COLPLEX, lateral flow immunoassaylerde hedef antijenleri yakalamak için kolisin adı verilen bakteriyel proteinler ile bunlara özgü immünite proteinleri arasındaki çok yüksek afiniteli ve birbirinden ayrıştırılabilir protein-protein etkileşimlerini kullanan bir moleküler adaptör sistemidir. Bu çalışma COLPLEX'i, Zaire ve Sudan Ebola virüsü glikoproteinlerini aynı lateral akış şeridinde birbirinden ayırt edebilen biplex LFIA prototipine entegre etmiş; sistemi protein bağlanma deneyleri, ELISA, kemilüminesans LFIA, altın nanoparçacıklı kuru LFIA, analitik tespit sınırı deneyleri ve insan serum/plazma örnekleriyle değerlendirmiştir.

Temel mimaride iki birbirine çapraz reaksiyon göstermeyen kolisin–immünite çifti kullanılmıştır. ColAP41–ImAP41 sistemi Zaire Ebola glikoproteinine özgü EE8 yakalama antikoru ile, ColKhan–ImKhan sistemi ise Zaire ve Sudan glikoproteinlerini tanıyabilen JA7 yakalama antikoru ile eşleştirilmiştir. Her iki hedef için XC2 adlı ortak tespit antikoru kullanılmıştır. Bu tasarım sayesinde Sudan glikoproteini yalnız Khan test çizgisini, Zaire glikoproteini ise hem AP41 hem Khan test çizgisini oluşturur. Böylece tek şeritte iki farklı sinyal deseniyle hedef ayrımı yapılabilir.

Altın nanoparçacık kullanan kuru LFIA formatında COLPLEX prototipinin Zaire Ebola glikoproteini için tespit sınırı 0,034 nM (1,1 ng/mL), doğrudan antikor immobilizasyonlu karşılaştırma formatında ise 0,47 nM (15,18 ng/mL) olarak raporlanmıştır. Sudan Ebola glikoproteini için COLPLEX tespit sınırı 0,065 nM (2,2 ng/mL), doğrudan formatta 2,10 nM (70,98 ng/mL) bulunmuştur. COLPLEX ayrıca daha düşük blank sinyali ve daha görünür test çizgileri üretmiştir.

Klinik değerlendirmede daha önceki Ebola salgınlarından alınmış RT-PCR pozitif 30 Zaire Ebola serum örneğinin 29'u COLPLEX biplex prototipi tarafından pozitif bulunmuş, bir RT-PCR pozitif örnek yanlış negatif kalmıştır. Sonuç bölümünde duyarlılık %96,7 (%95 güven aralığı: %83,3–99,9) olarak raporlanmıştır. Sarı humma, dengue, Rift Valley fever enfeksiyonlarını ve Senegal'den sağlıklı kontrolleri içeren 40 EBOV-negatif serum örneğinin tamamı negatif bulunmuş ve klinik özgüllük %100 olmuştur.

Bu sonuçlar önemli olmakla birlikte prototip henüz geniş ölçekli prospektif saha tanı çalışması değildir. Klinik duyarlılık yalnız 30 Zaire Ebola pozitif serum örneğinde değerlendirilmiştir; Sudan Ebola için klinik hasta örneği performansı bu çalışmada gösterilmemiştir. Ayrıca kuru şeritlerin yedi aylık oda sıcaklığı saklamasında performansın korunduğu gözlenmiş olsa da yazarlar stabilitenin sistematik biçimde incelenmediğini açıkça belirtmektedir.

Lateral flow immunoassay nedir?

Lateral flow immunoassay (LFIA; lateral akış immünoassayi), sıvı örneğin gözenekli bir şerit üzerinde kapiler kuvvetle ilerlediği ve örnekte bulunan hedef molekülün belirli yakalama/tanıma reaktifleriyle etkileşmesi sonucunda görünür veya cihazla ölçülebilir test çizgileri oluşturduğu hızlı test platformudur.

LFIA'ların önemli avantajları hızlı sonuç, basit kullanım, taşınabilirlik ve merkezi laboratuvara bağımlılığın azalmasıdır. Bu özellikler özellikle laboratuvar erişiminin sınırlı olduğu düşük ve orta gelirli bölgelerde point-of-care testler açısından değerlidir.

Bununla birlikte hızlı testlerde aynı anda birden fazla hedefi tespit etmek, yüksek duyarlılığı korumak ve nonspesifik arka planı düşük tutmak zor olabilir. Çalışmanın araştırdığı mühendislik problemi tam olarak budur.

Multiplex veya biplex ne demektir?

Multiplex, aynı test içinde birden fazla hedefin birbirinden ayrılarak ölçülmesini ifade eder. Bu çalışmada iki Ebola glikoprotein hedefi aynı şerit üzerinde ayrıştırıldığı için sistem biplex, yani iki hedefli bir multiplex yapı olarak geliştirilmiştir.

Multiplex tasarımın potansiyel avantajı yalnız iki ayrı test yerine tek test kullanmak değildir. Aynı biyolojik örnek hacmiyle birden fazla hedef analiz edilebilir; kullanılan membran, ambalaj, kalite kontrol ve bazı reaktif miktarları azaltılabilir.

Kolisin ve immünite proteini nedir?

