COLPLEX, lateral axın immunoanalizlərində hədəf antigenləri tutmaq üçün kolisin adlanan bakterial zülallarla onlara spesifik immunitet zülalları arasındakı çox yüksək afinitəli və bir-birindən seçilə bilən zülal–zülal qarşılıqlı təsirlərindən istifadə edən molekulyar adapter sistemidir. Bu tədqiqat COLPLEX-i Zaire və Sudan Ebola virusu qlikoproteinlərini eyni lateral axın zolağında bir-birindən fərqləndirə bilən biplex LFIA prototipinə inteqrasiya etmiş; sistemi zülal bağlanma təcrübələri, ELISA, kemilüminessent LFIA, qızıl nanohissəcikli quru LFIA, analitik aşkarlama həddi təcrübələri və insan serum/plazma nümunələri ilə qiymətləndirmişdir.

Əsas arxitekturada bir-biri ilə çarpaz reaksiya verməyən iki kolisin–immunitet cütündən istifadə edilmişdir. ColAP41–ImAP41 sistemi Zaire Ebola qlikoproteininə spesifik EE8 tutucu anticismi ilə, ColKhan–ImKhan sistemi isə Zaire və Sudan qlikoproteinlərini tanıya bilən JA7 tutucu anticismi ilə cütləşdirilmişdir. Hər iki hədəf üçün XC2 adlı ortaq aşkarlayıcı anticisim istifadə edilmişdir. Bu dizayn sayəsində Sudan qlikoproteini yalnız Khan test xəttini, Zaire qlikoproteini isə həm AP41, həm də Khan test xətlərini yaradır. Beləliklə, bir zolaqda iki fərqli siqnal nümunəsi ilə hədəflər bir-birindən ayrılır.

Qızıl nanohissəciklərdən istifadə edən quru LFIA formatında COLPLEX prototipinin Zaire Ebola qlikoproteini üçün aşkarlama həddi 0,034 nM (1,1 ng/mL), anticismin birbaşa immobilizasiya edildiyi müqayisə formatında isə 0,47 nM (15,18 ng/mL) olaraq bildirilmişdir. Sudan Ebola qlikoproteini üçün COLPLEX aşkarlama həddi 0,065 nM (2,2 ng/mL), birbaşa formatda 2,10 nM (70,98 ng/mL) olmuşdur. COLPLEX həmçinin daha aşağı blank siqnalı və daha görünən test xətləri yaratmışdır.

Klinik qiymətləndirmədə əvvəlki Ebola epidemiyalarından əldə edilmiş RT-PCR müsbət 30 Zaire Ebola serum nümunəsinin 29-u COLPLEX biplex prototipi tərəfindən müsbət tapılmış, bir RT-PCR müsbət nümunə yanlış mənfi qalmışdır. Nəticələr bölməsində həssaslıq %96,7 (%95 etibar intervalı: %83,3–99,9) olaraq bildirilmişdir. Sarı qızdırma, dengue, Rift Valley fever infeksiyalarını və Seneqaldan sağlam nəzarətləri əhatə edən 40 EBOV-mənfi serum nümunəsinin hamısı mənfi çıxmış və klinik spesifiklik %100 olmuşdur.

Bu nəticələr mühüm olsa da, prototip hələ genişmiqyaslı prospektiv sahə diaqnostika tədqiqatı deyil. Klinik həssaslıq yalnız 30 Zaire Ebola müsbət serum nümunəsində qiymətləndirilmişdir; Sudan Ebola üçün klinik xəstə nümunələrində performans bu tədqiqatda göstərilməmişdir. Bundan əlavə, quru zolaqların otaq temperaturunda yeddi aylıq saxlanması zamanı performansın qorunduğu müşahidə edilsə də, müəlliflər stabilliyin sistemli şəkildə öyrənilmədiyini açıq şəkildə bildirirlər.

Lateral flow immunoassay nədir?

Lateral flow immunoassay (LFIA; lateral axın immunoanalizi), maye nümunənin məsaməli zolaq boyunca kapilyar qüvvə ilə irəlilədiyi və nümunədəki hədəf molekulun müəyyən tutucu/tanıma reagentləri ilə qarşılıqlı təsiri nəticəsində gözlə görünən və ya cihazla ölçülə bilən test xətlərinin yarandığı sürətli test platformasıdır.

LFIA-ların mühüm üstünlükləri sürətli nəticə, sadə istifadə, daşına bilmə və mərkəzi laboratoriyadan asılılığın azalmasıdır. Bu xüsusiyyətlər xüsusilə laboratoriya əlçatanlığının məhdud olduğu aşağı və orta gəlirli regionlarda point-of-care testləri baxımından dəyərlidir.

Bununla belə, sürətli testlərdə eyni vaxtda birdən çox hədəfi aşkar etmək, yüksək həssaslığı qorumaq və qeyri-spesifik fonu aşağı saxlamaq çətin ola bilər. Tədqiqatın araşdırdığı mühəndislik problemi məhz budur.

Multiplex və ya biplex nə deməkdir?

Multiplex, eyni test daxilində birdən çox hədəfin bir-birindən fərqləndirilərək ölçülməsini ifadə edir. Bu tədqiqatda iki Ebola qlikoprotein hədəfi eyni zolaq üzərində ayrıldığı üçün sistem biplex, yəni iki hədəfli multiplex quruluş kimi hazırlanmışdır.

Multiplex dizaynın potensial üstünlüyü yalnız iki ayrı test əvəzinə bir testdən istifadə etmək deyil. Eyni bioloji nümunə həcmi ilə birdən çox hədəf analiz edilə bilər; istifadə olunan membran, qablaşdırma, keyfiyyətə nəzarət və bəzi reagent miqdarları azaldıla bilər.

Kolisin və immunitet zülalı nədir?

