuvda PAK4 yo‘qolishi α-SMA va I tip kollagen darajalarini kamaytirdi, Acta2, Des, Col1a1, Col1a2, Serpine1, Timp1 va Col7 kabi fibrogenik genlarning ekspressiyasini pasaytirdi.

PAK4ni susaytirish HSC proliferatsiyasi va migratsiyasini ham kamaytirdi, collagen gel contraction tajribasida kontraktil qobiliyatni bostirdi. Shu tariqa PAK4 ta’siri faqat kollagen ekspressiyasidagi bitta o‘zgarishga keltirib chiqarilmadi.

RNA-seq tahlili nega qilindi?

Alohida tanlangan fibroz genlarini o‘lchash tadqiqotchining oldindan bilgan nishonlariga qaratiladi. RNA sequencing (RNA-seq) esa butun transkriptom darajasidagi o‘zgarishlarni xolisroq tarzda tekshirish imkonini beradi.

PAK4 knockdown HSClarda n=4 biologik takror asosida o‘tkazilgan RNA-seqdan keyin Gene Ontology tahlili ekstrasellyulyar matriks tashkiloti, hujayra migratsiyasi va proliferatsiya bilan bog‘liq gen dasturlari o‘zgarganini ko‘rsatdi. Gene Set Enrichment Analysis esa kollagen hosil bo‘lishi bilan bog‘liq gen to‘plamlari PAK4 yo‘qotilganda pastga boshqarilganini ko‘rsatdi.

GO va GSEA o‘rtasidagi farq nima?

Gene Ontology tahlili o‘zgargan genlar qaysi biologik jarayonlarda ko‘proq jamlanganini tasniflaydi. GSEA esa genlarni faqat “ahamiyatli/ahamiyatsiz” tarzda ajratish o‘rniga, butun tartiblangan ekspressiya ro‘yxatidagi muayyan gen to‘plamlari ro‘yxatning yuqori yoki quyi qismida tizimli ravishda to‘planadimi-yo‘qmi, shuni baholaydi. Ushbu tadqiqotda har ikki yondashuv PAK4 yo‘qotilishi fibrogenik HSC dasturini bostiradi degan yo‘nalishda natija berdi.

HSCga xos Pak4 o‘chirilishi sichqonda qanday amalga oshirildi?

Pak4-floxed sichqonlar Pdgfr-β-CreERT2 sichqonlari bilan chatishtirilib Pak4^ΔHSC modeli yaratildi. CreERT2ni faollashtirish va faollashgan HSClarda Pak4 genini o‘chirish uchun tamoksifen intraperitoneal ravishda 75 mg/kg/kun dozada ketma-ket besh kun berildi.

Bu yondashuv butun tanadagi Pak4 genini o‘chirish o‘rniga nishon hujayra populyatsiyasiga kuchliroq yo‘naltiriladi. Shu tariqa kuzatilgan fibroz o‘zgarishining HSC ichidagi PAK4 funksiyasi bilan bog‘liqligi farmakologik tizimli ingibitsiyaga qaraganda bevosita sinovdan o‘tkazilishi mumkin.

CCl4 fibroz modeli

Sakkiz haftalik erkak sichqonlarda CCl₄ corn oil vehicle bilan taqqoslab, 0.6 mL/kg dozada haftasiga ikki marta, jami olti hafta intraperitoneal qo‘llandi. CCl₄ jigarda takrorlanuvchi gepatosellyulyar shikastlanish hosil qilib, fibrotik javobni qo‘zg‘atuvchi eksperimental modeldir.

BDL fibroz modeli

Ikkinchi modelda sakkiz haftalik erkak sichqonlarda sham operatsiya yoki bile duct ligation bajarildi va hayvonlar ikki haftadan keyin baholandi. BDL o‘t oqimini jarrohlik yo‘li bilan to‘sish orqali xolestatik jigar shikastlanishi va fibrozni yuzaga keltiradigan, mexanizm jihatidan CCl₄dan farqli modeldir.

CDAHFD nima uchun ishlatildi?

Olti haftalik C57BL/6N erkak sichqonlar normal chow diet yoki %60 kcal yog‘ va %0.1 metionin saqlovchi, qo‘shimcha xolin bo‘lmagan choline-deficient, L-amino acid-defined high-fat diet bilan 12 hafta boqildi. Tadqiqot bu modeldan PAK4 ekspressiyasi turli fibroz kontekstlarida oshishini ko‘rsatish uchun foydalandi.

HSC-spesifik Pak4 yo‘qotilishining in vivo natijasi

CCl₄ tajribasida LT-Vehicle n=6, LT-CCl₄ n=8, Pak4^ΔHSC-Vehicle n=4 va Pak4^ΔHSC-CCl₄ n=6. BDL tajribasida LT-Sham n=3, LT-BDL n=6, Pak4^ΔHSC-Sham n=3 va Pak4^ΔHSC-BDL n=6.

HSC proliferatsiyasi ham PCNA va α-SMA ikki karra-musbat hujayralar bo‘yicha kamaydi. Bunga qarshi ravishda cleaved caspase-3 va α-SMA birgalikdagi bo‘yalishi HSC apoptozida sezilarli o‘zgarish ko‘rsatmadi. Bu farq pastroq fibroz faqat HSClarning ko‘proq nobud bo‘lishidan kelib chiqmasligini; HSC faollashuvi va kengayishining bostirilishi muhimligini qo‘llab-quvvatlaydi.

