COLPLEX ni mfumo wa adapta ya molekuli unaotumia mwingiliano wa protini–protini wenye affiniti ya juu sana na unaoweza kutofautishwa kati ya protini za bakteria zinazoitwa colicin na protini zao maalum za kinga ili kunasa antijeni lengwa katika immunoassay za mtiririko wa pembeni. Utafiti huu uliunganisha COLPLEX katika prototipu ya biplex LFIA inayoweza kutofautisha glycoprotein za virusi vya Ebola vya Zaire na Sudan kwenye ukanda mmoja wa mtiririko wa pembeni; mfumo ulitathminiwa kwa majaribio ya kufungamana kwa protini, ELISA, LFIA ya chemiluminescence, LFIA kavu yenye chembechembe za dhahabu, majaribio ya kikomo cha utambuzi wa kiuchanganuzi na sampuli za seramu/plasma ya binadamu.

Katika usanifu wa msingi, jozi mbili za colicin–kinga zisizotoa mmenyuko mtambuka zilitumika. Mfumo wa ColAP41–ImAP41 uliunganishwa na kingamwili ya kunasa EE8 maalum kwa glycoprotein ya Ebola ya Zaire, huku mfumo wa ColKhan–ImKhan ukiunganishwa na kingamwili ya kunasa JA7 inayoweza kutambua glycoprotein za Zaire na Sudan. Kwa malengo yote mawili, kingamwili ya pamoja ya utambuzi iitwayo XC2 ilitumiwa. Kwa muundo huu, glycoprotein ya Sudan huunda mstari wa majaribio wa Khan pekee, ilhali glycoprotein ya Zaire huunda mistari yote ya AP41 na Khan. Hivyo, lengo linaweza kutofautishwa kwa mifumo miwili tofauti ya ishara kwenye ukanda mmoja.

Katika muundo wa LFIA kavu unaotumia chembechembe za dhahabu, kikomo cha utambuzi cha prototipu ya COLPLEX kwa glycoprotein ya Ebola ya Zaire kiliripotiwa kuwa 0,034 nM (1,1 ng/mL), huku katika muundo wa kulinganisha wenye kingamwili iliyowekwa moja kwa moja kikiwa 0,47 nM (15,18 ng/mL). Kwa glycoprotein ya Ebola ya Sudan, kikomo cha utambuzi cha COLPLEX kilikuwa 0,065 nM (2,2 ng/mL), na katika muundo wa moja kwa moja 2,10 nM (70,98 ng/mL). COLPLEX pia ilitoa ishara ya blank iliyo chini na mistari ya majaribio iliyoonekana zaidi.

Katika tathmini ya kliniki, sampuli 29 kati ya sampuli 30 za seramu za Zaire Ebola zenye RT-PCR chanya kutoka milipuko ya awali ya Ebola zilipatikana kuwa chanya na prototipu ya COLPLEX biplex, huku sampuli moja ya RT-PCR chanya ikibaki hasi kwa makosa. Katika sehemu ya matokeo, unyeti uliripotiwa kuwa %96,7 (%95 muda wa kujiamini: %83,3–99,9). Sampuli zote 40 za seramu EBOV-hasi zilizojumuisha maambukizi ya yellow fever, dengue, Rift Valley fever na vidhibiti vyenye afya kutoka Senegal zilikuwa hasi na umaalumu wa kliniki ulikuwa %100.

Ingawa matokeo haya ni muhimu, prototipu hii bado si utafiti mkubwa wa uchunguzi wa uwanjani wa matarajio. Unyeti wa kliniki ulitathminiwa katika sampuli 30 tu za seramu zenye Zaire Ebola chanya; utendaji katika sampuli za wagonjwa wenye Sudan Ebola haukuonyeshwa katika utafiti huu. Aidha, ingawa ilionekana kuwa utendaji uliendelea kuhifadhiwa baada ya vipande vikavu kuhifadhiwa kwa miezi saba kwenye joto la kawaida, waandishi wanaeleza wazi kuwa uthabiti haujachunguzwa kwa utaratibu.

Lateral flow immunoassay ni nini?

Lateral flow immunoassay (LFIA; immunoassay ya mtiririko wa pembeni) ni jukwaa la kipimo cha haraka ambapo sampuli ya kioevu husogea kwenye ukanda wenye vinyweleo kwa nguvu ya kapilari na molekuli lengwa katika sampuli inaposhirikiana na vitendanishi maalum vya kunasa/kutambua huunda mistari ya majaribio inayoonekana au inayoweza kupimwa kwa kifaa.

Faida muhimu za LFIA ni matokeo ya haraka, urahisi wa matumizi, kubebeka na kupungua kwa utegemezi wa maabara kuu. Sifa hizi ni muhimu hasa kwa vipimo vya point-of-care katika maeneo ya kipato cha chini na cha kati ambako upatikanaji wa maabara ni mdogo.

Hata hivyo, katika vipimo vya haraka inaweza kuwa vigumu kutambua malengo mengi kwa wakati mmoja, kudumisha unyeti mkubwa na kuweka usuli usio maalum katika kiwango cha chini. Hili ndilo tatizo la uhandisi linalochunguzwa na utafiti.

Multiplex au biplex maana yake nini?

Multiplex humaanisha kupima malengo mengi ndani ya kipimo kimoja huku yakitofautishwa kutoka kwa kila moja. Katika utafiti huu, kwa kuwa malengo mawili ya glycoprotein za Ebola yanatofautishwa kwenye ukanda mmoja, mfumo uliundwa kama biplex, yaani muundo wa multiplex wenye malengo mawili.

Faida inayowezekana ya muundo wa multiplex si kutumia kipimo kimoja badala ya vipimo viwili pekee. Malengo mengi yanaweza kuchambuliwa kwa kiasi kilekile cha sampuli ya kibaolojia; kiasi cha utando, vifungashio, udhibiti wa ubora na baadhi ya vitendanishi kinaweza kupunguzwa.

Colicin na protini ya kinga ni nini?