Kolisinler, bazı bakterilerin rakip bakterileri baskılamak amacıyla ürettiği antibakteriyel proteinlerdir. Kolisini üreten bakteri aynı zamanda kendi toksik proteininden korunmak için ona son derece güçlü ve özgül biçimde bağlanan bir immünite proteini üretir.

Bu doğal çiftlerin önemli özelliği çok yüksek bağlanma afinitesi ve özgüllüğüdür. Literatürde bazı kolisin–immünite çiftleri için yaklaşık 10⁻¹⁴ M düzeyinde ayrışma sabitleri bildirilmiştir. Karşılaştırma amacıyla streptavidin–biyotin etkileşimi yaklaşık 10⁻¹⁵ M düzeyindeki çok güçlü doğal nonkovalent etkileşimlerden biridir.

Önemli yorum sınırı: Bu çalışma seçilen AP41 ve Khan çiftlerinin kesin K_d değerini yüzey plazmon rezonansı gibi bir yöntemle ölçmemiştir. Çalışma, fonksiyonel bağlanma deneylerinde bu çiftlerin güçlü cognate bağlanma ve gözlenebilir non-cognate çapraz reaksiyon göstermediğini ortaya koymuştur. Femtomolar düzeyindeki K_d bilgisi önceki kolisin–immünite literatüründen gelmektedir.

Bio-orthogonal tanıma neden yararlı?

COLPLEX'in multiplex açısından ana avantajı, birden fazla farklı kolisin–immünite çiftinin birbirini karıştırmadan kullanılabilmesidir. AP41 immünite proteini AP41 kolisin çizgisine, Khan immünite proteini ise Khan kolisin çizgisine bağlanır. Kaynak Şekil 1'de yapılan basit bağlanma deneylerinde cognate çiftler güçlü sinyal verirken non-cognate kombinasyonlarda tespit edilebilir çapraz reaksiyon görülmemiştir.

Bu özellik, farklı yakalama antikorlarının farklı immünite proteinlerine bağlanarak şerit üzerinde farklı kolisin çizgilerine yönlendirilmesine olanak sağlar. Böylece tek bir biyotin–streptavidin sisteminin bütün yakalama komplekslerini aynı moleküler çapa yönlendirmesi yerine, her hedef ayrı moleküler adres üzerinden tutulabilir.

COLPLEX Neden Doğrudan Antikor İmmobilizasyonundan Daha Duyarlı Olabildi?

Kaynak çalışmanın sonuçlarına göre COLPLEX formatında yüksek afiniteli kolisin–immünite etkileşimi, antijen–antikor komplekslerinin lateral akış sırasında çözelti içinde oluşabilmesi ve yakalama antikorunun nitroselüloz üzerine doğrudan kurutulmaması birlikte daha yüksek test çizgisi sinyali ve daha düşük nonspesifik arka planla ilişkilendirilmiştir; ancak çalışma bu katkıların her birini ayrı ayrı nicel olarak izole eden bir mekanizma deneyi yapmamıştır.

Klasik doğrudan formatta yakalama antikoru nitroselüloz membranın test çizgisine doğrudan immobilize edilir. Bu yaklaşımda antikorun kuruma ve yüzeye bağlanma sırasında konformasyonu etkilenebilir ve antijenle etkileşim süresi lateral akışın fiziksel koşullarıyla sınırlanabilir.

COLPLEX yaklaşımında yakalama antikorları önce ilgili immünite proteinine füzyon hâlindedir. Antijen, yakalama antikoru ve tespit antikoru akış sırasında çözelti içinde kompleks oluşturabilir. Oluşan kompleks daha sonra immünite proteini üzerinden şeritteki cognate kolisin çizgisine çok güçlü biçimde bağlanır.

Çalışmada COLPLEX formatında doğrudan formata göre daha düşük yakalama antikoru miktarı kullanılmıştır. Tartışma bölümünde her antikor için yaklaşık 0,2–0,3 µg COLPLEX yakalama antikoru kullanımının, doğrudan formattaki yaklaşık 0,5 µg ile karşılaştırıldığında 1,6–2,5 kat daha az reaktif tüketimine karşılık geldiği belirtilmiştir.

COLPLEX ile streptavidin–biyotin karşılaştırması

Araştırmacılar AP41 immünite proteinine hem Renilla luciferase etiketi hem de biyotinlenebilir Avi-tag ekleyerek aynı proteinin immobilize ColAP41'e veya polimerik streptavidine bağlanmasını karşılaştırmıştır.

ELISA deneyinde polistreptavidin–biyotin sistemi daha yüksek mutlak sinyal üretmiş, fakat daha yüksek arka plan sinyali de göstermiştir. COLPLEX AP41 sistemi daha düşük arka planla güçlü bir bağlanma profili oluşturmuştur. Yazarlar bu sonucu COLPLEX'in streptavidin–biyotine alternatif veya tamamlayıcı bir yüksek-afinite adaptör platformu olabileceği şeklinde yorumlamaktadır.

Tek Bir Şerit Zaire ve Sudan Ebola Glikoproteinlerini Nasıl Ayırıyor?

Biplex prototipte Sudan Ebola glikoproteini yalnız JA7–ImKhan kompleksini oluşturarak Khan test çizgisini pozitif yaparken, Zaire Ebola glikoproteini hem EE8–ImAP41 hem JA7–ImKhan komplekslerini oluşturduğu için iki test çizgisini birden pozitif yapar; antijen yoksa yalnız kontrol çizgisi görünür.

