Blastocystis spp. ni protisti anaerobiki mwenye utofauti wa kijeni anayepatikana kwenye utumbo wa binadamu na wanyama wengi; utafiti huu ni wa uchunguzi, wa sehemu-mkato na wa uangalizi unaochunguza ikiwa jamii ya bakteria katika kinyesi na wasifu wa asidi za mafuta za mnyororo mfupi kwa yak wenye kuhara ambao kwa asili ni Blastocystis-chanya hutofautiana na yak wenye kuhara ambao ni Blastocystis-hasi. Sampuli 30 za kinyesi cha yak wenye kuhara kutoka shamba moja huko Lhasa zilichunguzwa; sampuli 11 zilipatikana kuwa chanya katika uchunguzi wa awali wa molekuli, na uthibitishaji wa mfuatano ulifanikiwa katika sita kati ya hizo. Uchambuzi linganishi ulifanywa kwa yak sita wenye kuhara waliokuwa Blastocystis-chanya na yak sita wenye kuhara waliokuwa Blastocystis-hasi waliochaguliwa kwa nasibu. Jamii za bakteria zilichunguzwa kwa ufuatiliaji wa amplikoni wa 16S rRNA V3–V4, huku asidi saba za mafuta za mnyororo mfupi za kinyesi zikichunguzwa kwa GC–MS.

Katika kundi la Blastocystis-chanya, viwango vya asidi asetiki, propioniki, butiriki, valeriki, kaproiki na isobutiriki vilikuwa vya chini; hakuna tofauti yenye umuhimu iliyoonekana kwa asidi isovaleriki. Katika uchambuzi wa 16S, ACE, Chao1, Faith's phylogenetic diversity, idadi ya ASV zilizobainika na utofauti wa Shannon vilikuwa vya chini katika kundi chanya kulingana na kizingiti cha umuhimu cha p<0,01 kilichobainishwa na utafiti. Muundo wa jumla wa jamii ya bakteria pia ulitengana kati ya makundi; matokeo ya ANOSIM yalikuwa R=0,9852 na p=0,003.

Katika kiwango cha kitaksonomia, wingi wa jamaa wa Bacteroidota ulikuwa wa chini na wingi wa jamaa wa Firmicutes_D ulikuwa wa juu kwa yak Blastocystis-chanya. Baadhi ya jenasi za bakteria zilizowahi kuhusishwa na uchachishaji wa kabohaidreti au uzalishaji wa asidi za mafuta za mnyororo mfupi pia ziliwakilishwa kwa kiwango kidogo katika kundi chanya. Uchambuzi wa PICRUSt2 ulionyesha tofauti katika uwezo wa utendaji wa kimikrobia uliokadiriwa kati ya makundi; hata hivyo, matokeo haya si vipimo vya moja kwa moja vya uonyeshaji wa jeni, shughuli za vimeng’enya au mtiririko wa kimetaboliki.

Kikomo kikuu cha tafsiri ya utafiti huu ni usababisho. Kwa kuwa makundi yote mawili yalijumuisha wanyama wenye kuhara, hakukuwa na kundi la udhibiti lenye afya, sampuli ilikuwa yak sita pekee/kundi, na lishe, umri, matumizi ya dawa na maambukizi mengine ya njia ya utumbo hayakudhibitiwa kwa kina, haiwezi kuhitimishwa kuwa Blastocystis ilisababisha mabadiliko ya mikrobiota, kupungua kwa SCFA au kuhara.

Je, Uwepo wa Blastocystis spp. Uthibitishwa Katika Utafiti Huu Kuwa Sababu ya Kuhara?

Hapana. Utafiti ulilinganisha tu wanyama Blastocystis-chanya na Blastocystis-hasi miongoni mwa yak wenye kuhara; kwa kuwa hapakuwa na kundi la udhibiti lenye afya wala muundo wa maambukizi ya majaribio, haiwezi kuonyeshwa kuwa Blastocystis ilisababisha kuhara au mabadiliko ya kimikrobia na kimetaboliki yaliyoonekana. Matokeo ni mifumo inayohusishwa na uwepo wa Blastocystis.

Umuhimu wa mikrobiota ya utumbo kwa yak

Yak ni wanyama wanaocheua waliozoea hali za mazingira za Nyanda za Juu za Qinghai–Tibet, kama vile hypoxia sugu ya hypobaric, halijoto ya chini, mionzi mikali ya ultraviolet na upungufu wa malisho wa msimu. Uchachishaji wa kimikrobia katika njia ya chakula una jukumu muhimu katika matumizi ya malisho ya nyanda za juu yenye nyuzinyuzi nyingi.

