COLPLEX lateral oqim immunoassaylarida maqsad antigenlarni tutish uchun kolitsin deb ataladigan bakterial oqsillar bilan ularga xos immunitet oqsillari o‘rtasidagi juda yuqori affinitetli va bir-biridan ajratib bo‘ladigan oqsil–oqsil o‘zaro ta’sirlaridan foydalanadigan molekulyar adapter tizimidir. Ushbu tadqiqot COLPLEXni Zaire va Sudan Ebola virusi glikoproteinlarini bir xil lateral oqim tasmasida bir-biridan farqlay oladigan biplex LFIA prototipiga integratsiya qilgan; tizim oqsil bog‘lanish tajribalari, ELISA, xemilyuminessent LFIA, oltin nanozarrali quruq LFIA, analitik aniqlash chegarasi tajribalari va inson zardobi/plazmasi namunalari bilan baholangan.

Asosiy arxitekturada o‘zaro kross-reaksiya bermaydigan ikkita kolitsin–immunitet juftligidan foydalanilgan. ColAP41–ImAP41 tizimi Zaire Ebola glikoproteiniga xos EE8 tutuvchi antitela bilan, ColKhan–ImKhan tizimi esa Zaire va Sudan glikoproteinlarini taniy oladigan JA7 tutuvchi antitela bilan juftlangan. Har ikki maqsad uchun XC2 nomli umumiy aniqlovchi antitela ishlatilgan. Ushbu dizayn tufayli Sudan glikoproteini faqat Khan test chizig‘ini, Zaire glikoproteini esa AP41 va Khan test chiziqlarining ikkalasini ham hosil qiladi. Shunday qilib, bitta tasmada ikki xil signal naqshi orqali maqsadlarni farqlash mumkin.

Oltin nanozarralardan foydalanadigan quruq LFIA formatida COLPLEX prototipining Zaire Ebola glikoproteini uchun aniqlash chegarasi 0,034 nM (1,1 ng/mL), antitela to‘g‘ridan-to‘g‘ri immobilizatsiya qilingan taqqoslash formatida esa 0,47 nM (15,18 ng/mL) deb xabar qilingan. Sudan Ebola glikoproteini uchun COLPLEX aniqlash chegarasi 0,065 nM (2,2 ng/mL), to‘g‘ridan-to‘g‘ri formatda esa 2,10 nM (70,98 ng/mL) bo‘lgan. COLPLEX shuningdek pastroq blank signal va ko‘rinuvchanroq test chiziqlarini hosil qilgan.

Klinik baholashda avvalgi Ebola epidemiyalaridan olingan RT-PCR musbat 30 ta Zaire Ebola zardob namunasining 29 tasi COLPLEX biplex prototipi tomonidan musbat deb topilgan, bir RT-PCR musbat namuna noto‘g‘ri manfiy bo‘lib qolgan. Natijalar bo‘limida sezgirlik %96,7 (%95 ishonch oralig‘i: %83,3–99,9) deb xabar qilingan. Sariq isitma, dengue, Rift Valley fever infeksiyalari va Senegaldan sog‘lom nazoratlarni o‘z ichiga olgan 40 ta EBOV-manfiy zardob namunasining barchasi manfiy bo‘lgan va klinik o‘ziga xoslik %100 ni tashkil etgan.

Bu natijalar muhim bo‘lsa-da, prototip hali keng ko‘lamli prospektiv dala diagnostika tadqiqoti emas. Klinik sezgirlik faqat 30 ta Zaire Ebola musbat zardob namunasida baholangan; Sudan Ebola uchun klinik bemor namunalari bo‘yicha ko‘rsatkich ushbu tadqiqotda ko‘rsatilmagan. Bundan tashqari, quruq tasmalar xona haroratida yetti oy saqlanganda ishlash qobiliyati saqlangani kuzatilgan bo‘lsa-da, mualliflar barqarorlik tizimli ravishda o‘rganilmaganini ochiq aytadi.

Lateral flow immunoassay nima?

Lateral flow immunoassay (LFIA; lateral oqim immunoassayi) — suyuq namuna g‘ovak tasma bo‘ylab kapillyar kuch ta’sirida harakatlanadigan va namunadagi maqsad molekulaning muayyan tutuvchi/tanish reagentlari bilan o‘zaro ta’siri natijasida ko‘zga ko‘rinadigan yoki qurilma bilan o‘lchanadigan test chiziqlari hosil bo‘ladigan tezkor test platformasidir.

LFIAlarning muhim afzalliklari tez natija, sodda foydalanish, ko‘chma imkoniyat va markaziy laboratoriyaga bog‘liqlikning kamayishidir. Bu xususiyatlar, ayniqsa, laboratoriya imkoniyati cheklangan past va o‘rta daromadli hududlarda point-of-care testlari uchun qimmatlidir.

Biroq tezkor testlarda bir vaqtning o‘zida bir nechta maqsadni aniqlash, yuqori sezgirlikni saqlash va nospetsifik fonni past darajada ushlab turish qiyin bo‘lishi mumkin. Tadqiqot ko‘rib chiqayotgan muhandislik muammosi aynan shudir.

Multiplex yoki biplex nimani anglatadi?

Multiplex bitta test ichida bir nechta maqsadning bir-biridan ajratilgan holda o‘lchanishini anglatadi. Ushbu tadqiqotda ikkita Ebola glikoprotein maqsadi bir xil tasma ustida farqlangani uchun tizim biplex, ya’ni ikki maqsadli multiplex tuzilma sifatida ishlab chiqilgan.

Multiplex dizaynning potensial afzalligi faqat ikkita alohida test o‘rniga bitta testdan foydalanish emas. Bir xil biologik namuna hajmi bilan bir nechta maqsadni tahlil qilish mumkin; ishlatiladigan membrana, qadoqlash, sifat nazorati va ayrim reagent miqdorlari kamaytirilishi mumkin.