Üç temel antikorun görevi

Kuru altın nanoparçacıklı test nasıl uygulanıyor?

Son prototip aşamasında reaktiflerin tamamı şerit üzerinde kuru hâle getirilmiştir. Test için 10 µL serum veya plazma, 90 µL migrasyon tamponu ile seyreltilmiş ve şerit karışıma yerleştirilmiştir. Test 20 dakika geliştirilmiş ve daha sonra sonuç okunmuştur.

XC2 tespit antikoru 40 nm altın nanoparçacıklara bağlanmıştır. COLPLEX yakalama antikor–immünite füzyonları ile XC2-altın konjugatı konjugat pedlerinde kurutulmuştur. Nitroselüloz membranda ColAP41 ve ColKhan ayrı test çizgileri olarak yer almıştır.

Test şeritleri 5 mm genişliğinde kesilmiş ve kurutucu içeren kapalı torbalarda oda sıcaklığında saklanmıştır.

Kemilüminesans geliştirme aşaması neden yapıldı?

Altın nanoparçacıklı nihai kuru format öncesinde araştırmacılar moleküler bağlanma mimarisini daha hassas bir optik okuma sistemiyle doğrulamak için Renilla luciferase ve NanoLuc tabanlı kemilüminesans deneyleri yürütmüştür.

Basit bağlanma formatında RLuc8–immünite füzyonları kullanılmış; tam immünoassay formatında ise yakalama antikoru–immünite füzyonları, Ebola glikoprotein antijenleri ve NanoLuc taşıyan XC2 tespit antikoru birlikte kullanılmıştır. Bu deneyler AP41 ve Khan sistemlerinin kendi cognate test çizgilerine seçici biçimde bağlandığını ve multiplex mimarinin çalışabildiğini doğrulamak için kullanılmıştır.

LoB ve LoD Ne Anlama Geliyor?

Limit of Blank (LoB), hedef antijen bulunmayan blank örneklerden beklenebilecek üst sinyal sınırını; Limit of Detection (LoD) ise test sinyalinin blank dağılımından güvenilir biçimde ayrılabildiği en düşük hedef konsantrasyonunu temsil eder. Bu çalışmada LoB tekrar test edilen negatif serumdan, LoD ise artan antijen konsantrasyonlarına uygulanan dört parametreli lojistik regresyon ve LoB kesişimi yaklaşımından hesaplanmıştır.

LoB formülü

\(\mathrm{LoB}=\overline{X}_{\mathrm{Blank}}+(2.58\times SD_{\mathrm{Blank}})\)

Formül neyi hesaplar? Antijen içermeyen negatif örneklerin oluşturduğu sinyal dağılımının üst karar sınırını.

\(\overline{X}_{\mathrm{Blank}}\) nedir? Tekrar ölçülen blank/negatif örnek sinyallerinin ortalamasıdır.

\(SD_{\mathrm{Blank}}\) nedir? Blank sinyallerinin standart sapmasıdır.

2,58 neden kullanılmıştır? Kaynak bu katsayının %99 güven düzeyine karşılık geldiğini belirtmektedir.

Birim nedir? Çalışmada çizgi sinyalleri test line intensity (TLI) birimleri üzerinden değerlendirilmiştir.

LoB hesaplaması için negatif serum örneği 30 kez test edilmiştir.

LoD nasıl hesaplandı?

Kaynak LoD için tek satırlık kapalı bir denklem vermemektedir. Bunun yerine artan antijen konsantrasyonları her konsantrasyon için n=5 tekrar ile ölçülmüş ve sinyal-konsantrasyon ilişkisi dört parametreli lojistik regresyon (4PL) ile modellenmiştir.

LoB üzerindeki konsantrasyonların standart sapmaları ortalanmış; oluşturulan eğriden 2,58 × SD çıkarılarak daha muhafazakâr bir düzeltilmiş eğri elde edilmiş ve LoB ile bu düzeltilmiş eğrinin kesiştiği konsantrasyon LoD olarak belirlenmiştir.

Kaynak 4PL fonksiyonunun açık matematiksel denklemini veya dört parametrenin sayısal değerlerini ana metinde vermemektedir. Bu nedenle burada kaynak dışı bir 4PL formülü veya parametre değeri oluşturulmamıştır.

Normalize test çizgisi yoğunluğu nasıl hesaplandı?

Farklı fotoğraflarda elde edilen çizgi sinyallerini karşılaştırabilmek için test çizgisinin ImageJ ile ölçülen pik alanı, her fotoğrafta bulunan basılı standart çizginin pik alanına bölünmüş ve sonuç 1000 ile çarpılmıştır.

\(I_{\mathrm{norm}}=\frac{A_{\mathrm{test}}}{A_{\mathrm{standard}}}\times1000\)

\(A_{\mathrm{test}}\): test çizgisinin pik alanı.

\(A_{\mathrm{standard}}\): aynı fotoğraftaki basılı standart çizginin pik alanı.

\(I_{\mathrm{norm}}\): fotoğraflar arası karşılaştırmayı kolaylaştıran normalize edilmiş göreli sinyal değeri.

Bu büyüklük gerçek antijen konsantrasyonu değildir. Antijen konsantrasyonu ayrı deneysel dilüsyon serisi üzerinden tanımlanmıştır.

