COLPLEX системаи молекулавии адаптерӣ мебошад, ки дар иммунотаҳлилҳои ҷараёни паҳлуӣ барои гирифтани антигенҳои ҳадаф аз таъсири мутақобилаи сафеда–сафедаи дорои аффинитети хеле баланд ва аз ҳам фарқшаванда байни сафедаҳои бактериявии колицин ва сафедаҳои иммунитетии махсуси онҳо истифода мекунад. Ин таҳқиқот COLPLEX-ро ба прототипи biplex LFIA ҳамгиро кардааст, ки метавонад гликопротеинҳои вируси Ebola-и Zaire ва Sudan-ро дар як тасмаи ҷараёни паҳлуӣ аз ҳам фарқ кунад; система бо озмоишҳои пайвастшавии сафедаҳо, ELISA, LFIA-и хемилюминессентӣ, LFIA-и хушки дорои нанозарраҳои тилло, озмоишҳои ҳадди аналитикии муайянкунӣ ва намунаҳои зардоб/плазмаи инсон арзёбӣ шудааст.

Дар меъмории асосӣ ду ҷуфти колицин–иммунитет истифода шудааст, ки бо ҳам реаксияи салибӣ намедиҳанд. Системаи ColAP41–ImAP41 бо антителаи гирифтании EE8, ки ба гликопротеини Ebola-и Zaire махсус аст, ва системаи ColKhan–ImKhan бо антителаи гирифтании JA7, ки гликопротеинҳои Zaire ва Sudan-ро мешиносад, ҷуфт карда шудааст. Барои ҳар ду ҳадаф антителаи умумии муайянкунандаи XC2 истифода шудааст. Бо ин тарҳ гликопротеини Sudan танҳо хатти тестии Khan-ро, вале гликопротеини Zaire ҳам хатти AP41 ва ҳам хатти Khan-ро ба вуҷуд меорад. Ба ин тартиб, дар як тасма ҳадафҳо аз рӯйи ду намунаи гуногуни сигнал фарқ карда мешаванд.

Дар формати LFIA-и хушки дорои нанозарраҳои тилло ҳадди муайянкунии прототипи COLPLEX барои гликопротеини Ebola-и Zaire 0,034 nM (1,1 ng/mL), ва дар формати муқоисавии дорои иммобилизатсияи мустақими антитела 0,47 nM (15,18 ng/mL) гузориш шудааст. Барои гликопротеини Ebola-и Sudan ҳадди муайянкунии COLPLEX 0,065 nM (2,2 ng/mL) ва дар формати мустақим 2,10 nM (70,98 ng/mL) будааст. COLPLEX ҳамчунин сигнали blank-и пасттар ва хатҳои тестии равшантар ҳосил кардааст.

Дар арзёбии клиникӣ аз 30 намунаи зардоби RT-PCR-мусбати Zaire Ebola, ки аз хуруҷҳои пешини Ebola гирифта шудаанд, 29 намуна аз ҷониби прототипи COLPLEX biplex мусбат муайян шуда, як намунаи RT-PCR-мусбат манфии бардурӯғ мондааст. Дар бахши натиҷаҳо ҳассосият %96,7 (%95 фосилаи эътимод: %83,3–99,9) гузориш шудааст. Ҳамаи 40 намунаи зардоби EBOV-манфӣ, ки сироятҳои yellow fever, dengue, Rift Valley fever ва назоратҳои солим аз Senegal-ро дар бар мегирифтанд, манфӣ буданд ва хосияти клиникӣ %100 буд.

Гарчанде ин натиҷаҳо муҳиманд, прототип ҳанӯз таҳқиқоти васеъмиқёси проспективии ташхисии саҳроӣ нест. Ҳассосияти клиникӣ танҳо дар 30 намунаи зардоби Zaire Ebola-мусбат арзёбӣ шудааст; иҷроиш дар намунаҳои клиникии беморони Sudan Ebola дар ин таҳқиқот нишон дода нашудааст. Илова бар ин, ҳарчанд мушоҳида шудааст, ки тасмаҳои хушк пас аз ҳафт моҳи нигоҳдорӣ дар ҳарорати хонагӣ иҷроиши худро нигоҳ доштаанд, муаллифон ошкоро мегӯянд, ки устуворӣ ба таври систематикӣ омӯхта нашудааст.

Lateral flow immunoassay чист?

Lateral flow immunoassay (LFIA; иммунотаҳлили ҷараёни паҳлуӣ) платформаи тести зуд аст, ки дар он намунаи моеъ бо қувваи капиллярӣ дар рӯйи тасмаи ковок пеш меравад ва дар натиҷаи таъсири мутақобилаи молекулаи ҳадафи дар намуна буда бо реагентҳои муайяни гирифтан/шинохтан хатҳои тестии намоён ё бо дастгоҳ ченшаванда ба вуҷуд меоянд.

Афзалиятҳои муҳими LFIA натиҷаи зуд, истифодаи сода, қобилияти интиқол ва кам шудани вобастагӣ аз лабораторияи марказӣ мебошанд. Ин хусусиятҳо махсусан барои тестҳои point-of-care дар минтақаҳои даромадашон паст ва миёна, ки дастрасӣ ба лаборатория маҳдуд аст, арзишманданд.

Бо вуҷуди ин, дар тестҳои зуд ҳамзамон муайян кардани чанд ҳадаф, нигоҳ доштани ҳассосияти баланд ва паст нигоҳ доштани заминаи ғайриспецификӣ метавонад душвор бошад. Масъалаи муҳандисие, ки таҳқиқот баррасӣ мекунад, маҳз ҳамин аст.

Multiplex ё biplex чӣ маъно дорад?

Multiplex маънои онро дорад, ки дар як тест чанд ҳадаф аз ҳам фарқ карда шуда, чен карда мешаванд. Азбаски дар ин таҳқиқот ду ҳадафи гликопротеини Ebola дар як тасма аз ҳам ҷудо карда мешаванд, система ҳамчун biplex, яъне сохтори multiplex-и дуҳадафа таҳия шудааст.

Афзалияти эҳтимолии тарҳи multiplex танҳо истифодаи як тест ба ҷойи ду тест нест. Бо як ҳаҷми намунаи биологӣ чанд ҳадафро таҳлил кардан мумкин аст; миқдори мембрана, бастабандӣ, назорати сифат ва баъзе реагентҳо метавонад кам карда шавад.