Colicin ni protini za antibakteria zinazozalishwa na baadhi ya bakteria ili kukandamiza bakteria washindani. Bakteria anayezalisha colicin pia huzalisha protini ya kinga inayofungamana kwa nguvu sana na kwa umaalumu na protini yake yenye sumu ili kujilinda.

Sifa muhimu ya jozi hizi za asili ni affiniti na umaalumu wa juu sana wa kufungamana. Katika fasihi, kwa baadhi ya jozi za colicin–kinga, viwango vya takribani 10⁻¹⁴ M vya konstanti za kutengana vimeripotiwa. Kwa kulinganisha, mwingiliano wa streptavidin–biotin ni mojawapo ya mwingiliano asilia usio wa kovalenti wenye nguvu sana katika kiwango cha takribani 10⁻¹⁵ M.

Kikomo muhimu cha tafsiri: Utafiti huu haukupima thamani kamili ya K_d ya jozi zilizochaguliwa za AP41 na Khan kwa njia kama surface plasmon resonance. Utafiti ulionyesha katika majaribio ya kufungamana kwa utendaji kuwa jozi hizi zilikuwa na kufungamana kwa nguvu kwa cognate na hazikuonyesha mmenyuko mtambuka wa non-cognate unaoweza kuonekana. Taarifa ya K_d katika kiwango cha femtomolar inatoka katika fasihi ya awali ya colicin–kinga.

Kwa nini utambuzi wa bio-orthogonal ni muhimu?

Faida kuu ya COLPLEX kwa multiplex ni kwamba jozi nyingi tofauti za colicin–kinga zinaweza kutumiwa bila kuingiliana. Protini ya kinga ya AP41 hufungamana na mstari wa colicin AP41, huku protini ya kinga ya Khan ikifungamana na mstari wa colicin Khan. Katika majaribio rahisi ya kufungamana katika Mchoro wa 1 wa chanzo, jozi za cognate zilitoa ishara kali, ilhali hakuna mmenyuko mtambuka wa non-cognate unaoweza kutambuliwa ulioonekana katika mchanganyiko usiolingana.

Sifa hii huruhusu kingamwili tofauti za kunasa kuunganishwa na protini tofauti za kinga na kuelekezwa kwenye mistari tofauti ya colicin kwenye ukanda. Hivyo, badala ya mfumo mmoja wa biotin–streptavidin kuelekeza kompleks zote za kunasa kwenye nanga ileile ya molekuli, kila lengo hushikiliwa kupitia anwani tofauti ya molekuli.

Kwa Nini COLPLEX Inaweza Kuwa Nyeti Zaidi Kuliko Uwekaji wa Moja kwa Moja wa Kingamwili?

Kulingana na matokeo ya utafiti wa chanzo, katika muundo wa COLPLEX mwingiliano wa colicin–kinga wenye affiniti ya juu, uwezo wa kompleks za antijeni–kingamwili kuunda ndani ya myeyusho wakati wa mtiririko wa pembeni, na kutokausha kingamwili ya kunasa moja kwa moja kwenye nitrocellulose kwa pamoja vilihusishwa na ishara ya juu zaidi ya mstari wa majaribio na usuli mdogo usio maalum; hata hivyo, utafiti haukufanya jaribio la mekanizimu linalotenganisha kwa kiasi mchango wa kila kipengele.

Katika muundo wa kawaida wa moja kwa moja, kingamwili ya kunasa huwekwa moja kwa moja kwenye mstari wa majaribio wa utando wa nitrocellulose. Katika njia hii, konformeshini ya kingamwili inaweza kuathiriwa wakati wa kukausha na kufungamana na uso, na muda wa mwingiliano wake na antijeni unaweza kupunguzwa na hali za kimwili za mtiririko wa pembeni.

Katika mbinu ya COLPLEX, kingamwili za kunasa kwanza huwa katika fusion na protini husika ya kinga. Antijeni, kingamwili ya kunasa na kingamwili ya kutambua zinaweza kuunda kompleks katika myeyusho wakati wa mtiririko. Kompleks iliyoundwa kisha hufungamana kwa nguvu sana na mstari wa colicin cognate kwenye ukanda kupitia protini ya kinga.

Katika utafiti huu, kiasi kidogo cha kingamwili ya kunasa kilitumiwa katika muundo wa COLPLEX kuliko katika muundo wa moja kwa moja. Katika sehemu ya mjadala, matumizi ya takribani 0,2–0,3 µg ya kingamwili ya kunasa ya COLPLEX kwa kila kingamwili yalielezwa kuwa sawa na matumizi ya reagent 1,6–2,5 mara chache zaidi ikilinganishwa na takribani 0,5 µg katika muundo wa moja kwa moja.

Ulinganisho wa COLPLEX na streptavidin–biotin

Watafiti waliongeza lebo ya Renilla luciferase na Avi-tag inayoweza kubiotinishwa kwenye protini ya kinga ya AP41 na kulinganisha kufungamana kwa protini hiyo hiyo na ColAP41 iliyowekwa au streptavidin ya polima.

Katika jaribio la ELISA, mfumo wa polystreptavidin–biotin ulitoa ishara kamili ya juu zaidi, lakini pia ulionyesha ishara ya usuli iliyo juu zaidi. Mfumo wa COLPLEX AP41 uliunda profaili ya kufungamana yenye nguvu na usuli wa chini. Waandishi walitafsiri matokeo haya kuwa COLPLEX inaweza kuwa jukwaa mbadala au la ziada la adapta yenye affiniti ya juu kwa streptavidin–biotin.

Ukanda Mmoja Hutofautishaje Glycoprotein za Ebola za Zaire na Sudan?

Katika prototipu ya biplex, glycoprotein ya Sudan Ebola huunda kompleks ya JA7–ImKhan pekee na kufanya mstari wa Khan kuwa chanya, ilhali glycoprotein ya Zaire Ebola huunda kompleks zote za EE8–ImAP41 na JA7–ImKhan na hivyo kufanya mistari yote miwili ya majaribio kuwa chanya; ikiwa hakuna antijeni, mstari wa udhibiti pekee huonekana.