COLPLEX ile doğrudan formatın LoB karşılaştırması

Kaynak, doğrudan testlerin blank sinyalinin karşılık gelen COLPLEX formatlarından yaklaşık 5 kat ve 7,5 kat daha yüksek olduğunu belirtmektedir. Daha düşük LoB, düşük antijen konsantrasyonlarındaki gerçek test sinyalinin arka plandan ayrılmasını kolaylaştırabilir.

LoD karşılaştırması

Sonuç bölümü GPSudan için LoD'nin “yaklaşık 32 kat”, GPZaire için “15 kat” daha düşük olduğunu belirtmektedir. Tartışma bölümünde GPSudan iyileşmesi daha sonra “34 kat” olarak ifade edilmiştir. Bu kaynak içi yuvarlama/ifade farkı nedeniyle Verianla anlatımında yukarıdaki doğrudan ölçülen LoD değerleri temel alınmıştır; yeni bir kat sayısı uydurulmamıştır.

10 nM antijen düzeyindeki sinyal karşılaştırması

Kaynak Şekil 6'nın nicel analizinde 10 nM GPSudan için Khan tabanlı COLPLEX çizgisi doğrudan formata göre yaklaşık 4 kat daha güçlü sinyal üretmiştir. 10 nM GPZaire koşulunda AP41 ve Khan tabanlı COLPLEX çizgileri, ilgili doğrudan formatlara göre sırasıyla yaklaşık 3 kat ve 2 kat daha güçlü sinyal vermiştir.

Bunlar belirli 10 nM test koşuluna ait sinyal büyüklüğü karşılaştırmalarıdır; bütün konsantrasyonlarda sabit bir kat artışı olduğu anlamına gelmez.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

İnsan örnekleri

Klinik duyarlılık değerlendirmesi için doğrulanmış Zaire Ebola enfeksiyonu bulunan 30 serum örneği kullanılmıştır. Kaynak bu örnekleri RT-PCR cycle threshold (Ct) değerlerine göre şu şekilde raporlamaktadır:

Kaynak sunum notu: Makale bu grupları yukarıdaki “<” etiketleriyle vermektedir; aralıkların birbirini dışlayan örneğin 20–24,99 gibi sınıflar olup olmadığını ana metinde ayrıca açıklaştırmamaktadır. Bu nedenle etiketler sessizce yeniden tanımlanmamıştır.

Negatif klinik özgüllük panelinde 40 serum örneği bulunmuştur:

• 10 sarı humma virüsü pozitif serum,
• 10 dengue virüsü pozitif serum,
• 10 Rift Valley fever virüsü pozitif serum,
• 10 Senegal'den endemik sağlıklı kontrol serumu.

Bunlara ek olarak Fransa Kan Servisi tarafından sağlanan 50 sağlıklı serum ve 50 EDTA plazma örneği, özellikle nonspesifik test çizgisi sinyali ve matriks uyumluluğu için ayrıca değerlendirilmiştir.

RT-PCR referans yöntemi

Zaire Ebola RNA'sı QuantiTect RT-PCR Master Mix Probe kiti kullanılarak değerlendirilmiştir. Kaynakta 5 µL RNA'nın 20 µL master mix'e eklendiği belirtilmektedir.

Termal profil:

• 50°C'de 10 dakika ters transkripsiyon,
• 95°C'de 15 dakika ters transkriptaz inaktivasyonu ve DNA polimeraz aktivasyonu,
• 45 amplifikasyon döngüsü,
• her döngüde 95°C'de 5 saniye,
• 60°C'de 50 saniye annealing-extension.

Belirgin logaritmik amplifikasyon ve Ct <38 pozitif kabul edilmiştir. Ct 38–42 arasındaki örnekler şüpheli/belirsiz olarak değerlendirilmiş; belirgin logaritmik amplifikasyon bulunmayan örnekler negatif kabul edilmiştir.

Ct, real-time PCR sinyalinin tanımlı floresans eşiğini aşması için gereken amplifikasyon döngüsü sayısıdır. Bu çalışmada RT-PCR, klinik LFIA değerlendirmesinde referans yöntem olarak kullanılmıştır.

Kolisin–immünite çiftlerinin seçimi

İki bağımsız protein çifti seçilmiştir:

• Col/Im AP41: Colicin WP_134294768 ve Immunity WP_017002173.
• Col/Im Khan: Colicin WP_036849747 ve Immunity WP_036849748.

Yöntem bölümünde AP41 çifti Pseudomonas aeruginosa AP41, Khan çifti ise Photorhabdus khanii kökenli olarak verilmiştir. Sonuç bölümünde AP41 kaynağını tanımlayan bir cümlede “Pseudomonas aeruginosa PAO1” ifadesi geçmektedir. Kaynaktaki bu küçük terminolojik tutarsızlık düzeltilmiş gibi gösterilmemiş; sistem makale boyunca araştırmacıların kullandığı AP41 adıyla anılmıştır.

Rekombinant protein üretimi

Kolisin DNaz bölgelerini ve karşılık gelen immünite proteinlerini kodlayan DNA dizileri ekspresyon plazmidlerine klonlanmıştır. Kolisinler DNaz–mCherry füzyon proteinleri ve C-terminal 6×His etiketiyle; immünite proteinleri ise N-terminal Renilla luciferase füzyonu ve C-terminal 6×His etiketiyle üretilmiştir.

