COLPLEX — латералдык агым иммуноанализдеринде максаттуу антигендерди кармоо үчүн колицин деп аталган бактериялык белоктор менен аларга тиешелүү иммунитет белокторунун ортосундагы өтө жогорку аффинитеттүү жана бири-биринен айырмалануучу белок–белок өз ара аракеттенүүлөрүн пайдаланган молекулалык адаптер системасы. Бул изилдөө COLPLEXти Zaire жана Sudan Ebola вирусунун гликопротеиндерин бир эле латералдык агым тилкесинде бири-биринен ажырата алган biplex LFIA прототибине интеграциялап; системаны белок байланышы боюнча тажрыйбалар, ELISA, хемилюминесценттик LFIA, алтын нанобөлүкчөлүү кургак LFIA, аналитикалык аныктоо чеги боюнча тажрыйбалар жана адамдын сыворотка/плазма үлгүлөрү менен баалаган.

Негизги архитектурада бири-бири менен кайчылаш реакция бербеген эки колицин–иммунитет жубу колдонулган. ColAP41–ImAP41 системасы Zaire Ebola гликопротеинине спецификалуу EE8 кармоочу антителосу менен, ColKhan–ImKhan системасы болсо Zaire жана Sudan гликопротеиндерин тааный алган JA7 кармоочу антителосу менен жупташтырылган. Эки максат үчүн тең XC2 аттуу жалпы аныктоочу антитело колдонулган. Бул дизайн аркылуу Sudan гликопротеини Khan тест сызыгын гана, Zaire гликопротеини болсо AP41 жана Khan тест сызыктарынын экөөнү тең түзөт. Ошентип, бир тилкеде эки башка сигнал үлгүсү аркылуу максаттарды айырмалоого болот.

Алтын нанобөлүкчөлөр колдонулган кургак LFIA форматында COLPLEX прототибинин Zaire Ebola гликопротеини үчүн аныктоо чеги 0,034 nM (1,1 ng/mL), антитело түздөн-түз иммобилизацияланган салыштыруу форматында болсо 0,47 nM (15,18 ng/mL) деп билдирилген. Sudan Ebola гликопротеини үчүн COLPLEX аныктоо чеги 0,065 nM (2,2 ng/mL), түз форматта 2,10 nM (70,98 ng/mL) болгон. COLPLEX ошондой эле төмөнүрөөк blank сигналын жана көрүнүктүүрөөк тест сызыктарын түзгөн.

Клиникалык баалоодо мурдагы Ebola эпидемияларынан алынган RT-PCR оң 30 Zaire Ebola сыворотка үлгүсүнүн 29 үлгүсү COLPLEX biplex прототиби тарабынан оң деп табылып, бир RT-PCR оң үлгү жалган терс бойдон калган. Натыйжалар бөлүмүндө сезгичтик %96,7 (%95 ишеним аралыгы: %83,3–99,9) деп билдирилген. Сары безгек, dengue, Rift Valley fever инфекцияларын жана Сенегалдан алынган дени сак контролдорду камтыган 40 EBOV-терс сыворотка үлгүсүнүн баары терс болуп, клиникалык спецификалуулук %100 болгон.

Бул натыйжалар маанилүү болгону менен, прототип азырынча кеңири масштабдагы проспективдүү талаа диагностика изилдөөсү эмес. Клиникалык сезгичтик болгону 30 Zaire Ebola оң сыворотка үлгүсүндө бааланган; Sudan Ebola үчүн клиникалык бейтап үлгүлөрүндөгү көрсөткүч бул изилдөөдө көрсөтүлгөн эмес. Мындан тышкары, кургак тилкелер бөлмө температурасында жети ай сакталганда көрсөткүчү сакталып калганы байкалганы менен, авторлор туруктуулук системалуу изилденбегенин ачык белгилешет.

Lateral flow immunoassay деген эмне?

Lateral flow immunoassay (LFIA; латералдык агым иммуноанализи) — суюк үлгү тешиктүү тилке боюнча капиллярдык күч менен жылып, үлгүдөгү максаттуу молекула белгилүү кармоочу/таануу реагенттери менен өз ара аракеттенгенде көзгө көрүнгөн же аспап менен өлчөнүүчү тест сызыктары пайда болгон тез тест платформасы.

LFIAнын маанилүү артыкчылыктары — тез жыйынтык, жөнөкөй колдонуу, көчмөлүүлүк жана борбордук лабораторияга көз карандылыктын азайышы. Бул өзгөчөлүктөр лабораториялык жеткиликтүүлүк чектелүү болгон төмөн жана орто кирешелүү аймактарда point-of-care тесттери үчүн өзгөчө маанилүү.

Бирок тез тесттерде бир учурда бир нече максатты аныктоо, жогорку сезгичтикти сактоо жана спецификалуу эмес фонду төмөн деңгээлде кармоо кыйын болушу мүмкүн. Изилдөө караган инженердик маселе дал ушул.

Multiplex же biplex эмнени билдирет?

Multiplex бир тесттин ичинде бир нече максаттын бири-биринен ажыратылып өлчөнүшүн билдирет. Бул изилдөөдө эки Ebola гликопротеин максаты бир эле тилкеде айырмалангандыктан, система biplex, башкача айтканда эки максаттуу multiplex түзүлүш катары иштелип чыккан.

Multiplex дизайнынын мүмкүн болгон артыкчылыгы эки өзүнчө тесттин ордуна бир гана тестти колдонуу менен чектелбейт. Ошол эле биологиялык үлгү көлөмү менен бир нече максатты талдоого болот; колдонулган мембрана, таңгак, сапатты көзөмөлдөө жана айрым реагенттердин көлөмү азайтылышы мүмкүн.

