PAK4-YAP sinyal ekseni, bu çalışmada aktive hepatik stellat hücrelerde p21-activated kinase 4'ün (PAK4) Yes-associated protein'i (YAP) insan proteinindeki T428 bölgesinde fosforile ederek YAP'ın protein stabilitesini, çekirdek birikimini ve transkripsiyonel aktivitesini artırdığı; bunun sonucunda hepatik stellat hücre aktivasyonu ve karaciğer fibrogenezini desteklediği düzenleyici mekanizmadır. Araştırmacılar bu ekseni insan karaciğer dokularında, primer fare hepatik stellat hücrelerinde, LX-2 insan HSC hattında, farklı fare fibrozis modellerinde, HSC'ye özgü Pak4 gen silme deneylerinde, RNA-seq analizlerinde, protein-protein etkileşimi ve kinaz testlerinde, mutagenezde, LC-MS/MS'de, moleküler modellemede ve PAK4 inhibitörü ND201651 ile farmakolojik deneylerde incelemiştir.

Çalışmanın temel bulgusu, PAK4'ün yalnız fibrotik karaciğerlerde artan bir protein olmadığıdır. PAK4'ün YAP ile fiziksel olarak etkileştiği, insan YAP'ını daha önce tanımlanmamış T428 treonin kalıntısında doğrudan fosforile ettiği ve bu değişikliğin YAP'ın ubikitin-proteazom sistemi üzerinden parçalanmasını azaltarak proteini stabilize ettiği gösterilmiştir. Stabilize olan YAP çekirdekte daha fazla birikmiş, TEAD-bağımlı transkripsiyonel aktivitesi yükselmiş ve CTGF, CCN1 ve kollajen ilişkili profibrotik gen programları güçlenmiştir.

PAK4'ün genetik olarak susturulması primer HSC'lerde α-SMA ve COL1A1 gibi fibrogenik göstergeleri azaltmış; hücre proliferasyonu, göçü ve kollajen jel kontraksiyonu gibi aktive HSC fenotiplerini baskılamıştır. HSC'ye özgü Pak4 silme işlemi hem karbon tetraklorür (CCl₄) hem de safra kanalı ligasyonu (BDL) ile oluşturulan fare fibrozis modellerinde kollajen birikimini, hidroksiprolin miktarını, α-SMA alanını ve fibrogenik gen ekspresyonunu azaltmıştır.

Mekanizmanın nedensel önemini sınamak için insan YAP'taki T428'e karşılık gelen fare Yap T413 bölgesi fosforillenemeyecek şekilde alanine dönüştürülmüştür. HSC'lerde phospho-inactive Yap^T413A mutantının ekspresyonu, normal WT-Yap ekspresyonundan farklı olarak CCl₄-ilişkili karaciğer fibrozisini güçlendirmemiş; tersine kollajen birikimini ve HSC aktivasyonunu azaltmıştır. Hücre deneylerinde insan YAP^T428A mutantı daha hızlı ubikitinlenmiş ve parçalanmış, çekirdekte daha az birikmiş ve daha düşük transkripsiyonel aktivite göstermiştir. Fosforilasyonu taklit eden YAP^T428E ise ters yönde davranmıştır.

İnsan karaciğer dokularında PAK4 ve YAP ekspresyonu normal dokudan fibrozis ve siroza doğru yükselmiş; T428-fosforillenmiş YAP da hastalık şiddetiyle birlikte artmıştır. Bununla birlikte insan verileri gözlemseldir. İnsanlarda PAK4 inhibisyonu uygulanmamış ve klinik tedavi başarısı test edilmemiştir. Çalışmanın ilaç müdahalesi, CCl₄ ile fibrozis oluşturulmuş farelerde oral ND201651 kullanılarak yapılmıştır. Bu nedenle sonuçlar güçlü bir preklinik mekanizma ve hedef doğrulaması sunmakla birlikte insanlarda kanıtlanmış antifibrotik tedavi olarak yorumlanamaz.

Karaciğer fibrozisinde hepatik stellat hücre neden merkezi bir hücredir?

Hepatik stellat hücreler (hepatic stellate cells, HSCs), sağlıklı karaciğerde büyük ölçüde sessiz yani quiescent durumda bulunan ve başlıca vitamin A içeren lipid damlacıklarını depolayan hücrelerdir. Karaciğer sürekli veya şiddetli hasara uğradığında HSC'ler aktive olur ve myofibroblast-benzeri bir fenotipe dönüşür. Bu dönüşümden sonra hücre dışı matriks, özellikle kollajen üretimi belirgin şekilde artar. Fibrozis; bu matriksin normal doku mimarisini bozacak şekilde birikmesidir.

Aktive HSC'ler yalnız kollajen üreten hücreler değildir. Proliferasyonları artabilir, hasarlı bölgelere göç edebilir ve kontraktil özellik kazanabilirler. Bu nedenle araştırmacılar PAK4'ün etkisini yalnız tek bir kollajen belirtecinde değil; fibrotik aktivite, proliferasyon, migrasyon ve kontraktilite gibi birden fazla HSC fenotipinde değerlendirmiştir.

α-SMA ve COL1A1 neyi gösteriyor?

α-SMA, alpha-smooth muscle actin'in kısaltmasıdır ve HSC'nin quiescent durumdan myofibroblast-benzeri aktive duruma geçtiğini izlemek için sık kullanılan göstergelerden biridir. COL1A1 ise tip I kollajenin alfa-1 zincirini kodlayan gen/proteindir. Tip I kollajen fibrotik ekstraselüler matriksin önemli bileşenlerinden biridir. Dolayısıyla α-SMA azalması HSC aktivasyonunun; COL1A1 ve diğer kollajen ilişkili genlerin azalması ise fibrogenik matriks üretiminin zayıfladığına işaret eder.

PAK4 nedir ve S474 neden ölçüldü?

PAK4, p21-activated kinase ailesinin grup II üyesi olan bir serin/treonin protein kinazıdır. Protein kinazlar hedef proteinlerde belirli amino asit kalıntılarına fosfat grubu ekleyerek proteinlerin aktivitesini, stabilitesini, hücre içi konumunu veya diğer proteinlerle etkileşimini değiştirebilir.

PAK ailesi grup I PAK1-3 ve grup II PAK4-6 olarak sınıflandırılır. Çalışmada yalnız toplam PAK4 miktarı değil, PAK4'ün S474 yani 474. amino asitteki serin kalıntısının fosforilasyonu da ölçülmüştür. PAK4'ün aktivasyonuyla ilişkili otofosforilasyonu nedeniyle p-PAK4(S474), PAK4 aktivitesinin bir göstergesi olarak kullanılmıştır.