Plazmidler E. coli BL21(DE3) hücrelerine aktarılmış, ekspresyon orta log fazda IPTG ile indüklenmiş ve hücreler gece boyunca inkübasyondan sonra toplanmıştır. Çözünür proteinler önce Ni²⁺-NTA afinite kromatografisi, ardından size-exclusion chromatography ile saflaştırılmıştır.

EE8 ve JA7 yakalama antikorları ile XC2 tespit antikoru önceki çalışmadan gelen hibridoma kökenli antikorlardır. JA7–ImKhan ve EE8–ImAP41 rekombinant füzyon antikorları CHO hücrelerinde üretilmiş ve Protein A kullanılarak saflaştırılmıştır.

Şerit üretimi

Altın nanoparçacıklı final test prosedürü

Her testte 10 µL serum veya plazma, 90 µL migrasyon tamponunda seyreltilmiştir. Tampon 240 mM Tris pH 7,7; 50 mM EDTA; %0,1 kazein ve %0,5 BigCHAP içermektedir. Şerit kuyucuğa yerleştirilmiş ve test 20 dakika geliştirilmiştir.

Kemilüminesans LFIA prosedürü

Basit formatta reaksiyon karışımı PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 sağlıklı insan serumu ve 10 nM RLuc8–ImAP41 ve/veya RLuc8–ImKhan içermiştir.

Tam formatta PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 sağlıklı insan serumu, 10 nM XC2–NanoLuc, 20 nM EE8–ImAP41, 20 nM JA7–ImKhan ve Zaire veya Sudan Ebola glikoprotein antijeni kullanılmıştır.

100 µL reaksiyon karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilmiş, şerit daha sonra 10 dakika göç ettirilmiştir. Kemilüminesans görüntülemede basit format için 35 saniye, tam format için 75 saniye pozlama kullanılmıştır.

AP41 ve Khan'ın özgüllük doğrulaması

Kaynak Şekil 1'de AP41 ve Khan kolisin–immünite çiftleri hem lateral flow hem mikroplaka formatında değerlendirilmiştir. Cognate etkileşimlerde güçlü sinyal oluşmuş, karşı çiftlerde gözlenebilir non-cognate çapraz reaksiyon görülmemiştir. Bu deneylerde hata çubukları standart sapmayı göstermekte ve N=3 tekrar kullanılmaktadır.

Kaynak Şekil 3'te tam Ebola glikoprotein immünoassayi ELISA formatında test edilmiştir. ColAP41 kaplı kuyucuklarda EE8–ImAP41/GPZaire/XC2–NanoLuc sistemi sinyal üretirken Khan tabanlı kompleksler sinyal üretmemiş; ColKhan kaplı kuyucuklarda ise JA7–ImKhan sistemi Zaire veya Sudan glikoproteiniyle sinyal oluşturmuştur. ELISA deneyleri N=3, kemilüminesans LFIA gösterimi N=2 ile verilmiştir.

Analitik performans

Kaynak Şekil 6'da GPZaire ve GPSudan antijenleri artan konsantrasyonlarda COLPLEX ve doğrudan formatlarla karşılaştırılmıştır. COLPLEX formatındaki test çizgileri bütün test edilen ortak konsantrasyonlarda daha yüksek sinyal vermiş ve daha düşük konsantrasyonlarda görsel olarak tespit edilebilir çizgiler üretmiştir.

COLPLEX deneyleri için kaynak Şekil 6'da N=5, doğrudan format için N=3 tekrar kullanılmıştır. Hata çubukları standart sapmayı göstermektedir.

Negatif serum ve plazma matrikslerinde nonspesifik bağlanma

Sağlıklı Avrupalı donörlerden 50 serum ve 50 EDTA plazma örneğinde test çizgilerinde görsel sinyal gözlenmemiştir. Hesaplanan test çizgisi sinyalleri AP41 ve Khan için belirlenen LoB eşiklerinin altında kalmıştır.

Kaynak, serum ve EDTA plazma matriksleri arasında belirgin fark gözlemediğini ve bunu prototipin farklı klinik örnek tiplerinde çalışabilirliğini destekleyen bir sonuç olarak yorumlamaktadır.

Bununla birlikte bu 100 örnek, Ebola dışındaki başka enfeksiyonlarla oluşabilecek bütün olası interferansları test eden klinik özgüllük paneli değildir. Bu amaçla ayrıca sarı humma, dengue ve Rift Valley fever örneklerini içeren 40 serumluk negatif klinik panel kullanılmıştır.

Klinik Örneklerde %96,7 Duyarlılık ve %100 Özgüllük Ne Anlama Geliyor?

Çalışmanın klinik panelinde 30 RT-PCR pozitif Zaire Ebola serumunun 29'u COLPLEX ile pozitif, biri negatif bulunmuş; 40 EBOV-negatif serumun tamamı negatif bulunmuştur. Bu örneklemde sonuç bölümünün raporladığı duyarlılık %96,7 ve özgüllük %100'dür; ancak özellikle yalnız 30 pozitif örnek bulunduğu için bu performans değerleri daha büyük ve prospektif saha popülasyonlarında ayrıca doğrulanmalıdır.

Duyarlılık

Kaynağın tanımının matematiksel gösterimi:

\(\mathrm{Duyarlılık}=\frac{TP}{TP+FN}\times100\)

Burada TP doğru pozitif, FN yanlış negatif örnek sayısıdır.

Çalışmada:

\(\frac{29}{29+1}\times100\approx96.7\%\)

Sonuç bölümünde %95 güven aralığı %83,3–99,9 olarak raporlanmıştır.