Kolitsin va immunitet oqsili nima?

Kolitsinlar ayrim bakteriyalar raqib bakteriyalarni bostirish uchun ishlab chiqaradigan antibakterial oqsillardir. Kolitsin ishlab chiqaruvchi bakteriya bir vaqtning o‘zida o‘zining toksik oqsilidan himoyalanish uchun unga nihoyatda kuchli va o‘ziga xos tarzda bog‘lanadigan immunitet oqsilini ham ishlab chiqaradi.

Ushbu tabiiy juftliklarning muhim xususiyati juda yuqori bog‘lanish affiniteti va o‘ziga xosligidir. Adabiyotlarda ayrim kolitsin–immunitet juftliklari uchun taxminan 10⁻¹⁴ M darajasidagi dissotsiatsiya konstantalari xabar qilingan. Taqqoslash uchun streptavidin–biotin o‘zaro ta’siri taxminan 10⁻¹⁵ M darajasidagi juda kuchli tabiiy nokovalent o‘zaro ta’sirlardan biridir.

Muhim talqin chegarasi: Ushbu tadqiqot tanlangan AP41 va Khan juftliklarining aniq K_d qiymatini sirt plazmon rezonansi kabi usul bilan o‘lchamagan. Tadqiqot funksional bog‘lanish tajribalarida bu juftliklar kuchli cognate bog‘lanish ko‘rsatganini va kuzatiladigan non-cognate kross-reaksiya bermaganini ko‘rsatgan. Femtomolyar darajadagi K_d ma’lumoti avvalgi kolitsin–immunitet adabiyotidan keladi.

Bio-orthogonal tanish nima uchun foydali?

COLPLEXning multiplex nuqtayi nazaridan asosiy afzalligi bir nechta turli kolitsin–immunitet juftliklarini bir-biriga xalaqit bermasdan ishlatish mumkinligidir. AP41 immunitet oqsili AP41 kolitsin chizig‘iga, Khan immunitet oqsili esa Khan kolitsin chizig‘iga bog‘lanadi. Manba 1-rasmda bajarilgan oddiy bog‘lanish tajribalarida cognate juftliklar kuchli signal bergan, non-cognate kombinatsiyalarda esa aniqlanadigan kross-reaksiya kuzatilmagan.

Bu xususiyat turli tutuvchi antitelalarning turli immunitet oqsillariga bog‘lanib, tasmadagi turli kolitsin chiziqlariga yo‘naltirilishiga imkon beradi. Shunday qilib, yagona biotin–streptavidin tizimi barcha tutuvchi komplekslarni bir xil molekulyar langarga yo‘naltirish o‘rniga, har bir maqsad alohida molekulyar manzil orqali ushlanadi.

COLPLEX Nega Antitelani To‘g‘ridan-to‘g‘ri Immobilizatsiya Qilishdan Ko‘ra Sezgirroq Bo‘lishi Mumkin?

Manba tadqiqot natijalariga ko‘ra, COLPLEX formatida yuqori affinitetli kolitsin–immunitet o‘zaro ta’siri, antigen–antitela komplekslarining lateral oqim vaqtida eritmada hosil bo‘lishi va tutuvchi antitelaning nitrosellyuloza ustiga to‘g‘ridan-to‘g‘ri quritilmasligi birgalikda yuqoriroq test chizig‘i signali va pastroq nospetsifik fon bilan bog‘langan; ammo tadqiqot ushbu hissalarning har birini alohida miqdoriy ajratadigan mexanizm tajribasini o‘tkazmagan.

Klassik to‘g‘ridan-to‘g‘ri formatda tutuvchi antitela nitrosellyuloza membranasining test chizig‘iga bevosita immobilizatsiya qilinadi. Bu yondashuvda antitelaning qurish va sirtga bog‘lanish vaqtida konformatsiyasi ta’sirlanishi mumkin va antigen bilan o‘zaro ta’sir vaqti lateral oqimning fizik sharoitlari bilan cheklanishi mumkin.

COLPLEX yondashuvida tutuvchi antitelalar avval tegishli immunitet oqsiliga fuzion holatda bo‘ladi. Antigen, tutuvchi antitela va aniqlovchi antitela oqim davomida eritmada kompleks hosil qilishi mumkin. Hosil bo‘lgan kompleks keyin immunitet oqsili orqali tasmadagi cognate kolitsin chizig‘iga juda kuchli bog‘lanadi.

Tadqiqotda COLPLEX formatida to‘g‘ridan-to‘g‘ri formatga qaraganda kamroq tutuvchi antitela miqdori ishlatilgan. Muhokama bo‘limida har bir antitela uchun taxminan 0,2–0,3 µg COLPLEX tutuvchi antitela ishlatilishi, to‘g‘ridan-to‘g‘ri formatdagi taxminan 0,5 µg bilan taqqoslanganda 1,6–2,5 baravar kam reagent sarfiga to‘g‘ri kelishi aytilgan.

COLPLEX va streptavidin–biotin taqqoslanishi

Tadqiqotchilar AP41 immunitet oqsiliga ham Renilla luciferase tegi, ham biotinlanadigan Avi-tag qo‘shib, ayni oqsilning immobilizatsiyalangan ColAP41ga yoki polimerik streptavidinga bog‘lanishini taqqoslagan.

ELISA tajribasida polistreptavidin–biotin tizimi yuqoriroq mutlaq signal hosil qilgan, biroq yuqoriroq fon signalini ham ko‘rsatgan. COLPLEX AP41 tizimi pastroq fon bilan kuchli bog‘lanish profilini yaratgan. Mualliflar bu natijani COLPLEX streptavidin–biotinga muqobil yoki uni to‘ldiruvchi yuqori affinitetli adapter platformasi bo‘lishi mumkinligi tarzida talqin qiladi.

Bitta Tasma Zaire va Sudan Ebola Glikoproteinlarini Qanday Ajratadi?