İlk bulgu: PAK4 fibrotik ve aktive HSC'lerde artıyor

CCl₄ ile oluşturulan fare karaciğer fibrozisinde toplam PAK4 ve p-PAK4(S474), HSC aktivasyon göstergesi α-SMA ile birlikte artmıştır. Aynı eğilim safra kanalı ligasyonu (BDL) modelinde ve choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet (CDAHFD) modelinde de değerlendirilmiştir.

İmmünofloresans analizleri PAK4 sinyalinin özellikle α-SMA-pozitif aktive HSC popülasyonuyla birlikte arttığını göstermiştir. Bu ayrım önemlidir; çünkü bütün karaciğer dokusunda bir proteinin artması, o proteinin mutlaka stellat hücrede arttığını göstermez. PAK4 ile α-SMA'nın aynı hücrelerde birlikte gösterilmesi HSC bağlamını güçlendirmiştir.

İnsan örnekleri nasıl kullanıldı?

İnsan karaciğer dokuları Jeonbuk National University Hospital'da karaciğer rezeksiyonu, transplantasyon veya biyopsi yapılan kişilerden Kasım 2017-Mayıs 2023 arasında toplanmıştır. Örnekler özgün patoloji raporlarındaki histolojik METAVIR evrelemesine göre normal, fibrozis ve siroz gruplarına ayrılmıştır.

Kohortun başlıca etiyolojisi kronik hepatit B virüsü enfeksiyonudur; ayrıca hepatit C, metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı ve alkol ilişkili karaciğer hastalığı örnekleri bulunmaktadır. Kaynak, siroz grubundaki bütün hastaların kompanse sirozlu olduğunu belirtmektedir.

İnsan doku analizlerinde PAK4 ve α-SMA'nın birlikte pozitif olduğu hücrelerin oranı fibrozis şiddetiyle artmıştır. Daha sonra YAP ve PAK4 ekspresyonu arasında HSC düzeyinde pozitif ilişki gösterilmiş; kaynak Figure 6i'de PAK4-pozitif ve YAP-pozitif HSC popülasyonları için r=0.6666 ve P<0.0001 raporlanmıştır. Ayrıca p-YAP(T428) proteini normal dokudan fibrozis ve siroza doğru yükselmiştir.

Burada önemli bilimsel sınır şudur: insan örneklerinde gözlenen ilişki, PAK4'ün hastalarda fibrozisi tek başına nedensel olarak oluşturduğunu kanıtlamaz. Nedensellik iddiasını güçlendiren asıl deneyler genetik silme, kinaz testi, mutasyon ve fare müdahaleleridir.

PAK4 neden aktive HSC'de yükseliyor?

Primer fare HSC'leri quiescent durumdan aktive duruma geçerken yalnız PAK4 proteini değil Pak4 mRNA'sı da artmıştır. Bu bulgu, artışın en azından kısmen transkripsiyonel düzeyde gerçekleşebileceğini düşündürmüştür.

Araştırmacılar Evolutionary Conserved Regions taramasıyla insan ve fare PAK4/Pak4 proksimal promoter bölgelerinde iki olası transkripsiyon faktörü bağlanma bölgesi belirlemiştir: HIF-1α ve YY1.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) deneyleri HIF-1α ve YY1'in PAK4 promoter bölgelerine bağlandığını göstermiştir. LX-2 hücrelerinde HIF-1α veya YY1'in siRNA ile susturulması PAK4 ekspresyonunu azaltmıştır. Böylece çalışma PAK4 artışının aktive HSC'nin transkripsiyonel yeniden programlanmasıyla bağlantılı olduğunu desteklemektedir.

ChIP deneyi neyi gösterir?

ChIP, belirli bir DNA-bağlayıcı proteinin hücre içinde hangi genomik bölgeye bağlı olduğunu sınamak için kullanılan bir yöntemdir. Bu deneyde soru “HIF-1α ve YY1 gerçekten PAK4 promoter bölgesine bağlanıyor mu?” şeklindedir. ChIP sonucu yalnız iki genin aynı anda ekspresyon gösterdiğini değil, transkripsiyon faktörünün ilgili promoter DNA'sıyla fiziksel ilişkisini sınar.

PAK4 kaybedildiğinde HSC'de ne oluyor?

Primer fare HSC'lerinde iki ayrı genetik yaklaşım kullanılmıştır. İlk yaklaşımda Pak4^f/f farelerden izole edilen HSC'ler üç gün kültüre edilmiş, ardından Cre rekombinaz taşıyan adenovirüsle enfekte edilmiş ve üç gün daha kültürlenmiştir. İkinci yaklaşım wild-type primer HSC'lerde siRNA ile Pak4 knockdown yapılmasıdır.

Her iki yaklaşımda da PAK4 kaybı α-SMA ve tip I kollajen düzeylerini düşürmüş, Acta2, Des, Col1a1, Col1a2, Serpine1, Timp1 ve Col7 gibi fibrogenik genlerin ekspresyonunu azaltmıştır.

PAK4 susturulması ayrıca HSC proliferasyonunu ve migrasyonunu azaltmış, collagen gel contraction deneyinde kontraktil kapasiteyi baskılamıştır. Böylece PAK4 etkisi yalnız kollajen ekspresyonundaki tek bir değişime indirgenmemiştir.

RNA-seq analizi neden yapıldı?

Tek tek seçilmiş fibrozis genlerini ölçmek araştırmacının önceden bildiği hedeflere odaklanır. RNA sequencing (RNA-seq) ise bütün transkriptom düzeyindeki değişimleri daha tarafsız biçimde incelemeye olanak verir.

PAK4 knockdown HSC'lerde n=4 biyolojik tekrar üzerinden yapılan RNA-seq sonrasında Gene Ontology analizi ekstraselüler matriks organizasyonu, hücre migrasyonu ve proliferasyonla ilişkili gen programlarının değiştiğini göstermiştir. Gene Set Enrichment Analysis ise kollajen oluşumu ile ilişkili gen kümelerinin PAK4 kaybında aşağı düzenlendiğini ortaya koymuştur.

GO ve GSEA arasındaki fark nedir?