Özgüllük

Kaynağın tanımının matematiksel gösterimi:

\(\mathrm{Özgüllük}=\frac{TN}{TN+FP}\times100\)

Burada TN doğru negatif, FP yanlış pozitif örnek sayısıdır.

40 kişilik EBOV-negatif klinik panelde:

\(\frac{40}{40+0}\times100=100\%\)

Giriş bölümünde özgüllük için %95 güven aralığı %88,43–100,00 olarak verilmiştir.

Tek yanlış negatif örnek

COY2117 kodlu bir serum örneği RT-PCR ile EBOV pozitif olmasına rağmen biplex LFIA tarafından tespit edilmemiştir. Kaynak bu örneğin RT-PCR Ct değerini 25,21 olarak vermekte ve sonucu yanlış negatif olarak sınıflandırmaktadır.

Bu örnek, prototipin %100 klinik duyarlılığa sahip olmadığını açık biçimde göstermektedir.

Mevcut Ebola hızlı testleriyle kaynak içi karşılaştırma

Yazarlar kendi COLPLEX sonuçlarını daha önce yayımlanmış Ebola LFIA çalışmalarının LoD değerleriyle karşılaştırmıştır. Bu karşılaştırma aynı deney içerisinde yapılmış head-to-head çalışma değildir; farklı yayınlardan bildirilen analitik LoD değerlerinin bağlamsal karşılaştırmasıdır.

WHO hedef ürün profiliyle yapılan kaynak içi karşılaştırma

Tartışma bölümünde yazarlar önceki bir meta-analizde mevcut Ebola antijen hızlı tanı testleri için birleştirilmiş duyarlılık ve özgüllük değerlerinin sırasıyla %82,1 ve %97,0 olarak bildirildiğini aktarmakta ve bunları WHO Ebola tanısal hedef ürün profili için kullanılan >%95 duyarlılık ve >%98 özgüllük hedefleriyle karşılaştırmaktadır.

Yazarlar kendi 30 pozitif ve 40 negatif klinik örnek panelindeki %96,7 duyarlılık ve %100 özgüllüğün bu hedeflerle uyumlu olduğunu belirtmektedir. Ancak bu, prototipin WHO tarafından onaylandığı veya geniş saha kullanımına hazır olduğu anlamına gelmez; çalışma bu tür bir düzenleyici onay raporlamamaktadır.

Üretilebilirlik ve stabilite gözlemleri

Kolisin ve immünite proteinlerinin E. coli sisteminde 14–35 mg/L kültür düzeyinde üretilebildiği bildirilmiştir. İmmünite proteini füzyonlu yakalama antikorlarının CHO hücrelerindeki üretim veriminin de konvansiyonel antikorlarla karşılaştırılabilir olduğu belirtilmektedir.

Kuru test şeritlerinin oda sıcaklığında kuru koşullarda 7 ay saklandıktan sonra performansını koruduğu ve arka plan sinyalinde artış görülmediği bildirilmiştir. Ancak yazarlar stabilitenin sistematik olarak incelenmediğini açıkça belirtmektedir. Bu nedenle yedi aylık gözlem, valide edilmiş raf ömrü olarak yorumlanmamalıdır.

Gelecekte önerilen kullanım alanları

Yazarlar kolisinlerin standart LFIA kasetlerinde evrensel moleküler adresler olarak kullanılabileceğini, farklı hedeflere özgü immünite-protein füzyonlu antikorların daha sonra aynı temel şerit mimarisine uygulanabileceğini öngörmektedir.

Ayrıca COLPLEX'in yalnız immünoassaylerle sınırlı olmayabileceği; immünite proteinlerinin antikor yerine primer veya prob gibi oligonükleotidlere bağlanması durumunda RPA veya LAMP gibi izotermal nükleik asit amplifikasyon ürünlerinin de multiplex lateral flow formatında yakalanabileceği önerilmektedir.

Bu bölüm çalışmanın geleceğe yönelik teknoloji önerisidir. COLPLEX tabanlı RPA veya LAMP moleküler testi bu makalede deneysel olarak geliştirilip doğrulanmamıştır.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• AP41 ve Khan kolisin–immünite çiftleri bu deney düzeninde güçlü cognate bağlanma ve gözlenebilir non-cognate çapraz reaksiyon olmadan çalışmıştır.
• İki ayrı COLPLEX çifti tek LFIA şeridinde birbirinden bağımsız moleküler test çizgileri oluşturabilir.
• COLPLEX prototipi Zaire ve Sudan Ebola glikoproteinlerini farklı çizgi desenleriyle ayırt edebilmiştir.
• COLPLEX formatı doğrudan antikor immobilizasyonuna göre daha düşük blank sinyali ve daha düşük LoD üretmiştir.
• Zaire Ebola RT-PCR pozitif 30 klinik serum örneğinin 29'u prototip tarafından pozitif bulunmuştur.
• 40 EBOV-negatif klinik serum örneğinin tamamı negatif bulunmuştur.
• 50 sağlıklı serum ve 50 sağlıklı EDTA plazma örneğinde test çizgilerinde nonspesifik pozitif sinyal gözlenmemiştir.
• COLPLEX daha düşük yakalama antikoru miktarıyla çalışabilmiştir.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• Prototipin bütün Ebola salgınlarında %96,7 duyarlılıkla çalışacağı kanıtlanmamıştır.
• Sudan Ebola enfeksiyonu bulunan gerçek hasta serumlarında klinik duyarlılık bu çalışmada ölçülmemiştir.
• 30 pozitif ve 40 negatif örnekten elde edilen klinik performans geniş ölçekli prospektif saha doğrulamasının yerine geçmez.
• COLPLEX'in kesin raf ömrü belirlenmemiştir.
• Seçilen AP41 ve Khan çiftlerinin kesin K_d değerleri bu çalışmada doğrudan ölçülmemiştir.
• COLPLEX'in streptavidin–biyotinden bütün kullanım senaryolarında üstün olduğu kanıtlanmamıştır.
• Üretim maliyetinin gerçek endüstriyel ölçekte ne kadar azalacağı hesaplanmamıştır.
• Prototip için düzenleyici onay veya rutin klinik kullanım izni raporlanmamıştır.
• COLPLEX tabanlı moleküler RPA/LAMP uygulaması bu makalede deneysel olarak doğrulanmamıştır.