Serum ALT va AST faolliklarining HSC-spesifik Pak4 knockout modellarida sezilarli o‘zgarmagani ham tadqiqotchilarning HSCga xos ta’sir haqidagi talqinini qo‘llab-quvvatlovchi qo‘shimcha topilmalardan biridir.

PAK4 bilan YAP o‘rtasidagi bog‘lanish qanday topildi?

PAK4 yo‘qotilgan HSClarning RNA-seq natijalarida KEGG pathway tahlili Hippo signaling pathway o‘zgarganini ko‘rsatdi. GeneMANIA asosidagi tarmoq tahlili YAPni ushbu o‘zgargan tarmoq bilan yaqin bog‘liq markaziy molekulalardan biri sifatida ko‘rsatdi.

Birlamchi HSC faollashuvi vaqtida YAP oqsili PAK4ga parallel ravishda oshdi. WT-PAK4ning ortiqcha ekspressiyasi YAP-responsive luciferase faolligini va CTGF hamda CYR61/CCN1 kabi YAP nishon genlarini oshirgan bo‘lsa, katalitik faolligi buzilgan PAK4^S474A mutanti xuddi shu ta’sirlarni ko‘rsatmadi.

Bu natija PAK4 faqat YAP bilan birga uchraydigan oqsil emasligini; PAK4 kinaza faolligi YAP funksiyasi uchun zarurligini ko‘rsatdi.

YAP nima?

Yes-associated protein (YAP) Hippo signaling pathwayning markaziy transkripsion koaktivatorlaridan biridir. YAP bevosita DNAga bog‘lanadigan klassik transkripsiya faktori emas; yadroda TEAD oilasi kabi DNA-bog‘lovchi hamkorlar bilan kompleks hosil qilib, CTGF, CCN1 va boshqa proliferativ/fibrogenik nishon genlar transkripsiyasini qo‘llab-quvvatlaydi.

YAPning biologik ta’siri faqat umumiy oqsil miqdori bilan belgilanmaydi. Oqsilning fosforillanish holati, barqarorligi, sitoplazma/yadro taqsimoti va ubikvitin-proteazoma tizimi tomonidan qanchalik tez parchalanishi ham muhim.

PAK4 YAPni T428da Fosforillaganda Nima O‘zgaradi?

PAK4 tomonidan inson YAPining T428 treonin qoldig‘i fosforillanishi YAP ubikvitinlanishini kamaytirib, oqsil parchalanishini sekinlashtiradi, YAP oqsili barqarorligi va yadroda to‘planishini oshiradi hamda TEADga bog‘liq transkripsion faollikni kuchaytiradi; tadqiqotning hujayra va sichqon tajribalarida bu zanjir kuchliroq HSC faollashuvi va fibrogenez bilan bog‘liq.

PAK4-YAP jismoniy o‘zaro ta’siri qanday ko‘rsatildi?

Co-immunoprecipitation (Co-IP) bir oqsil antikor yordamida cho‘ktirilganda unga bog‘langan boshqa oqsil ham kompleks tarkibida birga keladimi-yo‘qmi, shuni tekshiradi. Co-IP tajribalarida PAK4 va YAP bir xil oqsil kompleksida topildi.

Proximity ligation assay (PLA) hujayra ichida ikki oqsil juda yaqin jismoniy masofada joylashganini floresans signali bilan ko‘rsatadigan usuldir. PLA ham PAK4-YAP yaqinligini qo‘llab-quvvatladi.

Muhim spetsifiklik nazorati sifatida PAK4 YAPning paralogi TAZ bilan xuddi shu tarzda bog‘lanmadi. Bu natija PAK4 butun YAP/TAZ oilasini farqlamasdan nishonga olmasligini ko‘rsatadi.

PAK4 YAPni bevosita fosforillashi qanday ko‘rsatildi?

Rekombinant inson PAK4 va YAP qo‘llangan hujayrasiz in vitro kinase assay PAK4 YAPni bevosita fosforillay olishini ko‘rsatdi. Tajriba davomida PAK4ning o‘z avtofosforillanishi ham kuzatildi.

WT-PAK4 YAPning treonin fosforillanishini oshirgan bo‘lsa, kinase-dead PAK4^S474A mutanti xuddi shu oshishni hosil qilmadi. Serin fosforillanishida xuddi shu naqsh kuzatilmagani tadqiqotchilarni treonin qoldiqlariga yo‘naltirdi.

T428 hududi qanday topildi?

PhosphoNET va PhosphoSitePlus kabi in silico fosforillanish joyini bashorat qilish vositalari beshta nomzod YAP hududini taklif qildi. Ushbu nomzodlarni o‘z ichiga olgan oligopeptidlar bilan bajarilgan competition tajribalari PAK4 ayniqsa T428 hududini nishonga olishini ko‘rsatdi.

T428 fosforillanishi keyinchalik site-specific liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) tahlili bilan qo‘llab-quvvatlandi. Bu usul oqsil/peptidlarni massa/zaryad xatti-harakatiga ko‘ra ajratib, muayyan peptidlardagi post-translational modificationlarni aniqlash imkonini beradi.

Molekulyar modellashtirish nimani ko‘rsatdi va nimani ko‘rsatmadi?

Tadqiqotchilar inson YAPining T428ni o‘z ichiga olgan 423MDTGDTINQST433 peptid segmentini PAK4ning catalytic domainiga dock qildi, so‘ng sterik to‘qnashuvlarni kamaytirish va oqsil-peptid interfeysini bo‘shashtirish maqsadida backbone restraints saqlovchi qisqa muddatli molecular dynamics simulyatsiyalarini qo‘lladi.