Mikrobiota ya utumbo haijumuishi bakteria pekee. Archaea, kuvu, virusi na eukarioti za kimikrobia pia ni sehemu za ekosistimu ya utumbo. Hata hivyo, utafiti huu ulilenga hasa jamii za bakteria katika kinyesi na ukatumia ufuatiliaji wa amplikoni wa 16S rRNA; kuvu, virusi au mzigo kamili wa bakteria haukupimwa.

Asidi za mafuta za mnyororo mfupi ni nini?

Asidi za mafuta za mnyororo mfupi ni asidi ndogo za kikaboni zinazoweza kutengenezwa kutokana na usindikaji wa kabohaidreti zinazoweza kuchachushwa na vijidudu vya utumbo. Asetati, propionati na butirati ni miongoni mwa SCFA zinazochunguzwa zaidi katika ekosistimu ya utumbo.

SCFA zinahusishwa na kimetaboliki ya nishati ya seli za epitheliamu, pH ya lumen, uadilifu wa kizuizi na udhibiti wa kinga. Hata hivyo, kiasi cha SCFA kinachopimwa katika kinyesi hakionyeshi tu kiasi ambacho bakteria huzalisha. Uzalishaji, ufyonzwaji wa utumbo, matumizi na mwenyeji, muda wa mpito, kiwango cha maji katika kinyesi na upatikanaji wa substrati kwa pamoja huamua mkusanyiko katika kinyesi.

Kwa nini Blastocystis haifasiriwi yenyewe kama “pathojeni”?

Blastocystis inaweza kugunduliwa katika makundi mengi ya binadamu na wanyama, na uhusiano wa mwenyeji–mikrobiota unaweza kutofautiana kati ya tafiti. Katika baadhi ya tafiti za binadamu, uwepo wa Blastocystis umehusishwa na utofauti mkubwa zaidi wa bakteria, ilhali katika baadhi ya visa vya kuhara, aina ndogo fulani zimehusishwa na utofauti mdogo na mifumo tofauti ya mikrobiota.

Kwa hiyo, kuwa tu “Blastocystis-chanya” hakumaanishi matokeo yale yale ya kibiolojia kwa wenyeji wote. Aina ndogo, aina ya mwenyeji, hali ya kliniki, lishe, mikrobiota ya msingi na mazingira vinaweza kubadilisha matokeo.

Kwa nini utafiti huu unalenga yak wa nyanda za juu?

Hypoxia sugu, baridi, upungufu wa lishe wa msimu na utaratibu wa malisho yenye nyuzinyuzi nyingi kwa yak wanaoishi katika maeneo ya juu vinaweza kufanya uchachishaji wa utumbo na mwingiliano wa mwenyeji–mikrobu kuwa tofauti na ule wa wanyama wa maeneo ya chini.

Chanzo kinatumia muktadha huu wa kimazingira kama msingi wa kisayansi wa uwezekano wa kubadilika kwa uhusiano wa Blastocystis–mikrobiota. Hata hivyo, kwa kuwa majibu ya mwenyeji yanayohusiana na oksijeni, gradiyenti ya mwinuko au viashiria vya hypoxia hayakupimwa, haiwezi kuhitimishwa kuwa “mwinuko mkubwa uliongeza athari ya Blastocystis”.

Swali la utafiti

Swali kuu ni ikiwa uwepo wa asili wa Blastocystis kwa yak wenye kuhara unahusishwa na sifa nne zifuatazo:

• mabadiliko ya jamii ya bakteria katika kinyesi,
• kupungua kwa utajiri na utofauti wa bakteria,
• mabadiliko ya uwezo wa kimetaboliki wa kimikrobia uliokadiriwa,
• kupungua kwa viwango vya SCFA katika kinyesi.

Kwa nini kukosekana kwa kundi la udhibiti lenye afya ni muhimu?

Kundi hasi halikujumuisha wanyama wenye afya. Yak hawa pia walikuwa na kuhara. Kwa hiyo, jambo la pamoja kwa makundi yote mawili ni kuhara; utafiti unalinganisha ikiwa hali ya Blastocystis inahusishwa na muundo wa ziada wa mikrobiota/metaboliti ndani ya muktadha huu wa kliniki uliovurugika.

Muundo huu unaweza kuonyesha tofauti kati ya yak mwenye kuhara aliye Blastocystis-hasi na yak mwenye kuhara aliye Blastocystis-chanya; lakini hauwezi kuonyesha jinsi ekosistimu ya utumbo wa yak mwenye afya inavyoonekana au jukumu la Blastocystis katika mpito kutoka hali ya afya hadi kuhara.

Vigezo vingine vinavyochanganya

Umri, jinsia, hali ya mwili, ulaji wa kina wa malisho, historia ya chanjo, matumizi ya hivi karibuni ya dawa za kuua vijidudu au vimelea na ukali wa kuhara havikupatikana kwa utaratibu katika kiwango cha kila mnyama.