Kolisinlər, bəzi bakteriyaların rəqib bakteriyaları sıxışdırmaq məqsədilə istehsal etdiyi antibakterial zülallardır. Kolisin istehsal edən bakteriya eyni zamanda öz toksik zülalından qorunmaq üçün ona son dərəcə güclü və spesifik şəkildə bağlanan immunitet zülalı istehsal edir.

Bu təbii cütlərin mühüm xüsusiyyəti çox yüksək bağlanma afinitəsi və spesifikliyidir. Ədəbiyyatda bəzi kolisin–immunitet cütləri üçün təxminən 10⁻¹⁴ M səviyyəsində dissosiasiya sabitləri bildirilmişdir. Müqayisə üçün streptavidin–biotin qarşılıqlı təsiri təxminən 10⁻¹⁵ M səviyyəsindəki çox güclü təbii qeyri-kovalent qarşılıqlı təsirlərdən biridir.

Mühüm şərh məhdudiyyəti: Bu tədqiqat seçilmiş AP41 və Khan cütlərinin dəqiq K_d dəyərini səthi plazmon rezonansı kimi üsulla ölçməmişdir. Tədqiqat funksional bağlanma təcrübələrində bu cütlərin güclü cognate bağlanma göstərdiyini və müşahidə edilə bilən non-cognate çarpaz reaksiya vermədiyini göstərmişdir. Femtomolyar səviyyəli K_d məlumatı əvvəlki kolisin–immunitet ədəbiyyatından gəlir.

Bio-orthogonal tanıma niyə faydalıdır?

COLPLEX-in multiplex baxımından əsas üstünlüyü birdən çox fərqli kolisin–immunitet cütünün bir-birini qarışdırmadan istifadə oluna bilməsidir. AP41 immunitet zülalı AP41 kolisin xəttinə, Khan immunitet zülalı isə Khan kolisin xəttinə bağlanır. Mənbə Şəkil 1-də aparılan sadə bağlanma təcrübələrində cognate cütlər güclü siqnal verərkən non-cognate kombinasiyalarda aşkarlana bilən çarpaz reaksiya görülməmişdir.

Bu xüsusiyyət fərqli tutucu anticisimlərin fərqli immunitet zülallarına bağlanaraq zolaqdakı fərqli kolisin xətlərinə yönəldilməsinə imkan verir. Beləliklə, tək biotin–streptavidin sisteminin bütün tutucu kompleksləri eyni molekulyar lövbərə yönəltməsi əvəzinə hər hədəf ayrıca molekulyar ünvan vasitəsilə tutulur.

COLPLEX Niyə Anticisimlərin Birbaşa İmmobilizasiyasından Daha Həssas Ola Bildi?

Mənbə tədqiqatın nəticələrinə görə COLPLEX formatında yüksək afinitəli kolisin–immunitet qarşılıqlı təsiri, antigen–anticisim komplekslərinin lateral axın zamanı məhlulda yarana bilməsi və tutucu anticismin nitrosellüloz üzərinə birbaşa qurudulmaması birlikdə daha yüksək test xətti siqnalı və daha aşağı qeyri-spesifik fonla əlaqələndirilmişdir; lakin tədqiqat bu töhfələrin hər birini ayrıca kəmiyyətcə ayıran mexanizm təcrübəsi aparmamışdır.

Klassik birbaşa formatda tutucu anticisim nitrosellüloz membranın test xəttinə birbaşa immobilizasiya olunur. Bu yanaşmada anticismin quruma və səthə bağlanma zamanı konformasiyası təsirlənə bilər və antigenlə qarşılıqlı təsir müddəti lateral axının fiziki şərtləri ilə məhdudlaşa bilər.

COLPLEX yanaşmasında tutucu anticisimlər əvvəlcə müvafiq immunitet zülalına füzyon şəklindədir. Antigen, tutucu anticisim və aşkarlayıcı anticisim axın zamanı məhlulda kompleks yarada bilər. Yaranan kompleks daha sonra immunitet zülalı vasitəsilə zolaqdakı cognate kolisin xəttinə çox güclü şəkildə bağlanır.

Tədqiqatda COLPLEX formatında birbaşa formata nisbətən daha az tutucu anticisim miqdarı istifadə edilmişdir. Müzakirə bölməsində hər anticisim üçün təxminən 0,2–0,3 µg COLPLEX tutucu anticisim istifadəsinin, birbaşa formatdakı təxminən 0,5 µg ilə müqayisədə 1,6–2,5 dəfə daha az reagent sərfinə uyğun gəldiyi bildirilmişdir.

COLPLEX ilə streptavidin–biotin müqayisəsi

Tədqiqatçılar AP41 immunitet zülalına həm Renilla luciferase etiketi, həm də biotinləşdirilə bilən Avi-tag əlavə edərək eyni zülalın immobilizə edilmiş ColAP41-ə və ya polimerik streptavidinə bağlanmasını müqayisə etmişlər.

ELISA təcrübəsində polistreptavidin–biotin sistemi daha yüksək mütləq siqnal yaratmış, lakin daha yüksək fon siqnalı da göstərmişdir. COLPLEX AP41 sistemi daha aşağı fonla güclü bağlanma profili yaratmışdır. Müəlliflər bu nəticəni COLPLEX-in streptavidin–biotinə alternativ və ya tamamlayıcı yüksək afinitəli adapter platforması ola bilməsi kimi şərh edirlər.

Tək Bir Zolaq Zaire və Sudan Ebola Qlikoproteinlərini Necə Ayırır?

Biplex prototipdə Sudan Ebola qlikoproteini yalnız JA7–ImKhan kompleksini yaradaraq Khan test xəttini müsbət edir, Zaire Ebola qlikoproteini isə həm EE8–ImAP41, həm də JA7–ImKhan komplekslərini yaratdığı üçün hər iki test xəttini müsbət edir; antigen yoxdursa yalnız nəzarət xətti görünür.