Temel sınırlılıklar

Klinik pozitif örnek sayısı: Zaire Ebola için yalnız 30 RT-PCR pozitif serum örneği değerlendirilmiştir. Duyarlılık güven aralığının genişliği küçük örneklemin belirsizliğini yansıtmaktadır.

Sudan Ebola klinik doğrulaması: Sudan glikoproteini rekombinant/spike antijen deneylerinde başarıyla tespit edilmiş olsa da Sudan Ebola hastalarından alınmış klinik örneklerle tanısal duyarlılık gösterilmemiştir.

Format karşılaştırmasının optimizasyonu: Yazarlar aynı XC2-altın tespit antikorunu her iki formatta kullanmış, ancak deney koşullarının COLPLEX formatı için optimize edildiğini belirtmiştir. Doğrudan formatta konjugat miktarının ayrıca optimize edilmesi arka planı azaltabilir; ancak yazarlar bunun sinyali de azaltabileceğini tartışmaktadır.

Stabilite: Yedi aylık olumlu saklama gözlemi vardır ancak sistematik stabilite çalışması yoktur.

Farklı yayınlarla LoD karşılaştırması: Kaynak Tablo 2'deki önceki hızlı testlerle karşılaştırma tek bir standart deneyde yapılmış head-to-head test değildir.

Kaynak içi sayısal ifade farkları: Klinik duyarlılık giriş ve sonuç bölümlerinde farklı yuvarlama/güven aralığı biçimleriyle verilmiş; Sudan LoD iyileşmesi de sonuçta yaklaşık 32 kat, tartışmada 34 kat olarak ifade edilmiştir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: COLPLEX: A high-affinity protein adaptor for enhanced sensitivity and multiplex lateral flow immunoassays. application to ebola virus strain detection

Yazarlar: Romain Clément; Céline Couturier; Oumar Ndiaye; Cheikh Talibouya Touré; Frank William Mendy; Moussa Dia; Stéphanie Geoffroy; Anely Tranchot; Natacha Mariano; Stéphanie Donnat; Charlotte Mignon; Benoît Beitz; Alejandra Mier; Joseph Robert Anderson Fitchett; Oumar Faye; Cheikh Tidiane Diagne; Oxana Vratskikh; Christophe Védrine.

Corresponding author: Christophe Védrine.

Eş katkı: İncelenen kaynakta eş katkı/eş birinci yazar bildirimi bulunmamaktadır.

Kurum a: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 40 avenue Tony Garnier, Lyon 69007, France.

Kurum b: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 28 rue du Docteur Roux, Paris 75015, France.

Kurum c: DIATROPIX, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Kurum d: Virology Department, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Kurum e: Executive Office, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Dergi: Sensors and Actuators B: Chemical.

Cilt / yayın tarihi / makale numarası: Cilt 454, 1 Mayıs 2026, 139608.

Çevrimiçi yayın tarihi: 5 Şubat 2026.

Alınma tarihi: 6 Kasım 2025.

Revizyon tarihi: 30 Ocak 2026.

Kabul tarihi: 4 Şubat 2026.

DOI: 10.1016/j.snb.2026.139608.

Yayınevi: Elsevier B.V.

Kaynak türü: Hakemli araştırma makalesi; biyosensör/LFIA geliştirme, analitik karakterizasyon ve klinik örnek doğrulaması.

Lisans: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Ana klinik referans yöntemi: Zaire Ebola RT-PCR.

Ana analitik karşılaştırma: COLPLEX tabanlı biplex LFIA ile yakalama antikorlarının nitroselüloza doğrudan immobilize edildiği biplex LFIA.

Test hedefleri: Zaire Ebola glikoproteini ve Sudan Ebola glikoproteini.

Ana moleküler adaptörler: ColAP41–ImAP41 ve ColKhan–ImKhan.

Ana yakalama antikorları: EE8 ve JA7.

Ana tespit antikoru: XC2.

Görsel tespit sistemi: 40 nm altın nanoparçacık konjugatı.

Geliştirme aşamasındaki optik sistemler: RLuc8 ve NanoLuc tabanlı kemilüminesans.

Görüntü ve çizgi analizi: Chemidoc, ImageJ ve Image Lab.

İstatistik yazılımı: GraphPad Prism 10.0.

LoB yöntemi: Negatif serumun 30 tekrarlı ölçümünden MeanBlank + 2,58 × SDBlank; %99 güven düzeyi.