Zaidi ya hayo, sababu mbadala za kuhara zinazotokana na bakteria, virusi, protozoa na minyoo hazikuchunguzwa kwa kina. Kwa hiyo, sehemu ya tofauti za mikrobiota na SCFA zilizoonekana inaweza kuhusishwa na vigezo vya kliniki au mazingira visivyo Blastocystis.

Uthibitishaji wa spishi/aina ndogo ya Blastocystis

Eneo la small-subunit rRNA lenye takriban 600 bp liliongezwa kwa PCR. Primer zilizotumiwa ni Bs-RD5-F na Bs-BhRDr-R. Bidhaa za PCR zilikaguliwa kwa electrophoresis ya geli ya agarose na bidhaa zilizofanikiwa zilipelekwa kwa bidirectional Sanger sequencing.

Mfuatano sita uliothibitishwa ulionyesha ufanano wa %99,84 na marejeo ya GenBank PP439446.1 na OR117711.1. Mifuatano ilipakiwa kwenye GenBank kwa accession namba PX888047–PX888052.

Matokeo haya yaliunga mkono utambuzi wa Blastocystis spp.; hata hivyo, hayakuweza kubainisha kwa kuaminika aina ndogo maalum ya ST. Kwa hiyo, matokeo ya mikrobiota hayawezi kuhusishwa na aina ndogo maalum ya Blastocystis.

Nini kinaweza kusemwa kuhusu maambukizi ya zoonotiki?

Utafiti huu haujaribu maambukizi ya zoonotiki. Kwa kuwa mifuatano haikukusanywa kwa wakati mmoja na kwa azimio la aina ndogo kutoka kwa yak, binadamu, wanyama wengine na vyanzo vya pamoja vya mazingira, haiwezi kuonyeshwa maambukizi kwenda kwa binadamu au kutoka kwa binadamu kwenda kwa yak.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Muundo wa uchukuaji sampuli

Uhifadhi wa sampuli za kinyesi

Kinyesi kibichi kilichukuliwa moja kwa moja kutoka kwenye rektamu au mara tu baada ya kujisaidia kwa nyenzo tasa ya matumizi ya mara moja, kikabebwa juu ya barafu kavu na kuhifadhiwa maabara katika −80 °C.

Itifaki ya Blastocystis PCR

DNA ya jenomu ilitolewa kutoka takriban 200 mg za kinyesi kwa kutumia Omega Fecal DNA Kit. Eneo la Blastocystis SSU rRNA liliongezwa kwa primer Bs-RD5-F na Bs-BhRDr-R.

Katika mchanganyiko wa 25 µL PCR, 12,5 µL 2× Taq PCR Master Mix, 1,0 µL ya kila primer, takriban 100 ng template DNA na nuclease-free water zilitumiwa. Mzunguko wa joto ulikuwa: denaturation ya awali katika 95 °C kwa dakika 5, mizunguko 35 ya 95 °C kwa sekunde 15, 59 °C kwa sekunde 15 na 72 °C kwa sekunde 45, kisha final extension katika 72 °C kwa dakika 10.

Ufuatiliaji wa amplikoni wa 16S rRNA

Kwa uchambuzi wa bakteria, eneo la V3–V4 lenye utofauti mkubwa la jeni la 16S rRNA liliongezwa kwa primer 338F na 806R.

Amplification ilifanywa kwa denaturation ya awali katika 95 °C kwa dakika 3; mizunguko 30 ya 95 °C kwa sekunde 30, 55 °C kwa sekunde 30, 72 °C kwa sekunde 45; na hatimaye 72 °C kwa dakika 10.

Hakuna amplikoni iliyogunduliwa katika vidhibiti vya Extraction blank na no-template PCR. Maktaba zilifuatiliwa kwenye Illumina MiSeq kwa 2 × 300 bp paired-end.

Matokeo ya ubora wa ufuatiliaji

Mtiririko wa uchakataji wa bioinformatiki

Mifuatano iliyodemultiplex ilichakatwa kwa QIIME 2 v2023.9. Baada ya kuondoa primer na besi zenye ubora wa chini, denoising, kuunganisha paired-end, dereplication, error correction na chimera removal zilifanywa kwa DADA2.

DADA2 ilizalisha exact amplicon sequence variant badala ya makundi ya OTU yanayotegemea ufanano. Kwa uainishaji wa taksonomia, Genome Taxonomy Database release R214 na q2-feature-classifier naïve Bayes classifier zilitumiwa; confidence threshold ilikuwa 0,7.

Mifuatano ya chloroplast, mitochondria na isiyo ya bakteria iliondolewa; kabla ya uchambuzi wa utofauti, sampuli zilirarefy hadi kina cha chini kabisa cha ufuatiliaji.