Колицин ва сафедаи иммунитет чист?

Колицинҳо сафедаҳои антибактериявие мебошанд, ки баъзе бактерияҳо барои маҳдуд кардани бактерияҳои рақиб истеҳсол мекунанд. Бактерияи истеҳсолкунандаи колицин ҳамзамон барои муҳофизат аз сафедаи заҳрноки худ сафедаи иммунитет ҳосил мекунад, ки ба он хеле қавӣ ва махсус мепайвандад.

Хусусияти муҳими ин ҷуфтҳои табиӣ аффинитет ва хосияти хеле баланди пайвастшавӣ мебошад. Дар адабиёт барои баъзе ҷуфтҳои колицин–иммунитет доимии диссотсиатсияи тақрибан 10⁻¹⁴ M гузориш шудааст. Барои муқоиса, таъсири мутақобилаи streptavidin–biotin яке аз таъсирҳои мутақобилаи хеле қавии табиии ғайриковалентӣ дар сатҳи тақрибан 10⁻¹⁵ M мебошад.

Ҳадди муҳими тафсир: Ин таҳқиқот K_d-и дақиқи ҷуфтҳои интихобшудаи AP41 ва Khan-ро бо усуле мисли резонанси плазмони рӯизаминӣ чен накардааст. Таҳқиқот дар озмоишҳои функсионалии пайвастшавӣ нишон додааст, ки ин ҷуфтҳо пайвастшавии қавии cognate доранд ва реаксияи салибии non-cognate-и мушоҳидашаванда нишон намедиҳанд. Маълумоти K_d дар сатҳи фемтомолярӣ аз адабиёти пешини колицин–иммунитет гирифта шудааст.

Шинохти bio-orthogonal чаро муфид аст?

Афзалияти асосии COLPLEX барои multiplex он аст, ки чанд ҷуфти гуногуни колицин–иммунитетро бе омехтани ҳамдигар истифода бурдан мумкин аст. Сафедаи иммунитети AP41 ба хатти колицини AP41 ва сафедаи иммунитети Khan ба хатти колицини Khan мепайвандад. Дар озмоишҳои оддии пайвастшавии манбаи Расми 1 ҷуфтҳои cognate сигнали қавӣ доданд, дар ҳоле ки дар комбинацияҳои non-cognate реаксияи салибии муайяншаванда дида нашуд.

Ин хусусият имкон медиҳад, ки антителаҳои гуногуни гирифтан ба сафедаҳои гуногуни иммунитет пайваст шуда, ба хатҳои гуногуни колицин дар тасма равона шаванд. Ба ин тартиб, ба ҷойи он ки як системаи biotin–streptavidin ҳамаи комплексҳои гирифтанро ба як лангари молекулавӣ равона кунад, ҳар ҳадаф тавассути суроғаи молекулавии алоҳида нигоҳ дошта мешавад.

Чаро COLPLEX Метавонад Аз Иммобилизатсияи Мустақими Антитела Ҳассостар Бошад?

Мувофиқи натиҷаҳои таҳқиқоти манбаъ, дар формати COLPLEX таъсири мутақобилаи колицин–иммунитети дорои аффинитети баланд, имкони ташаккули комплексҳои антиген–антитела дар маҳлул ҳангоми ҷараёни паҳлуӣ ва мустақиман хушк нашудани антителаи гирифтан дар рӯйи нитроселлюлоза дар маҷмӯъ бо сигнали баландтари хатти тест ва заминаи пасттари ғайриспецификӣ алоқаманд шудаанд; аммо таҳқиқот озмоиши механизмеро анҷом надодааст, ки саҳми ҳар кадоми онҳоро алоҳида ба таври миқдорӣ ҷудо кунад.

Дар формати классикии мустақим антителаи гирифтан мустақиман дар хатти тести мембранаи нитроселлюлоза иммобилизатсия мешавад. Дар ин равиш конформатсияи антитела ҳангоми хушкшавӣ ва пайвастшавӣ ба сатҳ метавонад тағйир ёбад ва вақти таъсири мутақобила бо антиген бо шароити физикии ҷараёни паҳлуӣ маҳдуд шавад.

Дар равиши COLPLEX антителаҳои гирифтан аввал бо сафедаи иммунитети мувофиқ дар шакли fusion мебошанд. Антиген, антителаи гирифтан ва антителаи муайянкунанда метавонанд ҳангоми ҷараён дар маҳлул комплекс ташкил кунанд. Комплекси ҳосилшуда баъдан тавассути сафедаи иммунитет ба хатти колицини cognate дар тасма хеле қавӣ мепайвандад.

Дар таҳқиқот дар формати COLPLEX нисбат ба формати мустақим миқдори камтари антителаи гирифтан истифода шудааст. Дар бахши муҳокима гуфта шудааст, ки истифодаи тақрибан 0,2–0,3 µg антителаи гирифтании COLPLEX барои ҳар антитела дар муқоиса бо тақрибан 0,5 µg дар формати мустақим ба истеъмоли 1,6–2,5 маротиба камтар реагент мувофиқат мекунад.

Муқоисаи COLPLEX бо streptavidin–biotin

Муҳаққиқон ба сафедаи иммунитети AP41 ҳам нишонаи Renilla luciferase ва ҳам Avi-tag-и қобили биотинизатсия илова карда, пайвастшавии ҳамон сафедаро ба ColAP41-и иммобилизатсияшуда ё streptavidin-и полимерӣ муқоиса кардаанд.

Дар озмоиши ELISA системаи polystreptavidin–biotin сигнали мутлақи баландтар, вале ҳамчунин сигнали заминавии баландтар ҳосил кард. Системаи COLPLEX AP41 бо заминаи пасттар профили пайвастшавии қавӣ нишон дод. Муаллифон ин натиҷаро чунин тафсир мекунанд, ки COLPLEX метавонад платформаи алтернативӣ ё иловагии адаптери дорои аффинитети баланд ба streptavidin–biotin бошад.

Як Тасма Гликопротеинҳои Ebola-и Zaire ва Sudan-ро Чӣ Гуна Фарқ Мекунад?