Jukumu la kingamwili tatu kuu

Kipimo kikavu chenye chembechembe za dhahabu kinatumikaje?

Katika hatua ya mwisho ya prototipu, vitendanishi vyote vilikaushwa kwenye ukanda. Kwa kipimo, 10 µL seramu au plasma ilichanganywa na 90 µL bafa ya uhamaji na ukanda ukawekwa kwenye mchanganyiko. Kipimo kiliendelezwa kwa 20 dakika na kisha matokeo yakasomwa.

Kingamwili ya utambuzi XC2 iliunganishwa na 40 nm chembechembe za dhahabu. Fusion za kingamwili ya kunasa–kinga za COLPLEX na konjugati ya XC2-dhahabu zilikaushwa kwenye pedi za konjugati. Kwenye utando wa nitrocellulose, ColAP41 na ColKhan ziliwekwa kama mistari tofauti ya majaribio.

Vipande vya majaribio vilikatwa kwa upana wa 5 mm na kuhifadhiwa kwenye mifuko iliyofungwa yenye desiccant kwenye joto la kawaida.

Kwa nini hatua ya chemiluminescence ilifanywa?

Kabla ya muundo wa mwisho wa ukanda mkavu wenye chembechembe za dhahabu, watafiti walifanya majaribio ya chemiluminescence yanayotegemea Renilla luciferase na NanoLuc ili kuthibitisha usanifu wa kufungamana kwa molekuli kwa mfumo nyeti zaidi wa usomaji wa macho.

Katika muundo rahisi wa kufungamana, fusion za RLuc8–kinga zilitumiwa; katika muundo kamili wa immunoassay, fusion za kingamwili ya kunasa–kinga, antijeni za glycoprotein za Ebola na kingamwili ya utambuzi XC2 yenye NanoLuc zilitumiwa pamoja. Majaribio haya yalitumiwa kuthibitisha kuwa mifumo ya AP41 na Khan hufungamana kwa kuchagua na mistari yao ya cognate na kwamba usanifu wa multiplex unaweza kufanya kazi.

LoB na LoD Zinamaanisha Nini?

Limit of Blank (LoB) huwakilisha kikomo cha juu cha ishara kinachoweza kutarajiwa kutoka kwa sampuli za blank zisizo na antijeni lengwa; Limit of Detection (LoD) huwakilisha mkusanyiko wa chini kabisa wa lengo ambapo ishara ya kipimo inaweza kutofautishwa kwa kutegemewa na mgawanyo wa blank. Katika utafiti huu LoB ilihesabiwa kutoka kwa seramu hasi iliyopimwa mara kwa mara, huku LoD ikikokotolewa kwa kutumia regression ya logistic yenye vigezo vinne kwenye viwango vya antijeni vinavyoongezeka na njia ya makutano na LoB.

Fomula ya LoB

\(\mathrm{LoB}=\overline{X}_{\mathrm{Blank}}+(2.58\times SD_{\mathrm{Blank}})\)

Fomula inakokotoa nini? Kikomo cha juu cha uamuzi cha mgawanyo wa ishara unaotokana na sampuli hasi zisizo na antijeni.

\(\overline{X}_{\mathrm{Blank}}\) ni nini? Ni wastani wa ishara za sampuli za blank/hasi zilizopimwa mara kwa mara.

\(SD_{\mathrm{Blank}}\) ni nini? Ni mkengeuko sanifu wa ishara za blank.

Kwa nini 2,58 ilitumika? Chanzo kinaeleza kuwa mgawo huu unalingana na kiwango cha kujiamini cha %99.

Kitengo ni nini? Katika utafiti, ishara za mistari zilitathminiwa kwa vitengo vya test line intensity (TLI).

Kwa hesabu ya LoB, sampuli hasi ya seramu ilipimwa mara 30.

LoD ilikokotolewaje?

Chanzo hakitoi mlinganyo mmoja uliofungwa kwa LoD. Badala yake, viwango vya antijeni vinavyoongezeka vilipimwa kwa n=5 marudio kwa kila kiwango, na uhusiano wa ishara na mkusanyiko uliigwa kwa regression ya logistic yenye vigezo vinne (4PL).

Mkengeuko sanifu wa viwango vilivyo juu ya LoB ulipimwa kwa wastani; 2,58 × SD ilitolewa kutoka kwenye mkunjo ulioundwa ili kupata mkunjo uliorekebishwa kwa tahadhari zaidi, na mkusanyiko ambapo LoB ulikutana na mkunjo huu uliorekebishwa uliwekwa kama LoD.

Chanzo hakitoi mlinganyo wa wazi wa kihisabati wa kazi ya 4PL wala thamani za nambari za vigezo vinne katika maandishi makuu. Kwa hiyo, hakuna fomula ya 4PL au thamani ya kigezo kutoka nje ya chanzo iliyoundwa hapa.

Ukali wa mstari wa majaribio uliorekebishwa ulikokotolewaje?

Ili kulinganisha ishara za mistari zilizopatikana katika picha tofauti, eneo la kilele la mstari wa majaribio lililopimwa kwa ImageJ liligawanywa kwa eneo la kilele la mstari wa kawaida uliochapishwa katika kila picha na matokeo yakazidishwa kwa 1000.

\(I_{\mathrm{norm}}=\frac{A_{\mathrm{test}}}{A_{\mathrm{standard}}}\times1000\)

\(A_{\mathrm{test}}\): eneo la kilele la mstari wa majaribio.

\(A_{\mathrm{standard}}\): eneo la kilele la mstari wa kawaida uliochapishwa katika picha hiyo hiyo.

\(I_{\mathrm{norm}}\): thamani ya ishara jamaa iliyorekebishwa inayorahisisha kulinganisha kati ya picha.

Kiasi hiki si mkusanyiko halisi wa antijeni. Mkusanyiko wa antijeni ulifafanuliwa kupitia mfululizo tofauti wa majaribio ya dilution.