Üç əsas anticismin vəzifəsi

Quru qızıl nanohissəcikli test necə tətbiq olunur?

Son prototip mərhələsində reagentlərin hamısı zolaq üzərində quru hala gətirilmişdir. Test üçün 10 µL serum və ya plazma, 90 µL miqrasiya tamponu ilə durulaşdırılmış və zolaq qarışığa yerləşdirilmişdir. Test 20 dəqiqə inkişaf etdirilmiş və sonra nəticə oxunmuşdur.

XC2 aşkarlayıcı anticisim 40 nm qızıl nanohissəciklərə bağlanmışdır. COLPLEX tutucu anticisim–immunitet füzyonları ilə XC2-qızıl konjuqatı konjuqat pedlərində qurudulmuşdur. Nitrosellüloz membranda ColAP41 və ColKhan ayrı test xətləri kimi yerləşdirilmişdir.

Test zolaqları 5 mm enində kəsilmiş və quruducu olan qapalı paketlərdə otaq temperaturunda saxlanılmışdır.

Kemilüminessent inkişaf mərhələsi niyə aparıldı?

Qızıl nanohissəcikli son quru formatdan əvvəl tədqiqatçılar molekulyar bağlanma arxitekturasını daha həssas optik oxuma sistemi ilə təsdiqləmək üçün Renilla luciferase və NanoLuc əsaslı kemilüminessent təcrübələr aparmışlar.

Sadə bağlanma formatında RLuc8–immunitet füzyonlarından istifadə edilmiş; tam immunoanaliz formatında isə tutucu anticisim–immunitet füzyonları, Ebola qlikoprotein antigenləri və NanoLuc daşıyan XC2 aşkarlayıcı anticisim birlikdə istifadə edilmişdir. Bu təcrübələr AP41 və Khan sistemlərinin öz cognate test xətlərinə seçici bağlandığını və multiplex arxitekturanın işləyə bildiyini təsdiqləmək üçün aparılmışdır.

LoB və LoD Nə Deməkdir?

Limit of Blank (LoB), hədəf antigen olmayan blank nümunələrdən gözlənilə bilən yuxarı siqnal həddini; Limit of Detection (LoD) isə test siqnalının blank paylanmasından etibarlı şəkildə fərqlənə bildiyi ən aşağı hədəf konsentrasiyasını ifadə edir. Bu tədqiqatda LoB təkrar test edilən mənfi serumdan, LoD isə artan antigen konsentrasiyalarına tətbiq edilmiş dörd parametrli loqistik reqressiya və LoB kəsişməsi yanaşmasından hesablanmışdır.

LoB formulu

\(\mathrm{LoB}=\overline{X}_{\mathrm{Blank}}+(2.58\times SD_{\mathrm{Blank}})\)

Formula nəyi hesablayır? Antigen olmayan mənfi nümunələrin yaratdığı siqnal paylanmasının yuxarı qərar həddini.

\(\overline{X}_{\mathrm{Blank}}\) nədir? Təkrar ölçülən blank/mənfi nümunə siqnallarının orta qiymətidir.

\(SD_{\mathrm{Blank}}\) nədir? Blank siqnallarının standart sapmasıdır.

2,58 niyə istifadə edilmişdir? Mənbə bu əmsalın %99 etibar səviyyəsinə uyğun gəldiyini bildirir.

Vahid nədir? Tədqiqatda xətt siqnalları test line intensity (TLI) vahidləri ilə qiymətləndirilmişdir.

LoB hesablanması üçün mənfi serum nümunəsi 30 dəfə test edilmişdir.

LoD necə hesablandı?

Mənbə LoD üçün tək sətirlik qapalı tənlik vermir. Bunun əvəzinə artan antigen konsentrasiyaları hər konsentrasiya üçün n=5 təkrarla ölçülmüş və siqnal-konsentrasiya əlaqəsi dörd parametrli loqistik reqressiya (4PL) ilə modelləşdirilmişdir.

LoB üzərindəki konsentrasiyaların standart sapmaları ortalanmış; yaranan əyridən 2,58 × SD çıxılaraq daha konservativ düzəldilmiş əyri əldə edilmiş və LoB ilə bu düzəldilmiş əyrinin kəsişdiyi konsentrasiya LoD kimi müəyyən edilmişdir.

Mənbə 4PL funksiyasının açıq riyazi tənliyini və ya dörd parametrin sayısal qiymətlərini əsas mətndə vermir. Buna görə burada mənbə xaricində 4PL formulu və ya parametr qiyməti yaradılmamışdır.

Normallaşdırılmış test xətti intensivliyi necə hesablandı?

Müxtəlif fotoşəkillərdə əldə edilən xətt siqnallarını müqayisə edə bilmək üçün test xəttinin ImageJ ilə ölçülən pik sahəsi hər fotoşəkildəki çap edilmiş standart xəttin pik sahəsinə bölünmüş və nəticə 1000-ə vurulmuşdur.

\(I_{\mathrm{norm}}=\frac{A_{\mathrm{test}}}{A_{\mathrm{standard}}}\times1000\)

\(A_{\mathrm{test}}\): test xəttinin pik sahəsi.

\(A_{\mathrm{standard}}\): eyni fotoşəkildəki çap edilmiş standart xəttin pik sahəsi.

\(I_{\mathrm{norm}}\): fotoşəkillərarası müqayisəni asanlaşdıran normallaşdırılmış nisbi siqnal dəyəri.

Bu ölçü real antigen konsentrasiyası deyil. Antigen konsentrasiyası ayrıca eksperimental durulaşdırma seriyası ilə müəyyən edilmişdir.