Колицин жана иммунитет белогу деген эмне?

Колициндер — айрым бактериялар атаандаш бактерияларды басуу үчүн өндүргөн антибактериялык белоктор. Колицин өндүргөн бактерия өзүнүн уулуу белогунан коргонуу үчүн ага өтө күчтүү жана спецификалуу байланыша турган иммунитет белогун да өндүрөт.

Бул табигый жуптардын маанилүү өзгөчөлүгү — абдан жогорку байланыш аффинитети жана спецификалуулугу. Адабиятта айрым колицин–иммунитет жуптары үчүн болжол менен 10⁻¹⁴ M деңгээлиндеги ажыроо константалары билдирилген. Салыштыруу үчүн стрептавидин–биотин өз ара аракеттенүүсү болжол менен 10⁻¹⁵ M деңгээлиндеги эң күчтүү табигый коваленттик эмес өз ара аракеттенүүлөрдүн бири.

Маанилүү чечмелөө чеги: Бул изилдөө тандалган AP41 жана Khan жуптарынын так K_d маанисин беттик плазмон резонансы сыяктуу ыкма менен өлчөгөн эмес. Изилдөө функционалдык байланыш тажрыйбаларында бул жуптар күчтүү cognate байланыш көрсөтүп, байкалуучу non-cognate кайчылаш реакция бербегенин көрсөткөн. Фемтомолярдык деңгээлдеги K_d маалыматы мурдагы колицин–иммунитет адабиятынан алынган.

Bio-orthogonal таануу эмне үчүн пайдалуу?

COLPLEXтин multiplex жагынан негизги артыкчылыгы — бир нече ар башка колицин–иммунитет жуптарын бири-бирин чаташтырбай колдонууга болору. AP41 иммунитет белогу AP41 колицин сызыгына, Khan иммунитет белогу болсо Khan колицин сызыгына байланышат. Булактагы 1-сүрөттө жүргүзүлгөн жөнөкөй байланыш тажрыйбаларында cognate жуптар күчтүү сигнал берген, non-cognate комбинацияларда болсо аныкталуучу кайчылаш реакция байкалган эмес.

Бул өзгөчөлүк ар башка кармоочу антителолордун ар башка иммунитет белокторуна байланып, тилкедеги ар башка колицин сызыктарына багытталышына мүмкүндүк берет. Ошентип, бир гана биотин–стрептавидин системасы бардык кармоочу комплекстерди бир эле молекулалык якорго багыттагандын ордуна, ар бир максат өзүнчө молекулалык дарек аркылуу кармалат.

COLPLEX Эмне үчүн Антителону Түз Иммобилизациялоого Караганда Сезгичирээк Болушу Мүмкүн?

Булак изилдөөнүн натыйжалары боюнча COLPLEX форматында жогорку аффинитеттүү колицин–иммунитет өз ара аракеттенүүсү, антиген–антитело комплекстеринин латералдык агым учурунда эритмеде түзүлүшү жана кармоочу антителонун нитроцеллюлозага түз кургатылбашы бирге жогорку тест сызыгы сигналы жана төмөн спецификалуу эмес фон менен байланышкан; бирок изилдөө бул салымдардын ар бирин өзүнчө сандык бөлгөн механизм тажрыйбасын жүргүзгөн эмес.

Классикалык түз форматта кармоочу антитело нитроцеллюлоза мембранасынын тест сызыгына түз иммобилизацияланат. Бул ыкмада антителонун кургоо жана бетке байланышуу учурундагы конформациясы таасирлениши мүмкүн жана антиген менен өз ара аракеттенүү убактысы латералдык агымдын физикалык шарттары менен чектелиши мүмкүн.

COLPLEX ыкмасында кармоочу антителолор алгач тиешелүү иммунитет белогуна фузияланган абалда болот. Антиген, кармоочу антитело жана аныктоочу антитело агым учурунда эритмеде комплекс түзө алат. Түзүлгөн комплекс кийин иммунитет белогу аркылуу тилкедеги cognate колицин сызыгына абдан күчтүү байланыша алат.

Изилдөөдө COLPLEX форматында түз форматка караганда азыраак кармоочу антитело колдонулган. Талкуу бөлүмүндө ар бир антитело үчүн болжол менен 0,2–0,3 µg COLPLEX кармоочу антителосун колдонуу, түз форматтагы болжол менен 0,5 µg менен салыштырганда 1,6–2,5 эсе аз реагент сарптоого туура келери айтылган.

COLPLEX менен стрептавидин–биотин салыштырылышы

Изилдөөчүлөр AP41 иммунитет белогуна Renilla luciferase белгисин да, биотинделе турган Avi-tagди да кошуп, бир эле белоктун иммобилизацияланган ColAP41ге же полимердик стрептавидинге байланышын салыштырган.

ELISA тажрыйбасында полистрептавидин–биотин системасы жогорураак абсолюттук сигнал чыгарган, бирок жогорураак фон сигналын да көрсөткөн. COLPLEX AP41 системасы төмөн фон менен күчтүү байланыш профилин түзгөн. Авторлор бул натыйжаны COLPLEX стрептавидин–биотинге альтернатива же кошумча болгон жогорку аффинитеттүү адаптер платформасы болушу мүмкүн деп чечмелешет.

Бир Тилке Zaire жана Sudan Ebola Гликопротеиндерин Кантип Айырмалайт?

Biplex прототибинде Sudan Ebola гликопротеини JA7–ImKhan комплексин гана түзүп, Khan тест сызыгын оң кылат, ал эми Zaire Ebola гликопротеини EE8–ImAP41 жана JA7–ImKhan комплекстеринин экөөнү тең түзгөндүктөн эки тест сызыгы тең оң болот; антиген жок болсо контролдук сызык гана көрүнөт.