Ulinganisho wa LoB kati ya COLPLEX na muundo wa moja kwa moja

Chanzo kinaeleza kuwa ishara ya blank ya vipimo vya moja kwa moja ilikuwa takribani mara 5 na mara 7,5 juu kuliko miundo inayolingana ya COLPLEX. LoB ya chini inaweza kurahisisha kutenganisha ishara halisi ya kipimo na usuli katika viwango vya chini vya antijeni.

Ulinganisho wa LoD

Sehemu ya matokeo inasema kwamba LoD ya GPSudan ilikuwa “takribani mara 32” chini na ya GPZaire “mara 15” chini. Katika sehemu ya mjadala, uboreshaji wa GPSudan baadaye ulielezwa kuwa “mara 34”. Kwa sababu ya tofauti hii ya kuzungusha/kauli ndani ya chanzo, maelezo ya Verianla yanategemea thamani za LoD zilizopimwa moja kwa moja hapo juu; hakuna nambari mpya ya mara iliyobuniwa.

Ulinganisho wa ishara katika kiwango cha antijeni cha 10 nM

Katika uchanganuzi wa kiasi wa Mchoro wa 6 wa chanzo, mstari wa COLPLEX unaotegemea Khan kwa 10 nM GPSudan ulitoa ishara takribani mara 4 yenye nguvu zaidi kuliko muundo wa moja kwa moja. Katika hali ya 10 nM GPZaire, mistari ya COLPLEX inayotegemea AP41 na Khan ilitoa ishara takribani mara 3 na mara 2 yenye nguvu zaidi, mtawalia, kuliko miundo yao ya moja kwa moja.

Hizi ni ulinganisho wa ukubwa wa ishara katika hali mahususi ya 10 nM; hazimaanishi kuwa kuna ongezeko la mara sawa katika viwango vyote.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Sampuli za binadamu

Kwa tathmini ya unyeti wa kliniki, sampuli 30 za seramu kutoka kwa maambukizi yaliyothibitishwa ya Zaire Ebola zilitumiwa. Chanzo kinaripoti sampuli hizi kulingana na thamani za RT-PCR cycle threshold (Ct) kama ifuatavyo:

Maelezo kuhusu uwasilishaji wa chanzo: Makala inatoa makundi haya kwa lebo za “<” zilizo hapo juu; haifafanui katika maandishi makuu kama vipindi ni makundi yasiyoingiliana, kwa mfano 20–24,99. Kwa hiyo lebo hazijafafanuliwa upya kimya kimya.

Katika paneli hasi ya umaalumu wa kliniki kulikuwa na sampuli 40 za seramu:

• seramu 10 zenye virusi vya yellow fever chanya,
• seramu 10 zenye virusi vya dengue chanya,
• seramu 10 zenye virusi vya Rift Valley fever chanya,
• seramu 10 za vidhibiti vyenye afya vya eneo kutoka Senegal.

Zaidi ya hayo, seramu 50 zenye afya na plasma 50 za EDTA zilizotolewa na Huduma ya Damu ya Ufaransa zilitathminiwa tofauti, hasa kwa ishara ya mstari wa majaribio isiyo maalum na utangamano wa matriki.

Njia ya marejeo ya RT-PCR

RNA ya Zaire Ebola ilitathminiwa kwa kutumia kit ya QuantiTect RT-PCR Master Mix Probe. Chanzo kinasema kuwa 5 µL RNA iliongezwa kwenye 20 µL master mix.

Wasifu wa joto:

• 50°C kwa dakika 10 kwa reverse transcription,
• 95°C kwa dakika 15 kwa kuondoa shughuli ya reverse transcriptase na kuwezesha DNA polymerase,
• mizunguko 45 ya amplification,
• katika kila mzunguko 95°C kwa sekunde 5,
• 60°C kwa sekunde 50 annealing-extension.

Amplification ya logarithmic iliyo wazi na Ct <38 ilichukuliwa kuwa chanya. Sampuli zenye Ct 38–42 zilitathminiwa kuwa za shaka/zisizo na uhakika; sampuli zisizo na amplification ya logarithmic iliyo wazi zilichukuliwa kuwa hasi.

Ct ni idadi ya mizunguko ya amplification inayohitajika ili ishara ya real-time PCR ipite kizingiti kilichofafanuliwa cha fluorescence. Katika utafiti huu, RT-PCR ilitumika kama njia ya marejeo katika tathmini ya kliniki ya LFIA.

Uchaguzi wa jozi za colicin–kinga

Jozi mbili huru za protini zilichaguliwa:

• Col/Im AP41: Colicin WP_134294768 na Immunity WP_017002173.
• Col/Im Khan: Colicin WP_036849747 na Immunity WP_036849748.

Katika sehemu ya mbinu, jozi ya AP41 imeelezwa kuwa inatoka Pseudomonas aeruginosa AP41, na jozi ya Khan kutoka Photorhabdus khanii. Katika sehemu ya matokeo, sentensi moja inayofafanua chanzo cha AP41 hutumia neno “Pseudomonas aeruginosa PAO1”. Tofauti hii ndogo ya istilahi katika chanzo haikuonyeshwa kana kwamba imerekebishwa; mfumo umetajwa katika makala yote kwa jina AP41 linalotumiwa na watafiti.

Uzalishaji wa protini rekombinanti

Mfuatano wa DNA unaosimba maeneo ya DNase ya colicin na protini zinazolingana za kinga uliingizwa kwenye plasmid za kujieleza. Colicin zilitengenezwa kama protini fusion za DNase–mCherry zenye lebo ya C-terminal 6×His; protini za kinga zilitengenezwa kama fusion ya N-terminal Renilla luciferase yenye lebo ya C-terminal 6×His.

Plasmid ziliingizwa katika seli za E. coli BL21(DE3), kujieleza kulichochewa kwa IPTG katika awamu ya kati ya log, na seli zilikusanywa baada ya incubation ya usiku mmoja. Protini mumunyifu zilisafishwa kwanza kwa Ni²⁺-NTA affinity chromatography, kisha kwa size-exclusion chromatography.