Biplex prototipda Sudan Ebola glikoproteini faqat JA7–ImKhan kompleksini hosil qilib Khan test chizig‘ini musbat qiladi, Zaire Ebola glikoproteini esa ham EE8–ImAP41, ham JA7–ImKhan komplekslarini hosil qilgani uchun ikkala test chizig‘ini ham musbat qiladi; antigen bo‘lmasa faqat nazorat chizig‘i ko‘rinadi.

Uchta asosiy antitelaning vazifasi

Quruq oltin nanozarrali test qanday qo‘llanadi?

Yakuniy prototip bosqichida barcha reagentlar tasma ustida quruq holatga keltirilgan. Test uchun 10 µL zardob yoki plazma 90 µL migratsiya buferi bilan suyultirilgan va tasma aralashmaga joylashtirilgan. Test 20 daqiqa rivojlantirilgan va keyin natija o‘qilgan.

XC2 aniqlovchi antitela 40 nm oltin nanozarralarga bog‘langan. COLPLEX tutuvchi antitela–immunitet fuzionlari va XC2-oltin konjugati konjugat pedlarida quritilgan. Nitrosellyuloza membranasida ColAP41 va ColKhan alohida test chiziqlari sifatida joylashgan.

Test tasmalari 5 mm kenglikda kesilgan va quritgich saqlovchi yopiq paketlarda xona haroratida saqlangan.

Xemilyuminessent rivojlantirish bosqichi nima uchun bajarildi?

Oltin nanozarrali yakuniy quruq formatdan oldin tadqiqotchilar molekulyar bog‘lanish arxitekturasini sezgirroq optik o‘qish tizimi bilan tasdiqlash uchun Renilla luciferase va NanoLuc asosidagi xemilyuminessent tajribalarni o‘tkazgan.

Oddiy bog‘lanish formatida RLuc8–immunitet fuzionlari ishlatilgan; to‘liq immunoassay formatida esa tutuvchi antitela–immunitet fuzionlari, Ebola glikoprotein antigenlari va NanoLuc tashuvchi XC2 aniqlovchi antitela birgalikda ishlatilgan. Bu tajribalar AP41 va Khan tizimlarining o‘z cognate test chiziqlariga tanlab bog‘lanishini va multiplex arxitektura ishlashini tasdiqlash uchun o‘tkazilgan.

LoB va LoD Nimani Anglatadi?

Limit of Blank (LoB) maqsad antigen bo‘lmagan blank namunalardan kutilishi mumkin bo‘lgan yuqori signal chegarasini; Limit of Detection (LoD) esa test signali blank taqsimotidan ishonchli ajratilishi mumkin bo‘lgan eng past maqsad konsentratsiyasini anglatadi. Ushbu tadqiqotda LoB qayta-qayta test qilingan manfiy zardobdan, LoD esa ortib boruvchi antigen konsentratsiyalariga qo‘llangan to‘rt parametrli logistik regressiya va LoB kesishish yondashuvidan hisoblangan.

LoB formulasi

\(\mathrm{LoB}=\overline{X}_{\mathrm{Blank}}+(2.58\times SD_{\mathrm{Blank}})\)

Formula nimani hisoblaydi? Antigen bo‘lmagan manfiy namunalar yaratgan signal taqsimotining yuqori qaror chegarasini.

\(\overline{X}_{\mathrm{Blank}}\) nima? Qayta o‘lchangan blank/manfiy namuna signallarining o‘rtacha qiymati.

\(SD_{\mathrm{Blank}}\) nima? Blank signallarining standart og‘ishi.

2,58 nima uchun ishlatilgan? Manba bu koeffitsiyent %99 ishonch darajasiga mos kelishini bildiradi.

Birlik nima? Tadqiqotda chiziq signallari test line intensity (TLI) birliklarida baholangan.

LoB hisoblash uchun manfiy zardob namunasi 30 marta test qilingan.

LoD qanday hisoblangan?

Manba LoD uchun bitta yopiq tenglama bermaydi. Buning o‘rniga ortib boruvchi antigen konsentratsiyalari har bir konsentratsiyada n=5 takror bilan o‘lchangan va signal-konsentratsiya munosabati to‘rt parametrli logistik regressiya (4PL) bilan modellashtirilgan.

LoBdan yuqori konsentratsiyalarning standart og‘ishlari o‘rtachalashtirilgan; hosil bo‘lgan egri chiziqdan 2,58 × SD ayirilib, konservativroq tuzatilgan egri chiziq olingan va LoB bilan shu tuzatilgan egri chiziq kesishgan konsentratsiya LoD sifatida aniqlangan.

Manba 4PL funksiyasining ochiq matematik tenglamasini yoki to‘rtta parametrning sonli qiymatlarini asosiy matnda bermaydi. Shu sababli bu yerda manbadan tashqari 4PL formulasi yoki parametr qiymati yaratilmagan.

Normallashtirilgan test chizig‘i intensivligi qanday hisoblangan?

Turli fotosuratlarda olingan chiziq signallarini taqqoslash uchun test chizig‘ining ImageJ bilan o‘lchangan pik maydoni har bir fotosuratdagi bosma standart chiziq pik maydoniga bo‘lingan va natija 1000 ga ko‘paytirilgan.

\(I_{\mathrm{norm}}=\frac{A_{\mathrm{test}}}{A_{\mathrm{standard}}}\times1000\)

\(A_{\mathrm{test}}\): test chizig‘ining pik maydoni.

\(A_{\mathrm{standard}}\): ayni fotosuratdagi bosma standart chiziqning pik maydoni.

\(I_{\mathrm{norm}}\): fotosuratlararo taqqoslashni osonlashtiradigan normallashtirilgan nisbiy signal qiymati.

Bu kattalik haqiqiy antigen konsentratsiyasi emas. Antigen konsentratsiyasi alohida eksperimental suyultirish qatori orqali belgilangan.