Uchambuzi wa utofauti wa alfa

ACE na Chao1 huakisi makadirio ya utajiri; Faith's phylogenetic diversity huakisi utofauti wa kifilojenetiki; observed ASVs huonyesha idadi ya vibadala vilivyoonekana; Pielou evenness huonyesha usawa wa usambazaji wa jamii; na Shannon pamoja na Simpson huakisi utajiri na muundo wa usambazaji kwa njia tofauti.

Hakuna tofauti ya kikundi iliyogunduliwa kwa Good's coverage. Kufikia uwanda kwa mikunjo ya Rarefaction kunaashiria kwamba kina cha ufuatiliaji katika sampuli zilizopo kilitosha kubainisha utofauti wa bakteria ulioonekana; hii haimaanishi kuwa idadi ya sampuli ilitosha.

Utofauti wa beta na utengano wa makundi

Utofauti wa beta hutathmini kiasi ambacho muundo wa jamii za bakteria za sampuli hutofautiana. PCoA na NMDS zilitumika kwenye Bray–Curtis dissimilarity, na PCA pamoja na UPGMA pia zilitumiwa.

Thamani ya juu na chanya ya R katika ANOSIM inaonyesha kwamba katika sampuli 12 zilizochunguzwa, tofauti za muundo kati ya makundi zilikuwa kubwa kuliko tofauti ndani ya makundi. Kwa sababu ya sampuli ndogo, matokeo hayapaswi kuenezwa kwa makundi mengine.

Muundo katika kiwango cha phylum

Uwiano kama Firmicutes/Bacteroidota haupaswi kutumiwa pekee kama “kiashiria cha dysbiosis cha ulimwengu wote”. Uwiano wa taksonomia huathiriwa na aina ya mwenyeji, lishe, sehemu ya njia ya chakula, maandalizi ya sampuli, mbinu ya ufuatiliaji na muktadha wa ugonjwa.

Mifumo iliyoonekana katika kiwango cha jenasi

Katika kundi Blastocystis-chanya, jenasi nyingi zaidi zilijumuisha Arthrobacter_B (%10,20), Romboutsia_B (%8,94) na Faecousia (%8,04). Katika kundi Blastocystis-hasi, Faecousia (%16,17), Cryptobacteroides (%8,11) na Paraprevotella (%3,58) zilijitokeza.

Uchambuzi wa LEfSe ulionyesha Firmicutes_D, Actinobacteriota, Bacilli, Micrococcaceae, Planococcaceae, Bacillales_A, Peptostreptococcales na Arthrobacter_B kama taksoni tofauti katika kundi chanya; na Bacteroidota, Bacteroidia, Bacteroidales, Oscillospiraceae_88309, Spirochaetota, Verrucomicrobiota, Faecousia na Alloprevotella katika kundi hasi.

Taksoni hizi hazipaswi kuchukuliwa kama “biomarka ya utambuzi wa Blastocystis”. Uthibitishaji wa nje na uchambuzi wa utendaji wa utambuzi haukufanywa.

Mtandao wa kuonekana pamoja kwa vijidudu

Uchambuzi wa mtandao ulijumuisha tu jenasi zilizokuwepo katika angalau %50 ya sampuli na zenye wastani wa relative abundance zaidi ya %0,1. Uhusiano ulihifadhiwa wakati thamani kamili ya Spearman correlation ilikuwa angalau 0,70 na thamani ya q iliyosahihishwa kwa Benjamini–Hochberg ilikuwa <0,05.

Kwa mfano, Enterenecus ilionyesha uhusiano chanya na Phocaeicola_A_858004, Porcincola, Agathobacter_164119 na Pygmaiobacter. Faecousia ilikuwa na uhusiano chanya na UBA644, UBA5905 na UBA6857; ilhali Neoscardovia ilikuwa na uhusiano hasi na QALR01, UBA1732 na UBA1259.

Mtandao huu unaonyesha muundo wa takwimu wa kubadilika pamoja. Haiwezi kuhitimishwa kwamba bakteria mmoja anaunga mkono au kuzuia bakteria mwingine moja kwa moja.

Upimaji wa asidi za mafuta za mnyororo mfupi

Takriban 200 mg za kinyesi kilichoyeyushwa ziligandishwa katika 1,8 mL ya %0,5 asidi fosforiki; zikazungushwa kwa 15.000×g kwa dakika 10 katika 4 °C. Supernatant ilitolewa kwa ethyl acetate na kupitishwa kwenye kichujio cha 0,22 µm PTFE.

1 mM 4-methylvaleric acid ilitumiwa kama kiwango cha ndani. Mfululizo wa kalibresheni wa pointi saba uliandaliwa na sharti la R² ≥0,99 lilitumika kwa kukubalika.