Kingamwili za kunasa EE8 na JA7 pamoja na kingamwili ya utambuzi XC2 ni kingamwili zenye asili ya hybridoma kutoka utafiti wa awali. Kingamwili rekombinanti fusion za JA7–ImKhan na EE8–ImAP41 zilitengenezwa katika seli za CHO na kusafishwa kwa Protein A.

Utengenezaji wa ukanda

Utaratibu wa mwisho wa kipimo cha chembechembe za dhahabu

Katika kila kipimo, 10 µL seramu au plasma ilichanganywa katika 90 µL bafa ya uhamaji. Bafa ilikuwa na 240 mM Tris pH 7,7; 50 mM EDTA; %0,1 casein na %0,5 BigCHAP. Ukanda uliwekwa kwenye kisima na kipimo kiliendelezwa kwa dakika 20.

Utaratibu wa LFIA ya chemiluminescence

Katika muundo rahisi, mchanganyiko wa mmenyuko ulikuwa na PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 seramu ya binadamu mwenye afya na 10 nM RLuc8–ImAP41 na/au RLuc8–ImKhan.

Katika muundo kamili, PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 seramu ya binadamu mwenye afya, 10 nM XC2–NanoLuc, 20 nM EE8–ImAP41, 20 nM JA7–ImKhan na antijeni ya glycoprotein ya Ebola ya Zaire au Sudan zilitumiwa.

100 µL ya mchanganyiko wa mmenyuko iliwekwa katika incubation kwa dakika 15 kwenye joto la kawaida, kisha ukanda ukaachwa kuhamia kwa dakika 10. Katika upigaji picha wa chemiluminescence, muda wa exposure wa sekunde 35 ulitumika kwa muundo rahisi na sekunde 75 kwa muundo kamili.

Uthibitishaji wa umaalumu wa AP41 na Khan

Katika Mchoro wa 1 wa chanzo, jozi za colicin–kinga za AP41 na Khan zilitathminiwa katika miundo ya lateral flow na microplate. Mwingiliano wa cognate ulitoa ishara kali na hakuna mmenyuko mtambuka wa non-cognate unaoweza kuonekana ulioonekana katika jozi zisizolingana. Katika majaribio haya, error bars zinaonyesha mkengeuko sanifu na N=3 marudio yalitumika.

Katika Mchoro wa 3 wa chanzo, immunoassay kamili ya glycoprotein ya Ebola ilijaribiwa katika muundo wa ELISA. Katika visima vilivyofunikwa na ColAP41, mfumo wa EE8–ImAP41/GPZaire/XC2–NanoLuc ulitoa ishara ilhali kompleks zinazotegemea Khan hazikutoa ishara; katika visima vilivyofunikwa na ColKhan, mfumo wa JA7–ImKhan ulitoa ishara na glycoprotein ya Zaire au Sudan. Majaribio ya ELISA yaliwasilishwa kwa N=3 na onyesho la LFIA ya chemiluminescence kwa N=2.

Utendaji wa kiuchanganuzi

Katika Mchoro wa 6 wa chanzo, antijeni za GPZaire na GPSudan zililinganishwa katika viwango vinavyoongezeka kwa miundo ya COLPLEX na ya moja kwa moja. Mistari ya majaribio katika muundo wa COLPLEX ilitoa ishara ya juu katika viwango vyote vya pamoja vilivyojaribiwa na kuunda mistari inayoonekana katika viwango vya chini zaidi.

Kwa majaribio ya COLPLEX katika Mchoro wa 6 wa chanzo N=5 marudio yalitumika, na kwa muundo wa moja kwa moja N=3. Error bars zinaonyesha mkengeuko sanifu.

Kufungamana kusiko maalum katika matriki hasi za seramu na plasma

Katika sampuli 50 za seramu na 50 za plasma ya EDTA kutoka kwa wafadhili wenye afya wa Ulaya, hakuna ishara ya kuona iliyoonekana katika mistari ya majaribio. Ishara zilizokokotolewa za mstari wa majaribio zilibaki chini ya vizingiti vya LoB vilivyoainishwa kwa AP41 na Khan.

Chanzo kinasema hakikuona tofauti dhahiri kati ya matriki za seramu na plasma ya EDTA na kinatafsiri hili kama matokeo yanayounga mkono uwezo wa prototipu kufanya kazi katika aina tofauti za sampuli za kliniki.

Hata hivyo, sampuli hizi 100 si paneli ya umaalumu wa kliniki inayojaribu kila mwingiliano unaowezekana kutoka kwa maambukizi mengine yasiyo Ebola. Kwa lengo hilo, paneli hasi ya kliniki yenye sampuli 40 za seramu, ikiwa ni pamoja na yellow fever, dengue na Rift Valley fever, ilitumika pia.

Unyeti wa %96,7 na Umaalumu wa %100 Katika Sampuli za Kliniki Unamaanisha Nini?

Katika paneli ya kliniki ya utafiti, 29 kati ya seramu 30 zenye Zaire Ebola RT-PCR chanya zilikuwa chanya kwa COLPLEX na moja ilikuwa hasi; seramu zote 40 EBOV-hasi zilikuwa hasi. Katika seti hii ya sampuli, unyeti ulioripotiwa katika sehemu ya matokeo ni %96,7 na umaalumu ni %100; hata hivyo, hasa kwa kuwa kulikuwa na sampuli 30 chanya tu, thamani hizi za utendaji zinapaswa kuthibitishwa tofauti katika idadi kubwa zaidi na za matarajio za uwanjani.

Unyeti

Uwakilishi wa kihisabati wa ufafanuzi wa chanzo:

\(\mathrm{Duyarlılık}=\frac{TP}{TP+FN}\times100\)

Hapa TP ni idadi ya chanya za kweli na FN ni idadi ya hasi za uongo.

Katika utafiti:

\(\frac{29}{29+1}\times100\approx96.7\%\)

Katika sehemu ya matokeo, muda wa kujiamini wa %95 uliripotiwa kuwa %83,3–99,9.