COLPLEX bilan to‘g‘ridan-to‘g‘ri formatning LoB taqqoslanishi

Manba to‘g‘ridan-to‘g‘ri testlarning blank signali mos COLPLEX formatlaridan taxminan 5 baravar va 7,5 baravar yuqori ekanini bildiradi. Pastroq LoB past antigen konsentratsiyalaridagi haqiqiy test signalini fondan ajratishni osonlashtirishi mumkin.

LoD taqqoslanishi

Natijalar bo‘limi GPSudan uchun LoD “taxminan 32 baravar”, GPZaire uchun esa “15 baravar” past bo‘lganini bildiradi. Muhokama bo‘limida GPSudan yaxshilanishi keyinroq “34 baravar” deb ifodalangan. Manba ichidagi ushbu yaxlitlash/ifoda farqi sabab Verianla bayonida yuqoridagi to‘g‘ridan-to‘g‘ri o‘lchangan LoD qiymatlari asos qilib olingan; yangi ko‘paytirish soni uydirilmagan.

10 nM antigen darajasidagi signal taqqoslanishi

Manba 6-rasmning miqdoriy tahlilida 10 nM GPSudan uchun Khanga asoslangan COLPLEX chizig‘i to‘g‘ridan-to‘g‘ri formatga qaraganda taxminan 4 baravar kuchliroq signal hosil qilgan. 10 nM GPZaire sharoitida AP41 va Khanga asoslangan COLPLEX chiziqlari tegishli to‘g‘ridan-to‘g‘ri formatlarga nisbatan mos ravishda taxminan 3 baravar va 2 baravar kuchliroq signal bergan.

Bular muayyan 10 nM test sharoitiga tegishli signal kattaligi taqqoslashlaridir; barcha konsentratsiyalarda doimiy ko‘payish bor degani emas.

Tadqiqot Usuli va Natijalari

Inson namunalari

Klinik sezgirlikni baholash uchun tasdiqlangan Zaire Ebola infeksiyasi bo‘lgan 30 ta zardob namunasi ishlatilgan. Manba bu namunalarni RT-PCR cycle threshold (Ct) qiymatlariga ko‘ra quyidagicha bildiradi:

Manba taqdimoti bo‘yicha izoh: Maqola bu guruhlarni yuqoridagi “<” yorliqlari bilan beradi; oraliqlar bir-birini istisno qiladigan, masalan 20–24,99 kabi sinflarmi yoki yo‘qmi, asosiy matnda alohida aniqlashtirilmagan. Shu sababli yorliqlar yashirincha qayta ta’riflanmagan.

Manfiy klinik o‘ziga xoslik panelida 40 ta zardob namunasi bo‘lgan:

• 10 ta sariq isitma virusi musbat zardobi,
• 10 ta dengue virusi musbat zardobi,
• 10 ta Rift Valley fever virusi musbat zardobi,
• 10 ta Senegaldan endemik sog‘lom nazorat zardobi.

Bundan tashqari, Fransiya Qon Xizmati taqdim etgan 50 ta sog‘lom zardob va 50 ta EDTA plazma namunasi, ayniqsa, nospetsifik test chizig‘i signali va matritsa mosligi uchun alohida baholangan.

RT-PCR referens usuli

Zaire Ebola RNKsi QuantiTect RT-PCR Master Mix Probe to‘plami bilan baholangan. Manbada 5 µL RNK 20 µL master mixga qo‘shilgani aytilgan.

Termal profil:

• 50°C da 10 daqiqa teskari transkripsiya,
• 95°C da 15 daqiqa teskari transkriptaza inaktivatsiyasi va DNA polimeraza aktivatsiyasi,
• 45 amplifikatsiya sikli,
• har bir siklda 95°C da 5 soniya,
• 60°C da 50 soniya annealing-extension.

Aniq logarifmik amplifikatsiya va Ct <38 musbat deb qabul qilingan. Ct 38–42 oralig‘idagi namunalar shubhali/noaniq deb baholangan; aniq logarifmik amplifikatsiya bo‘lmagan namunalar manfiy deb qabul qilingan.

Ct real-time PCR signalining belgilangan fluoressensiya chegarasidan oshishi uchun zarur amplifikatsiya sikllari sonidir. Ushbu tadqiqotda RT-PCR klinik LFIA baholashida referens usul sifatida ishlatilgan.

Kolitsin–immunitet juftliklarini tanlash

Ikki mustaqil oqsil juftligi tanlangan:

• Col/Im AP41: Colicin WP_134294768 va Immunity WP_017002173.
• Col/Im Khan: Colicin WP_036849747 va Immunity WP_036849748.

Usul bo‘limida AP41 juftligi Pseudomonas aeruginosa AP41, Khan juftligi esa Photorhabdus khanii kelib chiqishli deb berilgan. Natijalar bo‘limida AP41 manbasini ta’riflovchi bir jumlada “Pseudomonas aeruginosa PAO1” iborasi uchraydi. Manbadagi bu kichik terminologik nomuvofiqlik tuzatilgandek ko‘rsatilmagan; tizim maqola davomida tadqiqotchilar ishlatgan AP41 nomi bilan atalgan.

Rekombinant oqsil ishlab chiqarish

Kolitsin DNaza domenlarini va mos immunitet oqsillarini kodlaydigan DNA ketma-ketliklari ekspressiya plazmidlariga klonlangan. Kolitsinlar DNaza–mCherry fuzion oqsillari va C-terminal 6×His tegi bilan; immunitet oqsillari esa N-terminal Renilla luciferase fuzioni va C-terminal 6×His tegi bilan ishlab chiqarilgan.

Plazmidlar E. coli BL21(DE3) hujayralariga o‘tkazilgan, ekspressiya o‘rta log fazada IPTG bilan induksiya qilingan va hujayralar tun davomida inkubatsiyadan so‘ng yig‘ilgan. Eruvchan oqsillar avval Ni²⁺-NTA affinitet xromatografiyasi, keyin size-exclusion chromatography bilan tozalangan.