Kifaa cha GC–MS ni mchanganyiko wa Agilent 7890B gas chromatograph na Agilent 5977B mass-selective detector. Kolamu ya HP-FFAP ina 30 m × 0,25 mm kipenyo cha ndani × 0,25 µm unene wa filamu.

µL moja ya sampuli iliingizwa katika hali ya splitless kwa joto la inlet la 250 °C, na helium ilitumika kama gesi ya kubeba kwa mtiririko thabiti wa 1,0 mL/dakika. Programu ya Oven ilikuwa 50 °C kwa dakika 1; kupanda hadi 180 °C kwa 10 °C/dakika; kisha hadi 240 °C kwa 20 °C/dakika na kushikilia katika 240 °C kwa dakika 5.

Electron ionization ilifanywa katika 70 eV na hali ya selected-ion-monitoring ilitumika.

Uthibitishaji wa mbinu ya GC–MS

Matokeo ya SCFA

Je, Kupungua kwa SCFA Katika Kinyesi Kunathibitisha Moja kwa Moja Kupungua kwa Uzalishaji wa SCFA wa Kimikrobia?

Hapana. Mkusanyiko wa SCFA katika kinyesi huathiriwa na uzalishaji wa kimikrobia pamoja na ufyonzwaji wa utumbo, matumizi ya mwenyeji, mpito wa njia ya chakula, kiwango cha maji ya kinyesi na substrati inayopatikana; kwa hiyo viwango vya chini vya SCFA vilivyopimwa katika utafiti vinaweza kuendana na uzalishaji mdogo wa kimikrobia lakini si kipimo cha moja kwa moja cha kasi ya uzalishaji.

Ufafanuzi wa pamoja wa SCFA na muundo wa bakteria

Uwakilishi mdogo katika kundi chanya wa Bacteroidota na baadhi ya taksoni kama Alloprevotella, Faecalibacterium, Caproiciproducens, Intestinimonas, Angelakisella na Roseburia, ambazo hapo awali zimehusishwa na uchachishaji wa kabohaidreti au uzalishaji wa SCFA, ni muundo unaoelekea katika mwelekeo mmoja na matokeo ya SCFA.

Hata hivyo, kazi inaweza kutofautiana kwa kiwango cha spishi na hata strain. Data ya amplikoni ya 16S V3–V4 haipimi bakteria huzalisha metaboliti zipi kwa kasi gani.

Je, Matokeo ya PICRUSt2 Yanapima Shughuli Halisi ya Kimetaboliki?

Hapana. PICRUSt2 ni mbinu ya utabiri inayotumia profaili za taksonomia za 16S rRNA na taarifa za jenomu rejea kukokotoa uwezo unaowezekana wa kijeni na kimetaboliki wa jamii; kiasi halisi cha jeni, transkripseni, protini, shughuli za vimeng’enya, mtiririko wa kimetaboliki au uzalishaji wa SCFA havikupimwa moja kwa moja.

Utabiri unaotegemea MetaCyc

Katika kundi Blastocystis-chanya, baadhi ya njia zilizokadiriwa zinazohusiana na glycolysis, TCA/glyoxylate bypass na methionine/homoserine metabolism ziliripotiwa kuwa na uwakilishi mkubwa zaidi.

Katika kundi hasi, njia kama ASPASN-PWY na COLANSYN-PWY na NAGLIPASYN-PWY zinazohusiana na biosynthesis ya gamba la seli/glycan zilikadiriwa zaidi.

Utabiri unaotegemea KEGG

Katika kundi chanya, uwakilishi uliokadiriwa wa njia zinazohusiana na ketone body synthesis/degradation, fatty acid metabolism, branched-chain amino acid degradation, ABC transporters, phosphotransferase system na tryptophan metabolism ulikuwa juu zaidi.

Katika kundi hasi, njia kama branched-chain amino acid biosynthesis, folate one-carbon pool, glycosaminoglycan degradation, biotin metabolism na lipopolysaccharide biosynthesis zilikadiriwa kuwa na uwakilishi mkubwa zaidi.

Uthibitishaji wa tofauti hizi za utendaji zinazoonekana unahitaji vipimo vya moja kwa moja vya molekuli kama shotgun metagenomics, metatranscriptomics au metabolomics.

Uchambuzi wa takwimu

Takwimu zilifanywa kwa SPSS 27.0. Kila yak alichukuliwa kama kitengo huru cha majaribio; ikiwa kulikuwa na marudio ya kiufundi, wastani ulitumika kutoa thamani moja kwa kila mnyama.