Дар прототипи biplex гликопротеини Sudan Ebola танҳо комплекси JA7–ImKhan-ро ташкил карда, хатти тести Khan-ро мусбат мекунад; гликопротеини Zaire Ebola бошад, ҳам комплексҳои EE8–ImAP41 ва ҳам JA7–ImKhan-ро ташкил мекунад ва аз ин рӯ ҳар ду хатти тест мусбат мешаванд; агар антиген набошад, танҳо хатти назорат намоён мешавад.

Вазифаи се антителаи асосӣ

Тести хушки дорои нанозарраҳои тилло чӣ гуна иҷро мешавад?

Дар марҳилаи ниҳоии прототип ҳамаи реагентҳо дар рӯйи тасма хушк карда шудаанд. Барои тест 10 µL зардоб ё плазма бо 90 µL буфери мигратсия тунук карда шуда, тасма ба омехта гузошта шудааст. Тест 20 дақиқа инкишоф дода шуда, баъд натиҷа хонда шудааст.

Антителаи муайянкунандаи XC2 ба 40 nm нанозарраҳои тилло пайваст карда шудааст. Fusion-ҳои антителаи гирифтан–иммунитети COLPLEX ва конъюгати XC2-тилло дар падҳои конъюгат хушк карда шудаанд. Дар мембранаи нитроселлюлоза ColAP41 ва ColKhan ҳамчун хатҳои алоҳидаи тест ҷойгир шудаанд.

Тасмаҳои тест бо паҳнои 5 mm бурида шуда, дар бастаҳои пӯшидаи дорои хушккунанда дар ҳарорати хонагӣ нигоҳ дошта шудаанд.

Чаро марҳилаи хемилюминессентӣ гузаронида шуд?

Пеш аз формати ниҳоии хушки дорои нанозарраҳои тилло муҳаққиқон барои тасдиқи меъмории пайвастшавии молекулавӣ бо системаи оптикии ҳассостар озмоишҳои хемилюминессентии бар асоси Renilla luciferase ва NanoLuc гузарониданд.

Дар формати оддии пайвастшавӣ fusion-ҳои RLuc8–иммунитет истифода шуданд; дар формати пурраи иммунотаҳлил fusion-ҳои антителаи гирифтан–иммунитет, антигенҳои гликопротеини Ebola ва антителаи муайянкунандаи XC2, ки NanoLuc дошт, якҷоя истифода шуданд. Ин озмоишҳо барои тасдиқи пайвастшавии интихобии системаҳои AP41 ва Khan ба хатҳои cognate-и худ ва қобилияти кори меъмории multiplex истифода шуданд.

LoB ва LoD Чӣ Маъно Доранд?

Limit of Blank (LoB) ҳадди болоии сигналеро, ки аз намунаҳои blank-и бе антигени ҳадаф интизор шудан мумкин аст; Limit of Detection (LoD) бошад, пасттарин консентратсияи ҳадафро ифода мекунад, ки сигнали тестро аз тақсимоти blank боэътимод фарқ кардан мумкин аст. Дар ин таҳқиқот LoB аз зардоби манфии такроран санҷидашуда ва LoD аз регрессияи логистикии чорпараметрӣ барои консентратсияҳои афзояндаи антиген ва равиши буриши LoB ҳисоб карда шудааст.

Формулаи LoB

\(\mathrm{LoB}=\overline{X}_{\mathrm{Blank}}+(2.58\times SD_{\mathrm{Blank}})\)

Формула чиро ҳисоб мекунад? Ҳадди болоии қарор барои тақсимоти сигнале, ки намунаҳои манфии бе антиген ба вуҷуд меоранд.

\(\overline{X}_{\mathrm{Blank}}\) чист? Миёнаи сигналҳои намунаҳои blank/манфӣ, ки такроран чен шудаанд.

\(SD_{\mathrm{Blank}}\) чист? Инҳирофи стандартии сигналҳои blank.

Чаро 2,58 истифода шудааст? Манбаъ мегӯяд, ки ин коэффисиент ба сатҳи эътимоди %99 мувофиқат мекунад.

Воҳид чист? Дар таҳқиқот сигналҳои хат бо воҳидҳои test line intensity (TLI) арзёбӣ шудаанд.

Барои ҳисоб кардани LoB намунаи зардоби манфӣ 30 маротиба санҷида шудааст.

LoD чӣ гуна ҳисоб шуд?

Манбаъ барои LoD як муодилаи пӯшидаи яксатрӣ намедиҳад. Ба ҷойи ин, консентратсияҳои афзояндаи антиген дар ҳар консентратсия бо n=5 такрор чен карда шуда, робитаи сигнал–консентратсия бо регрессияи логистикии чорпараметрӣ (4PL) моделсозӣ шудааст.

Инҳирофҳои стандартии консентратсияҳои аз LoB боло миёна карда шуданд; аз каҷи ҳосилшуда 2,58 × SD тарҳ карда шуда, каҷи ислоҳшудаи консервативитар ба даст омад ва консентратсияе, ки LoB бо ин каҷи ислоҳшуда мебурад, ҳамчун LoD муайян карда шуд.

Манбаъ дар матни асосӣ муодилаи ошкори математикии функсияи 4PL ё арзишҳои ададии чор параметрро намедиҳад. Аз ин рӯ, дар ин ҷо формула ё арзиши параметри берун аз манбаъ сохта нашудааст.

Шиддати нормализатсияшудаи хатти тест чӣ гуна ҳисоб шуд?

Барои муқоисаи сигналҳои хат аз аксҳои гуногун масоҳати қуллаи хатти тест, ки бо ImageJ чен шудааст, ба масоҳати қуллаи хатти стандарти чопшуда дар ҳамон акс тақсим ва натиҷа ба 1000 зарб карда шудааст.

\(I_{\mathrm{norm}}=\frac{A_{\mathrm{test}}}{A_{\mathrm{standard}}}\times1000\)

\(A_{\mathrm{test}}\): масоҳати қуллаи хатти тест.

\(A_{\mathrm{standard}}\): масоҳати қуллаи хатти стандарти чопшуда дар ҳамон акс.

\(I_{\mathrm{norm}}\): арзиши нисбии сигнали нормализатсияшуда, ки муқоисаи байни аксҳоро осон мекунад.