Gene Ontology analizi değişen genlerin hangi biyolojik süreçlerde yoğunlaştığını sınıflandırır. GSEA ise genleri yalnız “anlamlı/anlamsız” biçiminde ayırmak yerine bütün sıralanmış ekspresyon listesindeki belirli gen kümelerinin listenin üst veya alt bölümünde sistematik olarak birikip birikmediğini değerlendirir. Bu çalışmada iki yaklaşım da PAK4 kaybının fibrogenik HSC programını baskıladığı yönünde sonuç vermiştir.

HSC'ye özgü Pak4 silme farede nasıl yapıldı?

Pak4-floxed fareler Pdgfr-β-CreERT2 fareleriyle çaprazlanarak Pak4^ΔHSC modeli oluşturulmuştur. CreERT2'nin aktive edilmesi ve aktive HSC'lerde Pak4 geninin silinmesi için tamoksifen intraperitoneal olarak 75 mg/kg/gün dozunda beş ardışık gün verilmiştir.

Bu yaklaşım bütün vücuttaki Pak4 genini silmek yerine hedef hücre popülasyonuna daha güçlü biçimde odaklanır. Böylece gözlenen fibrozis değişiminin HSC içindeki PAK4 işleviyle bağlantısı farmakolojik sistemik inhibisyona göre daha doğrudan sınanabilir.

CCl4 fibrozis modeli

Sekiz haftalık erkek farelerde CCl₄, corn oil vehicle ile karşılaştırmalı biçimde 0.6 mL/kg dozunda haftada iki kez, toplam altı hafta intraperitoneal uygulanmıştır. CCl₄ karaciğerde tekrarlayan hepatoselüler hasar oluşturarak fibrotik yanıtı tetikleyen deneysel modeldir.

BDL fibrozis modeli

İkinci modelde sekiz haftalık erkek farelerde sham operasyon veya bile duct ligation uygulanmış ve hayvanlar iki hafta sonra değerlendirilmiştir. BDL, safra akımının cerrahi olarak engellenmesiyle kolestatik karaciğer hasarı ve fibrozis oluşturan mekanistik olarak CCl₄'ten farklı bir modeldir.

CDAHFD ne için kullanıldı?

Altı haftalık C57BL/6N erkek fareler normal chow diet veya %60 kcal yağ ve %0.1 metiyonin içeren, ek kolin içermeyen choline-deficient, L-amino acid-defined high-fat diet ile 12 hafta beslenmiştir. Çalışma bu modeli PAK4 ekspresyonunun farklı fibrozis bağlamlarında arttığını göstermek için kullanmıştır.

HSC-spesifik Pak4 kaybının in vivo sonucu

CCl₄ deneyinde LT-Vehicle n=6, LT-CCl₄ n=8, Pak4^ΔHSC-Vehicle n=4 ve Pak4^ΔHSC-CCl₄ n=6'dır. BDL deneyinde LT-Sham n=3, LT-BDL n=6, Pak4^ΔHSC-Sham n=3 ve Pak4^ΔHSC-BDL n=6'dır.

HSC proliferasyonu da PCNA ve α-SMA çift-pozitif hücreler üzerinden azalmıştır. Buna karşılık cleaved caspase-3 ve α-SMA eş boyaması HSC apoptozunda belirgin değişiklik göstermemiştir. Bu ayrım, daha düşük fibrozisin yalnız HSC'lerin daha fazla ölmesinden kaynaklanmadığını; HSC aktivasyonu ve genişlemesinin baskılanmasının önemli olduğunu desteklemektedir.

Serum ALT ve AST aktivitelerinin HSC-spesifik Pak4 knockout modellerinde belirgin değişmemesi de araştırmacıların HSC'ye özgü etki yorumunu destekleyen ek bulgulardan biridir.

PAK4 ile YAP arasındaki bağlantı nasıl bulundu?

PAK4 kaybedilen HSC'lerin RNA-seq sonuçlarında KEGG pathway analizi Hippo signaling pathway'nin değiştiğini göstermiştir. GeneMANIA tabanlı ağ analizi YAP'ı bu değişen ağla yakın ilişkili merkezi moleküllerden biri olarak işaret etmiştir.

Primer HSC aktivasyonu sırasında YAP proteini PAK4'e paralel biçimde artmıştır. WT-PAK4'ün aşırı ekspresyonu YAP-responsive luciferase aktivitesini ve CTGF ile CYR61/CCN1 gibi YAP hedef genlerini artırırken katalitik aktivitesi bozulmuş PAK4^S474A mutantı aynı etkileri göstermemiştir.

Bu sonuç PAK4'ün yalnız YAP'la beraber bulunan bir protein olmadığını; PAK4'ün kinaz aktivitesinin YAP fonksiyonu açısından gerekli olduğunu düşündürmüştür.

YAP nedir?

Yes-associated protein (YAP), Hippo signaling pathway'nin merkezi transkripsiyonel koaktivatorlerinden biridir. YAP doğrudan DNA'ya bağlanan klasik bir transkripsiyon faktörü değildir; çekirdekte TEAD ailesi gibi DNA-bağlayıcı ortaklarla kompleks oluşturarak CTGF, CCN1 ve diğer proliferatif/fibrogenik hedef genlerin transkripsiyonunu destekler.

YAP'ın biyolojik etkisi yalnız toplam protein miktarıyla belirlenmez. Proteinin fosforilasyon durumu, stabilitesi, sitoplazma/çekirdek dağılımı ve ubikitin-proteazom sistemi tarafından ne kadar hızlı parçalandığı da önemlidir.

PAK4, YAP'ı T428'de Fosforile Ettiğinde Ne Değişiyor?

PAK4 tarafından insan YAP'ın T428 treonin kalıntısının fosforillenmesi YAP ubikitinasyonunu azaltarak proteinin parçalanmasını yavaşlatıyor, YAP protein stabilitesini ve çekirdekte birikimini artırıyor ve TEAD-bağımlı transkripsiyonel aktiviteyi güçlendiriyor; çalışmanın hücre ve fare deneylerinde bu zincir daha güçlü HSC aktivasyonu ve fibrogenezle bağlantılıdır.

PAK4-YAP fiziksel etkileşimi nasıl gösterildi?

Co-immunoprecipitation (Co-IP), bir proteinin antikorla çöktürülmesi sırasında ona bağlı başka bir proteinin de kompleks içinde gelip gelmediğini inceler. Co-IP deneylerinde PAK4 ve YAP aynı protein kompleksinde bulunmuştur.

Proximity ligation assay (PLA), hücre içinde iki proteinin çok yakın fiziksel mesafede bulunduğunu floresans sinyaliyle gösteren bir yöntemdir. PLA da PAK4-YAP yakınlığını desteklemiştir.