Usambazaji wa kawaida ulitathminiwa kwa Shapiro–Wilk na usawa wa variance kwa mtihani wa Levene. Data za kawaida zenye variance sawa zililinganishwa kwa independent-samples Student's t-test; data za kawaida zenye variance zisizo sawa kwa Welch's t-test; na data zisizo na usambazaji wa kawaida kwa Mann–Whitney U.

Kizingiti kikuu cha pande mbili cha umuhimu kilikuwa p<0,01. Katika kulinganisha nyingi za taksonomia na utendaji uliokadiriwa, marekebisho ya Benjamini–Hochberg false-discovery-rate yalitumika na q<0,01 ikachukuliwa kuwa yenye umuhimu. Matokeo ambayo hayakudumisha umuhimu baada ya marekebisho yalitathminiwa kama ya uchunguzi.

Kwa LEfSe, vigezo tofauti vya uteuzi vilitumiwa: p<0,05 katika Kruskal–Wallis na pairwise Wilcoxon tests na LDA score ≥2,0.

Uangalifu katika kutafsiri kizingiti cha p katika chanzo

Katika abstract ya chanzo, Pielou evenness p=0,011 na Simpson p=0,037 ziliripotiwa kuwa chini katika kundi chanya. Hata hivyo, katika sehemu ya mbinu, kizingiti kikuu cha pande mbili cha umuhimu wa takwimu kiliwekwa kuwa p<0,01.

Kwa hiyo, ingawa metrika hizi mbili za utofauti wa alfa zilikuwa na mwelekeo wa kuwa chini, hazipaswi kuchukuliwa kuwa zenye umuhimu wa takwimu kulingana na kizingiti kikuu. ACE, Chao1, Faith's PD, observed ASVs na Shannon zinakidhi sharti la p<0,01.

Njia ya kibiolojia ya dhahania iliyopendekezwa na utafiti

Utaratibu unaojadiliwa na waandishi si mnyororo wa sababu uliothibitishwa moja kwa moja, bali ni dhana inayounganisha matokeo yaliyopo:

1. Uwepo wa Blastocystis huonekana pamoja na muundo fulani wa jamii ya bakteria.
2. Uwakilishi wa jamaa wa baadhi ya taksoni zinazohusishwa na uundaji wa SCFA hupungua.
3. Viwango vya SCFA kadhaa katika kinyesi hupimwa kuwa vya chini.
4. Inadhaniwa kuwa upatikanaji mdogo wa SCFA unaweza kuathiri homeostasis ya epitheliamu na kinga.

Hatua ya mwisho haikupimwa moja kwa moja katika utafiti huu. Intestinal permeability, tight-junction proteins, GPR43 expression, cytokines na histopathology havikutathminiwa.

Tafsiri kwa mtazamo wa tiba ya mifugo

Kipimo cha Blastocystis PCR kinaweza kuwa sehemu ya uchunguzi mpana wa utambuzi wa kuhara kwa yak. Hata hivyo, matokeo chanya ya PCR pekee hayabaini sababu ya kuhara wala kuthibitisha uchaguzi wa tiba maalum.

Katika tathmini ya kliniki, lishe, hidrasheni, historia ya dawa, ukali wa kuhara na maambukizi mengine ya bakteria, virusi, protozoa au minyoo pia yanapaswa kutathminiwa.

Chanzo kinaeleza kuwa hatua za jumla za usalama wa kibayolojia, kama usimamizi unaofaa wa kinyesi na kulinda malisho/maji dhidi ya uchafuzi wa kinyesi, zinaweza kupunguza mfiduo wa kinyesi–mdomo.

Ufanisi wa probiotics, prebiotics, virutubisho vya SCFA au maandalizi ya mimea katika ugonjwa wa yak unaohusishwa na Blastocystis haujathibitishwa na utafiti huu; havipaswi kuwasilishwa kama tiba zilizothibitishwa.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

Katika kinyesi cha yak wenye kuhara waliokuwa Blastocystis-chanya, viwango vya SCFA sita vilikuwa vya chini kuliko vya yak wenye kuhara waliokuwa Blastocystis-hasi.

Muundo wa jamii za bakteria wa makundi chanya na hasi ya yak wenye kuhara ulitengana wazi katika sampuli zilizochunguzwa.

ACE, Chao1, Faith's PD, observed ASVs na utofauti wa Shannon vilikuwa vya chini katika kundi chanya chini ya kizingiti kikuu cha p<0,01 cha utafiti.

Bacteroidota na baadhi ya taksoni zinazohusishwa na fermentation/SCFA zilionyesha wingi wa jamaa wa chini katika kundi chanya.

PICRUSt2 ilionyesha tofauti katika uwezo wa utendaji uliokadiriwa wa makundi.

Matokeo yasiyoungwa mkono na utafiti

Haijaonyeshwa kuwa Blastocystis husababisha kuhara.