COLPLEX ilə birbaşa formatın LoB müqayisəsi

Mənbə birbaşa testlərin blank siqnalının uyğun COLPLEX formatlarından təxminən 5 dəfə və 7,5 dəfə daha yüksək olduğunu bildirir. Daha aşağı LoB aşağı antigen konsentrasiyalarındakı həqiqi test siqnalının fondan ayrılmasını asanlaşdıra bilər.

LoD müqayisəsi

Nəticələr bölməsi GPSudan üçün LoD-un “təxminən 32 dəfə”, GPZaire üçün “15 dəfə” daha aşağı olduğunu bildirir. Müzakirə bölməsində GPSudan yaxşılaşması daha sonra “34 dəfə” kimi ifadə edilmişdir. Mənbə daxilindəki bu yuvarlaqlaşdırma/ifadə fərqinə görə Verianla mətnində yuxarıdakı birbaşa ölçülmüş LoD dəyərləri əsas götürülmüş, yeni qat sayı uydurulmamışdır.

10 nM antigen səviyyəsində siqnal müqayisəsi

Mənbə Şəkil 6-nın kəmiyyət analizində 10 nM GPSudan üçün Khan əsaslı COLPLEX xətti birbaşa formata nisbətən təxminən 4 dəfə daha güclü siqnal yaratmışdır. 10 nM GPZaire şəraitində AP41 və Khan əsaslı COLPLEX xətləri müvafiq birbaşa formatlara nisbətən müvafiq olaraq təxminən 3 dəfə və 2 dəfə daha güclü siqnal vermişdir.

Bunlar konkret 10 nM test şəraitinə aid siqnal böyüklüyü müqayisələridir; bütün konsentrasiyalarda sabit qat artımı olduğu mənasına gəlmir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

İnsan nümunələri

Klinik həssaslığın qiymətləndirilməsi üçün təsdiqlənmiş Zaire Ebola infeksiyası olan 30 serum nümunəsi istifadə edilmişdir. Mənbə bu nümunələri RT-PCR cycle threshold (Ct) dəyərlərinə görə aşağıdakı kimi bildirir:

Mənbə təqdimat qeydi: Məqalə bu qrupları yuxarıdakı “<” etiketləri ilə verir; intervalların bir-birini istisna edən, məsələn 20–24,99 kimi siniflər olub-olmadığını əsas mətndə ayrıca aydınlaşdırmır. Buna görə etiketlər səssizcə yenidən müəyyən edilməmişdir.

Mənfi klinik spesifiklik panelində 40 serum nümunəsi olmuşdur:

• 10 sarı qızdırma virusu müsbət serum,
• 10 dengue virusu müsbət serum,
• 10 Rift Valley fever virusu müsbət serum,
• 10 Seneqaldan endemik sağlam nəzarət serumu.

Bunlara əlavə olaraq Fransa Qan Xidməti tərəfindən təqdim edilən 50 sağlam serum və 50 EDTA plazma nümunəsi, xüsusilə qeyri-spesifik test xətti siqnalı və matriks uyğunluğu üçün ayrıca qiymətləndirilmişdir.

RT-PCR referans metodu

Zaire Ebola RNT-si QuantiTect RT-PCR Master Mix Probe kiti ilə qiymətləndirilmişdir. Mənbədə 5 µL RNT-nin 20 µL master mix-ə əlavə edildiyi bildirilir.

Termal profil:

• 50°C-də 10 dəqiqə tərs transkripsiya,
• 95°C-də 15 dəqiqə tərs transkriptaza inaktivasiyası və DNA polimeraza aktivasiyası,
• 45 amplifikasiya dövrü,
• hər dövrdə 95°C-də 5 saniyə,
• 60°C-də 50 saniyə annealing-extension.

Aydın loqarifmik amplifikasiya və Ct <38 müsbət hesab edilmişdir. Ct 38–42 arasındakı nümunələr şübhəli/qeyri-müəyyən kimi qiymətləndirilmiş; aydın loqarifmik amplifikasiya olmayan nümunələr mənfi hesab edilmişdir.

Ct, real-time PCR siqnalının müəyyən edilmiş flüoresans həddini aşması üçün lazım olan amplifikasiya dövrlərinin sayıdır. Bu tədqiqatda RT-PCR klinik LFIA qiymətləndirilməsində referans metod kimi istifadə edilmişdir.

Kolisin–immunitet cütlərinin seçimi

İki müstəqil zülal cütü seçilmişdir:

• Col/Im AP41: Colicin WP_134294768 və Immunity WP_017002173.
• Col/Im Khan: Colicin WP_036849747 və Immunity WP_036849748.

Metod bölməsində AP41 cütü Pseudomonas aeruginosa AP41, Khan cütü isə Photorhabdus khanii mənşəli kimi verilmişdir. Nəticələr bölməsində AP41 mənbəyini təsvir edən bir cümlədə “Pseudomonas aeruginosa PAO1” ifadəsi keçir. Mənbədəki bu kiçik terminoloji uyğunsuzluq düzəldilmiş kimi göstərilməmiş; sistem məqalə boyunca tədqiqatçıların istifadə etdiyi AP41 adı ilə qeyd edilmişdir.

Rekombinant zülal istehsalı

Kolisin DNaz sahələrini və uyğun immunitet zülallarını kodlayan DNA ardıcıllıqları ekspressiya plazmidlərinə klonlanmışdır. Kolisinlər DNaz–mCherry füzyon zülalları və C-terminal 6×His etiketi ilə; immunitet zülalları isə N-terminal Renilla luciferase füzyonu və C-terminal 6×His etiketi ilə istehsal edilmişdir.

Plazmidlər E. coli BL21(DE3) hüceyrələrinə köçürülmüş, ekspressiya orta log fazada IPTG ilə induksiya edilmiş və hüceyrələr gecəboyu inkubasiyadan sonra toplanmışdır. Həll olan zülallar əvvəlcə Ni²⁺-NTA afinitə xromatoqrafiyası, sonra size-exclusion chromatography ilə təmizlənmişdir.