Olingan modellarda YAP T428 hududi PAK4ning katalitik cho‘ntagiga tomon yo‘naldi va treonin hydroxyl guruhi katalitik qoldiqdan vodorod bog‘i masofasida joylashdi.

Bu model “PAK4-T428 fosforillanishining o‘zi kompyuterda isbotlandi” degani emas. Molecular docking va MD reaksiyaning strukturaviy jihatdan mumkinligiga izohlovchi yordam beradi. Bevosita biokimyoviy dalil kinase assay, mutagenez, peptide competition va LC-MS/MSdan keladi.

Yangi p-T428-YAP antitanasi nega ishlab chiqildi?

T428 ilgari YAPning yaxshi tavsiflangan fosforillanish joylaridan biri bo‘lmagani sababli tadqiqotchilar T428-fosforillangan YAPni maxsus o‘lchash uchun yangi polyclonal antibody ishlab chiqdi.

Inson YAP T428 hududini o‘z ichiga olgan EMDTGD[pT]INQSTL phosphopeptide sintez qilindi, keyhole limpet hemocyaninga bog‘landi va quyonlarni immunizatsiya qilishda ishlatildi. Antitana titrlari fosforillangan va fosforillanmagan peptidlarga qarshi ELISA yordamida baholandi.

Serum protein A/G chromatography va undan keyin fosforillangan peptidega xos affinity purification bilan tozalandi. Antitananing T428-fosforillangan peptidega selektivligi ELISA va peptide competition tajribalari bilan tasdiqlandi.

PAK4 susaytirilganda T428 fosforillanishi nega butunlay yo‘qolmadi?

LX-2 hujayralarida PAK4 knockdowndan keyin p-YAP(T428) signali sezilarli kamaydi, ammo butunlay yo‘qolmadi. Mualliflar buning ikki ehtimoliy izohini aniq ko‘rsatadi: tajriba sharoitida PAK4 susaytirilishi to‘liq bo‘lmagani va/yoki T428ni fosforillay oladigan hali aniqlanmagan boshqa kinazalar mavjudligi.

Shuning uchun tadqiqot “YAP T428ni biologik jihatdan faqat PAK4 fosforillashi mumkin” degan xulosani qo‘llab-quvvatlamaydi. Qo‘llab-quvvatlanadigan xulosa shuki, PAK4 T428ni bevosita fosforillay oladigan va bu hududda muhim boshqaruvchi rolga ega kinazadir.

PAK4 YAP miqdorini mRNA orqali oshiradimi?

Birlamchi HSClarda PAK4 knockdown YAP oqsili miqdorini kamaytirgan bo‘lsa-da, Yap mRNAsini sezilarli o‘zgartirmadi. Bu holat PAK4ning YAPga asosiy ta’siri transkripsiya darajasida yangi YAP ishlab chiqarishni oshirishdan ko‘ra oqsil barqarorligiga bog‘liqligini ko‘rsatdi.

CHX chase testi nimani o‘lchaydi?

Cycloheximide (CHX) yangi oqsil sintezini ingibitsiya qiladi. Yangi YAP ishlab chiqarilishi to‘xtatilgandan keyin mavjud YAP vaqt o‘tishi bilan qanchalik tez kamayishi kuzatilsa, oqsil barqarorligi haqida ma’lumot olish mumkin.

PAK4ning ortiqcha ekspressiyasi YAPning CHX mavjudligida uzoqroq saqlanishini ta’minladi. Bunga qarshi phospho-inactive YAP^T428A tezroq yo‘qoldi. Bu natija T428 fosforillanishi YAP oqsil umrini uzaytiruvchi funksional ta’sirga ega ekanini qo‘llab-quvvatlaydi.

Ubikvitinlanish nega muhim?

Ubikvitin nishon oqsillarni hujayra ichida, ayniqsa proteazomal parchalanishga yuborishda ishlatiladigan kichik belgilovchi oqsildir. Oqsilning yuqori darajada polyubiquitinationga uchrashi ko‘p hollarda uni proteazoma tomonidan parchalanishga tayyorlash bilan bog‘liq.

PAK4 overexpression YAP ubikvitinlanishini kamaytirdi. PAK4 knockdown sabab yuzaga kelgan YAP beqarorligi E3 ubiquitin ligase β-TRCP susaytirilganda qaytarildi, FBXW7 knockdown esa xuddi shu himoyani bermadi. Shu sababli tadqiqot PAK4-YAP barqarorlashuvi bog‘lanishida ayniqsa β-TRCPni ajratib ko‘rsatadi.

LATS1 va PAK4 bir xil fosforillanishni amalga oshiradimi?

Yo‘q. Kanonik Hippo signaling pathwayda LATS1ning YAPdagi yaxshi ma’lum ingibitor joylaridan biri S127dir. S127 fosforillanishi 14-3-3 bog‘lanishini, sitoplazmada ushlanishni va YAP ingibitsiyasini qo‘llab-quvvatlaydi.

PAK4 esa ushbu tadqiqotda YAPni T428da faollashtiruvchi yo‘nalishda fosforillovchi boshqa kinaza sifatida ko‘rsatildi. PAK4 knockdown LATS1ning umumiy miqdorini yoki T1079-fosforillangan faol LATS1 darajasini o‘zgartirmadi. PAK4ning YAPni barqarorlashtiruvchi ta’siri LATS1 knockdown sharoitida ham saqlanib qoldi.