EE8 va JA7 tutuvchi antitelalari hamda XC2 aniqlovchi antitela avvalgi tadqiqotdan olingan gibridoma kelib chiqishli antitelalardir. JA7–ImKhan va EE8–ImAP41 rekombinant fuzion antitelalari CHO hujayralarida ishlab chiqarilgan va Protein A yordamida tozalangan.

Tasma ishlab chiqarish

Oltin nanozarrali yakuniy test protsedurasi

Har bir testda 10 µL zardob yoki plazma 90 µL migratsiya buferida suyultirilgan. Bufer tarkibida 240 mM Tris pH 7,7; 50 mM EDTA; %0,1 kazein va %0,5 BigCHAP bo‘lgan. Tasma quduqchaga joylashtirilgan va test 20 daqiqa rivojlantirilgan.

Xemilyuminessent LFIA protsedurasi

Oddiy formatda reaksiya aralashmasi PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 sog‘lom inson zardobi va 10 nM RLuc8–ImAP41 va/yoki RLuc8–ImKhan ni o‘z ichiga olgan.

To‘liq formatda PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 sog‘lom inson zardobi, 10 nM XC2–NanoLuc, 20 nM EE8–ImAP41, 20 nM JA7–ImKhan va Zaire yoki Sudan Ebola glikoprotein antigenidan foydalanilgan.

100 µL reaksiya aralashmasi xona haroratida 15 daqiqa inkubatsiya qilingan, keyin tasma 10 daqiqa migratsiya qilingan. Xemilyuminessent tasvirlashda oddiy format uchun 35 soniya, to‘liq format uchun 75 soniya ekspozitsiya ishlatilgan.

AP41 va Khanning o‘ziga xosligini tasdiqlash

Manba 1-rasmda AP41 va Khan kolitsin–immunitet juftliklari ham lateral flow, ham mikroplastinka formatida baholangan. Cognate o‘zaro ta’sirlarda kuchli signal hosil bo‘lgan, qarama-qarshi juftliklarda kuzatiladigan non-cognate kross-reaksiya aniqlanmagan. Ushbu tajribalarda xato chiziqlari standart og‘ishni ko‘rsatadi va N=3 takror ishlatilgan.

Manba 3-rasmda to‘liq Ebola glikoprotein immunoassayi ELISA formatida sinovdan o‘tkazilgan. ColAP41 bilan qoplangan quduqchalarda EE8–ImAP41/GPZaire/XC2–NanoLuc tizimi signal hosil qilgan, Khan asosidagi komplekslar signal bermagan; ColKhan bilan qoplangan quduqchalarda esa JA7–ImKhan tizimi Zaire yoki Sudan glikoproteini bilan signal hosil qilgan. ELISA tajribalari N=3, xemilyuminessent LFIA namoyishi N=2 bilan berilgan.

Analitik ko‘rsatkich

Manba 6-rasmda GPZaire va GPSudan antigenlari ortib boruvchi konsentratsiyalarda COLPLEX va to‘g‘ridan-to‘g‘ri formatlar bilan taqqoslangan. COLPLEX formatidagi test chiziqlari sinovdan o‘tkazilgan barcha umumiy konsentratsiyalarda yuqoriroq signal bergan va pastroq konsentratsiyalarda vizual aniqlanadigan chiziqlar hosil qilgan.

COLPLEX tajribalari uchun manba 6-rasmda N=5, to‘g‘ridan-to‘g‘ri format uchun N=3 takror ishlatilgan. Xato chiziqlari standart og‘ishni ko‘rsatadi.

Manfiy zardob va plazma matritsalarida nospetsifik bog‘lanish

Sog‘lom yevropalik donorlardan olingan 50 zardob va 50 EDTA plazma namunasida test chiziqlarida vizual signal kuzatilmagan. Hisoblangan test chizig‘i signallari AP41 va Khan uchun belgilangan LoB chegaralaridan past bo‘lgan.

Manba zardob va EDTA plazma matritsalari o‘rtasida aniq farq kuzatilmaganini va buni prototipning turli klinik namuna turlarida ishlash qobiliyatini qo‘llab-quvvatlovchi natija sifatida talqin qiladi.

Biroq bu 100 namuna Ebola tashqarisidagi boshqa infeksiyalarning barcha mumkin bo‘lgan interferensiyalarini sinovdan o‘tkazuvchi klinik o‘ziga xoslik paneli emas. Shu maqsadda sariq isitma, dengue va Rift Valley fever namunalarini o‘z ichiga olgan 40 zardoblik manfiy klinik panel ham ishlatilgan.

Klinik Namunalarda %96,7 Sezgirlik va %100 O‘ziga Xoslik Nimani Anglatadi?

Tadqiqotning klinik panelida 30 RT-PCR musbat Zaire Ebola zardobining 29 tasi COLPLEX bilan musbat, bittasi manfiy topilgan; 40 EBOV-manfiy zardobning barchasi manfiy bo‘lgan. Ushbu namuna to‘plamida natijalar bo‘limida bildirilgan sezgirlik %96,7 va o‘ziga xoslik %100 ni tashkil qiladi; biroq ayniqsa faqat 30 ta musbat namuna borligi sababli bu ko‘rsatkichlar kattaroq va prospektiv dala populyatsiyalarida alohida tasdiqlanishi kerak.

Sezgirlik

Manba ta’rifining matematik ifodasi:

\(\mathrm{Duyarlılık}=\frac{TP}{TP+FN}\times100\)

Bu yerda TP haqiqiy musbat, FN noto‘g‘ri manfiy namunalar sonidir.

Tadqiqotda:

\(\frac{29}{29+1}\times100\approx96.7\%\)

Natijalar bo‘limida %95 ishonch oralig‘i %83,3–99,9 deb xabar qilingan.