EE8 və JA7 tutucu anticisimləri ilə XC2 aşkarlayıcı anticisim əvvəlki tədqiqatdan gələn hibridoma mənşəli anticisimlərdir. JA7–ImKhan və EE8–ImAP41 rekombinant füzyon anticisimləri CHO hüceyrələrində istehsal edilmiş və Protein A ilə təmizlənmişdir.

Zolaq istehsalı

Qızıl nanohissəcikli son test proseduru

Hər testdə 10 µL serum və ya plazma 90 µL miqrasiya tamponunda durulaşdırılmışdır. Tampon 240 mM Tris pH 7,7; 50 mM EDTA; %0,1 kazein və %0,5 BigCHAP ehtiva etmişdir. Zolaq quyucuğa yerləşdirilmiş və test 20 dəqiqə inkişaf etdirilmişdir.

Kemilüminessent LFIA proseduru

Sadə formatda reaksiya qarışığı PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 sağlam insan serumu və 10 nM RLuc8–ImAP41 və/və ya RLuc8–ImKhan ehtiva etmişdir.

Tam formatda PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 sağlam insan serumu, 10 nM XC2–NanoLuc, 20 nM EE8–ImAP41, 20 nM JA7–ImKhan və Zaire və ya Sudan Ebola qlikoprotein antigenindən istifadə edilmişdir.

100 µL reaksiya qarışığı otaq temperaturunda 15 dəqiqə inkubasiya edilmiş, zolaq daha sonra 10 dəqiqə miqrasiya etdirilmişdir. Kemilüminessent görüntüləmədə sadə format üçün 35 saniyə, tam format üçün 75 saniyə ekspozisiya istifadə edilmişdir.

AP41 və Khan spesifikliyinin təsdiqi

Mənbə Şəkil 1-də AP41 və Khan kolisin–immunitet cütləri həm lateral flow, həm də mikroplaka formatında qiymətləndirilmişdir. Cognate qarşılıqlı təsirlərdə güclü siqnal yaranmış, qarşı cütlərdə müşahidə edilə bilən non-cognate çarpaz reaksiya görülməmişdir. Bu təcrübələrdə xəta çubuqları standart sapmanı göstərir və N=3 təkrar istifadə edilmişdir.

Mənbə Şəkil 3-də tam Ebola qlikoprotein immunoanalizi ELISA formatında sınaqdan keçirilmişdir. ColAP41 örtüklü quyucuqlarda EE8–ImAP41/GPZaire/XC2–NanoLuc sistemi siqnal yaradarkən Khan əsaslı komplekslər siqnal yaratmamış; ColKhan örtüklü quyucuqlarda isə JA7–ImKhan sistemi Zaire və ya Sudan qlikoproteini ilə siqnal yaratmışdır. ELISA təcrübələri N=3, kemilüminessent LFIA göstərimi N=2 ilə verilmişdir.

Analitik performans

Mənbə Şəkil 6-da GPZaire və GPSudan antigenləri artan konsentrasiyalarda COLPLEX və birbaşa formatlarla müqayisə edilmişdir. COLPLEX formatındakı test xətləri sınaqdan keçirilmiş bütün ortaq konsentrasiyalarda daha yüksək siqnal vermiş və daha aşağı konsentrasiyalarda vizual olaraq aşkarlana bilən xətlər yaratmışdır.

COLPLEX təcrübələri üçün mənbə Şəkil 6-da N=5, birbaşa format üçün N=3 təkrar istifadə edilmişdir. Xəta çubuqları standart sapmanı göstərir.

Mənfi serum və plazma matrikslərində qeyri-spesifik bağlanma

Sağlam avropalı donorlardan 50 serum və 50 EDTA plazma nümunəsində test xətlərində vizual siqnal müşahidə edilməmişdir. Hesablanmış test xətti siqnalları AP41 və Khan üçün müəyyən edilmiş LoB hədlərindən aşağı qalmışdır.

Mənbə serum və EDTA plazma matriksləri arasında aydın fərq müşahidə etmədiyini və bunu prototipin fərqli klinik nümunə tiplərində işləyə bilməsini dəstəkləyən nəticə kimi şərh edir.

Bununla belə, bu 100 nümunə Ebola xaricindəki başqa infeksiyaların yarada biləcəyi bütün mümkün interferensiyaları sınaqdan keçirən klinik spesifiklik paneli deyil. Bu məqsədlə sarı qızdırma, dengue və Rift Valley fever nümunələrini əhatə edən 40 serumlu mənfi klinik panel ayrıca istifadə edilmişdir.

Klinik Nümunələrdə %96,7 Həssaslıq və %100 Spesifiklik Nə Deməkdir?

Tədqiqatın klinik panelində 30 RT-PCR müsbət Zaire Ebola serumunun 29-u COLPLEX ilə müsbət, biri mənfi tapılmış; 40 EBOV-mənfi serumun hamısı mənfi olmuşdur. Bu nümunədə nəticələr bölməsinin bildirdiyi həssaslıq %96,7, spesifiklik isə %100-dür; lakin xüsusilə yalnız 30 müsbət nümunə olduğuna görə bu performans dəyərləri daha böyük və prospektiv sahə populyasiyalarında ayrıca təsdiqlənməlidir.

Həssaslıq

Mənbə tərifinin riyazi göstərimi:

\(\mathrm{Duyarlılık}=\frac{TP}{TP+FN}\times100\)

Burada TP doğru müsbət, FN yanlış mənfi nümunə sayıdır.

Tədqiqatda:

\(\frac{29}{29+1}\times100\approx96.7\%\)

Nəticələr bölməsində %95 etibar intervalı %83,3–99,9 olaraq bildirilmişdir.