Phosphomimetic YAP^T428E mutanti, shuningdek, LATS1 tomonidan qo‘zg‘atiladigan YAP degradatsiyasiga chidamliroq bo‘ldi. Bu natijalar PAK4-T428 o‘qi LATS1ning kanonik ingibitsiya mexanizmini faqat yuqoridan yoqib-o‘chiradigan bilvosita ta’sirdan farq qilishini qo‘llab-quvvatlaydi.

YAPT428A va YAPT428E Mutatsiyalari Nimani Sinaydi?

YAP^T428Ada fosforillanishi mumkin bo‘lgan treonin alaninga almashtirilib T428 fosforillanishi sodir bo‘lishi to‘sqinlanadi; YAP^T428Eda treonin glutamatga almashtirilib fosforillangan hududning manfiy zaryadi qisman taqlid qilinadi. Bu qarama-qarshi mutantlar T428 fosforillanishi faqat birga kuzatiladigan belgi yoki YAP barqarorligi, hujayra ichidagi joylashuvi va transkripsion funksiyasiga ta’sir qiluvchi funksional regulyatormi, shuni sinash uchun ishlatilgan.

T428A mutantining natijasi

PAK4 mavjudligida WT-YAPga nisbatan YAP^T428A ko‘proq ubikvitinlandi va CHX chase davomida tezroq parchalandi. Xuddi shu mutant hujayralarda ko‘proq sitoplazmik ushlanish va pastroq YAP-responsive luciferase faolligi kuzatildi.

T428E mutantining natijasi

Fosforillanishni taqlid qiluvchi YAP^T428E mutanti teskari yo‘nalishda harakat qildi; YAP barqarorligi va transkripsion faollik jihatidan phospho-inactive mutantdan farqli natija berdi. Shu tariqa T428 fosforillanish holati YAP funksiyasini haqiqatan o‘zgartirishi mumkinligi qo‘llab-quvvatlandi.

Inson T428 va sichqon T413 nega turli raqamga ega?

Bir xil funksional hudud inson va sichqon oqsil ketma-ketliklarida aminokislotalar raqamlanishi turlicha bo‘lgani sababli turli raqam bilan ataladi. Inson YAPidagi T428 qoldig‘ining sichqon Yapidagi ortologik mosligi T413dir. Shu sababli inson hujayra tajribalaridagi YAP^T428A bilan sichqon in vivo tajribasidagi Yap^T413A bir xil biologik fosforillanish nuqtasining turlararo mos shakllaridir.

YapT413A mutanti sichqon jigarida nima qildi?

WT-Yap yoki phospho-inactive Yap^T413A HSClarda selektiv ekspressiya uchun Col1a1 promoter nazoratidagi lentiviral vektorlar bilan yetkazildi. CCl₄ qo‘llashning dastlabki ikki haftasidan keyin nazorat LV, LV-Yap yoki LV-Yap^T413A sichqonlarga retro-orbital intravenoz ravishda 1×10⁸ TU/sichqon dozada berildi; CCl₄ yana to‘rt hafta davom ettirildi.

WT-Yap overexpression kollagen to‘planishi va fibrogenik javobni kuchaytirdi. Bunga qarshi Yap^T413A xuddi shu fibrotik ta’sirni hosil qila olmadi va CCl₄ guruhiga nisbatan kollagen to‘planishini ham kamaytirdi.

Mexanizm zanjirining mustaqil Verianla sxemasi

LATS1, β-TRCP va PAK4 bir xil boshqaruv tarmog‘ida qanday bog‘langan?

Kanonik Hippo yo‘lida LATS1 YAPni S127da fosforillab, sitoplazmada ushlanish va degradatsiya yo‘nalishiga suradi. β-TRCP esa YAPning ubikvitinlanish va degradatsiya mexanizmida qatnashadigan E3 ligazalardan biridir. Tadqiqot PAK4-T428 fosforillanishi YAPga buning teskari yo‘nalishida, ya’ni barqarorlashuv va faollashuv yo‘nalishida ta’sir qilishini ko‘rsatadi.

Shu sababli YAP xatti-harakati bitta “yoqish/o‘chirish” fosforillanishidan iborat emas. Bir xil oqsil turli hududlardan fosforillanganda turli, hatto qarama-qarshi biologik natijalar yuzaga kelishi mumkin. S127 ingibitor yo‘nalishda ma’lum hudud bo‘lsa, T428 ushbu tadqiqotda faollashtiruvchi yo‘nalishda aniqlangan.

Inson to‘qimasidagi p-YAP(T428) natijasi nega muhim?

Mexanizm faqat kultura hujayrasida yoki eksperimental sichqonda ishlashi inson kasalligida xuddi shu biologik o‘q faol ekanini anglatmaydi. Tadqiqotchilarning maxsus p-T428-YAP antitanasi bilan inson jigar to‘qimasida o‘tkazgan tahlili T428-fosforillangan YAP fibroz va sirrozda ortishini ko‘rsatdi.

Bu topilma PAK4-YAP o‘qi inson jigar fibrozida biologik jihatdan ahamiyatli ekanini qo‘llab-quvvatlaydi. Shunga qaramay, inson ma’lumotlari observational bo‘lgani sababli PAK4 ingibitsiyasi bemorlarda fibrozni kamaytiradi degan xulosani faqat shu ma’lumotdan chiqarib bo‘lmaydi.

YAP va PAK4 o‘rtasidagi inson to‘qima korrelyatsiyasi qanday talqin qilinishi kerak?