Önemli bir özgüllük kontrolü olarak PAK4, YAP'ın paralogu TAZ ile aynı biçimde bağlanmamıştır. Bu sonuç, PAK4'ün bütün YAP/TAZ ailesini ayrım yapmadan hedeflemediğini göstermektedir.

PAK4'ün YAP'ı doğrudan fosforile ettiği nasıl gösterildi?

Rekombinant insan PAK4 ve YAP'ın kullanıldığı hücresiz in vitro kinase assay, PAK4'ün YAP'ı doğrudan fosforile edebildiğini göstermiştir. Deney sırasında PAK4'ün kendi otofosforilasyonu da izlenmiştir.

WT-PAK4 YAP'ın treonin fosforilasyonunu artırırken kinase-dead PAK4^S474A mutantı aynı artışı oluşturmamıştır. Serin fosforilasyonunda aynı örüntü görülmemesi araştırmacıları treonin kalıntılarına yöneltmiştir.

T428 bölgesi nasıl bulundu?

PhosphoNET ve PhosphoSitePlus gibi in silico fosforilasyon bölgesi tahmin araçları beş aday YAP bölgesi önermiştir. Bu adayları içeren oligopeptitlerle yapılan competition deneyleri PAK4'ün özellikle T428 bölgesini hedeflediğini göstermiştir.

T428 fosforilasyonu daha sonra site-specific liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analiziyle desteklenmiştir. Bu yöntem protein/peptitleri kütle/yük davranışlarına göre ayırarak belirli peptitlerdeki post-translational modification'ları tespit etmeye olanak verir.

Moleküler modelleme neyi gösterdi ve neyi göstermedi?

Araştırmacılar insan YAP'ın T428'i içeren 423MDTGDTINQST433 peptit segmentini PAK4'ün catalytic domain'ine dock etmiş, ardından sterik çakışmaları azaltmak ve protein-peptit ara yüzünü gevşetmek amacıyla backbone restraints içeren kısa süreli molecular dynamics simülasyonları uygulamıştır.

Elde edilen modellerde YAP T428 bölgesi PAK4'ün katalitik cebine doğru yönlenmiş ve treonin hydroxyl grubu katalitik kalıntıya hidrojen bağı mesafesinde konumlanmıştır.

Bu model “PAK4-T428 fosforilasyonunun kendisi bilgisayarda kanıtlandı” anlamına gelmez. Molecular docking ve MD yapısal olarak reaksiyonun mümkün olduğuna ilişkin açıklayıcı destek sağlar. Doğrudan biyokimyasal kanıt kinase assay, mutagenez, peptide competition ve LC-MS/MS'den gelmektedir.

Yeni p-T428-YAP antikoru neden üretildi?

T428 daha önce YAP'ın iyi tanımlanmış fosforilasyon bölgelerinden biri olmadığı için araştırmacılar T428-fosforillenmiş YAP'ı özel olarak ölçmek amacıyla yeni bir polyclonal antibody üretmiştir.

İnsan YAP T428 bölgesini içeren EMDTGD[pT]INQSTL phosphopeptide sentezlenmiş, keyhole limpet hemocyanin'e bağlanmış ve tavşanların immunizasyonunda kullanılmıştır. Antikor titreleri fosforillenmiş ve fosforillenmemiş peptitlere karşı ELISA ile değerlendirilmiştir.

Serum protein A/G chromatography ve ardından fosforile peptide'e özgü affinity purification ile saflaştırılmıştır. Antikorun T428-fosforillenmiş peptide seçiciliği ELISA ve peptide competition deneyleriyle doğrulanmıştır.

PAK4 susturulduğunda T428 fosforilasyonu neden tamamen sıfırlanmadı?

LX-2 hücrelerinde PAK4 knockdown sonrası p-YAP(T428) sinyali belirgin biçimde azalmış fakat tamamen yok olmamıştır. Yazarlar bunun iki olası açıklamasını açıkça belirtmektedir: deney koşullarında PAK4 susturulmasının tam olmaması ve/veya T428'i fosforile edebilen henüz tanımlanmamış başka kinazların bulunması.

Bu nedenle çalışma “YAP T428'i biyolojik olarak yalnızca PAK4 fosforile edebilir” sonucunu desteklemez. Desteklenen sonuç, PAK4'ün T428'i doğrudan fosforile edebilen ve bu bölgede önemli düzenleyici rolü olan bir kinaz olduğudur.

PAK4 YAP miktarını mRNA üzerinden mi artırıyor?

Primer HSC'lerde PAK4 knockdown YAP protein miktarını azaltırken Yap mRNA'sını belirgin biçimde değiştirmemiştir. Bu durum PAK4'ün YAP üzerindeki başlıca etkisinin transkripsiyon düzeyinde yeni YAP üretimini artırmaktan çok protein stabilitesi üzerinde olduğunu düşündürmüştür.

CHX chase testi neyi ölçüyor?

Cycloheximide (CHX), yeni protein sentezini inhibe eder. Yeni YAP üretimi durdurulduktan sonra mevcut YAP'ın zamana göre ne kadar hızlı azaldığı izlenirse proteinin stabilitesi hakkında bilgi edinilebilir.

PAK4'ün aşırı ekspresyonu YAP'ın CHX varlığında daha uzun süre korunmasını sağlamıştır. Buna karşılık phospho-inactive YAP^T428A daha hızlı kaybolmuştur. Bu sonuç T428 fosforilasyonunun YAP protein ömrünü uzatan işlevsel etkisini desteklemektedir.

Ubikitinasyon neden önemli?

Ubikitin, hedef proteinlerin hücre içinde özellikle proteazomal yıkıma gönderilmesinde kullanılan küçük bir işaret proteinidir. Bir proteinin yüksek düzeyde polyubiquitination'a uğraması çoğu durumda proteazom tarafından parçalanmaya hazırlanmasıyla ilişkilidir.

PAK4 overexpression YAP ubikitinasyonunu azaltmıştır. PAK4 knockdown nedeniyle oluşan YAP destabilizasyonu, E3 ubiquitin ligase β-TRCP susturulduğunda geri dönerken FBXW7 knockdown aynı korumayı sağlamamıştır. Bu nedenle çalışma PAK4-YAP stabilizasyon bağlantısında β-TRCP'yi özellikle öne çıkarmaktadır.

LATS1 ile PAK4 aynı fosforilasyonu mu yapıyor?

Hayır. Kanonik Hippo signaling pathway içinde LATS1'in YAP üzerindeki iyi bilinen inhibitör bölgelerinden biri S127'dir. S127 fosforilasyonu 14-3-3 bağlanmasını, sitoplazmik tutulmayı ve YAP inhibisyonunu destekler.