Үч негизги антителонун милдети

Кургак алтын нанобөлүкчөлүү тест кантип жүргүзүлөт?

Акыркы прототип баскычында бардык реагенттер тилкеде кургак абалга келтирилген. Тест үчүн 10 µL сыворотка же плазма 90 µL миграция буфери менен суюлтулуп, тилке аралашмага салынган. Тест 20 мүнөт өнүктүрүлүп, андан кийин жыйынтык окулган.

XC2 аныктоочу антитело 40 nm алтын нанобөлүкчөлөргө байланышкан. COLPLEX кармоочу антитело–иммунитет фузиялары жана XC2-алтын конъюгаты конъюгат паддарында кургатылган. Нитроцеллюлоза мембранасында ColAP41 жана ColKhan өзүнчө тест сызыктары катары жайгашкан.

Тест тилкелери 5 mm туурасында кесилип, кургаткычы бар жабык баштыктарда бөлмө температурасында сакталган.

Хемилюминесценттик иштеп чыгуу баскычы эмне үчүн жүргүзүлгөн?

Алтын нанобөлүкчөлүү акыркы кургак форматка чейин изилдөөчүлөр молекулалык байланыш архитектурасын сезгичирээк оптикалык окуу системасы менен ырастоо үчүн Renilla luciferase жана NanoLuc негизиндеги хемилюминесценттик тажрыйбаларды жүргүзүшкөн.

Жөнөкөй байланыш форматында RLuc8–иммунитет фузиялары колдонулган; толук иммуноанализ форматында болсо кармоочу антитело–иммунитет фузиялары, Ebola гликопротеин антигендери жана NanoLuc ташыган XC2 аныктоочу антитело бирге колдонулган. Бул тажрыйбалар AP41 жана Khan системалары өзүнүн cognate тест сызыктарына тандалма байланышаарын жана multiplex архитектура иштей аларын ырастоо үчүн жүргүзүлгөн.

LoB жана LoD Эмнени Билдирет?

Limit of Blank (LoB) максаттуу антиген жок blank үлгүлөрдөн күтүлүшү мүмкүн болгон жогорку сигнал чегин; Limit of Detection (LoD) болсо тест сигналы blank бөлүштүрүүдөн ишенимдүү айырмаланган эң төмөнкү максаттуу концентрацияны билдирет. Бул изилдөөдө LoB кайра-кайра текшерилген терс сывороткадан, LoD болсо өсүп жаткан антиген концентрацияларына колдонулган төрт параметрлүү логистикалык регрессия жана LoB кесилиш ыкмасы менен эсептелген.

LoB формуласы

\(\mathrm{LoB}=\overline{X}_{\mathrm{Blank}}+(2.58\times SD_{\mathrm{Blank}})\)

Формула эмнени эсептейт? Антиген камтыбаган терс үлгүлөр түзгөн сигнал бөлүштүрүүнүн жогорку чечим чегин.

\(\overline{X}_{\mathrm{Blank}}\) деген эмне? Кайра өлчөнгөн blank/терс үлгү сигналдарынын орточо мааниси.

\(SD_{\mathrm{Blank}}\) деген эмне? Blank сигналдарынын стандарттык четтөөсү.

2,58 эмне үчүн колдонулган? Булак бул коэффициент %99 ишеним деңгээлине туура келерин билдирет.

Бирдик кандай? Изилдөөдө сызык сигналдары test line intensity (TLI) бирдиктери менен бааланган.

LoB эсептөө үчүн терс сыворотка үлгүсү 30 жолу текшерилген.

LoD кантип эсептелген?

Булак LoD үчүн бир саптык жабык теңдеме бербейт. Анын ордуна өсүп жаткан антиген концентрациялары ар бир концентрацияда n=5 кайталоо менен өлчөнүп, сигнал-концентрация байланышы төрт параметрлүү логистикалык регрессия (4PL) менен моделденген.

LoBдан жогору концентрациялардын стандарттык четтөөлөрү орточолонгон; түзүлгөн ийри сызыктан 2,58 × SD алынып, консервативдүү түзөтүлгөн ийри алынган жана LoB менен ушул түзөтүлгөн ийри кесилишкен концентрация LoD катары аныкталган.

Булак 4PL функциясынын ачык математикалык теңдемесин же төрт параметрдин сандык маанилерин негизги текстте бербейт. Ошондуктан бул жерде булактан тышкаркы 4PL формуласы же параметр мааниси түзүлгөн эмес.

Нормалдаштырылган тест сызыгынын интенсивдүүлүгү кантип эсептелген?

Ар башка сүрөттөрдөгү сызык сигналдарын салыштыруу үчүн тест сызыгынын ImageJ менен өлчөнгөн пик аянты ар бир сүрөттөгү басылган стандарт сызыктын пик аянтына бөлүнүп, натыйжа 1000 санына көбөйтүлгөн.

\(I_{\mathrm{norm}}=\frac{A_{\mathrm{test}}}{A_{\mathrm{standard}}}\times1000\)

\(A_{\mathrm{test}}\): тест сызыгынын пик аянты.

\(A_{\mathrm{standard}}\): ошол эле сүрөттөгү басылган стандарт сызыктын пик аянты.

\(I_{\mathrm{norm}}\): сүрөттөр аралык салыштырууну жеңилдеткен нормалдаштырылган салыштырмалуу сигнал мааниси.

Бул чоңдук реалдуу антиген концентрациясы эмес. Антиген концентрациясы өзүнчө эксперименттик суюлтуу сериясы аркылуу аныкталган.