O‘ziga xoslik

Manba ta’rifining matematik ifodasi:

\(\mathrm{Özgüllük}=\frac{TN}{TN+FP}\times100\)

Bu yerda TN haqiqiy manfiy, FP noto‘g‘ri musbat namunalar sonidir.

40 kishilik EBOV-manfiy klinik panelda:

\(\frac{40}{40+0}\times100=100\%\)

Kirish bo‘limida o‘ziga xoslik uchun %95 ishonch oralig‘i %88,43–100,00 deb berilgan.

Bitta noto‘g‘ri manfiy namuna

COY2117 kodli zardob namunasi RT-PCR bo‘yicha EBOV musbat bo‘lsa-da, biplex LFIA tomonidan aniqlanmagan. Manba bu namunaning RT-PCR Ct qiymatini 25,21 deb beradi va natijani noto‘g‘ri manfiy deb tasniflaydi.

Bu namuna prototip %100 klinik sezgirlikka ega emasligini aniq ko‘rsatadi.

Mavjud Ebola tezkor testlari bilan manba ichidagi taqqoslash

Mualliflar o‘z COLPLEX natijalarini ilgari chop etilgan Ebola LFIA tadqiqotlarining LoD qiymatlari bilan taqqoslagan. Bu taqqoslash bitta tajriba doirasida o‘tkazilgan head-to-head tadqiqot emas; turli nashrlardan xabar qilingan analitik LoD qiymatlarining kontekstual taqqoslanishidir.

WHO maqsadli mahsulot profili bilan manba ichidagi taqqoslash

Muhokama bo‘limida mualliflar oldingi meta-tahlilda mavjud Ebola antigen tezkor diagnostika testlari uchun birlashtirilgan sezgirlik va o‘ziga xoslik qiymatlari mos ravishda %82,1 va %97,0 deb xabar qilinganini keltiradi va ularni WHO Ebola diagnostik maqsadli mahsulot profili uchun ishlatiladigan >%95 sezgirlik va >%98 o‘ziga xoslik maqsadlari bilan taqqoslaydi.

Mualliflar o‘zlarining 30 musbat va 40 manfiy klinik namuna panelidagi %96,7 sezgirlik va %100 o‘ziga xoslik ushbu maqsadlarga mos kelishini aytadi. Biroq bu prototip WHO tomonidan tasdiqlangan yoki keng dala foydalanishiga tayyor degani emas; tadqiqot bunday regulyator tasdiqni xabar qilmaydi.

Ishlab chiqarish mumkinligi va barqarorlik kuzatuvlari

Kolitsin va immunitet oqsillari E. coli tizimida 14–35 mg/L kultura darajasida ishlab chiqarilishi mumkinligi xabar qilingan. Immunitet oqsili bilan fuzion tutuvchi antitelalarning CHO hujayralaridagi ishlab chiqarish unumdorligi ham an’anaviy antitelalar bilan taqqoslanadigan ekani aytiladi.

Quruq test tasmalari xona haroratida quruq sharoitda 7 oy saqlangandan keyin ishlash qobiliyatini saqlagani va fon signalida oshish kuzatilmagani xabar qilingan. Biroq mualliflar barqarorlik tizimli ravishda o‘rganilmaganini ochiq bildiradi. Shu sababli yetti oylik kuzatuv validatsiyalangan yaroqlilik muddati sifatida talqin qilinmasligi kerak.

Kelajakda taklif etilgan qo‘llanish sohalari

Mualliflar kolitsinlardan standart LFIA kassetalarida universal molekulyar manzillar sifatida foydalanish mumkinligini, turli maqsadlarga xos immunitet-oqsil fuzion antitelalar keyin ayni asosiy tasma arxitekturasiga tatbiq etilishi mumkinligini nazarda tutadi.

Shuningdek, COLPLEX faqat immunoassaylar bilan cheklanmasligi mumkinligi; immunitet oqsillari antitela o‘rniga primer yoki prob kabi oligonukleotidlarga bog‘lansa, RPA yoki LAMP kabi izotermal nuklein kislota amplifikatsiya mahsulotlari ham multiplex lateral flow formatida ushlanishi mumkinligi taklif etiladi.

Bu bo‘lim tadqiqotning kelajakka yo‘naltirilgan texnologik taklifidir. COLPLEX asosidagi RPA yoki LAMP molekulyar testi ushbu maqolada eksperimental ishlab chiqilmagan va tasdiqlanmagan.

Tadqiqot qo‘llab-quvvatlaydigan natijalar

• AP41 va Khan kolitsin–immunitet juftliklari ushbu tajriba sharoitida kuchli cognate bog‘lanish va kuzatiladigan non-cognate kross-reaksiyasiz ishlagan.
• Ikki alohida COLPLEX juftligi bitta LFIA tasmasida bir-biridan mustaqil molekulyar test chiziqlarini hosil qila oladi.
• COLPLEX prototipi Zaire va Sudan Ebola glikoproteinlarini turli chiziq naqshlari orqali farqlay olgan.
• COLPLEX formati antitelalarni to‘g‘ridan-to‘g‘ri immobilizatsiya qilishga qaraganda pastroq blank signal va pastroq LoD hosil qilgan.
• Zaire Ebola RT-PCR musbat 30 klinik zardob namunasining 29 tasi prototip tomonidan musbat deb topilgan.
• 40 EBOV-manfiy klinik zardob namunasining barchasi manfiy topilgan.
• 50 sog‘lom zardob va 50 sog‘lom EDTA plazma namunasida test chiziqlarida nospetsifik musbat signal kuzatilmagan.
• COLPLEX kamroq tutuvchi antitela miqdori bilan ishlay olgan.