PAK4 ise bu çalışmada YAP'ı T428'de aktive edici yönde fosforile eden farklı bir kinaz olarak gösterilmiştir. PAK4 knockdown LATS1'in toplam miktarını veya T1079-fosforillenmiş aktif LATS1 düzeyini değiştirmemiştir. PAK4'ün YAP stabilizasyon etkisi LATS1 knockdown koşullarında da devam etmiştir.

Phosphomimetic YAP^T428E mutantı ayrıca LATS1 ile uyarılan YAP degradasyonuna daha dirençli davranmıştır. Bu sonuçlar PAK4-T428 ekseninin LATS1'in kanonik inhibisyon mekanizmasını yalnız yukarıdan açıp kapatan dolaylı bir etkiden farklı olduğunu desteklemektedir.

YAPT428A ve YAPT428E Mutasyonları Neyi Test Ediyor?

YAP^T428A'da fosforillenebilen treonin alaninle değiştirilerek T428 fosforilasyonunun gerçekleşmesi engellenir; YAP^T428E'de treonin glutamatla değiştirilerek fosforillenmiş bölgenin negatif yükü kısmen taklit edilir. Bu karşıt mutantlar T428 fosforilasyonunun yalnız birlikte görülen bir işaret mi yoksa YAP stabilitesi, hücre içi konumu ve transkripsiyonel işlev üzerinde fonksiyonel bir düzenleyici mi olduğunu sınamak için kullanılmıştır.

T428A mutantının sonucu

PAK4 varlığında WT-YAP'a kıyasla YAP^T428A daha fazla ubikitinlenmiş ve CHX chase sırasında daha hızlı parçalanmıştır. Aynı mutant hücrelerde daha fazla sitoplazmik tutulma ve daha düşük YAP-responsive luciferase aktivitesi göstermiştir.

T428E mutantının sonucu

Fosforilasyonu taklit eden YAP^T428E mutantı ters yönde davranmış; YAP stabilitesi ve transkripsiyonel aktivite açısından phospho-inactive mutanttan farklı sonuç vermiştir. Böylece T428 fosforilasyon durumunun YAP fonksiyonunu gerçekten değiştirebildiği desteklenmiştir.

İnsan T428 ile fare T413 neden farklı numaraya sahip?

Aynı işlevsel bölge insan ve fare protein dizilerinde amino asit numaralandırmasının farklı olması nedeniyle farklı numarayla adlandırılır. İnsan YAP'taki T428 kalıntısının fare Yap'taki ortolog karşılığı T413'tür. Bu nedenle insan hücre deneylerindeki YAP^T428A ile fare in vivo deneyindeki Yap^T413A aynı biyolojik fosforilasyon noktasının türler arası karşılıklarıdır.

YapT413A mutantı fare karaciğerinde ne yaptı?

WT-Yap veya phospho-inactive Yap^T413A, HSC'lerde seçici ekspresyon amacıyla Col1a1 promoter kontrollü lentiviral vektörlerle taşınmıştır. CCl₄ uygulamasının ilk iki haftasından sonra kontrol LV, LV-Yap veya LV-Yap^T413A farelere retro-orbital intravenöz olarak 1×10⁸ TU/fare dozunda verilmiş; CCl₄ dört hafta daha sürdürülmüştür.

WT-Yap overexpression kollajen birikimini ve fibrogenik yanıtı güçlendirmiştir. Buna karşılık Yap^T413A aynı fibrotik etkiyi oluşturamamış ve CCl₄ grubuna kıyasla kollajen birikimini de azaltmıştır.

Mekanizma zincirinin bağımsız Verianla şeması

LATS1, β-TRCP ve PAK4 aynı düzenleyici ağda nasıl ilişkilendiriliyor?

Kanonik Hippo yolunda LATS1, YAP'ı S127'de fosforile ederek sitoplazmik tutulma ve degradasyon yönüne iter. β-TRCP ise YAP'ın ubikitinasyon ve degradasyon mekanizmasına katılan E3 ligazlardan biridir. Çalışma PAK4-T428 fosforilasyonunun YAP'ı bunun ters yönünde, yani stabilizasyon ve aktivasyon yönünde etkilediğini göstermektedir.

Bu nedenle YAP'ın davranışı tek bir “aç/kapa” fosforilasyonundan oluşmaz. Aynı protein farklı bölgelerden fosforile edildiğinde farklı hatta hatta zıt biyolojik sonuçlar ortaya çıkabilir. S127 inhibitör yönde bilinen bir bölgeyken T428 bu çalışmada aktive edici yönde tanımlanmıştır.

İnsan dokusundaki p-YAP(T428) sonucu neden önemli?

Bir mekanizmanın yalnız kültür hücresinde veya deneysel farede çalışması, insan hastalığında aynı biyolojik eksenin devrede olduğu anlamına gelmez. Araştırmacıların özel p-T428-YAP antikoruyla insan karaciğer dokusunda yaptığı analiz, T428-fosforillenmiş YAP'ın fibrozis ve sirozda arttığını göstermiştir.

Bu bulgu PAK4-YAP ekseninin insan karaciğer fibrozisinde biyolojik olarak ilgili olduğunu destekler. Buna rağmen insan verisi observational olduğu için PAK4 inhibisyonunun hastalarda fibrozisi azaltacağı sonucu bu veriden tek başına çıkarılamaz.

YAP ve PAK4 arasındaki insan doku korelasyonu nasıl yorumlanmalıdır?

Kaynak Figure 6i'de PAK4-eksprese eden ve YAP-eksprese eden HSC popülasyonları arasında r=0.6666 ve P<0.0001 pozitif korelasyon gösterilmektedir. Pozitif r değeri PAK4-pozitif HSC oranı arttıkça YAP-pozitif HSC oranının da artma eğiliminde olduğunu gösterir.

P<0.0001, sıfır ilişki varsayımı altında gözlenen veya daha uç bir ilişkinin yalnız rastlantıyla ortaya çıkmasının test modeli içinde çok düşük olasılıklı olduğuna işaret eder. Ancak düşük p değeri ilişkiyi nedensellik haline getirmez ve etkinin klinik büyüklüğünü tek başına açıklamaz.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Çalışmanın kanıt katmanları

PAK4 inhibitörü ND201651 ne yaptı?