COLPLEX менен түз форматтын LoB салыштырылышы

Булак түз тесттердин blank сигналы тиешелүү COLPLEX форматтарынан болжол менен 5 эсе жана 7,5 эсе жогору экенин билдирет. Төмөн LoB төмөн антиген концентрацияларындагы чыныгы тест сигналын фондон айырмалоону жеңилдетиши мүмкүн.

LoD салыштырылышы

Натыйжалар бөлүмүндө GPSudan үчүн LoD “болжол менен 32 эсе”, GPZaire үчүн “15 эсе” төмөн экени айтылат. Талкуу бөлүмүндө GPSudan жакшырышы кийин “34 эсе” деп берилген. Булак ичиндеги бул тегеректөө/айтуу айырмасынан улам Verianla текстинде жогорудагы түз өлчөнгөн LoD маанилери негиз кылынган; жаңы эсе көрсөткүчү ойлоп табылган эмес.

10 nM антиген деңгээлиндеги сигнал салыштырылышы

Булактагы 6-сүрөттүн сандык анализинде 10 nM GPSudan үчүн Khan негизиндеги COLPLEX сызыгы түз форматка караганда болжол менен 4 эсе күчтүү сигнал берген. 10 nM GPZaire шартында AP41 жана Khan негизиндеги COLPLEX сызыктары тиешелүү түз форматтарга салыштырмалуу тиешелүүлүгүнө жараша болжол менен 3 эсе жана 2 эсе күчтүү сигнал берген.

Бул белгилүү 10 nM тест шартына тиешелүү сигнал чоңдугу салыштыруулары; бардык концентрацияларда туруктуу эсе өсүш бар дегенди билдирбейт.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Адам үлгүлөрү

Клиникалык сезгичтикти баалоо үчүн ырасталган Zaire Ebola инфекциясы бар 30 сыворотка үлгүсү колдонулган. Булак бул үлгүлөрдү RT-PCR cycle threshold (Ct) маанилерине жараша төмөнкүдөй берет:

Булакты берүү боюнча эскертүү: Макала бул топторду жогорудагы “<” белгилери менен берет; интервалдар бири-бирин жокко чыгаруучу, мисалы 20–24,99 сыяктуу класстарбы же жокпу негизги текстте өзүнчө такталган эмес. Ошондуктан белгилер унчукпай кайра аныкталган жок.

Терс клиникалык спецификалуулук панелинде 40 сыворотка үлгүсү болгон:

• 10 сары безгек вирусу оң сыворотка,
• 10 dengue вирусу оң сыворотка,
• 10 Rift Valley fever вирусу оң сыворотка,
• 10 Сенегалдан эндемикалык дени сак контроль сывороткасы.

Мындан тышкары Франция Кан Кызматы берген 50 дени сак сыворотка жана 50 EDTA плазма үлгүсү, айрыкча спецификалуу эмес тест сызыгы сигналы жана матрица шайкештиги үчүн өзүнчө бааланган.

RT-PCR референс ыкмасы

Zaire Ebola РНКсы QuantiTect RT-PCR Master Mix Probe кити менен бааланган. Булакта 5 µL РНК 20 µL master mixке кошулганы айтылат.

Термалдык профиль:

• 50°Cде 10 мүнөт тескери транскрипция,
• 95°Cде 15 мүнөт тескери транскриптаза инактивациясы жана DNA полимераза активациясы,
• 45 амплификация цикли,
• ар бир циклде 95°Cде 5 секунд,
• 60°Cде 50 секунд annealing-extension.

Ачык логарифмдик амплификация жана Ct <38 оң деп кабыл алынган. Ct 38–42 аралыгындагы үлгүлөр шектүү/анык эмес деп бааланган; ачык логарифмдик амплификация жок үлгүлөр терс деп кабыл алынган.

Ct real-time PCR сигналы белгиленген флуоресценция чегинен өтүшү үчүн талап кылынган амплификация циклдеринин саны. Бул изилдөөдө RT-PCR клиникалык LFIA баалоосунда референс ыкма катары колдонулган.

Колицин–иммунитет жуптарын тандоо

Эки көз карандысыз белок жубу тандалган:

• Col/Im AP41: Colicin WP_134294768 жана Immunity WP_017002173.
• Col/Im Khan: Colicin WP_036849747 жана Immunity WP_036849748.

Ыкма бөлүмүндө AP41 жубу Pseudomonas aeruginosa AP41, Khan жубу болсо Photorhabdus khanii тегинен деп берилген. Натыйжалар бөлүмүндө AP41 булагын сүрөттөгөн бир сүйлөмдө “Pseudomonas aeruginosa PAO1” деген сөз колдонулат. Булактагы бул майда терминологиялык дал келбестик оңдолгондой көрсөтүлгөн эмес; система макала бою изилдөөчүлөр колдонгон AP41 аталышы менен берилген.

Рекомбинанттык белок өндүрүү

Колицин DNase домендерин жана тиешелүү иммунитет белокторун коддогон DNA тизмектери экспрессия плазмиддерине клондолгон. Колициндер DNase–mCherry фузиялык белоктору жана C-terminal 6×His белгиси менен; иммунитет белоктору болсо N-terminal Renilla luciferase фузиясы жана C-terminal 6×His белгиси менен өндүрүлгөн.

Плазмиддер E. coli BL21(DE3) клеткаларына өткөрүлүп, экспрессия орто log фазада IPTG менен индукцияланып, клеткалар түнкү инкубациядан кийин чогултулган. Эригич белоктор адегенде Ni²⁺-NTA аффинитеттик хроматографиясы, андан кийин size-exclusion chromatography менен тазаланган.