Manba Figure 6ida PAK4-ekspressiya qiluvchi va YAP-ekspressiya qiluvchi HSC populyatsiyalari o‘rtasida r=0.6666 va P<0.0001 musbat korrelyatsiya ko‘rsatilgan. Musbat r qiymati PAK4-musbat HSClar ulushi oshgani sari YAP-musbat HSClar ulushi ham oshishga moyil ekanini ko‘rsatadi.

P<0.0001 nol bog‘liqlik farazi ostida kuzatilgan yoki undan ham keskinroq bog‘lanishning faqat tasodif bilan paydo bo‘lish ehtimoli test modeli doirasida juda past ekaniga ishora qiladi. Biroq past p qiymati bog‘liqlikni sababiylikka aylantirmaydi va ta’sirning klinik kattaligini o‘z-o‘zidan tushuntirmaydi.

Tadqiqot Usuli va Natijalari

Tadqiqotning dalil qatlamlari

PAK4 ingibitori ND201651 nima qildi?

ND201651 manbada og‘iz orqali qo‘llash mumkin bo‘lgan kichik molekulali selektiv PAK4 ingibitori sifatida tavsiflangan. Birlamchi sichqon HSClarida ND201651 YAP va α-SMA oqsillarini, YAP nishonlari Ctgf va Ccn1ni hamda fibrogenik Acta2, Col1a1 va Col1a2 ekspressiyasini kamaytirdi. Xuddi shu hujayra tajribalarida manba qo‘llangan sharoitlarda hujayra hayotchanligi sezilarli ta’sirlanmaganini bildiradi.

In vivo tajribada sichqonlar olti hafta CCl₄ qo‘llanayotgan paytda oxirgi to‘rt hafta davomida og‘iz orqali ND201651 bilan davolandi.

ND201651 CCl₄ bilan oshgan p-PAK4, YAP va p-YAP(T428) darajalarini bostirdi; Ctgf/Ccn1 va fibrogenik gen ekspressiyasini kamaytirdi. Sirius red va Masson's trichrome gistologiyasi hamda hydroxyproline o‘lchovi kollagen/fibroz yukining kamayganini ko‘rsatdi.

30 mg/kg guruhida serum ALT va AST faolliklari kamaydi va CCl₄ bilan bog‘liq tana vazni yo‘qotilishida yaxshilanish kuzatildi. Mualliflar bu natijalarni davolashning foydali ta’sirlari va tajriba sharoitida yaqqol tizimli toksiklik bo‘lmagani bilan mos deb talqin qiladi.

Biroq ALT, AST, tana vazni va qisqa muddatli hujayra hayotchanligi o‘lchovlari keng qamrovli toksikologiya emas. Klinik xavfsizlik, nishondan tashqari ta’sirlar, uzoq muddatli dozalash, farmakokinetika va inson biofoydalanishi ushbu tajribada hal qilinmagan.

ND201651 Natijasi PAK4 Ingibitori Insonlarda Jigar Fibrozini Davolashini Ko‘rsatadimi?

Yo‘q. ND201651 bilan bevosita davolangan tirik organizmlar sichqonlardir; insonlardan faqat jigar to‘qima namunalari tekshirilgan. Tadqiqot PAK4ni kuchli preklinik antifibrotik nishon sifatida qo‘llab-quvvatlaydi, ammo insonlarda samarali doza, xavfsizlik, farmakokinetika, uzoq muddatli nojo‘ya ta’sir yoki klinik fibroz regressiyasini ko‘rsatmaydi.

Farmakologik tajriba nega HSC-spesifik knockoutdan boshqacha talqin qilinishi kerak?

Pak4^ΔHSC modeli Pak4 yo‘qolishini aynan HSC populyatsiyasiga yo‘naltirsa, og‘iz orqali berilgan ND201651 tizimli ravishda tarqaladigan farmakologik ingibitordir. Shu sababli dori tajribasi faqat HSCdagi PAK4 ta’sirini ajratib ko‘rsatmaydi.

Mualliflar Discussion bo‘limida shikastlangan gepatotsitlar HSC faollashuviga ta’sir qiluvchi signallarni ajratishini va ilgari gepatotsit PAK4 ingibitsiyasi oksidlovchi shikastlanish hamda lipotoksiklikni kamaytirishi mumkinligini eslatadi. Shu sababli ND201651ning sichqondagi antifibrotik ta’siri HSC va gepatotsitlardagi birgalikdagi PAK4 ingibitsiyasidan kelib chiqishi mumkinligini aniq muhokama qiladi.

HSCga xos natija bilan tizimli davolash natijasi nega birgalikda muhim?

HSC-spesifik knockout PAK4 HSC ichida fibroz uchun haqiqatan funksional ekanini ko‘rsatadigan hujayra turiga xos dalil beradi. Tizimli ingibitor tajribasi esa molekulyar nishonga farmakologik aralashish mumkinligini ko‘rsatadi. Ikki tajriba bir xil yo‘nalishda natija berishi nishon tasdig‘ini kuchaytiradi, biroq ular bir xil biologik savolga javob bermaydi.

Statistik tahlil qanday bajarildi?

Manba natijalarni, boshqacha ko‘rsatilmagan bo‘lsa, o‘rtacha ± standart xato (mean ± SEM) sifatida taqdim etgan. Shakllardagi alohida nuqtalar biologik takrorlarni ifodalaydi va natijalar kamida uchta mustaqil namuna yoki tajribadan olingani ko‘rsatilgan.