Spesifiklik

Mənbə tərifinin riyazi göstərimi:

\(\mathrm{Özgüllük}=\frac{TN}{TN+FP}\times100\)

Burada TN doğru mənfi, FP yanlış müsbət nümunə sayıdır.

40 nəfərlik EBOV-mənfi klinik paneldə:

\(\frac{40}{40+0}\times100=100\%\)

Giriş bölməsində spesifiklik üçün %95 etibar intervalı %88,43–100,00 olaraq verilmişdir.

Bir yanlış mənfi nümunə

COY2117 kodlu bir serum nümunəsi RT-PCR ilə EBOV müsbət olmasına baxmayaraq biplex LFIA tərəfindən aşkarlanmamışdır. Mənbə bu nümunənin RT-PCR Ct dəyərini 25,21 olaraq verir və nəticəni yanlış mənfi kimi təsnif edir.

Bu nümunə prototipin %100 klinik həssaslığa malik olmadığını açıq şəkildə göstərir.

Mövcud Ebola sürətli testləri ilə mənbədaxili müqayisə

Müəlliflər öz COLPLEX nəticələrini daha əvvəl dərc edilmiş Ebola LFIA tədqiqatlarının LoD dəyərləri ilə müqayisə etmişlər. Bu müqayisə eyni təcrübə daxilində aparılmış head-to-head tədqiqat deyil; fərqli nəşrlərdən bildirilmiş analitik LoD dəyərlərinin kontekstual müqayisəsidir.

WHO hədəf məhsul profili ilə mənbədaxili müqayisə

Müzakirə bölməsində müəlliflər əvvəlki meta-analizdə mövcud Ebola antigen sürətli diaqnostika testləri üçün birləşdirilmiş həssaslıq və spesifiklik dəyərlərinin müvafiq olaraq %82,1 və %97,0 olduğunu bildirir və bunları WHO Ebola diaqnostik hədəf məhsul profili üçün istifadə olunan >%95 həssaslıq və >%98 spesifiklik hədəfləri ilə müqayisə edirlər.

Müəlliflər öz 30 müsbət və 40 mənfi klinik nümunə panelindəki %96,7 həssaslıq və %100 spesifikliyin bu hədəflərlə uyğun olduğunu bildirirlər. Lakin bu, prototipin WHO tərəfindən təsdiqləndiyi və ya geniş sahə istifadəsinə hazır olduğu demək deyil; tədqiqat belə bir tənzimləyici təsdiq bildirmir.

İstehsal edilə bilmə və stabillik müşahidələri

Kolisin və immunitet zülallarının E. coli sistemində 14–35 mg/L kultura səviyyəsində istehsal edilə bildiyi bildirilmişdir. İmmunitet zülalı ilə füzyon olunmuş tutucu anticisimlərin CHO hüceyrələrindəki istehsal məhsuldarlığının da konvensional anticisimlərlə müqayisə edilə bilən olduğu qeyd olunur.

Quru test zolaqlarının otaq temperaturunda quru şəraitdə 7 ay saxlandıqdan sonra performansını qoruduğu və fon siqnalında artım müşahidə edilmədiyi bildirilmişdir. Lakin müəlliflər stabilliyin sistemli şəkildə araşdırılmadığını açıq şəkildə bildirirlər. Buna görə yeddi aylıq müşahidə validasiya edilmiş raf ömrü kimi şərh edilməməlidir.

Gələcək üçün təklif edilən istifadə sahələri

Müəlliflər kolisinlərin standart LFIA kasetlərində universal molekulyar ünvanlar kimi istifadə oluna biləcəyini, fərqli hədəflərə spesifik immunitet-zülal füzyonlu anticisimlərin daha sonra eyni əsas zolaq arxitekturasına tətbiq oluna biləcəyini nəzərdə tuturlar.

Bundan əlavə, COLPLEX-in yalnız immunoanalizlərlə məhdudlaşmaya biləcəyi; immunitet zülallarının anticisim əvəzinə primer və ya prob kimi oliqonukleotidlərə bağlanması halında RPA və ya LAMP kimi izotermal nuklein turşusu amplifikasiya məhsullarının da multiplex lateral flow formatında tutula biləcəyi təklif olunur.

Bu bölmə tədqiqatın gələcəyə yönəlik texnologiya təklifidir. COLPLEX əsaslı RPA və ya LAMP molekulyar testi bu məqalədə eksperimental olaraq hazırlanıb təsdiqlənməmişdir.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• AP41 və Khan kolisin–immunitet cütləri bu eksperimental quruluşda güclü cognate bağlanma və müşahidə edilə bilən non-cognate çarpaz reaksiya olmadan işləmişdir.
• İki ayrı COLPLEX cütü tək LFIA zolağında bir-birindən müstəqil molekulyar test xətləri yarada bilir.
• COLPLEX prototipi Zaire və Sudan Ebola qlikoproteinlərini fərqli xətt nümunələri ilə fərqləndirə bilmişdir.
• COLPLEX formatı birbaşa anticisim immobilizasiyasına nisbətən daha aşağı blank siqnalı və daha aşağı LoD yaratmışdır.
• Zaire Ebola RT-PCR müsbət 30 klinik serum nümunəsinin 29-u prototip tərəfindən müsbət tapılmışdır.
• 40 EBOV-mənfi klinik serum nümunəsinin hamısı mənfi tapılmışdır.
• 50 sağlam serum və 50 sağlam EDTA plazma nümunəsində test xətlərində qeyri-spesifik müsbət siqnal müşahidə edilməmişdir.
• COLPLEX daha aşağı tutucu anticisim miqdarı ilə işləyə bilmişdir.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