Ин бузургӣ консентратсияи воқеии антиген нест. Консентратсияи антиген бо силсилаи алоҳидаи таҷрибавии тунуккунӣ муайян шудааст.

Муқоисаи LoB-и COLPLEX ва формати мустақим

Манбаъ мегӯяд, ки сигнали blank-и тестҳои мустақим нисбат ба форматҳои мувофиқи COLPLEX тақрибан 5 маротиба ва 7,5 маротиба баландтар буд. LoB-и пасттар метавонад ҷудо кардани сигнали воқеии тестро аз замина дар консентратсияҳои пасти антиген осон кунад.

Муқоисаи LoD

Бахши натиҷаҳо мегӯяд, ки LoD барои GPSudan “тақрибан 32 маротиба” ва барои GPZaire “15 маротиба” пасттар буд. Дар бахши муҳокима беҳбудии GPSudan баъдан “34 маротиба” гуфта шудааст. Аз сабаби ин фарқи мудавваркунӣ/ифода дар дохили манбаъ, дар матни Verianla арзишҳои мустақим ченшудаи LoD дар боло асос гирифта шудаанд; шумораи нави маротиба сохта нашудааст.

Муқоисаи сигнал дар сатҳи антигени 10 nM

Дар таҳлили миқдории Расми 6-и манбаъ хатти COLPLEX-и асосёфта ба Khan барои 10 nM GPSudan нисбат ба формати мустақим тақрибан 4 маротиба сигнали қавитар ҳосил кардааст. Дар шароити 10 nM GPZaire хатҳои COLPLEX-и асосёфта ба AP41 ва Khan нисбат ба форматҳои мустақими мувофиқ мутаносибан тақрибан 3 маротиба ва 2 маротиба сигнали қавитар додаанд.

Инҳо муқоисаҳои бузургии сигнал барои шароити мушаххаси 10 nM мебошанд; маънои онро надоранд, ки дар ҳамаи консентратсияҳо афзоиши доимии чандкарата мавҷуд аст.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Намунаҳои инсонӣ

Барои арзёбии ҳассосияти клиникӣ 30 намунаи зардоб аз сирояти тасдиқшудаи Zaire Ebola истифода шудааст. Манбаъ ин намунаҳоро аз рӯйи арзишҳои RT-PCR cycle threshold (Ct) чунин гузориш мекунад:

Ёддошт оид ба пешниҳоди манбаъ: Мақола ин гурӯҳҳоро бо нишонаҳои “<” дар боло медиҳад; дар матни асосӣ алоҳида шарҳ дода нашудааст, ки оё ин фосилаҳо синфҳои ба ҳам истиснокунанда, масалан 20–24,99, мебошанд ё не. Аз ин рӯ, нишонаҳо хомӯшона аз нав таъриф нашудаанд.

Дар панели клиникии хосияти манфӣ 40 намунаи зардоб буданд:

• 10 зардоби мусбати вируси yellow fever,
• 10 зардоби мусбати вируси dengue,
• 10 зардоби мусбати вируси Rift Valley fever,
• 10 зардоби назоратии солими эндемикӣ аз Senegal.

Илова бар ин, 50 зардоби солим ва 50 плазмаи EDTA, ки Хадамоти Хуни Фаронса пешниҳод кардааст, махсусан барои сигнали ғайриспецификии хатти тест ва мувофиқати матритса алоҳида арзёбӣ шудаанд.

Усули референсии RT-PCR

RNA-и Zaire Ebola бо маҷмӯаи QuantiTect RT-PCR Master Mix Probe арзёбӣ шудааст. Манбаъ мегӯяд, ки 5 µL RNA ба 20 µL master mix илова шудааст.

Профили гармӣ:

• 50°C барои 10 дақиқа транскрипсияи баръакс,
• 95°C барои 15 дақиқа ғайрифаъолсозии транскриптазаи баръакс ва фаъолсозии DNA полимераза,
• 45 давраи амплификатсия,
• дар ҳар давра 95°C барои 5 сония,
• 60°C барои 50 сония annealing-extension.

Амплификатсияи возеҳи логарифмӣ ва Ct <38 мусбат ҳисобида шудааст. Намунаҳои Ct 38–42 шубҳанок/номуайян арзёбӣ шудаанд; намунаҳое, ки амплификатсияи возеҳи логарифмӣ надоштанд, манфӣ ҳисобида шуданд.

Ct шумораи давраҳои амплификатсияест, ки барои гузаштани сигнали real-time PCR аз ҳадди муайяни флуорессенсия лозим аст. Дар ин таҳқиқот RT-PCR ҳамчун усули референсӣ дар арзёбии клиникии LFIA истифода шудааст.

Интихоби ҷуфтҳои колицин–иммунитет

Ду ҷуфти мустақили сафеда интихоб шуданд:

• Col/Im AP41: Colicin WP_134294768 ва Immunity WP_017002173.
• Col/Im Khan: Colicin WP_036849747 ва Immunity WP_036849748.

Дар бахши усул ҷуфти AP41 аз Pseudomonas aeruginosa AP41 ва ҷуфти Khan аз Photorhabdus khanii гуфта шудааст. Дар бахши натиҷаҳо дар як ҷумлае, ки манбаи AP41-ро тавсиф мекунад, ибораи “Pseudomonas aeruginosa PAO1” истифода шудааст. Ин номувофиқии хурди истилоҳии манбаъ ҳамчун ислоҳшуда нишон дода нашудааст; система дар тамоми мақола бо номи AP41, ки муҳаққиқон истифода кардаанд, ном бурда шудааст.

Истеҳсоли сафедаи рекомбинантӣ

Пайдарпаии DNA, ки доменҳои DNase-и колицин ва сафедаҳои иммунитети мувофиқро рамзгузорӣ мекунанд, ба плазмидҳои экспрессия клониданд. Колицинҳо ҳамчун сафедаҳои fusion-и DNase–mCherry бо нишонаи C-terminal 6×His; сафедаҳои иммунитет ҳамчун fusion-и N-terminal Renilla luciferase бо нишонаи C-terminal 6×His истеҳсол шуданд.