ND201651, kaynakta oral kullanılabilen küçük moleküllü selektif PAK4 inhibitörü olarak tanımlanmaktadır. Primer fare HSC'lerinde ND201651 YAP ve α-SMA proteinlerini, YAP hedefleri Ctgf ve Ccn1'i ve fibrogenik Acta2, Col1a1 ve Col1a2 ekspresyonunu azaltmıştır. Aynı hücre deneylerinde kaynak, kullanılan koşullarda hücre canlılığının belirgin biçimde etkilenmediğini bildirmektedir.

İn vivo deneyde fareler altı hafta CCl₄ uygulaması alırken son dört hafta boyunca oral ND201651 ile tedavi edilmiştir.

ND201651, CCl₄ ile artan p-PAK4, YAP ve p-YAP(T428) düzeylerini baskılamış; Ctgf/Ccn1 ve fibrogenik gen ekspresyonunu azaltmıştır. Sirius red ve Masson's trichrome histolojisi ile hydroxyproline ölçümü kollajen/fibrozis yükünün azaldığını göstermiştir.

30 mg/kg grubunda serum ALT ve AST aktiviteleri azalmış ve CCl₄ ile ilişkili vücut ağırlığı kaybında düzelme görülmüştür. Yazarlar bu sonuçları tedavinin yararlı etkileri ve deney koşullarında belirgin sistemik toksisite olmamasıyla uyumlu yorumlamaktadır.

Ancak ALT, AST, vücut ağırlığı ve kısa dönem hücre canlılığı ölçümleri kapsamlı toksikoloji değildir. Klinik güvenlik, hedef dışı etkiler, uzun süreli dozlama, farmakokinetik ve insan biyoyararlanımı bu deney tarafından çözülmüş değildir.

ND201651 Sonucu PAK4 İnhibitörünün İnsanlarda Karaciğer Fibrozisini Tedavi Ettiğini Gösteriyor mu?

Hayır. ND201651 ile doğrudan tedavi edilen canlı organizmalar farelerdir; insanlardan yalnız karaciğer doku örnekleri incelenmiştir. Çalışma PAK4'ü güçlü bir preklinik antifibrotik hedef olarak destekler, fakat insanlarda etkin doz, güvenlik, farmakokinetik, uzun dönem yan etki veya klinik fibrozis gerilemesi göstermez.

Farmakolojik deney neden HSC-spesifik knockout'tan farklı yorumlanmalıdır?

Pak4^ΔHSC modeli Pak4 kaybını özellikle HSC popülasyonuna yöneltirken ağızdan verilen ND201651 sistemik olarak dağılan farmakolojik bir inhibitördür. Bu nedenle ilaç deneyi yalnız HSC'deki PAK4 etkisini izole etmez.

Yazarlar kendi Discussion bölümünde yaralanmış hepatositlerin HSC aktivasyonunu etkileyen sinyaller salgıladığını ve daha önce hepatosit PAK4 inhibisyonunun oksidatif hasar ile lipotoksisiteyi azaltabildiğini hatırlatmaktadır. Bu nedenle ND201651'in faredeki antifibrotik etkisinin HSC ve hepatositler üzerindeki birleşik PAK4 inhibisyonundan kaynaklanabileceğini açıkça tartışmaktadırlar.

HSC'ye özgü sonuç ile sistemik tedavi sonucu neden birlikte önemli?

HSC-spesifik knockout, PAK4'ün HSC içinde fibrozis için gerçekten işlevsel olduğunu gösteren hücre-tipine özgü kanıt sağlar. Sistemik inhibitör deneyi ise moleküler hedefin farmakolojik olarak müdahale edilebilir olduğunu gösterir. İki deneyin aynı yönde sonuç vermesi hedef doğrulamayı güçlendirir, fakat iki deney aynı biyolojik soruyu cevaplamaz.

İstatistiksel analiz nasıl yapıldı?

Kaynak sonuçları aksi belirtilmedikçe ortalama ± standart hata (mean ± SEM) olarak sunmuştur. Şekillerdeki ayrı noktalar biyolojik tekrarları temsil etmektedir ve sonuçların en az üç bağımsız örnek veya deneyden elde edildiği belirtilmektedir.

İki grup arasındaki karşılaştırmalar için iki yönlü değil, two-tailed unpaired Student's t test kullanılmıştır. Birden fazla grubun karşılaştırılması gerektiğinde one-way ANOVA veya deney tasarımına göre two-way ANOVA uygulanmış ve ardından Tukey post-hoc multiple comparisons testi yapılmıştır.

Kaynak istatistiksel anlamlılık eşiğini P<0.05 olarak tanımlamıştır. Analizler GraphPad Prism 10 yazılımında gerçekleştirilmiştir.

SEM ne anlama geliyor?

SEM, sample mean'in popülasyon ortalamasını ne kadar hassas tahmin ettiğini ifade eden standart hata ölçüsüdür. Standart sapma bireyler veya biyolojik tekrarlar arasındaki yayılımı tanımlarken SEM ortalamanın belirsizliğiyle ilişkilidir. Kaynak grafiklerde mean±SEM kullandığı için hata çubukları doğrudan bütün biyolojik varyasyonun standart sapması olarak yorumlanmamalıdır.

Bu makalede matematiksel formül var mı?