Tadqiqot qo‘llab-quvvatlamaydigan natijalar

• Prototip barcha Ebola epidemiyalarida %96,7 sezgirlik bilan ishlashi isbotlanmagan.
• Sudan Ebola infeksiyasi bo‘lgan haqiqiy bemor zardoblarida klinik sezgirlik ushbu tadqiqotda o‘lchanmagan.
• 30 musbat va 40 manfiy namunadan olingan klinik ko‘rsatkich keng ko‘lamli prospektiv dala validatsiyasini almashtirmaydi.
• COLPLEXning aniq yaroqlilik muddati aniqlanmagan.
• Tanlangan AP41 va Khan juftliklarining aniq K_d qiymatlari ushbu tadqiqotda bevosita o‘lchanmagan.
• COLPLEX streptavidin–biotindan barcha foydalanish ssenariylarida ustun ekani isbotlanmagan.
• Ishlab chiqarish tannarxi haqiqiy sanoat miqyosida qancha kamayishi hisoblanmagan.
• Prototip uchun regulyator tasdiq yoki muntazam klinik foydalanish ruxsati xabar qilinmagan.
• COLPLEX asosidagi molekulyar RPA/LAMP ilovasi ushbu maqolada eksperimental tasdiqlanmagan.

Asosiy cheklovlar

Klinik musbat namuna soni: Zaire Ebola uchun faqat 30 RT-PCR musbat zardob namunasi baholangan. Sezgirlik ishonch oralig‘ining kengligi kichik namuna to‘plamidagi noaniqlikni aks ettiradi.

Sudan Ebola klinik validatsiyasi: Sudan glikoproteini rekombinant/spike antigen tajribalarida muvaffaqiyatli aniqlangan bo‘lsa-da, Sudan Ebola bemorlaridan olingan klinik namunalarda diagnostik sezgirlik ko‘rsatilmagan.

Format taqqoslashining optimallashtirilishi: Mualliflar bir xil XC2-oltin aniqlovchi antitelani har ikki formatda ishlatgan, ammo tajriba sharoitlari COLPLEX formati uchun optimallashtirilganini bildirgan. To‘g‘ridan-to‘g‘ri formatda konjugat miqdorini alohida optimallashtirish fonni kamaytirishi mumkin; biroq mualliflar bu signalni ham kamaytirishi mumkinligini muhokama qiladi.

Barqarorlik: Yetti oylik ijobiy saqlash kuzatuvi bor, ammo tizimli barqarorlik tadqiqoti yo‘q.

Turli nashrlar bilan LoD taqqoslanishi: Manba 2-jadvaldagi oldingi tezkor testlar bilan taqqoslash bitta standart tajribada o‘tkazilgan head-to-head test emas.

Manba ichidagi sonli ifoda farqlari: Klinik sezgirlik kirish va natijalar bo‘limlarida turli yaxlitlash/ishonch oralig‘i shakllarida berilgan; Sudan LoD yaxshilanishi ham natijalarda taxminan 32 baravar, muhokamada 34 baravar deb ifodalangan.

Manba va Usul Haqida Izoh

Asl sarlavha: COLPLEX: A high-affinity protein adaptor for enhanced sensitivity and multiplex lateral flow immunoassays. application to ebola virus strain detection

Mualliflar: Romain Clément; Céline Couturier; Oumar Ndiaye; Cheikh Talibouya Touré; Frank William Mendy; Moussa Dia; Stéphanie Geoffroy; Anely Tranchot; Natacha Mariano; Stéphanie Donnat; Charlotte Mignon; Benoît Beitz; Alejandra Mier; Joseph Robert Anderson Fitchett; Oumar Faye; Cheikh Tidiane Diagne; Oxana Vratskikh; Christophe Védrine.

Corresponding author: Christophe Védrine.

Teng hissa: Ko‘rib chiqilgan manbada teng hissa/teng birinchi muallif bayonoti yo‘q.

Muassasa a: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 40 avenue Tony Garnier, Lyon 69007, France.

Muassasa b: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 28 rue du Docteur Roux, Paris 75015, France.

Muassasa c: DIATROPIX, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Muassasa d: Virology Department, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Muassasa e: Executive Office, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Jurnal: Sensors and Actuators B: Chemical.

Jild / nashr sanasi / maqola raqami: Jild 454, 1 may 2026, 139608.

Onlayn nashr sanasi: 5 fevral 2026.

Olingan sana: 6 noyabr 2025.

Qayta ko‘rib chiqish sanasi: 30 yanvar 2026.

Qabul sanasi: 4 fevral 2026.

DOI: 10.1016/j.snb.2026.139608.

Nashriyot: Elsevier B.V.

Manba turi: Taqrizdan o‘tgan tadqiqot maqolasi; biosensor/LFIA ishlab chiqish, analitik xarakterizatsiya va klinik namuna validatsiyasi.

Litsenziya: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Asosiy klinik referens usul: Zaire Ebola RT-PCR.

Asosiy analitik taqqoslash: COLPLEX asosidagi biplex LFIA bilan tutuvchi antitelalar nitrosellyulozaga to‘g‘ridan-to‘g‘ri immobilizatsiya qilingan biplex LFIA.

Test maqsadlari: Zaire Ebola glikoproteini va Sudan Ebola glikoproteini.

Asosiy molekulyar adapterlar: ColAP41–ImAP41 va ColKhan–ImKhan.

Asosiy tutuvchi antitelalar: EE8 va JA7.

Asosiy aniqlovchi antitela: XC2.

Vizual aniqlash tizimi: 40 nm oltin nanozarra konjugati.

Ishlab chiqish bosqichidagi optik tizimlar: RLuc8 va NanoLuc asosidagi xemilyuminessensiya.

Tasvir va chiziq tahlili: Chemidoc, ImageJ va Image Lab.

Statistik dastur: GraphPad Prism 10.0.

LoB usuli: Manfiy zardobning 30 takroriy o‘lchovidan MeanBlank + 2,58 × SDBlank; %99 ishonch darajasi.