EE8 жана JA7 кармоочу антителолору жана XC2 аныктоочу антитело мурунку изилдөөдөн алынган гибридома тектүү антителолор. JA7–ImKhan жана EE8–ImAP41 рекомбинанттык фузиялык антителолор CHO клеткаларында өндүрүлүп, Protein A менен тазаланган.

Тилке өндүрүү

Алтын нанобөлүкчөлүү акыркы тест процедурасы

Ар бир тестте 10 µL сыворотка же плазма 90 µL миграция буферинде суюлтулган. Буфер 240 mM Tris pH 7,7; 50 mM EDTA; %0,1 казеин жана %0,5 BigCHAP камтыган. Тилке кудукчага жайгаштырылып, тест 20 мүнөт өнүктүрүлгөн.

Хемилюминесценттик LFIA процедурасы

Жөнөкөй форматта реакция аралашмасы PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 дени сак адам сывороткасы жана 10 nM RLuc8–ImAP41 жана/же RLuc8–ImKhan камтыган.

Толук форматта PBS, %1 BSA, %0,05 Tween 20, %10 дени сак адам сывороткасы, 10 nM XC2–NanoLuc, 20 nM EE8–ImAP41, 20 nM JA7–ImKhan жана Zaire же Sudan Ebola гликопротеин антигени колдонулган.

100 µL реакция аралашмасы бөлмө температурасында 15 мүнөт инкубацияланып, тилке андан кийин 10 мүнөт миграцияланган. Хемилюминесценттик сүрөткө тартууда жөнөкөй формат үчүн 35 секунд, толук формат үчүн 75 секунд экспозиция колдонулган.

AP41 жана Khандын спецификалуулугун ырастоо

Булактагы 1-сүрөттө AP41 жана Khan колицин–иммунитет жуптары латералдык агым жана микропластинка форматтарында бааланган. Cognate өз ара аракеттенүүлөрдө күчтүү сигнал пайда болуп, каршы жуптарда байкалуучу non-cognate кайчылаш реакция болгон эмес. Бул тажрыйбаларда ката тилкелери стандарттык четтөөнү көрсөтүп, N=3 кайталоо колдонулган.

Булактагы 3-сүрөттө толук Ebola гликопротеин иммуноанализи ELISA форматында текшерилген. ColAP41 менен капталган кудукчаларда EE8–ImAP41/GPZaire/XC2–NanoLuc системасы сигнал берген, Khan негизиндеги комплекстер сигнал бербеген; ColKhan менен капталган кудукчаларда JA7–ImKhan системасы Zaire же Sudan гликопротеини менен сигнал берген. ELISA тажрыйбалары N=3, хемилюминесценттик LFIA көрсөтүүсү N=2 менен берилген.

Аналитикалык көрсөткүчтөр

Булактагы 6-сүрөттө GPZaire жана GPSudan антигендери өсүп жаткан концентрацияларда COLPLEX жана түз форматтар менен салыштырылган. COLPLEX форматындагы тест сызыктары бардык сыналган жалпы концентрацияларда жогорураак сигнал берип, төмөн концентрацияларда визуалдык аныкталуучу сызыктарды түзгөн.

COLPLEX тажрыйбалары үчүн 6-сүрөттө N=5, түз формат үчүн N=3 кайталоо колдонулган. Ката тилкелери стандарттык четтөөнү көрсөтөт.

Терс сыворотка жана плазма матрицаларындагы спецификалуу эмес байланыш

Дени сак европалык донорлордон алынган 50 сыворотка жана 50 EDTA плазма үлгүсүндө тест сызыктарында визуалдык сигнал байкалган эмес. Эсептелген тест сызыгы сигналдары AP41 жана Khan үчүн белгиленген LoB чектеринен төмөн болгон.

Булак сыворотка менен EDTA плазма матрицаларынын ортосунда ачык айырма байкалбаганын жана муну прототиптин ар башка клиникалык үлгү типтеринде иштей аларын колдогон натыйжа катары чечмелейт.

Бирок бул 100 үлгү Ebolaдан башка инфекциялардан болушу мүмкүн болгон бардык интерференцияларды текшерген клиникалык спецификалуулук панели эмес. Бул максатта сары безгек, dengue жана Rift Valley fever үлгүлөрүн камтыган 40 сывороткалуу терс клиникалык панель өзүнчө колдонулган.

Клиникалык Үлгүлөрдө %96,7 Сезгичтик жана %100 Спецификалуулук Эмнени Билдирет?

Изилдөөнүн клиникалык панелинде 30 RT-PCR оң Zaire Ebola сывороткасынын 29 үлгүсү COLPLEX менен оң, бирөө терс табылган; 40 EBOV-терс сыворотканын баары терс болгон. Бул үлгүлөрдө натыйжалар бөлүмү билдирген сезгичтик %96,7 жана спецификалуулук %100; бирок болгону 30 оң үлгү болгондуктан, бул көрсөткүчтөр чоңураак жана проспективдүү талаа популяцияларында өзүнчө ырасталышы керек.

Сезгичтик

Булактагы аныктаманын математикалык көрсөтүлүшү:

\(\mathrm{Duyarlılık}=\frac{TP}{TP+FN}\times100\)

Бул жерде TP чыныгы оң, FN жалган терс үлгүлөрдүн саны.

Изилдөөдө:

\(\frac{29}{29+1}\times100\approx96.7\%\)

Натыйжалар бөлүмүндө %95 ишеним аралыгы %83,3–99,9 деп билдирилген.

Спецификалуулук

Булактагы аныктаманын математикалык көрсөтүлүшү:

\(\mathrm{Özgüllük}=\frac{TN}{TN+FP}\times100\)

Бул жерде TN чыныгы терс, FP жалган оң үлгүлөрдүн саны.