Ikki guruh o‘rtasidagi taqqoslashlar uchun ikki yo‘nalishli emas, two-tailed unpaired Student's t test ishlatilgan. Bir nechta guruhni taqqoslash zarur bo‘lganda one-way ANOVA yoki tajriba dizayniga ko‘ra two-way ANOVA qo‘llangan va undan so‘ng Tukey post-hoc multiple comparisons testi bajarilgan.

Manba statistik ahamiyatlilik chegarasini P<0.05 deb belgilagan. Tahlillar GraphPad Prism 10 dasturida bajarilgan.

SEM nimani anglatadi?

SEM sample mean populyatsiya o‘rtachasini qanchalik aniq baholashini ifodalovchi standart xato o‘lchovidir. Standart og‘ish individlar yoki biologik takrorlar o‘rtasidagi tarqalishni tavsiflasa, SEM o‘rtachaning noaniqligi bilan bog‘liq. Manba grafiklarda mean±SEM ishlatgani uchun xato chiziqlari barcha biologik variatsiyaning standart og‘ishi sifatida bevosita talqin qilinmasligi kerak.

Bu maqolada matematik formula bormi?

Asosiy manba PDF ilmiy natijani belgilaydigan mustaqil matematik tenglama yoki formula bermaydi. Shu sababli Verianla manbada bo‘lmagan korrelyatsiya, ANOVA, t testi yoki SEM formulalarini tadqiqotning o‘z tenglamasi kabi yaratmagan. Statistik usullarning vazifalari o‘rgatuvchi tarzda tushuntirilgan, ammo manbadan tashqari matematik tuzilma ilmiy topilma qatlamiga qo‘shilmagan.

Tadqiqot qo‘llab-quvvatlaydigan xulosalar

• PAK4 faollashgan HSClarda va turli fibrotik jigar modellarida ortadi.
• HIF-1α va YY1 PAK4 promoteri bilan bog‘lanib, HSC faollashuvi vaqtida PAK4ning transkripsion oshishiga hissa qo‘shadi.
• PAK4 yo‘qolishi HSCning fibrogenik faolligi, proliferatsiyasi, migratsiyasi va kontraktilligini bostiradi.
• HSCga xos Pak4 o‘chirilishi CCl4 va BDL sichqon modellarida jigar fibrozini kamaytiradi.
• PAK4 YAP bilan jismonan o‘zaro ta’sirlashadi va YAPni inson oqsilida T428 hududida bevosita fosforillay oladi.
• T428 fosforillanishi YAP ubikvitinlanishini kamaytiradi, YAP barqarorligi, yadroda to‘planishi va transkripsion faolligini oshiradi.
• PAK4ning bu ta’siri LATS1 faolligini oshirish yoki kamaytirishdan mustaqil mexanizm sifatida qo‘llab-quvvatlanadi.
• YAPT428A/YapT413A tajribalari T428/T413 fosforillanishining funksional ahamiyatini tasdiqlaydi.
• Inson fibrotik jigar to‘qimalarida PAK4, YAP va p-YAP(T428) oshishi kuzatiladi.
• ND201651 sichqon CCl4 modelida HSC faollashuvi va fibrotik to‘qima ko‘rsatkichlarini kamaytiradi.

Tadqiqot qo‘llab-quvvatlamaydigan xulosalar

• PAK4 ingibitori insonlarda jigar fibrozini davolashi ko‘rsatilmagan.
• ND201651 uchun klinik doza, inson farmakokinetikasi yoki uzoq muddatli inson xavfsizligi aniqlanmagan.
• T428 faqat PAK4 tomonidan fosforillanishi mumkinligi isbotlanmagan; PAK4 knockdowndan keyin qoldiq p-T428 signali saqlanib qolgan.
• Inson to‘qimasidagi PAK4-YAP korrelyatsiyasi o‘z-o‘zidan sababiylik dalili emas.
• PAK4 ingibitsiyasining barcha ta’siri faqat HSC orqali yuzaga kelishi farmakologik tajribada ko‘rsatilmagan.
• PAK4 ingibitsiyasi barcha fibroz sabablarida bir xil samaradorlikda ishlashi isbotlanmagan.
• PAK4 TAZ bilan xuddi shu mexanizmni amalga oshirishi ko‘rsatilmagan; tadqiqot aksincha PAK4ning YAPga selektivligini qo‘llab-quvvatlaydi.
• Erkak sichqonlardagi natijalar urg‘ochi sichqonlarda ham xuddi shunday bo‘lishi bevosita sinovdan o‘tkazilmagan.
• Qisqa muddatli hujayra hayotchanligi, ALT/AST va tana vazni natijalari keng qamrovli dori toksikologiyasining o‘rnini bosmaydi.

Tadqiqotning asosiy cheklovlari va ochiq savollari

Birinchi muhim cheklov klinik tarjimadir. Tadqiqot kuchli inson to‘qima bog‘lanishlarini ko‘rsatsa-da, terapevtik aralashuvning o‘zi insonlarda emas, sichqonlarda bajarilgan.

Ikkinchi cheklov mavjud PAK4 ingibitorlarini rivojlantirish bilan bog‘liq. Mualliflar PAK4 ingibitorlari uchun past biofoydalanish va potensial off-target ta’sirlar hanuz muammo bo‘lishi mumkinligini aniq ta’kidlaydi; yangi kimyoviy scaffoldlar va targeted protein degradation kabi muqobil yondashuvlarni o‘rganishni taklif qiladi.