Ana kaynak PDF bilimsel sonucu tanımlayan bağımsız bir matematiksel denklem veya formül vermemektedir. Bu nedenle Verianla kaynakta bulunmayan korelasyon, ANOVA, t testi veya SEM formüllerini çalışmanın kendi denklemiymiş gibi üretmemiştir. İstatistik yöntemlerinin görevleri öğretici olarak açıklanmış, ancak kaynak dışı matematiksel yapı bilimsel bulgu katmanına eklenmemiştir.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• PAK4, aktive HSC'lerde ve çeşitli fibrotik karaciğer modellerinde artmaktadır.
• HIF-1α ve YY1, PAK4 promoter'ıyla ilişki kurarak HSC aktivasyonu sırasında PAK4'ün transkripsiyonel artışına katkıda bulunmaktadır.
• PAK4 kaybı HSC'nin fibrogenik aktivitesini, proliferasyonunu, migrasyonunu ve kontraktilitesini baskılamaktadır.
• HSC'ye özgü Pak4 silme CCl4 ve BDL fare modellerinde karaciğer fibrozisini azaltmaktadır.
• PAK4 YAP ile fiziksel olarak etkileşir ve YAP'ı insan proteininde T428 bölgesinde doğrudan fosforile edebilir.
• T428 fosforilasyonu YAP ubikitinasyonunu azaltır, YAP stabilitesini, çekirdek birikimini ve transkripsiyonel aktivitesini artırır.
• PAK4'ün bu etkisi LATS1 aktivitesini yükseltip düşürmesinden bağımsız bir mekanizma olarak desteklenmektedir.
• YAPT428A/YapT413A deneyleri T428/T413 fosforilasyonunun işlevsel önemini doğrulamaktadır.
• İnsan fibrotik karaciğer dokularında PAK4, YAP ve p-YAP(T428) artışı gözlenmektedir.
• ND201651 fare CCl4 modelinde HSC aktivasyonu ve fibrotik doku göstergelerini azaltmaktadır.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• PAK4 inhibitörünün insanlarda karaciğer fibrozisini tedavi ettiği gösterilmemiştir.
• ND201651 için klinik doz, insan farmakokinetiği veya uzun dönem insan güvenliği belirlenmemiştir.
• T428'in yalnızca PAK4 tarafından fosforile edilebildiği kanıtlanmamıştır; PAK4 knockdown sonrasında artık p-T428 sinyali kalmıştır.
• İnsan dokusunda PAK4-YAP korelasyonu tek başına nedensellik kanıtı değildir.
• PAK4 inhibisyonunun bütün etkilerinin yalnız HSC üzerinden oluştuğu farmakolojik deneyde gösterilmemiştir.
• PAK4 inhibisyonunun bütün fibrozis nedenlerinde aynı etkinlikle çalışacağı kanıtlanmamıştır.
• PAK4'ün TAZ ile aynı mekanizmayı yürüttüğü gösterilmemiştir; çalışma tersine PAK4'ün YAP'a seçiciliğini desteklemektedir.
• Erkek farelerdeki sonuçların dişi farelerde aynı olacağı doğrudan test edilmemiştir.
• Kısa dönem hücre canlılığı, ALT/AST ve vücut ağırlığı sonuçları kapsamlı ilaç toksikolojisi yerine geçmez.

Çalışmanın temel sınırlılıkları ve açık soruları

Birinci önemli sınır klinik çeviridir. Çalışma güçlü insan doku ilişkileri gösterse de terapötik müdahalenin kendisi insanlarda değil farelerde yapılmıştır.

İkinci sınır, mevcut PAK4 inhibitörlerinin geliştirilmesidir. Yazarlar PAK4 inhibitörleri için kötü biyoyararlanım ve potansiyel off-target etkilerin halen sorun olabileceğini açıkça belirtmekte; yeni kimyasal scaffold'lar ve targeted protein degradation gibi alternatif yaklaşımların araştırılmasını önermektedir.

Üçüncü açık soru, YAP T428 fosforilasyonunun diğer post-translational modifications ve mekanik stres gibi YAP düzenleyicileriyle nasıl birlikte çalıştığıdır. YAP aynı protein üzerinde birçok farklı düzenleyici sinyal alır ve T428'in bu geniş ağ içindeki ağırlığı henüz bütünüyle bilinmemektedir.

Dördüncü açık soru, PAK4-YAP ekseninin HSC'nin yalnız patolojik fibrogenik işlevlerinde değil, giderek daha fazla tanınan fizyolojik/homeostatic işlevlerinde nasıl davranacağıdır.

Beşinci açık soru, aktive HSC'de HIF-1α ve YY1 artışını başlatan üst düzey mekanizmaların ve bu faktörlerin PAK4 dışındaki kritik hedeflerinin tam olarak açıklanmamış olmasıdır.

Altıncı sınır, hayvan deneylerinin erkek farelerde gerçekleştirilmesidir. Çalışma bu nedenle cinsiyete bağlı olası biyolojik farklılıkları doğrudan sınamamaktadır.

Çalışmanın klinik anlamı nasıl sınırlandırılmalıdır?

PAK4-YAP T428 ekseni terapötik hedef geliştirme açısından güçlü bir mekanistik adaydır. Bunun nedeni hedefin yalnız ekspresyon korelasyonuyla değil; genetik silme, doğrudan kinase assay, site-specific LC-MS/MS, mutagenez, protein stabilitesi deneyleri, in vivo hedef bölge mutasyonu ve farmakolojik inhibisyon gibi bağımsız kanıt katmanlarıyla desteklenmesidir.

Bununla birlikte “iyi ilaç hedefi” olmak ile “onaylanmış güvenli ilaç” olmak aynı kavram değildir. Klinik geliştirme için seçici molekül, farmakokinetik, biyoyararlanım, hedef dışı etkiler, doz-cevap, kronik toksisite, farklı fibrozis etiyolojileri ve insan klinik çalışmaları ayrıca gereklidir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: p21-activated kinase 4 drives hepatic stellate cell activation and liver fibrosis through the phosphorylation of YAP at T428.

Yazarlar ve sıra: Gil-Hwan Kim, Hyunsoo Rho, Chang Hun Lee, You-Jung Hong, Yongdo Park, Hwang Chan Yu, Mi-Young Song, Hye Jin Jo, Eun Joo Kang, Ri Han, Song Yi Yu, Ekihiro Seki, Yoonji Lee, Sangkyu Lee, Eun Ju Bae, Byung-Hyun Park, Chang Yeob Han.

Eş katkı: Gil-Hwan Kim, Hyunsoo Rho ve Chang Hun Lee eşit katkılı yazarlardır.

Sorumlu yazarlar: Eun Ju Bae, Byung-Hyun Park ve Chang Yeob Han.

Kurumlar: School of Pharmacy and Institute of New Drug Development, Jeonbuk National University; College of Pharmacy, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Ewha Womans University; Graduate Program in Innovative Biomaterials Convergence, Ewha Womans University; Division of Gastroenterology, Department of Internal Medicine, Jeonbuk National University Medical School; Research Institute of Clinical Medicine of Jeonbuk National University-Biomedical Research Institute of Jeonbuk National University Hospital; Graduate School of Medical Science and Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Jeonbuk National University Medical School; School of Pharmacy, Sungkyunkwan University; College of Pharmacy, Chung-Ang University; Karsh Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center.

Dergi: Signal Transduction and Targeted Therapy.

Cilt / makale numarası: 11 / 297.

Yayın yılı: 2026.

Alınma tarihi: 19 Kasım 2025.

Revizyon tarihi: 19 Mart 2026.

Kabul tarihi: 11 Mayıs 2026.

Version of Record yayın tarihi: 30 Temmuz 2026.

DOI: 10.1038/s41392-026-02796-0.

Resmî kayıt: Nature / Signal Transduction and Targeted Therapy; DOI üzerinden erişilebilir.