Плазмидҳо ба ҳуҷайраҳои E. coli BL21(DE3) гузаронида шуда, экспрессия дар фазаи миёнаи log бо IPTG индуктсия ва ҳуҷайраҳо пас аз инкубатсияи шабона ҷамъоварӣ шуданд. Сафедаҳои ҳалшаванда аввал бо хроматографияи аффинитетии Ni²⁺-NTA ва сипас бо size-exclusion chromatography пок карда шуданд.

Антителаҳои гирифтании EE8 ва JA7 ва антителаи муайянкунандаи XC2 антителаҳои аз гибридомаи таҳқиқоти пешин мебошанд. Антителаҳои рекомбинантии fusion-и JA7–ImKhan ва EE8–ImAP41 дар ҳуҷайраҳои CHO истеҳсол ва бо Protein A пок карда шуданд.

Истеҳсоли тасма

Тартиби ниҳоии тест бо нанозарраҳои тилло

Дар ҳар тест 10 µL зардоб ё плазма дар 90 µL буфери мигратсия тунук карда шудааст. Буфер 240 mM Tris pH 7,7; 50 mM EDTA; %0,1 казеин ва %0,5 BigCHAP дошт. Тасма ба чоҳак гузошта шуда, тест 20 дақиқа инкишоф дода шудааст.

Тартиби LFIA-и хемилюминессентӣ

Дар формати оддӣ омехтаи реаксия PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 зардоби инсони солим ва 10 nM RLuc8–ImAP41 ва/ё RLuc8–ImKhan дошт.

Дар формати пурра PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 зардоби инсони солим, 10 nM XC2–NanoLuc, 20 nM EE8–ImAP41, 20 nM JA7–ImKhan ва антигени гликопротеини Ebola-и Zaire ё Sudan истифода шуданд.

100 µL омехтаи реаксия дар ҳарорати хонагӣ 15 дақиқа инкубатсия шуда, баъдан тасма 10 дақиқа мигратсия дода шуд. Дар тасвиргирии хемилюминессентӣ барои формати оддӣ 35 сония ва барои формати пурра 75 сония экспозиция истифода шуд.

Тасдиқи хосияти AP41 ва Khan

Дар Расми 1-и манбаъ ҷуфтҳои колицин–иммунитети AP41 ва Khan ҳам дар формати lateral flow ва ҳам дар микропланшет арзёбӣ шуданд. Дар таъсирҳои мутақобилаи cognate сигнали қавӣ ҳосил шуд ва дар ҷуфтҳои муқобил реаксияи салибии non-cognate-и мушоҳидашаванда дида нашуд. Дар ин озмоишҳо хатҳои хато инҳирофи стандартиро нишон дода, N=3 такрор истифода шудааст.

Дар Расми 3-и манбаъ иммунотаҳлили пурраи гликопротеини Ebola дар формати ELISA санҷида шуд. Дар чоҳакҳои бо ColAP41 пӯшонидашуда системаи EE8–ImAP41/GPZaire/XC2–NanoLuc сигнал дод, дар ҳоле ки комплексҳои асосёфта ба Khan сигнал надоданд; дар чоҳакҳои бо ColKhan пӯшонидашуда системаи JA7–ImKhan бо гликопротеини Zaire ё Sudan сигнал дод. Озмоишҳои ELISA бо N=3 ва намоиши LFIA-и хемилюминессентӣ бо N=2 дода шудаанд.

Иҷроиши аналитикӣ

Дар Расми 6-и манбаъ антигенҳои GPZaire ва GPSudan дар консентратсияҳои афзоянда бо COLPLEX ва форматҳои мустақим муқоиса шудаанд. Хатҳои тестии формати COLPLEX дар ҳамаи консентратсияҳои муштараки санҷидашуда сигнали баландтар дода, дар консентратсияҳои пасттар хатҳои визуалӣ муайяншаванда ҳосил карданд.

Барои озмоишҳои COLPLEX дар Расми 6-и манбаъ N=5, барои формати мустақим N=3 такрор истифода шудааст. Хатҳои хато инҳирофи стандартиро нишон медиҳанд.

Пайвастшавии ғайриспецификӣ дар матритсаҳои зардоб ва плазмаи манфӣ

Дар 50 зардоб ва 50 плазмаи EDTA аз донорҳои солими аврупоӣ дар хатҳои тест сигналҳои визуалӣ дида нашуданд. Сигналҳои ҳисобшудаи хатти тест аз ҳадҳои LoB-и муайяншуда барои AP41 ва Khan пасттар монданд.

Манбаъ мегӯяд, ки байни матритсаҳои зардоб ва плазмаи EDTA фарқи равшан мушоҳида нашуд ва ин натиҷаро ҳамчун дастгирии қобилияти кори прототип дар намудҳои гуногуни намунаҳои клиникӣ тафсир мекунад.

Бо вуҷуди ин, ин 100 намуна панели хосияти клиникӣ нест, ки ҳамаи интерференсияҳои эҳтимолии аз сироятҳои ғайри Ebola пайдошавандаро месанҷад. Барои ин мақсад панели клиникии манфии 40-зардобӣ, ки намунаҳои yellow fever, dengue ва Rift Valley fever-ро дар бар мегирифт, алоҳида истифода шуд.

Ҳассосияти %96,7 ва Хосияти %100 дар Намунаҳои Клиникӣ Чӣ Маъно Доранд?

Дар панели клиникии таҳқиқот аз 30 зардоби RT-PCR-мусбати Zaire Ebola, 29-то бо COLPLEX мусбат ва якто манфӣ буд; ҳамаи 40 зардоби EBOV-манфӣ манфӣ буданд. Дар ин маҷмӯи намунаҳо ҳассосияти гузоришшуда дар бахши натиҷаҳо %96,7 ва хосият %100 аст; аммо азбаски ҳамагӣ 30 намунаи мусбат буд, ин нишондиҳандаҳо бояд дар популятсияҳои саҳроии калонтар ва проспективӣ алоҳида тасдиқ шаванд.

Ҳассосият

Намоиши математикии таърифи манбаъ:

\(\mathrm{Duyarlılık}=\frac{TP}{TP+FN}\times100\)

Дар ин ҷо TP мусбати дуруст ва FN шумораи намунаҳои манфии бардурӯғ аст.