Uchinchi ochiq savol YAP T428 fosforillanishi boshqa post-translational modifications va mexanik stress kabi YAP regulyatorlari bilan qanday birga ishlashidir. YAP bir xil oqsilning o‘zida ko‘plab turli boshqaruv signallarini qabul qiladi va T428ning bu keng tarmoqdagi salmog‘i hali to‘liq ma’lum emas.

To‘rtinchi ochiq savol PAK4-YAP o‘qi HSCning faqat patologik fibrogenik funksiyalarida emas, tobora ko‘proq tan olinayotgan fiziologik/homeostatic funksiyalarida qanday tutishidir.

Beshinchi ochiq savol faollashgan HSCda HIF-1α va YY1 oshishini boshlaydigan yuqori darajadagi mexanizmlar va bu faktorlarning PAK4dan tashqari muhim nishonlari to‘liq tushuntirilmaganidir.

Oltinchi cheklov hayvon tajribalari erkak sichqonlarda bajarilganidir. Shu sababli tadqiqot jinsga bog‘liq ehtimoliy biologik farqlarni bevosita sinamaydi.

Tadqiqotning klinik ma’nosi qanday cheklanishi kerak?

PAK4-YAP T428 o‘qi terapevtik nishon ishlab chiqish nuqtai nazaridan kuchli mexanistik nomzoddir. Buning sababi nishon faqat ekspressiya korrelyatsiyasi bilan emas, balki genetik o‘chirish, bevosita kinase assay, site-specific LC-MS/MS, mutagenez, oqsil barqarorligi tajribalari, in vivo nishon hudud mutatsiyasi va farmakologik ingibitsiya kabi mustaqil dalil qatlamlari bilan qo‘llab-quvvatlanganidir.

Biroq “yaxshi dori nishoni” bo‘lish bilan “tasdiqlangan xavfsiz dori” bo‘lish bir xil tushuncha emas. Klinik rivojlantirish uchun selektiv molekula, farmakokinetika, biofoydalanish, nishondan tashqari ta’sirlar, doza-javob, surunkali toksiklik, turli fibroz etiologiyalari va inson klinik tadqiqotlari alohida talab etiladi.

Manba va Usul Haqida Izoh

Asl sarlavha: p21-activated kinase 4 drives hepatic stellate cell activation and liver fibrosis through the phosphorylation of YAP at T428.

Mualliflar va tartib: Gil-Hwan Kim, Hyunsoo Rho, Chang Hun Lee, You-Jung Hong, Yongdo Park, Hwang Chan Yu, Mi-Young Song, Hye Jin Jo, Eun Joo Kang, Ri Han, Song Yi Yu, Ekihiro Seki, Yoonji Lee, Sangkyu Lee, Eun Ju Bae, Byung-Hyun Park, Chang Yeob Han.

Teng hissa: Gil-Hwan Kim, Hyunsoo Rho va Chang Hun Lee teng hissa qo‘shgan mualliflardir.

Mas’ul mualliflar: Eun Ju Bae, Byung-Hyun Park va Chang Yeob Han.

Muassasalar: School of Pharmacy and Institute of New Drug Development, Jeonbuk National University; College of Pharmacy, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Ewha Womans University; Graduate Program in Innovative Biomaterials Convergence, Ewha Womans University; Division of Gastroenterology, Department of Internal Medicine, Jeonbuk National University Medical School; Research Institute of Clinical Medicine of Jeonbuk National University-Biomedical Research Institute of Jeonbuk National University Hospital; Graduate School of Medical Science and Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Jeonbuk National University Medical School; School of Pharmacy, Sungkyunkwan University; College of Pharmacy, Chung-Ang University; Karsh Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center.

Jurnal: Signal Transduction and Targeted Therapy.

Jild / maqola raqami: 11 / 297.

Nashr yili: 2026.

Qabul qilingan sana: 19 Noyabr 2025.

Qayta ko‘rib chiqish sanasi: 19 Mart 2026.

Qabul sanasi: 11 May 2026.

Version of Record nashr sanasi: 30 Iyul 2026.

DOI: 10.1038/s41392-026-02796-0.

Rasmiy qayd: Nature / Signal Transduction and Targeted Therapy; DOI orqali kirish mumkin.

Manba turi: Original Article / taqrizdan o‘tgan tadqiqot maqolasi.

Preprint holati: Bu manba preprint emas; rasmiy Version of Record.

Litsenziya: Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International (CC BY-NC-ND 4.0).

Litsenziya/tasvir izohi: CC BY-NC-ND litsenziyasi moslashtirilgan manba materialini ulashishga ruxsat bermagani uchun manba Figure 1-8 kompozitsiyasi qayta yaratilmagan. Maqola ichidagi SVG manba matndagi faktik mexanizm munosabatlaridan noldan yaratilgan mustaqil ta’limiy sxemadir.

Inson tadqiqoti etik tasdig‘i: Jeonbuk National University Hospital Institutional Review Board, IRB No. JUH 2023-11-024-001. Tadqiqot Helsinki Deklaratsiyasiga muvofiq o‘tkazilgan va ishtirokchilardan yozma informed consent olingan.

Hayvon tadqiqoti etik tasdig‘i: Jeonbuk National University Institutional Animal Care and Use Committee, No. NON2023-099.

Hayvonlar: Wild-type C57BL/6N va C57BL/6J erkak sichqonlar; Pak4-floxed va Pdgfr-β-CreERT2 liniyalari ishlatilgan.