40 адамдык EBOV-терс клиникалык панелде:

\(\frac{40}{40+0}\times100=100\%\)

Кириш бөлүмүндө спецификалуулук үчүн %95 ишеним аралыгы %88,43–100,00 деп берилген.

Бир жалган терс үлгү

COY2117 коддуу сыворотка үлгүсү RT-PCR менен EBOV оң болгонуна карабастан biplex LFIA тарабынан аныкталган эмес. Булак бул үлгүнүн RT-PCR Ct маанисин 25,21 деп берет жана натыйжаны жалган терс деп классификациялайт.

Бул үлгү прототиптин %100 клиникалык сезгичтикке ээ эмес экенин ачык көрсөтөт.

Учурдагы Ebola тез тесттери менен булак ичиндеги салыштыруу

Авторлор өздөрүнүн COLPLEX натыйжаларын мурда жарыяланган Ebola LFIA изилдөөлөрүнүн LoD маанилери менен салыштырышкан. Бул салыштыруу бир эле тажрыйбанын ичинде жүргүзүлгөн head-to-head изилдөө эмес; ар башка басылмалардан билдирилген аналитикалык LoD маанилеринин контексттик салыштырылышы.

WHO максаттуу продукт профили менен булак ичиндеги салыштыруу

Талкуу бөлүмүндө авторлор мурдагы мета-анализде учурдагы Ebola антиген тез диагностикалык тесттери үчүн бириктирилген сезгичтик жана спецификалуулук тиешелүүлүгүнө жараша %82,1 жана %97,0 деп билдирилгенин айтып, аларды WHO Ebola диагностикалык максаттуу продукт профили үчүн колдонулган >%95 сезгичтик жана >%98 спецификалуулук максаттары менен салыштырышат.

Авторлор өздөрүнүн 30 оң жана 40 терс клиникалык үлгү панелиндеги %96,7 сезгичтик менен %100 спецификалуулук бул максаттарга туура келерин белгилешет. Бирок бул прототип WHO тарабынан жактырылды же кеңири талаа колдонууга даяр дегенди билдирбейт; изилдөө мындай жөнгө салуучу жактырууну билдирбейт.

Өндүрүлүшү жана туруктуулук байкоолору

Колицин жана иммунитет белоктору E. coli системасында 14–35 mg/L культура деңгээлинде өндүрүлө алары билдирилген. Иммунитет белогуна фузияланган кармоочу антителолордун CHO клеткаларындагы өндүрүш түшүмү да кадимки антителолор менен салыштырууга боло турганы айтылган.

Кургак тест тилкелери бөлмө температурасында кургак шартта 7 ай сакталгандан кийин көрсөткүчүн сактаганы жана фон сигналында өсүү байкалбаганы билдирилген. Бирок авторлор туруктуулук системалуу изилденбегенин ачык белгилешет. Ошондуктан жети айлык байкоо валидделген сактоо мөөнөтү катары чечмеленбеши керек.

Келечекте сунушталган колдонуу тармактары

Авторлор колициндер стандарттык LFIA кассеталарында универсалдуу молекулалык даректер катары колдонулушу мүмкүн экенин, ар башка максаттарга спецификалуу иммунитет-белок фузиялуу антителолор кийин ошол эле негизги тилке архитектурасына колдонулушу мүмкүн экенин болжолдошот.

Мындан тышкары, COLPLEX иммуноанализдер менен гана чектелбеши мүмкүн; иммунитет белоктору антителонун ордуна праймер же проб сыяктуу олигонуклеотиддерге байланыштырылса, RPA же LAMP сыяктуу изотермалдык нуклеин кычкылы амплификация продуктулары да multiplex lateral flow форматында кармалышы мүмкүн деп сунушталат.

Бул бөлүм изилдөөнүн келечекке багытталган технологиялык сунушу. COLPLEX негизиндеги RPA же LAMP молекулалык тести бул макалада эксперименттик түрдө иштелип чыгып, ырасталган эмес.

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

• AP41 жана Khan колицин–иммунитет жуптары бул эксперименттик түзүлүштө күчтүү cognate байланыш жана байкалуучу non-cognate кайчылаш реакциясыз иштеген.
• Эки өзүнчө COLPLEX жубу бир LFIA тилкесинде бири-биринен көз карандысыз молекулалык тест сызыктарын түзө алат.
• COLPLEX прототиби Zaire жана Sudan Ebola гликопротеиндерин ар башка сызык үлгүлөрү менен айырмалай алган.
• COLPLEX форматы антителону түз иммобилизациялоого караганда төмөн blank сигнал жана төмөн LoD чыгарган.
• Zaire Ebola RT-PCR оң 30 клиникалык сыворотка үлгүсүнүн 29 үлгүсү прототип тарабынан оң табылган.
• 40 EBOV-терс клиникалык сыворотка үлгүсүнүн баары терс табылган.
• 50 дени сак сыворотка жана 50 дени сак EDTA плазма үлгүсүндө тест сызыктарында спецификалуу эмес оң сигнал байкалган эмес.
• COLPLEX азыраак кармоочу антитело көлөмү менен иштей алган.