• Prototipin bütün Ebola epidemiyalarında %96,7 həssaslıqla işləyəcəyi sübut edilməmişdir.
• Sudan Ebola infeksiyası olan real xəstə serumlarında klinik həssaslıq bu tədqiqatda ölçülməmişdir.
• 30 müsbət və 40 mənfi nümunədən əldə edilən klinik performans genişmiqyaslı prospektiv sahə validasiyasını əvəz etmir.
• COLPLEX-in dəqiq raf ömrü müəyyən edilməmişdir.
• Seçilmiş AP41 və Khan cütlərinin dəqiq K_d dəyərləri bu tədqiqatda birbaşa ölçülməmişdir.
• COLPLEX-in streptavidin–biotindən bütün istifadə ssenarilərində üstün olduğu sübut edilməmişdir.
• İstehsal xərcinin real sənaye miqyasında nə qədər azalacağı hesablanmamışdır.
• Prototip üçün tənzimləyici təsdiq və ya rutin klinik istifadə icazəsi bildirilməmişdir.
• COLPLEX əsaslı molekulyar RPA/LAMP tətbiqi bu məqalədə eksperimental olaraq təsdiqlənməmişdir.

Əsas məhdudiyyətlər

Klinik müsbət nümunə sayı: Zaire Ebola üçün yalnız 30 RT-PCR müsbət serum nümunəsi qiymətləndirilmişdir. Həssaslıq etibar intervalının genişliyi kiçik nümunənin qeyri-müəyyənliyini əks etdirir.

Sudan Ebola klinik validasiyası: Sudan qlikoproteini rekombinant/spike antigen təcrübələrində uğurla aşkarlansa da, Sudan Ebola xəstələrindən alınmış klinik nümunələrlə diaqnostik həssaslıq göstərilməmişdir.

Format müqayisəsinin optimallaşdırılması: Müəlliflər eyni XC2-qızıl aşkarlayıcı anticisimdən hər iki formatda istifadə etmiş, lakin eksperimental şərtlərin COLPLEX formatı üçün optimallaşdırıldığını bildirmişlər. Birbaşa formatda konjuqat miqdarının ayrıca optimallaşdırılması fonu azalda bilər; lakin müəlliflər bunun siqnalı da azalda biləcəyini müzakirə edirlər.

Stabillik: Yeddi aylıq müsbət saxlanma müşahidəsi var, lakin sistemli stabillik tədqiqatı yoxdur.

Fərqli nəşrlərlə LoD müqayisəsi: Mənbə Cədvəl 2-də əvvəlki sürətli testlərlə müqayisə vahid standart təcrübədə aparılmış head-to-head test deyil.

Mənbədaxili sayısal ifadə fərqləri: Klinik həssaslıq giriş və nəticələr bölmələrində fərqli yuvarlaqlaşdırma/etibar intervalı formatları ilə verilmiş; Sudan LoD yaxşılaşması da nəticələrdə təxminən 32 dəfə, müzakirədə 34 dəfə kimi ifadə edilmişdir.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal başlıq: COLPLEX: A high-affinity protein adaptor for enhanced sensitivity and multiplex lateral flow immunoassays. application to ebola virus strain detection

Müəlliflər: Romain Clément; Céline Couturier; Oumar Ndiaye; Cheikh Talibouya Touré; Frank William Mendy; Moussa Dia; Stéphanie Geoffroy; Anely Tranchot; Natacha Mariano; Stéphanie Donnat; Charlotte Mignon; Benoît Beitz; Alejandra Mier; Joseph Robert Anderson Fitchett; Oumar Faye; Cheikh Tidiane Diagne; Oxana Vratskikh; Christophe Védrine.

Corresponding author: Christophe Védrine.

Bərabər töhfə: Nəzərdən keçirilən mənbədə bərabər töhfə/bərabər birinci müəllif bildirişi yoxdur.

Qurum a: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 40 avenue Tony Garnier, Lyon 69007, France.

Qurum b: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 28 rue du Docteur Roux, Paris 75015, France.

Qurum c: DIATROPIX, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Qurum d: Virology Department, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Qurum e: Executive Office, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Jurnal: Sensors and Actuators B: Chemical.

Cild / nəşr tarixi / məqalə nömrəsi: Cild 454, 1 may 2026, 139608.

Onlayn nəşr tarixi: 5 fevral 2026.

Alınma tarixi: 6 noyabr 2025.

Reviziya tarixi: 30 yanvar 2026.

Qəbul tarixi: 4 fevral 2026.

DOI: 10.1016/j.snb.2026.139608.

Nəşriyyat: Elsevier B.V.

Mənbə növü: Hakemli tədqiqat məqaləsi; biosensor/LFIA inkişafı, analitik xarakterizasiya və klinik nümunə validasiyası.

Lisenziya: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Əsas klinik referans metod: Zaire Ebola RT-PCR.

Əsas analitik müqayisə: COLPLEX əsaslı biplex LFIA ilə tutucu anticisimlərin nitrosellüloza birbaşa immobilizasiya edildiyi biplex LFIA.

Test hədəfləri: Zaire Ebola qlikoproteini və Sudan Ebola qlikoproteini.

Əsas molekulyar adapterlər: ColAP41–ImAP41 və ColKhan–ImKhan.

Əsas tutucu anticisimlər: EE8 və JA7.

Əsas aşkarlayıcı anticisim: XC2.

Vizual aşkarlama sistemi: 40 nm qızıl nanohissəcik konjuqatı.

İnkişaf mərhələsindəki optik sistemlər: RLuc8 və NanoLuc əsaslı kemilüminessensiya.

Görüntü və xətt analizi: Chemidoc, ImageJ və Image Lab.

Statistik proqram: GraphPad Prism 10.0.

LoB metodu: Mənfi serumun 30 təkrarlı ölçümündən MeanBlank + 2,58 × SDBlank; %99 etibar səviyyəsi.