Umaalumu

Uwakilishi wa kihisabati wa ufafanuzi wa chanzo:

\(\mathrm{Özgüllük}=\frac{TN}{TN+FP}\times100\)

Hapa TN ni idadi ya hasi za kweli na FP ni idadi ya chanya za uongo.

Katika paneli ya kliniki ya watu 40 EBOV-hasi:

\(\frac{40}{40+0}\times100=100\%\)

Katika sehemu ya utangulizi, muda wa kujiamini wa %95 kwa umaalumu ulipewa kama %88,43–100,00.

Sampuli moja hasi ya uongo

Sampuli ya seramu yenye msimbo COY2117 ilikuwa EBOV chanya kwa RT-PCR lakini haikutambuliwa na biplex LFIA. Chanzo kinatoa thamani ya RT-PCR Ct ya sampuli hii kama 25,21 na kinaainisha matokeo kuwa hasi ya uongo.

Sampuli hii inaonyesha wazi kuwa prototipu haina unyeti wa kliniki wa %100.

Ulinganisho wa ndani ya chanzo na vipimo vya haraka vya Ebola vilivyopo

Waandishi walilinganisha matokeo yao ya COLPLEX na thamani za LoD za tafiti za Ebola LFIA zilizochapishwa awali. Ulinganisho huu si utafiti wa head-to-head uliofanywa katika jaribio moja; ni ulinganisho wa kimuktadha wa thamani za kiuchanganuzi za LoD zilizoripotiwa kutoka machapisho tofauti.

Ulinganisho wa ndani ya chanzo na wasifu lengwa wa bidhaa wa WHO

Katika sehemu ya mjadala, waandishi wanataja kwamba katika meta-analysis ya awali, thamani zilizounganishwa za unyeti na umaalumu kwa vipimo vya haraka vya antijeni za Ebola zilizopo ziliripotiwa kuwa %82,1 na %97,0 mtawalia, na wanazilinganisha na malengo ya >%95 unyeti na >%98 umaalumu yanayotumiwa kwa wasifu lengwa wa bidhaa ya uchunguzi wa Ebola wa WHO.

Waandishi wanaeleza kwamba unyeti wa %96,7 na umaalumu wa %100 katika paneli yao ya sampuli 30 chanya na 40 hasi unalingana na malengo haya. Hata hivyo, hii haimaanishi kwamba prototipu imeidhinishwa na WHO au iko tayari kwa matumizi makubwa ya uwanjani; utafiti hauripoti idhini kama hiyo ya udhibiti.

Uzalishikaji na uchunguzi wa uthabiti

Imeripotiwa kuwa colicin na protini za kinga zinaweza kuzalishwa katika mfumo wa E. coli kwa kiwango cha 14–35 mg/L kultura. Ufanisi wa uzalishaji wa kingamwili za kunasa zilizounganishwa na protini za kinga katika seli za CHO pia umeelezwa kuwa unalinganishwa na kingamwili za kawaida.

Imeripotiwa kuwa vipande vikavu vya majaribio vilidumisha utendaji wake baada ya kuhifadhiwa kwa miezi 7 katika hali kavu kwenye joto la kawaida na hakuna ongezeko la ishara ya usuli lililoonekana. Hata hivyo, waandishi wanaeleza wazi kwamba uthabiti haujachunguzwa kwa utaratibu. Kwa hiyo, uchunguzi wa miezi saba haupaswi kutafsiriwa kama muda wa rafu uliothibitishwa.

Maeneo ya matumizi yanayopendekezwa kwa siku zijazo

Waandishi wanapendekeza kwamba colicin zinaweza kutumika kama anwani za molekuli za jumla katika kaseti za kawaida za LFIA, na kingamwili zenye fusion ya protini ya kinga maalum kwa malengo tofauti zinaweza baadaye kutumika katika usanifu uleule wa msingi wa ukanda.

Pia inapendekezwa kwamba COLPLEX huenda isiishie kwenye immunoassay pekee; ikiwa protini za kinga zitaunganishwa na oligonucleotide kama primer au probe badala ya kingamwili, bidhaa za amplification ya asidi nukleiki ya isotermal kama RPA au LAMP pia zinaweza kunaswa katika muundo wa multiplex lateral flow.

Sehemu hii ni pendekezo la teknolojia la baadaye la utafiti. Kipimo cha molekuli cha COLPLEX kinachotegemea RPA au LAMP hakikuendelezwa wala kuthibitishwa kwa majaribio katika makala hii.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• Jozi za colicin–kinga za AP41 na Khan zilifanya kazi katika mpangilio huu wa majaribio kwa kufungamana kwa nguvu kwa cognate na bila mmenyuko mtambuka wa non-cognate unaoweza kuonekana.
• Jozi mbili tofauti za COLPLEX zinaweza kuunda mistari huru ya majaribio ya molekuli kwenye ukanda mmoja wa LFIA.
• Prototipu ya COLPLEX iliweza kutofautisha glycoprotein za Ebola za Zaire na Sudan kwa mifumo tofauti ya mistari.
• Muundo wa COLPLEX ulitoa ishara ya blank iliyo chini na LoD ya chini kuliko uwekaji wa moja kwa moja wa kingamwili.
• Sampuli 29 kati ya 30 za seramu za kliniki za Zaire Ebola zenye RT-PCR chanya zilipatikana kuwa chanya na prototipu.
• Sampuli zote 40 za seramu za kliniki EBOV-hasi zilikuwa hasi.
• Katika sampuli 50 za seramu zenye afya na 50 za plasma ya EDTA yenye afya, hakuna ishara chanya isiyo maalum iliyoonekana kwenye mistari ya majaribio.
• COLPLEX iliweza kufanya kazi kwa kiasi kidogo cha kingamwili ya kunasa.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono

• Haijathibitishwa kwamba prototipu itafanya kazi kwa unyeti wa %96,7 katika milipuko yote ya Ebola.
• Unyeti wa kliniki katika seramu za wagonjwa halisi wenye Sudan Ebola haukupimwa katika utafiti huu.
• Utendaji wa kliniki uliopatikana kutoka kwa sampuli 30 chanya na 40 hasi hauchukui nafasi ya uthibitishaji mkubwa wa matarajio wa uwanjani.
• Muda kamili wa rafu wa COLPLEX haujaamuliwa.
• Thamani kamili za K_d za jozi zilizochaguliwa za AP41 na Khan hazikupimwa moja kwa moja katika utafiti huu.
• Haijathibitishwa kwamba COLPLEX ni bora kuliko streptavidin–biotin katika hali zote za matumizi.
• Haijakokotolewa ni kwa kiasi gani gharama ya uzalishaji itapungua katika kiwango halisi cha viwandani.
• Hakuna idhini ya udhibiti au ruhusa ya matumizi ya kawaida ya kliniki iliyoripotiwa kwa prototipu.
• Matumizi ya molekuli ya COLPLEX yanayotegemea RPA/LAMP hayakuthibitishwa kwa majaribio katika makala hii.

Vikwazo vikuu

Idadi ya sampuli chanya za kliniki: Kwa Zaire Ebola, sampuli 30 tu za seramu zenye RT-PCR chanya zilitathminiwa. Upana wa muda wa kujiamini wa unyeti unaakisi kutokuwa na uhakika kwa sampuli ndogo.

Uthibitishaji wa kliniki wa Sudan Ebola: Ingawa glycoprotein ya Sudan ilitambuliwa kwa mafanikio katika majaribio ya antijeni rekombinanti/spike, unyeti wa uchunguzi haukuonyeshwa kwa sampuli za kliniki kutoka kwa wagonjwa wenye Sudan Ebola.

Uboreshaji wa ulinganisho wa muundo: Waandishi walitumia kingamwili hiyo hiyo ya XC2-dhahabu ya utambuzi katika miundo yote miwili, lakini walisema kuwa hali za majaribio ziliboreshwa kwa muundo wa COLPLEX. Uboreshaji tofauti wa kiasi cha konjugati katika muundo wa moja kwa moja unaweza kupunguza usuli; hata hivyo, waandishi wanajadili kuwa hii inaweza pia kupunguza ishara.

Uthabiti: Kuna uchunguzi mzuri wa kuhifadhi kwa miezi saba, lakini hakuna utafiti wa uthabiti wa kimfumo.

Ulinganisho wa LoD na machapisho tofauti: Ulinganisho na vipimo vya haraka vya awali katika Jedwali la 2 la chanzo si kipimo cha head-to-head kilichofanywa katika jaribio moja sanifu.

Tofauti za kauli za nambari ndani ya chanzo: Unyeti wa kliniki umetolewa katika utangulizi na sehemu ya matokeo kwa kuzungusha na miundo tofauti ya muda wa kujiamini; uboreshaji wa LoD ya Sudan pia umeelezwa kuwa takribani mara 32 katika matokeo na mara 34 katika mjadala.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Kichwa asilia: COLPLEX: A high-affinity protein adaptor for enhanced sensitivity and multiplex lateral flow immunoassays. application to ebola virus strain detection

Waandishi: Romain Clément; Céline Couturier; Oumar Ndiaye; Cheikh Talibouya Touré; Frank William Mendy; Moussa Dia; Stéphanie Geoffroy; Anely Tranchot; Natacha Mariano; Stéphanie Donnat; Charlotte Mignon; Benoît Beitz; Alejandra Mier; Joseph Robert Anderson Fitchett; Oumar Faye; Cheikh Tidiane Diagne; Oxana Vratskikh; Christophe Védrine.

Corresponding author: Christophe Védrine.

Mchango sawa: Hakuna tamko la mchango sawa/mwandishi wa kwanza sawa katika chanzo kilichokaguliwa.

Taasisi a: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 40 avenue Tony Garnier, Lyon 69007, France.

Taasisi b: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 28 rue du Docteur Roux, Paris 75015, France.

Taasisi c: DIATROPIX, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Taasisi d: Virology Department, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Taasisi e: Executive Office, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Jarida: Sensors and Actuators B: Chemical.

Juzuu / tarehe ya kuchapishwa / nambari ya makala: Juzuu 454, 1 Mei 2026, 139608.

Tarehe ya kuchapishwa mtandaoni: 5 Februari 2026.

Tarehe ya kupokelewa: 6 Novemba 2025.

Tarehe ya marekebisho: 30 Januari 2026.

Tarehe ya kukubaliwa: 4 Februari 2026.

DOI: 10.1016/j.snb.2026.139608.

Mchapishaji: Elsevier B.V.

Aina ya chanzo: Makala ya utafiti iliyopitiwa na rika; uendelezaji wa biosensor/LFIA, tabia za kiuchanganuzi na uthibitishaji wa sampuli za kliniki.

Leseni: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Njia kuu ya marejeo ya kliniki: Zaire Ebola RT-PCR.

Ulinganisho mkuu wa kiuchanganuzi: COLPLEX biplex LFIA dhidi ya biplex LFIA ambapo kingamwili za kunasa zimewekwa moja kwa moja kwenye nitrocellulose.

Malengo ya kipimo: Glycoprotein ya Ebola ya Zaire na glycoprotein ya Ebola ya Sudan.

Adapta kuu za molekuli: ColAP41–ImAP41 na ColKhan–ImKhan.

Kingamwili kuu za kunasa: EE8 na JA7.

Kingamwili kuu ya utambuzi: XC2.

Mfumo wa utambuzi wa kuona: Konjugati ya chembe ya dhahabu ya 40 nm.

Mifumo ya macho katika hatua ya uendelezaji: Chemiluminescence inayotegemea RLuc8 na NanoLuc.

Uchanganuzi wa picha na mstari: Chemidoc, ImageJ na Image Lab.

Programu ya takwimu: GraphPad Prism 10.0.