Изилдөө колдобогон жыйынтыктар

• Прототип бардык Ebola эпидемияларында %96,7 сезгичтик менен иштей турганы далилденген эмес.
• Sudan Ebola инфекциясы бар чыныгы бейтаптардын сывороткасында клиникалык сезгичтик бул изилдөөдө өлчөнгөн эмес.
• 30 оң жана 40 терс үлгүдөн алынган клиникалык көрсөткүч кеңири масштабдагы проспективдүү талаа валидациясын алмаштырбайт.
• COLPLEXтин так сактоо мөөнөтү аныкталган эмес.
• Тандалган AP41 жана Khan жуптарынын так K_d маанилери бул изилдөөдө түз өлчөнгөн эмес.
• COLPLEX стрептавидин–биотинден бардык колдонуу сценарийлеринде артык экени далилденген эмес.
• Өндүрүш наркы реалдуу өнөр жай масштабында канча азаяры эсептелген эмес.
• Прототип үчүн жөнгө салуучу жактыруу же күнүмдүк клиникалык колдонууга уруксат билдирилген эмес.
• COLPLEX негизиндеги молекулалык RPA/LAMP колдонмосу бул макалада эксперименттик ырасталган эмес.

Негизги чектөөлөр

Клиникалык оң үлгүлөрдүн саны: Zaire Ebola үчүн болгону 30 RT-PCR оң сыворотка үлгүсү бааланган. Сезгичтиктин ишеним аралыгынын кеңдиги чакан үлгүдөгү белгисиздикти чагылдырат.

Sudan Ebola клиникалык валидациясы: Sudan гликопротеини рекомбинанттык/spike антиген тажрыйбаларында ийгиликтүү аныкталганы менен, Sudan Ebola бейтаптарынан алынган клиникалык үлгүлөрдө диагностикалык сезгичтик көрсөтүлгөн эмес.

Формат салыштыруунун оптималдаштырылышы: Авторлор бир эле XC2-алтын аныктоочу антителону эки форматта тең колдонуп, бирок эксперименттик шарттар COLPLEX форматы үчүн оптималдаштырылганын белгилешкен. Түз форматта конъюгат көлөмүн өзүнчө оптималдаштыруу фонду азайтышы мүмкүн; бирок авторлор бул сигналды да азайтышы мүмкүн экенин талкуулашат.

Туруктуулук: Жети айлык оң сактоо байкоосу бар, бирок системалуу туруктуулук изилдөөсү жок.

Ар башка басылмалар менен LoD салыштыруу: Булактагы 2-таблицада мурунку тез тесттер менен салыштыруу бир стандарттуу экспериментте жүргүзүлгөн head-to-head тест эмес.

Булак ичиндеги сандык айтылыш айырмалары: Клиникалык сезгичтик кириш жана натыйжалар бөлүмдөрүндө ар башка тегеректөө/ишеним аралыгы форматында берилген; Sudan LoD жакшырышы да натыйжаларда болжол менен 32 эсе, талкууда 34 эсе деп айтылган.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска аталышы: COLPLEX: A high-affinity protein adaptor for enhanced sensitivity and multiplex lateral flow immunoassays. application to ebola virus strain detection

Авторлор: Romain Clément; Céline Couturier; Oumar Ndiaye; Cheikh Talibouya Touré; Frank William Mendy; Moussa Dia; Stéphanie Geoffroy; Anely Tranchot; Natacha Mariano; Stéphanie Donnat; Charlotte Mignon; Benoît Beitz; Alejandra Mier; Joseph Robert Anderson Fitchett; Oumar Faye; Cheikh Tidiane Diagne; Oxana Vratskikh; Christophe Védrine.

Corresponding author: Christophe Védrine.

Тең салым: Каралган булакта тең салым/тең биринчи автор тууралуу билдирүү жок.

Мекеме a: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 40 avenue Tony Garnier, Lyon 69007, France.

Мекеме b: Bioassays, Microsystems and Optical Engineering, BIOASTER, 28 rue du Docteur Roux, Paris 75015, France.

Мекеме c: DIATROPIX, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Мекеме d: Virology Department, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Мекеме e: Executive Office, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, Dakar BP 220, Senegal.

Журнал: Sensors and Actuators B: Chemical.

Том / жарыялоо күнү / макала номери: Том 454, 1 май 2026, 139608.

Онлайн жарыялоо күнү: 5 февраль 2026.

Алынган күнү: 6 ноябрь 2025.

Кайра каралган күнү: 30 январь 2026.

Кабыл алынган күнү: 4 февраль 2026.

DOI: 10.1016/j.snb.2026.139608.

Басма: Elsevier B.V.

Булак түрү: Рецензияланган изилдөө макаласы; биосенсор/LFIA иштеп чыгуу, аналитикалык мүнөздөмө жана клиникалык үлгү валидациясы.

Лицензия: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Негизги клиникалык референс ыкма: Zaire Ebola RT-PCR.

Негизги аналитикалык салыштыруу: COLPLEX негизиндеги biplex LFIA менен кармоочу антителолор нитроцеллюлозага түз иммобилизацияланган biplex LFIA.

Тест максаттары: Zaire Ebola гликопротеини жана Sudan Ebola гликопротеини.

Негизги молекулалык адаптерлер: ColAP41–ImAP41 жана ColKhan–ImKhan.

Негизги кармоочу антителолор: EE8 жана JA7.

Негизги аныктоочу антитело: XC2.

Визуалдык аныктоо системасы: 40 nm алтын нанобөлүкчө конъюгаты.

Иштеп чыгуу баскычындагы оптикалык системалар: RLuc8 жана NanoLuc негизиндеги хемилюминесценция.

Сүрөт жана сызык анализи: Chemidoc, ImageJ жана Image Lab.

Статистикалык программа: GraphPad Prism 10.0.

LoB ыкмасы: Терс сыворотканын 30 кайталанма өлчөөсүнөн MeanBlank + 2,58 × SDBlank; %99 ишеним деңгээли.

LoD ыкмасы: Ар бир концентрацияда n=5 өлчөө, төрт параметрлүү логистикалык регрессия, стандарттык четтөөнү түзөтүү жана LoB менен түзөтүлгөн ийринин кесилиши.