LoD metodu: Hər konsentrasiyada n=5 ölçüm, dörd parametrli loqistik reqressiya, standart sapma düzəlişi və LoB ilə düzəldilmiş əyri kəsişməsi.

Klinik həssaslıq paneli: 30 RT-PCR müsbət Zaire Ebola serum nümunəsi; 29 doğru müsbət, 1 yanlış mənfi.

Klinik spesifiklik paneli: 40 EBOV-mənfi serum; 10 sarı qızdırma, 10 dengue, 10 Rift Valley fever, 10 Seneqal sağlam nəzarət; hamısı mənfi.

Əlavə matriks/qeyri-spesifik bağlanma paneli: Avropadakı sağlam donorlardan 50 sağlam serum və 50 EDTA plazma.

Etika: Tədqiqat Helsinki Bəyannaməsinin prinsiplərinə uyğun aparılmış və analizdən əvvəl nümunələr identifikasiyasızlaşdırılmışdır. Ebola nümunələri milli səhiyyə orqanlarının fövqəladə cavab missiyası zamanı rutin hal idarəetməsindən əldə edildiyi üçün ayrıca IRB təsdiqinin tələb olunmadığı; xəstələrin Ebola testi üçün şifahi razılıq verdiyi və nümunələrin sonradan referans biobankda saxlandığı bildirilmişdir. Digər hemorragik qızdırma və sağlam donor nümunələri müvafiq etik təsdiqli nəzarət fəaliyyətlərindən qalan nümunələrdir.

Məlumat əlçatanlığı: Məlumatların əsaslandırılmış sorğu əsasında təqdim ediləcəyi bildirilib.

Maliyyələşdirmə bildirişi: Nəzərdən keçirilən əsas PDF-də ayrıca Funding bölməsi və ya xüsusi maliyyələşdirmə bəyanatı yoxdur; buna görə maliyyə mənbəyi uydurulmamışdır.

Süni intellekt bildirişi: Nəzərdən keçirilən əsas PDF-də ayrıca generativ süni intellekt istifadəsi bildirişi yoxdur.

Maraqlar toqquşması: Christophe Védrine-in “Methods and reagents for multiplex binding experiments” adlı WO2020104397A1 patentinin BIOASTER adından gözləmədə olduğu bildirilmişdir. Digər müəlliflər tədqiqata təsir etmiş görünə biləcək məlum rəqabətli maliyyə marağı və ya şəxsi münasibət bildirməmişdir.

CRediT töhfələri: Oumar Faye — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Resources, Investigation, Formal analysis; Cheikh Talibouya Touré — Resources, Investigation, Data curation; Joseph Robert Anderson Fitchett — Writing – review & editing, Validation; Anely Tranchot — Visualization, Investigation, Formal analysis; Christophe Védrine — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Formal analysis, Conceptualization; Stéphanie Geoffroy — Visualization, Validation, Investigation, Formal analysis; Oxana Vratskikh — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Supervision, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Moussa Dia — Resources, Investigation, Data curation; Cheikh Tidiane Diagne — Writing – review & editing, Validation, Resources, Investigation, Formal analysis; Frank William Mendy — Resources, Investigation, Data curation; Benoît Beitz — Visualization, Investigation, Formal analysis; Romain Clément — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Charlotte Mignon — Visualization, Supervision, Methodology, Formal analysis; Stéphanie Donnat — Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Natacha Mariano — Writing – original draft, Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Oumar Ndiaye — Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis; Alejandra Mier — Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Conceptualization; Céline Couturier — Visualization, Investigation, Formal analysis.

Mənbədaxili kəmiyyət uyğunsuzluğu 1: Giriş/erkən xülasə bölməsində 29/30 klinik müsbət nümunə üçün həssaslıq %96,6 və etibar intervalı %82,24–99,91 kimi yazıldığı halda, nəticələr bölməsində %96,7 və %95 GA %83,3–99,9 yazılır. Əsas xam nisbət 29/30-dur.

Mənbədaxili kəmiyyət uyğunsuzluğu 2: GPSudan LoD yaxşılaşması nəticələr bölməsində təxminən 32 dəfə, müzakirə bölməsində 34 dəfə kimi yazılmışdır. Birbaşa bildirilən LoD dəyərləri 0,065 nM / 2,2 ng/mL və 2,10 nM / 70,98 ng/mL-dir.

Mənbədaxili terminologiya qeydi: Metod bölməsi AP41 cütünü Pseudomonas aeruginosa AP41 mənşəli kimi təsvir edərkən nəticələr bölməsində bir yerdə Pseudomonas aeruginosa PAO1 ifadəsi istifadə olunur. Verianla mətni bu qeyri-müəyyənliyi genişləndirməmiş və cütün tədqiqat daxilindəki canonical adı olan AP41-dən istifadə etmişdir.

Vizual yenidənqurma: Mənbə Şəkil 4-dəki test arxitekturası mənbə əlaqələrinə əsaslanaraq fərqli qrafik kompozisiya ilə inline SVG kimi yenidən yaradılmışdır. Şəkil 6–7-dəki kəmiyyət konsentrasiya qrafikləri isə xam nöqtə koordinatlarının hamısı əsas mətndə olmadığından saxta interpolasiya ilə çəkilməmiş; açıq şəkildə bildirilən LoB, LoD və klinik nəticələr HTML cədvəllərində təqdim edilmişdir.

Əsas şərh məhdudiyyəti: COLPLEX bu tədqiqatda güclü analitik və ilkin klinik nümunə performansı göstərmiş prototipdir. Nəticələr cihazın bütün Ebola epidemiyası şəraitlərində eyni performansı göstərəcəyini, Sudan Ebola xəstələrində klinik olaraq təsdiqləndiyini, tənzimləyici təsdiq aldığını və ya validasiya edilmiş uzun raf ömrünə malik olduğunu göstərmir.