Дар таҳқиқот:

\(\frac{29}{29+1}\times100\approx96.7\%\)

Дар бахши натиҷаҳо фосилаи эътимоди %95 %83,3–99,9 гузориш шудааст.

Хосият

Намоиши математикии таърифи манбаъ:

\(\mathrm{Özgüllük}=\frac{TN}{TN+FP}\times100\)

Дар ин ҷо TN манфии дуруст ва FP шумораи намунаҳои мусбати бардурӯғ аст.

Дар панели клиникии 40-нафараи EBOV-манфӣ:

\(\frac{40}{40+0}\times100=100\%\)

Дар бахши муқаддима фосилаи эътимоди %95 барои хосият %88,43–100,00 дода шудааст.

Як намунаи манфии бардурӯғ

Намунаи зардоби бо коди COY2117 бо RT-PCR EBOV-мусбат буд, аммо аз ҷониби biplex LFIA муайян нашуд. Манбаъ арзиши RT-PCR Ct-и ин намунаро 25,21 медиҳад ва натиҷаро ҳамчун манфии бардурӯғ гурӯҳбандӣ мекунад.

Ин намуна ошкоро нишон медиҳад, ки прототип ҳассосияти клиникии %100 надорад.

Муқоисаи дохилиманбаъӣ бо тестҳои тези мавҷудаи Ebola

Муаллифон натиҷаҳои COLPLEX-и худро бо арзишҳои LoD-и таҳқиқоти қаблан нашршудаи Ebola LFIA муқоиса карданд. Ин муқоиса таҳқиқоти head-to-head дар як озмоиш нест; он муқоисаи контекстии арзишҳои аналитикии LoD аз нашрияҳои гуногун мебошад.

Муқоисаи дохилиманбаъӣ бо профили ҳадафии маҳсулоти WHO

Дар бахши муҳокима муаллифон гузориш мекунанд, ки дар як мета-таҳлили пешин барои тестҳои тези ташхисии антигени Ebola ҳассосият ва хосияти якҷояшуда мутаносибан %82,1 ва %97,0 буданд ва онҳоро бо ҳадафҳои >%95 ҳассосият ва >%98 хосият, ки барои профили ҳадафии маҳсулоти ташхисии Ebola-и WHO истифода мешаванд, муқоиса мекунанд.

Муаллифон мегӯянд, ки ҳассосияти %96,7 ва хосияти %100 дар панели клиникии 30 мусбат ва 40 манфии онҳо ба ин ҳадафҳо мувофиқат мекунанд. Аммо ин маънои тасдиқи прототип аз ҷониби WHO ё омодагӣ барои истифодаи васеи саҳроиро надорад; таҳқиқот чунин тасдиқи танзимгариро гузориш намекунад.

Мушоҳидаҳои истеҳсолпазирӣ ва устуворӣ

Гузориш шудааст, ки колицинҳо ва сафедаҳои иммунитет дар системаи E. coli дар сатҳи 14–35 mg/L культура истеҳсол карда мешаванд. Ҳосилнокии истеҳсоли антителаҳои гирифтан, ки бо сафедаи иммунитет fusion шудаанд, дар ҳуҷайраҳои CHO низ бо антителаҳои анъанавӣ муқоисашаванда гуфта шудааст.

Гузориш шудааст, ки тасмаҳои хушки тест пас аз 7 моҳ нигоҳдорӣ дар шароити хушк ва ҳарорати хонагӣ иҷроиши худро нигоҳ дошта, афзоиши сигнали заминавӣ дида нашудааст. Аммо муаллифон ошкоро мегӯянд, ки устуворӣ систематикӣ таҳқиқ нашудааст. Аз ин рӯ, мушоҳидаи ҳафтмоҳа набояд ҳамчун муҳлати эътибори валидатсияшуда тафсир шавад.

Соҳаҳои истифодаи пешниҳодшуда дар оянда

Муаллифон пешбинӣ мекунанд, ки колицинҳо метавонанд дар кассетаҳои стандартии LFIA ҳамчун суроғаҳои универсалии молекулавӣ истифода шаванд ва антителаҳои fusion-и сафедаи иммунитет, ки ба ҳадафҳои гуногун махсусанд, баъдтар дар ҳамон меъмории асосии тасма истифода шаванд.

Ҳамчунин пешниҳод мешавад, ки COLPLEX танҳо бо иммунотаҳлилҳо маҳдуд набошад; агар сафедаҳои иммунитет ба ҷойи антитела ба олигонуклеотидҳо, ба мисли primer ё probe, пайваст шаванд, маҳсулоти амплификатсияи изотермалии кислотаи нуклеинӣ, ба мисли RPA ё LAMP, низ метавонанд дар формати multiplex lateral flow гирифта шаванд.

Ин бахш пешниҳоди технологӣ барои оянда аст. Тести молекулавии COLPLEX-асоси RPA ё LAMP дар ин мақола таҷрибавӣ таҳия ва тасдиқ нашудааст.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

• Ҷуфтҳои колицин–иммунитети AP41 ва Khan дар ин тарҳи таҷрибавӣ бо пайвастшавии қавии cognate ва бе реаксияи салибии non-cognate-и мушоҳидашаванда кор карданд.
• Ду ҷуфти алоҳидаи COLPLEX метавонанд дар як тасмаи LFIA хатҳои молекулавии мустақили тестӣ созанд.
• Прототипи COLPLEX тавонист гликопротеинҳои Ebola-и Zaire ва Sudan-ро бо намунаҳои гуногуни хат фарқ кунад.
• Формати COLPLEX нисбат ба иммобилизатсияи мустақими антитела сигнали blank-и пасттар ва LoD-и пасттар ҳосил кард.
• Аз 30 намунаи клиникии зардоби RT-PCR-мусбати Zaire Ebola, 29-то аз ҷониби прототип мусбат муайян шуданд.
• Ҳамаи 40 намунаи клиникии зардоби EBOV-манфӣ манфӣ буданд.
• Дар 50 зардоби солим ва 50 плазмаи EDTA-и солим дар хатҳои тест сигнали мусбати ғайриспецификӣ дида нашуд.
• COLPLEX бо миқдори камтари антителаи гирифтан кор карда тавонист.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