LoD usuli: Har bir konsentratsiyada n=5 o‘lchov, to‘rt parametrli logistik regressiya, standart og‘ish tuzatishi va LoB bilan tuzatilgan egri chiziq kesishishi.

Klinik sezgirlik paneli: 30 RT-PCR musbat Zaire Ebola zardob namunasi; 29 haqiqiy musbat, 1 noto‘g‘ri manfiy.

Klinik o‘ziga xoslik paneli: 40 EBOV-manfiy zardob; 10 sariq isitma, 10 dengue, 10 Rift Valley fever, 10 Senegal sog‘lom nazorat; barchasi manfiy.

Qo‘shimcha matritsa/nospetsifik bog‘lanish paneli: Yevropadagi sog‘lom donorlardan 50 sog‘lom zardob va 50 EDTA plazma.

Etika: Tadqiqot Helsinki deklaratsiyasi tamoyillariga muvofiq o‘tkazilgan va tahlildan oldin namunalar deidentifikatsiya qilingan. Ebola namunalari milliy sog‘liqni saqlash organlarining favqulodda javob vazifasi doirasida muntazam holat boshqaruvidan olingani sabab alohida IRB tasdig‘i talab qilinmagani; bemorlar Ebola testi uchun og‘zaki rozilik bergani va namunalar keyinchalik referens biobankda saqlangani bildirilgan. Boshqa gemorragik isitma va sog‘lom donor namunalari tegishli etik tasdiqlangan kuzatuv faoliyatlaridan qolgan namunalardir.

Ma’lumotlar mavjudligi: Ma’lumotlar asosli so‘rov bo‘yicha taqdim etilishi aytilgan.

Moliyalashtirish bayonoti: Ko‘rib chiqilgan asosiy PDFda alohida Funding bo‘limi yoki maxsus moliyalashtirish bayonoti yo‘q; shuning uchun moliyalashtirish manbasi uydirilmagan.

Sun’iy intellekt bayonoti: Ko‘rib chiqilgan asosiy PDFda alohida generativ sun’iy intellektdan foydalanish bayonoti yo‘q.

Manfaatlar to‘qnashuvi: Christophe Védrinening “Methods and reagents for multiplex binding experiments” nomli WO2020104397A1 patenti BIOASTER nomidan kutilayotgan holatda ekani xabar qilingan. Boshqa mualliflar tadqiqotga ta’sir ko‘rsatgandek ko‘rinishi mumkin bo‘lgan ma’lum raqobatlashuvchi moliyaviy manfaat yoki shaxsiy munosabatni bildirmagan.

CRediT hissalari: Oumar Faye — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Resources, Investigation, Formal analysis; Cheikh Talibouya Touré — Resources, Investigation, Data curation; Joseph Robert Anderson Fitchett — Writing – review & editing, Validation; Anely Tranchot — Visualization, Investigation, Formal analysis; Christophe Védrine — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Formal analysis, Conceptualization; Stéphanie Geoffroy — Visualization, Validation, Investigation, Formal analysis; Oxana Vratskikh — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Supervision, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Moussa Dia — Resources, Investigation, Data curation; Cheikh Tidiane Diagne — Writing – review & editing, Validation, Resources, Investigation, Formal analysis; Frank William Mendy — Resources, Investigation, Data curation; Benoît Beitz — Visualization, Investigation, Formal analysis; Romain Clément — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Charlotte Mignon — Visualization, Supervision, Methodology, Formal analysis; Stéphanie Donnat — Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Natacha Mariano — Writing – original draft, Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Oumar Ndiaye — Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis; Alejandra Mier — Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Conceptualization; Céline Couturier — Visualization, Investigation, Formal analysis.

Manba ichidagi miqdoriy nomuvofiqlik 1: Kirish/erta xulosa bo‘limida 29/30 klinik musbat namuna uchun sezgirlik %96,6 va ishonch oralig‘i %82,24–99,91 deb yozilgan, natijalar bo‘limida esa %96,7 va %95 CI %83,3–99,9 deb yozilgan. Asosiy xom nisbat 29/30 dir.

Manba ichidagi miqdoriy nomuvofiqlik 2: GPSudan LoD yaxshilanishi natijalar bo‘limida taxminan 32 baravar, muhokama bo‘limida 34 baravar deb yozilgan. To‘g‘ridan-to‘g‘ri xabar qilingan LoD qiymatlari 0,065 nM / 2,2 ng/mL va 2,10 nM / 70,98 ng/mL dir.

Manba ichidagi terminologiya izohi: Usul bo‘limi AP41 juftligini Pseudomonas aeruginosa AP41 kelib chiqishli deb ta’riflasa, natijalar bo‘limida bir joyda Pseudomonas aeruginosa PAO1 iborasi ishlatilgan. Verianla matni ushbu noaniqlikni kengaytirmagan va juftlikning tadqiqot ichidagi canonical nomi bo‘lgan AP41 ni ishlatgan.

Vizual qayta qurish: Manba 4-rasmdagi test arxitekturasi manba munosabatlariga asoslangan holda boshqa grafik kompozitsiyada inline SVG sifatida qayta qurilgan. 6–7-rasmlardagi miqdoriy konsentratsiya grafiklari esa xom nuqta koordinatalarining barchasi asosiy matnda bo‘lmagani sabab soxta interpolatsiya bilan chizilmagan; aniq xabar qilingan LoB, LoD va klinik natijalar HTML jadvallarida berilgan.

Asosiy talqin chegarasi: COLPLEX ushbu tadqiqotda kuchli analitik va dastlabki klinik namuna ko‘rsatkichlarini namoyish etgan prototipdir. Natijalar qurilma barcha Ebola epidemiyasi sharoitlarida ayni ko‘rsatkichni berishini, Sudan Ebola bemorlarida klinik tasdiqlanganini, regulyator tasdiq olganini yoki validatsiyalangan uzoq yaroqlilik muddatiga ega ekanini ko‘rsatmaydi.