Клиникалык сезгичтик панели: 30 RT-PCR оң Zaire Ebola сыворотка үлгүсү; 29 чыныгы оң, 1 жалган терс.

Клиникалык спецификалуулук панели: 40 EBOV-терс сыворотка; 10 сары безгек, 10 dengue, 10 Rift Valley fever, 10 Сенегал дени сак контроль; баары терс.

Кошумча матрица/спецификалуу эмес байланыш панели: Европадагы дени сак донорлордон 50 дени сак сыворотка жана 50 EDTA плазма.

Этика: Изилдөө Хельсинки декларациясынын принциптерине ылайык жүргүзүлүп, анализге чейин үлгүлөрдүн идентификациясы алынып салынган. Ebola үлгүлөрү улуттук саламаттык сактоо органдарынын шашылыш жооп милдети учурундагы кадимки учурларды башкаруудан алынгандыктан өзүнчө IRB жактыруусу талап кылынбаганы; бейтаптар Ebola тестине оозеки макулдук бергени жана үлгүлөр кийин референс биобанкта сакталганы билдирилген. Башка геморрагиялык ысытма жана дени сак донор үлгүлөрү тиешелүү этикалык жактырылган көзөмөл иш-чараларынан калган үлгүлөр.

Маалыматтын жеткиликтүүлүгү: Маалыматтар негиздүү суроо-талап боюнча берилери айтылган.

Каржылоо билдирүүсү: Каралган негизги PDFте өзүнчө Funding бөлүмү же атайын каржылоо билдирүүсү жок; ошондуктан каржылоо булагы ойлоп табылган эмес.

Жасалма интеллект билдирүүсү: Каралган негизги PDFте өзүнчө генеративдик жасалма интеллект колдонуу жөнүндө билдирүү жок.

Кызыкчылыктардын кагылышы: Christophe Védrineдин “Methods and reagents for multiplex binding experiments” аттуу WO2020104397A1 патенти BIOASTER атынан күтүлүп жатканы билдирилген. Калган авторлор изилдөөгө таасир этиши мүмкүн деп көрүнгөн белгилүү атаандаш каржылык кызыкчылык же жеке мамиле билдиришкен эмес.

CRediT салымдары: Oumar Faye — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Resources, Investigation, Formal analysis; Cheikh Talibouya Touré — Resources, Investigation, Data curation; Joseph Robert Anderson Fitchett — Writing – review & editing, Validation; Anely Tranchot — Visualization, Investigation, Formal analysis; Christophe Védrine — Writing – review & editing, Validation, Supervision, Formal analysis, Conceptualization; Stéphanie Geoffroy — Visualization, Validation, Investigation, Formal analysis; Oxana Vratskikh — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Supervision, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Moussa Dia — Resources, Investigation, Data curation; Cheikh Tidiane Diagne — Writing – review & editing, Validation, Resources, Investigation, Formal analysis; Frank William Mendy — Resources, Investigation, Data curation; Benoît Beitz — Visualization, Investigation, Formal analysis; Romain Clément — Writing – review & editing, Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis, Conceptualization; Charlotte Mignon — Visualization, Supervision, Methodology, Formal analysis; Stéphanie Donnat — Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Natacha Mariano — Writing – original draft, Visualization, Methodology, Investigation, Formal analysis; Oumar Ndiaye — Writing – original draft, Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Formal analysis; Alejandra Mier — Visualization, Validation, Methodology, Investigation, Conceptualization; Céline Couturier — Visualization, Investigation, Formal analysis.

Булак ичиндеги сандык дал келбестик 1: Кириш/алгачкы кыскача бөлүмдө 29/30 клиникалык оң үлгү үчүн сезгичтик %96,6 жана ишеним аралыгы %82,24–99,91 деп жазылса, натыйжалар бөлүмүндө %96,7 жана %95 CI %83,3–99,9 деп берилет. Негизги чийки катыш 29/30.

Булак ичиндеги сандык дал келбестик 2: GPSudan LoD жакшырышы натыйжалар бөлүмүндө болжол менен 32 эсе, талкуу бөлүмүндө 34 эсе деп жазылган. Түз билдирилген LoD маанилери 0,065 nM / 2,2 ng/mL жана 2,10 nM / 70,98 ng/mL.

Булак ичиндеги терминология эскертүүсү: Ыкма бөлүмү AP41 жубун Pseudomonas aeruginosa AP41 тегинен деп сүрөттөсө, натыйжалар бөлүмүндө бир жерде Pseudomonas aeruginosa PAO1 деген сөз колдонулат. Verianla тексти бул белгисиздикти кеңейтпей, жуптун изилдөө ичиндеги canonical аталышы AP41ди колдонгон.

Визуалдык кайра түзүү: Булактагы 4-сүрөттөгү тест архитектурасы булак мамилелерине таянып, башка графикалык композиция менен inline SVG катары кайра түзүлгөн. 6–7-сүрөттөрдөгү сандык концентрация графиктери болсо бардык чийки чекит координаттары негизги текстте болбогондуктан жасалма интерполяция менен тартылган эмес; ачык билдирилген LoB, LoD жана клиникалык натыйжалар HTML таблицаларында берилген.

Негизги чечмелөө чеги: COLPLEX бул изилдөөдө күчтүү аналитикалык жана алгачкы клиникалык үлгү көрсөткүчтөрүн көрсөткөн прототип. Натыйжалар түзмөк бардык Ebola эпидемия шарттарында ушундай эле көрсөткүч берерин, Sudan Ebola бейтаптарында клиникалык ырасталганын, жөнгө салуучу жактыруу алганын же валидделген узак сактоо мөөнөтүнө ээ экенин көрсөтпөйт.