LoD yöntemi: Her konsantrasyonda n=5 ölçüm, dört parametreli lojistik regresyon, standart sapma düzeltmesi ve LoB ile düzeltilmiş eğri kesişimi.

Klinik duyarlılık paneli: 30 RT-PCR pozitif Zaire Ebola serum örneği; 29 doğru pozitif, 1 yanlış negatif.

Klinik özgüllük paneli: 40 EBOV-negatif serum; 10 sarı humma, 10 dengue, 10 Rift Valley fever, 10 Senegal sağlıklı kontrol; tümü negatif.

Ek matriks/nonspesifik bağlanma paneli: 50 sağlıklı serum ve 50 EDTA plazma, Avrupa'daki sağlıklı donörlerden.

Etik: Çalışma Helsinki Bildirgesi ilkelerine göre yürütülmüş ve analizden önce örnekler kimliksizleştirilmiştir. Ebola örnekleri ulusal sağlık otoritelerinin acil yanıt görevi sırasında rutin vaka yönetiminden elde edildiği için ayrı IRB onayı aranmadığı; hastaların Ebola testi için sözlü onam verdiği ve örneklerin daha sonra referans biyobankasında saklandığı belirtilmiştir. Diğer hemorajik ateş ve sağlıklı donör örnekleri ilgili etik onaylı sürveyans faaliyetlerinden kalan örneklerdir.

Veri erişilebilirliği: Verilerin makul talep üzerine sağlanacağı belirtilmiştir.

Finansman bildirimi: İncelenen ana PDF'de ayrı bir Funding bölümü veya özel finansman beyanı bulunmamaktadır; bu nedenle finansman kaynağı uydurulmamıştır.

Yapay zekâ bildirimi: İncelenen ana PDF'de ayrı bir üretken yapay zekâ kullanım bildirimi bulunmamaktadır.

Çıkar çatışması: Christophe Védrine'in “Methods and reagents for multiplex binding experiments” başlıklı WO2020104397A1 patentinin BIOASTER adına beklemede olduğu bildirilmiştir. Diğer yazarlar çalışmayı etkilemiş görünebilecek bilinen rekabet eden finansal çıkar veya kişisel ilişki bildirmemiştir.

CRediT katkıları: Oumar Faye — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Resources, Investigation, Formal analysis; Cheikh Talibouya Touré — Resources, Investigation, Data curation; Joseph Robert Anderson Fitchett — Writing – review & editing, Validation; Anely Tranchot — Visualization, Investigation, Formal analysis; Christophe Védrine — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Formal analysis, Conceptualization; Stéphanie Geoffroy — Visualization, Validation, Investigation, Formal analysis; Oxana Vratskikh — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Supervision, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Moussa Dia — Resources, Investigation, Data curation; Cheikh Tidiane Diagne — Writing – review & editing, Validation, Resources, Investigation, Formal analysis; Frank William Mendy — Resources, Investigation, Data curation; Benoît Beitz — Visualization, Investigation, Formal analysis; Romain Clément — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Charlotte Mignon — Visualization, Supervision, Methodology, Formal analysis; Stéphanie Donnat — Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Natacha Mariano — Writing – original draft, Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Oumar Ndiaye — Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis; Alejandra Mier — Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Conceptualization; Céline Couturier — Visualization, Investigation, Formal analysis.

Kaynak içi nicel tutarsızlık 1: Giriş/erken özet bölümünde 29/30 klinik pozitif örnek için duyarlılık %96,6 ve güven aralığı %82,24–99,91 olarak yazılırken sonuç bölümünde %96,7 ve %95 GA %83,3–99,9 yazmaktadır. Temel ham oran 29/30'dur.

Kaynak içi nicel tutarsızlık 2: GPSudan LoD iyileşmesi sonuç bölümünde yaklaşık 32 kat, tartışma bölümünde 34 kat olarak yazılmıştır. Doğrudan raporlanan LoD değerleri 0,065 nM / 2,2 ng/mL ve 2,10 nM / 70,98 ng/mL'dir.

Kaynak içi terminoloji notu: Yöntem bölümü AP41 çiftini Pseudomonas aeruginosa AP41 kökenli olarak tanımlarken sonuç bölümünde bir yerde Pseudomonas aeruginosa PAO1 ifadesi kullanılmaktadır. Verianla metni bu belirsizliği genişletmemiş ve çiftin çalışma içindeki canonical adı olan AP41'i kullanmıştır.

Görsel yeniden inşa: Kaynak Şekil 4'teki test mimarisi, kaynak ilişkilere dayanarak farklı grafik kompozisyonla inline SVG olarak yeniden oluşturulmuştur. Şekil 6–7'deki nicel konsantrasyon grafikleri ise ham nokta koordinatlarının tamamı ana metinde bulunmadığından sahte interpolasyonla çizilmemiş; açıkça raporlanan LoB, LoD ve klinik sonuçlar HTML tablolarında sunulmuştur.

Temel yorum sınırı: COLPLEX bu çalışmada güçlü analitik ve ilk klinik örnek performansı göstermiş bir prototiptir. Sonuçlar, cihazın bütün Ebola salgın koşullarında aynı performansı göstereceğini, Sudan Ebola hastalarında klinik olarak doğrulandığını, düzenleyici onay aldığını veya valide edilmiş uzun raf ömrüne sahip olduğunu göstermez.