Haijaonyeshwa kuwa Blastocystis husababisha moja kwa moja mabadiliko ya bakteria yaliyoonekana.

Haijaonyeshwa kuwa viwango vya chini vya SCFA katika kinyesi vinawakilisha moja kwa moja kasi ya chini ya uzalishaji wa SCFA wa kimikrobia.

Wasifu wa mikrobiota wa yak wenye afya hauwezi kutolewa kutokana na utafiti huu.

Matokeo ya PICRUSt2 si vipimo vya moja kwa moja vya uonyeshaji wa jeni au mtiririko wa kimetaboliki.

Mahusiano katika mtandao wa co-occurrence si mwingiliano wa moja kwa moja wa kimikrobia.

Tofauti za taksonomia hazijathibitishwa kama biomarka za utambuzi.

Haiwezi kuhitimishwa sifa za pathogenic za aina ndogo maalum ya Blastocystis.

Maambukizi ya zoonotiki yak–binadamu hayajaonyeshwa.

Haijaonyeshwa kuwa probiotics, prebiotics, SCFA au bidhaa za mimea ni tiba ya Blastocystis.

Vikwazo vikuu

Tafiti za baadaye

Uthibitishaji wa matokeo unahitaji tafiti kubwa zaidi, za longitudinal na zinazojumuisha mashamba mengi. Kutathmini yak wenye afya na yak wenye kuhara kwa pamoja kunaweza kutoa hali ya rejea inayokosekana.

Taarifa za kina kuhusu umri, jinsia, hali ya mwili, lishe, historia ya dawa na ukali wa kliniki zinapaswa kukusanywa; maambukizi sambamba ya bakteria, virusi, protozoa na minyoo yanapaswa kuchunguzwa kwa kina.

Kwa Blastocystis, uchambuzi wa subtype-resolved unapaswa kufanywa; kazi ya kimikrobia inapaswa kupimwa moja kwa moja kwa shotgun metagenomics, metatranscriptomics au metabolomics.

Ili kutathmini utaratibu wa kibiolojia katika kiwango cha mwenyeji, matokeo kama uadilifu wa kizuizi cha utumbo, protini za tight-junction, vipokezi vya SCFA, cytokines, histopathology, digestibility na utendaji wa uzalishaji yanahitajika.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Kichwa asili: Blastocystis spp. Positivity Is Associated with Altered Fecal Bacterial Communities and Reduced Short-Chain Fatty Acid Concentrations in Diarrheic Yaks.

Waandishi: Qiang Zhang; Ziye Zhu; Ziyi Xu; Muhammad Safdar; Wentong Liu; Kun Li.

Corresponding authors: Wentong Liu; Kun Li.

Taasisi: Agriculture, Rural Affairs, Water Resources and Science & Technology Bureau of Lixian County; College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University; School of Basic Medicine, Hubei University of Arts and Science; Department of Breeding & Genetics, Cholistan University of Veterinary and Animal Sciences; Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas.

Jarida: Veterinary Sciences.

Mchapishaji: MDPI, Basel, Switzerland.

Taarifa ya uchapishaji: Veterinary Sciences 2026, 13(9), 910.

DOI: 10.3390/vetsci13090910.

Historia ya makala: Imepokelewa 13 Julai 2026; imerekebishwa 31 Agosti 2026; imekubaliwa 1 Septemba 2026; imechapishwa 4 Septemba 2026.

Aina ya chanzo: Makala asilia ya utafiti; utafiti wa wanyama wa uchunguzi, sehemu-mkato na uangalizi.

Mapitio ya wenzao: Veterinary Sciences ni jarida la ufikiaji wazi linalopitiwa na wenzao.

Leseni: Creative Commons Attribution (CC BY).

Sampuli kuu: Sampuli za kinyesi cha yak wenye kuhara zilizopatikana mwaka 2025 kutoka shamba moja huko Lhasa.

Ulinganisho wa mwisho: 6 yak wenye kuhara Blastocystis-chanya na 6 yak wenye kuhara Blastocystis-hasi.

Udhibiti wenye afya: Haupo.

Mbinu ya kutambua Blastocystis: SSU rRNA PCR + bidirectional Sanger sequencing.

Mifuatano ya Blastocystis: GenBank PX888047–PX888052.

Aina ndogo: Haikuweza kupangiwa kwa kuaminika.

Mbinu ya wasifu wa bakteria: 16S rRNA V3–V4 amplicon sequencing; Illumina MiSeq 2 × 300 bp.

Bioinformatiki: QIIME 2 v2023.9; DADA2; GTDB release R214; q2-feature-classifier.

Ufuatiliaji ghafi: 2.751.028 read.

Ufuatiliaji baada ya udhibiti wa ubora: 2.620.949 read; %95,27 retention.