HSC-spesifik Pak4 knockout: Pak4flox/flox × Pdgfr-β-CreERT2 chatishtirilishi; CreERT2 faollashuvi uchun 75 mg/kg/kun tamoksifen, ketma-ket besh kun intraperitoneal.

CCl4 modeli: Sakkiz haftalik erkak sichqonlarda CCl4 0.6 mL/kg intraperitoneal, haftasiga ikki marta, olti hafta.

BDL modeli: Sakkiz haftalik erkak sichqonlarda bile duct ligation; ikki haftadan keyin namuna olish.

CDAHFD modeli: Olti haftalik C57BL/6N erkak sichqonlarda %60 kcal yog‘, %0.1 metionin va qo‘shimcha xolin bo‘lmagan dieta; 12 hafta.

Hujayra tizimlari: LX-2 immortalized human HSC line va birlamchi sichqon HSClari.

Birlamchi HSC kulturasi: Collagenase type IV perfusion va Percoll gradient centrifugation bilan ajratish; DMEM + %10 fetal bovine serum + 100 U/mL penicillin + 100 μg/mL streptomycin; 37 °C va %5 CO2.

Asosiy molekulyar usullar: Western blot, immunofluorescence/co-immunofluorescence, qPCR, ChIP, RNA-seq, Gene Ontology, GSEA, Co-IP, PLA, in vitro kinase assay, immunoprecipitation/ubiquitination assay, cycloheximide chase, YAP-responsive luciferase assay, peptide competition, LC-MS/MS, molecular docking va qisqa molecular dynamics refinement.

Yangi p-T428-YAP antitanasi: Inson YAP T428ni o‘z ichiga olgan EMDTGD[pT]INQSTL phosphopeptide ishlatilib maxsus polyclonal antibody ishlab chiqilgan; ELISA va peptide competition bilan spetsifiklik nazorat qilingan.

Mouse Yap T413 mutanti: Inson YAP T428ning sichqon ortologi T413dir. YapT413A mutatsiyasi ACC → GCC sifatida yaratilgan va Col1a1 promoter nazoratidagi lentiviral tizim ishlatilgan.

Lentiviral in vivo qo‘llash: CCl4 davolashining dastlabki ikki haftasidan keyin nazorat LV, LV-Yap yoki LV-YapT413A retro-orbital intravenoz 1×10⁸ TU/sichqon qo‘llangan va CCl4 yana to‘rt hafta davom ettirilgan.

Farmakologik aralashuv: ND201651 og‘iz orqali PAK4 ingibitori; CCl4 modelining oxirgi to‘rt haftasida 10 yoki 30 mg/kg.

Statistika: Natijalar mean±SEM; nuqtalar biologik takror; ikki guruh uchun two-tailed unpaired Student's t test; ko‘p guruhlar uchun one-way yoki two-way ANOVA va Tukey post-hoc test; ahamiyatlilik P<0.05; GraphPad Prism 10.

Matematik formula holati: Asosiy PDF mustaqil ilmiy tenglama/formula taqdim etmaydi. Manbadan tashqari tenglama yaratilmagan.

RNA-seq ma’lumotlariga kirish: Raw va processed RNA-seq ma’lumotlari NCBI Gene Expression Omnibusda GSE308719 kirish raqami bilan saqlangan.

Ma’lumotlar mavjudligi: Tadqiqotda yaratilgan yoki tahlil qilingan ma’lumotlar maqola ichida mavjudligi va RNA-seq ma’lumotlari GEOga joylashtirilgani bildirilgan.

Moliyalashtirish: National Research Foundation of Korea tomonidan 2020R1C1C1003652, 2021R1I1A3041149, RS-2024-00344251, RS-2026-25476540, RS-2023-NR077221 va RS-2024-00357518 grantlari; Bio & Medical Technology Development Program doirasida 2022M3E5F2017607, RS-2026-25517589 va RS-2025-02214748; shuningdek Yuhan Innovation Program, Jeonbuk National University Hospital Biomedical Research Institute Fund va Jeonbuk National University Glocal University 30 Project ko‘magi bildirilgan.

Manfaatlar to‘qnashuvi: Mualliflar competing interests yo‘qligini bildirgan.

Muallif hissalari: G.H.K., H.R., E.J.B., B.H.P. va C.Y.H. tadqiqotni loyihalagan. G.H.K., H.R., Y.J.H., Y.P., H.C.Y., M.Y.S., H.J.J. va S.Y.Y. tajribalarni o‘tkazib, ma’lumotlarni tahlil qilgan. C.H.L. inson to‘qima namunalarini to‘plagan. E.J.K. va S.L. LC-MS/MS tahlilini; R.H. va Y.L. molecular docking tahlilini bajargan. E.S. texnik yordam va ilmiy tavsiya bergan. E.J.B., B.H.P. va C.Y.H. tadqiqotni nazorat qilgan.

Asosiy ilmiy chegara: Inson to‘qima tahlillari klinik bog‘liqlikni ko‘rsatadi, ammo davolash tajribasi emas. Sababiy va terapevtik dalillarning muhim qismi hujayra va sichqon modellariga asoslangan.

Dori rivojlantirish chegarasi: Manba PAK4 ingibitorlari uchun past biofoydalanish va potensial off-target ta’sirlar hal qilinishi kerak bo‘lgan muammolar ekanini bildiradi.

Mexanizm chegarasi: PAK4 knockdown T428 fosforillanishini butunlay yo‘q qilmagan; to‘liq bo‘lmagan knockdown va/yoki hali aniqlanmagan boshqa kinazalar ehtimoliy izohlar sifatida manbada saqlangan.