• Исбот нашудааст, ки прототип дар ҳамаи хуруҷҳои Ebola бо ҳассосияти %96,7 кор мекунад.
• Ҳассосияти клиникӣ дар зардоби беморони воқеии Sudan Ebola дар ин таҳқиқот чен нашудааст.
• Иҷроиши клиникии аз 30 намунаи мусбат ва 40 манфӣ гирифташуда ҷойгузини валидатсияи васеъмиқёси проспективии саҳроӣ нест.
• Муҳлати дақиқи эътибори COLPLEX муайян нашудааст.
• Арзишҳои дақиқи K_d-и ҷуфтҳои интихобшудаи AP41 ва Khan дар ин таҳқиқот мустақиман чен нашудаанд.
• Исбот нашудааст, ки COLPLEX дар ҳамаи сенарияҳои истифода аз streptavidin–biotin беҳтар аст.
• Ҳисоб нашудааст, ки хароҷоти истеҳсол дар миқёси воқеии саноатӣ чӣ қадар кам мешавад.
• Барои прототип тасдиқи танзимгарӣ ё иҷозати истифодаи мунтазами клиникӣ гузориш нашудааст.
• Татбиқи молекулавии COLPLEX-асоси RPA/LAMP дар ин мақола таҷрибавӣ тасдиқ нашудааст.

Маҳдудиятҳои асосӣ

Шумораи намунаҳои клиникии мусбат: Барои Zaire Ebola танҳо 30 намунаи зардоби RT-PCR-мусбат арзёбӣ шудааст. Васеъ будани фосилаи эътимоди ҳассосият номуайянии намунаи хурдро инъикос мекунад.

Валидатсияи клиникии Sudan Ebola: Гарчанде гликопротеини Sudan дар озмоишҳои антигени рекомбинантӣ/spike бомуваффақият муайян шуд, ҳассосияти ташхисӣ бо намунаҳои клиникии беморони Sudan Ebola нишон дода нашудааст.

Оптимизатсияи муқоисаи формат: Муаллифон ҳамон антителаи муайянкунандаи XC2-тиллоро дар ҳар ду формат истифода кардаанд, вале гуфтаанд, ки шароити таҷрибавӣ барои формати COLPLEX оптимизатсия шудааст. Оптимизатсияи алоҳидаи миқдори конъюгат дар формати мустақим метавонад заминаро кам кунад; аммо муаллифон муҳокима мекунанд, ки ин метавонад сигналро низ кам кунад.

Устуворӣ: Мушоҳидаи мусбати нигоҳдории ҳафтмоҳа вуҷуд дорад, аммо таҳқиқоти систематикии устуворӣ нест.

Муқоисаи LoD бо нашрияҳои гуногун: Муқоиса бо тестҳои тези пешина дар Ҷадвали 2-и манбаъ тести head-to-head дар як озмоиши стандартӣ нест.

Фарқҳои ифодаи ададӣ дар дохили манбаъ: Ҳассосияти клиникӣ дар бахшҳои муқаддима ва натиҷаҳо бо мудавваркунӣ/форматҳои гуногуни фосилаи эътимод дода шудааст; беҳбудии LoD-и Sudan низ дар натиҷаҳо тақрибан 32 маротиба ва дар муҳокима 34 маротиба гуфта шудааст.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Унвони аслӣ: COLPLEX: A high-affinity protein adaptor for enhanced sensitivity and multiplex lateral flow immunoassays. application to ebola virus strain detection

Муаллифон: Romain Clément; Céline Couturier; Oumar Ndiaye; Cheikh Talibouya Touré; Frank William Mendy; Moussa Dia; Stéphanie Geoffroy; Anely Tranchot; Natacha Mariano; Stéphanie Donnat; Charlotte Mignon; Benoît Beitz; Alejandra Mier; Joseph Robert Anderson Fitchett; Oumar Faye; Cheikh Tidiane Diagne; Oxana Vratskikh; Christophe Védrine.

Corresponding author: Christophe Védrine.

Саҳми баробар: Дар манбаи баррасишуда изҳороти саҳми баробар/муаллифи якуми баробар вуҷуд надорад.

Муассиса a: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 40 avenue Tony Garnier, Lyon 69007, France.

Муассиса b: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 28 rue du Docteur Roux, Paris 75015, France.

Муассиса c: DIATROPIX, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Муассиса d: Virology Department, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Муассиса e: Executive Office, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Маҷалла: Sensors and Actuators B: Chemical.

Ҷилд / санаи нашр / рақами мақола: Ҷилд 454, 1 майи 2026, 139608.

Санаи нашри онлайн: 5 феврали 2026.

Санаи дарёфт: 6 ноябри 2025.

Санаи бознигарӣ: 30 январи 2026.

Санаи пазируфтан: 4 феврали 2026.

DOI: 10.1016/j.snb.2026.139608.

Ношир: Elsevier B.V.

Навъи манбаъ: Мақолаи таҳқиқотии аз баррасии ҳамтоён гузашта; таҳияи biosensor/LFIA, тавсифи аналитикӣ ва валидатсияи намунаҳои клиникӣ.

Литсензия: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Усули асосии референсии клиникӣ: Zaire Ebola RT-PCR.

Муқоисаи асосии аналитикӣ: COLPLEX-асоси biplex LFIA ва biplex LFIA, ки дар он антителаҳои гирифтан мустақиман дар нитроселлюлоза иммобилизатсия шудаанд.

Ҳадафҳои тест: Гликопротеини Ebola-и Zaire ва гликопротеини Ebola-и Sudan.

Адаптерҳои асосии молекулавӣ: ColAP41–ImAP41 ва ColKhan–ImKhan.

Антителаҳои асосии гирифтан: EE8 ва JA7.

Антителаи асосии муайянкунанда: XC2.

Системаи муайянкунии визуалӣ: Конъюгати нанозарраҳои тиллои 40 nm.

Системаҳои оптикии марҳилаи таҳия: Хемилюминессенсияи асосёфта ба RLuc8 ва NanoLuc.

Таҳлили тасвир ва хат: Chemidoc, ImageJ ва Image Lab.

Нармафзори оморӣ: GraphPad Prism 10.0.

Усули LoB: Аз 30 ченкунии такрории зардоби манфӣ MeanBlank + 2,58 × SDBlank; сатҳи эътимоди %99.