Kaynak türü: Original Article / hakemli araştırma makalesi.

Preprint durumu: Bu kaynak preprint değildir; resmî Version of Record'dur.

Lisans: Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International (CC BY-NC-ND 4.0).

Lisans/görsel notu: CC BY-NC-ND lisansı uyarlanmış kaynak materyalin paylaşılmasına izin vermediğinden kaynak Figure 1-8'in kompozisyonu yeniden üretilmemiştir. Makale içinde verilen SVG, kaynak metindeki olgusal mekanizma ilişkilerinden sıfırdan hazırlanmış bağımsız bir eğitim şemasıdır.

İnsan araştırması etik onayı: Jeonbuk National University Hospital Institutional Review Board, IRB No. JUH 2023-11-024-001. Çalışma Helsinki Bildirgesi doğrultusunda yürütülmüş ve katılımcılardan yazılı informed consent alınmıştır.

Hayvan araştırması etik onayı: Jeonbuk National University Institutional Animal Care and Use Committee, No. NON2023-099.

Hayvanlar: Wild-type C57BL/6N ve C57BL/6J erkek fareler; Pak4-floxed ve Pdgfr-β-CreERT2 hatları kullanılmıştır.

HSC-spesifik Pak4 knockout: Pak4flox/flox × Pdgfr-β-CreERT2 çaprazlaması; CreERT2 aktivasyonu için 75 mg/kg/gün tamoksifen, beş ardışık gün intraperitoneal.

CCl4 modeli: Sekiz haftalık erkek farelerde CCl4 0.6 mL/kg intraperitoneal, haftada iki kez, altı hafta.

BDL modeli: Sekiz haftalık erkek farelerde bile duct ligation; iki hafta sonra örnekleme.

CDAHFD modeli: Altı haftalık C57BL/6N erkek farelerde %60 kcal yağ, %0.1 metiyonin ve ek kolin içermeyen diyet; 12 hafta.

Hücre sistemleri: LX-2 immortalized human HSC line ve primer fare HSC'leri.

Primer HSC kültürü: Collagenase type IV perfusion ve Percoll gradient centrifugation ile izolasyon; DMEM + %10 fetal bovine serum + 100 U/mL penicillin + 100 μg/mL streptomycin; 37 °C ve %5 CO2.

Ana moleküler yöntemler: Western blot, immunofluorescence/co-immunofluorescence, qPCR, ChIP, RNA-seq, Gene Ontology, GSEA, Co-IP, PLA, in vitro kinase assay, immunoprecipitation/ubiquitination assay, cycloheximide chase, YAP-responsive luciferase assay, peptide competition, LC-MS/MS, molecular docking ve kısa molecular dynamics refinement.

Yeni p-T428-YAP antikoru: İnsan YAP T428'i içeren EMDTGD[pT]INQSTL phosphopeptide kullanılarak özel polyclonal antibody geliştirilmiş; ELISA ve peptide competition ile özgüllük kontrol edilmiştir.

Mouse Yap T413 mutantı: İnsan YAP T428'in fare ortoloğu T413'tür. YapT413A mutasyonu ACC → GCC olarak oluşturulmuş ve Col1a1 promoter kontrollü lentiviral sistem kullanılmıştır.

Lentiviral in vivo uygulama: CCl4 tedavisinin ilk iki haftasından sonra kontrol LV, LV-Yap veya LV-YapT413A retro-orbital intravenöz 1×10⁸ TU/fare uygulanmış ve CCl4 dört hafta daha sürdürülmüştür.

Farmakolojik müdahale: ND201651 oral PAK4 inhibitörü; CCl4 modelinin son dört haftasında 10 veya 30 mg/kg.

İstatistik: Sonuçlar mean±SEM; noktalar biyolojik tekrar; iki grup için two-tailed unpaired Student's t test; çoklu gruplar için one-way veya two-way ANOVA ve Tukey post-hoc test; anlamlılık P<0.05; GraphPad Prism 10.

Matematiksel formül durumu: Ana PDF bağımsız bir bilimsel denklem/formül sunmamaktadır. Kaynak dışı denklem üretilmemiştir.

RNA-seq veri erişimi: Raw ve processed RNA-seq verileri NCBI Gene Expression Omnibus içinde GSE308719 erişim numarasıyla depolanmıştır.

Veri erişilebilirliği: Çalışmada üretilen veya analiz edilen verilerin makale içinde mevcut olduğu ve RNA-seq verilerinin GEO'ya yatırıldığı belirtilmiştir.

Finansman: National Research Foundation of Korea tarafından 2020R1C1C1003652, 2021R1I1A3041149, RS-2024-00344251, RS-2026-25476540, RS-2023-NR077221 ve RS-2024-00357518 hibeleri; Bio & Medical Technology Development Program kapsamında 2022M3E5F2017607, RS-2026-25517589 ve RS-2025-02214748; ayrıca Yuhan Innovation Program, Jeonbuk National University Hospital Biomedical Research Institute Fund ve Jeonbuk National University Glocal University 30 Project desteği bildirilmiştir.

Çıkar çatışması: Yazarlar competing interests bulunmadığını beyan etmiştir.

Yazar katkıları: G.H.K., H.R., E.J.B., B.H.P. ve C.Y.H. çalışmayı tasarlamıştır. G.H.K., H.R., Y.J.H., Y.P., H.C.Y., M.Y.S., H.J.J. ve S.Y.Y. deneyleri yürütüp verileri analiz etmiştir. C.H.L. insan doku örneklerini toplamıştır. E.J.K. ve S.L. LC-MS/MS analizini; R.H. ve Y.L. molecular docking analizini gerçekleştirmiştir. E.S. teknik destek ve bilimsel öneri sağlamıştır. E.J.B., B.H.P. ve C.Y.H. çalışmayı denetlemiştir.

Temel bilimsel sınır: İnsan doku analizleri klinik ilişki sağlar fakat tedavi deneyi değildir. Nedensel ve terapötik kanıtların önemli bölümü hücre ve fare modellerine dayanmaktadır.

İlaç geliştirme sınırı: Kaynak PAK4 inhibitörleri için kötü biyoyararlanım ve potansiyel off-target etkilerin çözülmesi gereken problemler olduğunu belirtmektedir.

Mekanizma sınırı: PAK4 knockdown T428 fosforilasyonunu tamamen ortadan kaldırmamıştır; tamamlanmamış knockdown ve/veya henüz tanımlanmamış diğer kinazlar olası açıklamalar olarak kaynakta korunmaktadır.