Mbinu ya LoB: Kutoka kwa vipimo 30 vya kurudia vya seramu hasi MeanBlank + 2,58 × SDBlank; kiwango cha kujiamini cha %99.

Mbinu ya LoD: Vipimo n=5 katika kila mkusanyiko, regression ya logistic yenye vigezo vinne, marekebisho ya mkengeuko sanifu na makutano ya LoB na mkunjo uliorekebishwa.

Paneli ya unyeti wa kliniki: Sampuli 30 za seramu za Zaire Ebola zenye RT-PCR chanya; 29 chanya za kweli, 1 hasi ya uongo.

Paneli ya umaalumu wa kliniki: Seramu 40 EBOV-hasi; 10 yellow fever, 10 dengue, 10 Rift Valley fever, 10 vidhibiti vyenye afya kutoka Senegal; zote hasi.

Paneli ya ziada ya matriki/kufungamana kusiko maalum: Seramu 50 zenye afya na plasma 50 za EDTA kutoka kwa wafadhili wenye afya barani Ulaya.

Maadili: Utafiti ulifanywa kwa mujibu wa kanuni za Azimio la Helsinki na sampuli zilitolewa utambulisho kabla ya uchanganuzi. Ilielezwa kuwa idhini tofauti ya IRB haikuhitajika kwa sampuli za Ebola kwa sababu zilipatikana kutokana na usimamizi wa kawaida wa kesi wakati wa jukumu la dharura la mamlaka za kitaifa za afya; wagonjwa walitoa ridhaa ya mdomo kwa kipimo cha Ebola na sampuli zilihifadhiwa baadaye katika biobank ya marejeo. Sampuli nyingine za homa za hemorrhagic na wafadhili wenye afya zilikuwa mabaki kutoka shughuli za ufuatiliaji zilizoidhinishwa kimaadili.

Upatikanaji wa data: Imeelezwa kuwa data itatolewa kwa ombi la msingi.

Tamko la ufadhili: Hakuna sehemu tofauti ya Funding wala tamko maalum la ufadhili katika PDF kuu iliyokaguliwa; kwa hiyo chanzo cha ufadhili hakijabuniwa.

Tamko la akili bandia: Hakuna tamko tofauti la matumizi ya generative AI katika PDF kuu iliyokaguliwa.

Mgongano wa maslahi: Imeripotiwa kuwa hataza WO2020104397A1 ya Christophe Védrine yenye kichwa “Methods and reagents for multiplex binding experiments” inasubiri kwa niaba ya BIOASTER. Waandishi wengine hawakuripoti maslahi ya kifedha yanayoshindana au uhusiano wa kibinafsi unaojulikana ambao unaweza kuonekana kuathiri utafiti.

Michango ya CRediT: Oumar Faye — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Resources, Investigation, Formal analysis; Cheikh Talibouya Touré — Resources, Investigation, Data curation; Joseph Robert Anderson Fitchett — Writing – review & editing, Validation; Anely Tranchot — Visualization, Investigation, Formal analysis; Christophe Védrine — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Formal analysis, Conceptualization; Stéphanie Geoffroy — Visualization, Validation, Investigation, Formal analysis; Oxana Vratskikh — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Supervision, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Moussa Dia — Resources, Investigation, Data curation; Cheikh Tidiane Diagne — Writing – review & editing, Validation, Resources, Investigation, Formal analysis; Frank William Mendy — Resources, Investigation, Data curation; Benoît Beitz — Visualization, Investigation, Formal analysis; Romain Clément — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Charlotte Mignon — Visualization, Supervision, Methodology, Formal analysis; Stéphanie Donnat — Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Natacha Mariano — Writing – original draft, Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Oumar Ndiaye — Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis; Alejandra Mier — Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Conceptualization; Céline Couturier — Visualization, Investigation, Formal analysis.

Tofauti ya kiasi ndani ya chanzo 1: Katika utangulizi/muhtasari wa awali, kwa sampuli 29/30 chanya za kliniki, unyeti umeandikwa kuwa %96,6 na muda wa kujiamini %82,24–99,91, ilhali katika sehemu ya matokeo umeandikwa %96,7 na %95 CI %83,3–99,9. Uwiano msingi usiorekebishwa ni 29/30.

Tofauti ya kiasi ndani ya chanzo 2: Uboreshaji wa LoD ya GPSudan umeandikwa kuwa takribani mara 32 katika sehemu ya matokeo na mara 34 katika sehemu ya mjadala. Thamani za LoD zilizoripotiwa moja kwa moja ni 0,065 nM / 2,2 ng/mL na 2,10 nM / 70,98 ng/mL.

Maelezo ya istilahi ndani ya chanzo: Sehemu ya mbinu inaeleza jozi ya AP41 kuwa ya asili ya Pseudomonas aeruginosa AP41, huku katika sehemu ya matokeo mahali pamoja ikitumia kauli Pseudomonas aeruginosa PAO1. Maandishi ya Verianla hayajapanua utata huu na yametumia jina canonical la jozi ndani ya utafiti, AP41.

Ujenzi upya wa kuona: Usanifu wa kipimo katika Mchoro wa 4 wa chanzo umejengwa upya kama inline SVG kwa muundo tofauti wa picha kulingana na uhusiano wa chanzo. Grafu za kiasi za mkusanyiko katika Michoro ya 6–7 hazijachorwa kwa interpolation bandia kwa sababu kuratibu zote za pointi ghafi hazipo katika maandishi makuu; LoB, LoD na matokeo ya kliniki yaliyoripotiwa wazi yamewasilishwa katika majedwali ya HTML.

Kikomo kikuu cha tafsiri: COLPLEX ni prototipu iliyoonyesha utendaji mzuri wa kiuchanganuzi na wa awali wa sampuli za kliniki katika utafiti huu. Matokeo hayaonyeshi kwamba kifaa kitatoa utendaji uleule katika hali zote za milipuko ya Ebola, kimethibitishwa kliniki kwa wagonjwa wa Sudan Ebola, kimepata idhini ya udhibiti au kina muda mrefu wa rafu uliothibitishwa.