Усули LoD: Дар ҳар консентратсия n=5 ченкунӣ, регрессияи логистикии чорпараметрӣ, ислоҳи инҳирофи стандартӣ ва буриши LoB бо каҷи ислоҳшуда.

Панели ҳассосияти клиникӣ: 30 намунаи зардоби RT-PCR-мусбати Zaire Ebola; 29 мусбати дуруст, 1 манфии бардурӯғ.

Панели хосияти клиникӣ: 40 зардоби EBOV-манфӣ; 10 yellow fever, 10 dengue, 10 Rift Valley fever, 10 назорати солим аз Senegal; ҳама манфӣ.

Панели иловагии матритса/пайвастшавии ғайриспецификӣ: 50 зардоби солим ва 50 плазмаи EDTA аз донорҳои солим дар Аврупо.

Этика: Таҳқиқот мувофиқи принсипҳои Эъломияи Хелсинки анҷом дода шуда, намунаҳо пеш аз таҳлил беидентификатсия шуданд. Гуфта шудааст, ки барои намунаҳои Ebola тасдиқи алоҳидаи IRB талаб нашуд, зеро онҳо дар ҷараёни вазифаи посухи изтирории мақомоти миллии тандурустӣ аз идоракунии муқаррарии ҳолатҳо гирифта шуданд; беморон барои тести Ebola розигии шифоҳӣ доданд ва намунаҳо баъдан дар биобонки референсӣ нигоҳ дошта шуданд. Намунаҳои дигари табҳои геморрагӣ ва донорҳои солим аз фаъолиятҳои назоратии дорои тасдиқи дахлдори этикӣ боқӣ мондаанд.

Дастрасии маълумот: Гуфта шудааст, ки маълумот бо дархости асоснок дода мешавад.

Изҳороти маблағгузорӣ: Дар PDF-и асосии баррасишуда бахши алоҳидаи Funding ё изҳороти махсуси маблағгузорӣ вуҷуд надорад; аз ин рӯ манбаи маблағгузорӣ сохта нашудааст.

Изҳороти зеҳни сунъӣ: Дар PDF-и асосии баррасишуда изҳороти алоҳида оид ба истифодаи зеҳни сунъии тавлидӣ вуҷуд надорад.

Бархӯрди манфиатҳо: Гузориш шудааст, ки патенти WO2020104397A1-и Christophe Védrine бо унвони “Methods and reagents for multiplex binding experiments” аз номи BIOASTER дар ҳолати интизорӣ аст. Дигар муаллифон манфиати молиявии рақобаткунанда ё муносибати шахсии маълумеро, ки метавонад ба таҳқиқот таъсир расонда бошад, гузориш накардаанд.

Саҳмҳои CRediT: Oumar Faye — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Resources, Investigation, Formal analysis; Cheikh Talibouya Touré — Resources, Investigation, Data curation; Joseph Robert Anderson Fitchett — Writing – review & editing, Validation; Anely Tranchot — Visualization, Investigation, Formal analysis; Christophe Védrine — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Formal analysis, Conceptualization; Stéphanie Geoffroy — Visualization, Validation, Investigation, Formal analysis; Oxana Vratskikh — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Supervision, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Moussa Dia — Resources, Investigation, Data curation; Cheikh Tidiane Diagne — Writing – review & editing, Validation, Resources, Investigation, Formal analysis; Frank William Mendy — Resources, Investigation, Data curation; Benoît Beitz — Visualization, Investigation, Formal analysis; Romain Clément — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Charlotte Mignon — Visualization, Supervision, Methodology, Formal analysis; Stéphanie Donnat — Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Natacha Mariano — Writing – original draft, Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Oumar Ndiaye — Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis; Alejandra Mier — Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Conceptualization; Céline Couturier — Visualization, Investigation, Formal analysis.

Номувофиқии миқдории дохилиманбаъӣ 1: Дар бахши муқаддима/хулосаи аввал барои 29/30 намунаи клиникии мусбат ҳассосият %96,6 ва фосилаи эътимод %82,24–99,91 навишта шудааст, вале дар бахши натиҷаҳо %96,7 ва %95 CI %83,3–99,9 дода шудааст. Нисбати хоми асосӣ 29/30 мебошад.

Номувофиқии миқдории дохилиманбаъӣ 2: Беҳбудии LoD-и GPSudan дар бахши натиҷаҳо тақрибан 32 маротиба ва дар бахши муҳокима 34 маротиба гуфта шудааст. Арзишҳои мустақим гузоришшудаи LoD 0,065 nM / 2,2 ng/mL ва 2,10 nM / 70,98 ng/mL мебошанд.

Ёддошти истилоҳии дохилиманбаъӣ: Дар бахши усул ҷуфти AP41 ҳамчун аз Pseudomonas aeruginosa AP41 гирифташуда тавсиф мешавад, аммо дар як ҷойи бахши натиҷаҳо ибораи Pseudomonas aeruginosa PAO1 истифода шудааст. Матни Verianla ин номуайяниро васеъ накарда, номи canonical-и ҷуфт дар дохили таҳқиқот — AP41-ро истифода кардааст.

Бозсозии визуалӣ: Меъмории тест дар Расми 4-и манбаъ дар асоси муносибатҳои манбаъ бо композицияи графикии дигар ҳамчун inline SVG аз нав сохта шудааст. Графикҳои миқдории консентратсия дар Расмҳои 6–7 бо интерполятсияи сохта кашида нашудаанд, зеро ҳамаи координатаҳои нуқтаҳои хом дар матни асосӣ вуҷуд надоранд; LoB, LoD ва натиҷаҳои клиникии ошкоро гузоришшуда дар ҷадвалҳои HTML пешниҳод шудаанд.

Ҳадди асосии тафсир: COLPLEX прототипест, ки дар ин таҳқиқот иҷроиши қавии аналитикӣ ва аввалияи намунаҳои клиникиро нишон додааст. Натиҷаҳо нишон намедиҳанд, ки дастгоҳ дар ҳамаи шароити хуруҷи Ebola ҳамон иҷроишро хоҳад дошт, дар беморони Sudan Ebola клиникӣ тасдиқ шудааст, тасдиқи танзимгарӣ гирифтааст ё муҳлати дарози валидатсияшудаи нигоҳдорӣ дорад.