Ufikiaji wa data ghafi ya 16S: NCBI Sequence Read Archive BioProject PRJNA1414128.

Utofauti wa alfa: ACE, Chao1, Faith's phylogenetic diversity, observed ASVs, Pielou's evenness, Shannon, Simpson na Good's coverage.

Utofauti wa beta: Bray–Curtis; PCA; PCoA; NMDS; UPGMA; ANOSIM 999 permutations.

Uchambuzi wa taksoni tofauti: LEfSe; LDA ≥2,0.

Mtandao wa co-occurrence: Spearman correlation katika kiwango cha jenasi; uwepo katika ≥%50 ya sampuli; wastani wa relative abundance >%0,1; |ρ| ≥0,70; BH q<0,05.

Utabiri wa utendaji: PICRUSt2; MetaCyc na KEGG. Si kipimo cha moja kwa moja cha utendaji.

Mbinu ya SCFA: Gas chromatography–mass spectrometry.

GC–MS: Agilent 7890B + 5977B mass-selective detector; HP-FFAP column.

SCFA zilizopimwa: Acetic, propionic, butyric, isobutyric, valeric, isovaleric na caproic acids.

Takwimu: SPSS v27.0; Shapiro–Wilk; Levene; Student's t-test; Welch's t-test; Mann–Whitney U; Benjamini–Hochberg FDR.

Kizingiti kikuu cha umuhimu: Pande mbili p<0,01; katika kulinganisha nyingi za taksoni/utendaji q<0,01. LEfSe ilitumia p<0,05 katika itifaki yake ya uteuzi.

Dokezo la uripoti wa takwimu: Katika Abstract, Pielou's evenness p=0,011 na Simpson p=0,037 ziliripotiwa kuwa za chini; thamani hizi mbili hazikidhi kizingiti kikuu cha p<0,01 kilichoelezwa katika sehemu ya mbinu.

Matokeo makuu ya SCFA: Katika kundi chanya, asidi asetiki, propioniki, butiriki, valeriki, kaproiki na isobutiriki ni za chini; hakuna tofauti yenye umuhimu kwa asidi isovaleriki.

ANOSIM: R=0,9852; p=0,003.

Kamati ya maadili: Ethics Committee of Nanjing Agricultural University; NJAU.No20240910164; tarehe ya idhini 10 Septemba 2024.

Ridhaa iliyoarifiwa: Haitumiki.

Ufadhili: Key R&D and Transformation Projects of the Xizang Autonomous Region, XZ202601ZY0138; National Natural Science Foundation of China, 32102692.

Upatikanaji wa data: Data ghafi za 16S PRJNA1414128; mifuatano ya Blastocystis SSU rRNA PX888047–PX888052.

Mgongano wa maslahi: Waandishi hawakuripoti mgongano wa maslahi.

Michango ya waandishi: Uundaji wa dhana Kun Li; metodolojia, programu, uchambuzi rasmi, utafiti na uhifadhi wa data Qiang Zhang, Ziye Zhu na Ziyi Xu; uthibitishaji Kun Li na Wentong Liu; rasilimali, uoneshaji, usimamizi, usimamizi wa mradi na upatikanaji wa ufadhili Kun Li; rasimu ya awali Kun Li na Wentong Liu; mapitio/uhariri Kun Li na Muhammad Safdar kama ilivyoripotiwa.

Kikomo kikuu cha kimetodolojia: Kwa sababu ya muundo wa sehemu-mkato wenye sampuli ndogo, ukosefu wa udhibiti wenye afya, shamba moja, metadata isiyokamilika ya mwenyeji/lishe, kutotengwa kwa utaratibu kwa pathojeni nyingine za enteriki na kutobainishwa kwa aina ndogo ya Blastocystis, usababisho hauwezi kuanzishwa.

Kikomo cha tafsiri ya utendaji: Data ya wingi wa jamaa ya 16S haipimi idadi kamili ya bakteria; PICRUSt2 haipimi jeni halisi au shughuli ya kimetaboliki; na mkusanyiko wa SCFA katika kinyesi haupimi moja kwa moja kasi ya uzalishaji wa kimikrobia wa utumbo.

Kikomo cha matumizi ya tiba ya mifugo: Blastocystis PCR chanya peke yake haiwezi kubainisha sababu ya kuhara na haitoshi kwa matibabu maalum.

Dokezo la matumizi ya taswira: Chanzo kina leseni ya CC BY. Katika taswira ya jalada la Verianla, badala ya kunakili grafu za chanzo moja kwa moja, inapendelewa kuonyesha kwa usahihi wa kisayansi, kwa kujitegemea na kwa mpangilio wa kisayansi uhusiano kati ya yak, Blastocystis, mabadiliko ya jamii ya bakteria na kupungua kwa SCFA.