Плазмаи нитроген-оксиген (N₂/O₂ plasma), равиши физикии плазма мебошад, ки ҳадаф дорад аз ҷараёни назоратшавандаи газҳои нитроген ва оксиген плазмаи барқӣ ҳосил карда, намудҳои реактивии оксиген ва нитрогенро ба вуҷуд орад. Ин таҳқиқот таъсири муҳитҳои бо плазмаи N₂/O₂ коркардшударо дар моделҳои аденокарциномаи эндометрии HEC1A, карциномаи сервикалии HeLa, меланомаи муш B16F10 ва саратони ғайрихурдҳуҷайравии шуши инсон H1299; бо истифода аз фибробластҳои ибтидоии инсон ҳамчун назорати муқаррарӣ ва инчунин модели омоси муши B16F10/C57BL/6 арзёбӣ кардааст. Хулосаи асосии манбаъ ин аст, ки плазмаи N₂/O₂ дар моделҳои омӯхташудаи саратон стресси оксидиро зиёд карда, асосан апоптозро фаъол мекунад ва онро осеби оксидии мембрана, ки бо пероксидатсияи липидҳо алоқаманд аст, ҳамроҳӣ мекунад.

Дар таҷрибаҳои in vitro ҳуҷайраҳо бевосита зери ҷараёни плазма нигоҳ дошта нашудаанд. Манбаъ мегӯяд, ки муҳити фарҳангӣ бо плазма коркард шуда, сипас ба ҳуҷайраҳо татбиқ шудааст. Дар усули пешфарз муҳити фарҳангӣ бо плазмаи N₂/O₂ барои 10 дақиқа коркард шуда, ҳуҷайраҳо дар ин муҳит 24 соат инкубатсия шудаанд; дар баъзе шаклҳо коркарди плазмаи 0, 5 ё 10 дақиқа ва давраҳои гуногуни инкубатсия низ истифода шудаанд.

Дар ҳуҷайраҳои HEC1A бо зиёд шудани сатҳи плазма қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳо кам шуд, дар ҳоле ки дар фибробластҳои ибтидоии инсон чунин талафоти равшан дида нашуд. Дар ҳуҷайраҳои H1299, 1 µM carboxy-PTIO, ки барои маҳдуд кардани таъсири намудҳои реактивии нитроген истифода шуд, таъсири ситотоксикии плазмаи N₂/O₂-ро коҳиш дод. Бо вуҷуди ин, таҳқиқот танҳо бо як навъи муайяни ҳуҷайраи муқаррарӣ муқоиса кардааст; натиҷа маънои онро надорад, ки ҳамаи бофтаҳои муқаррарӣ ба плазма тобоваранд ё ин усул барои одамон бехатар аст.

Апоптоз бо ситометрияи ҷараёнии Annexin V/propidium iodide, афзоиши генҳои проапоптотикии Bax ва Bak1, коҳиши Bcl-2, Bcl-xl ва Bcl-w дар Figure 2, пора шудани PARP ва caspase-3, афзоиши γH2AX, фосфорилатсияи p53 Ser15, болоравии нишондиҳандаҳои стресси ER BIP ва CHOP ва аз даст рафтани потенсиали мембранаи митохондрия, ки бо JC-1 чен шудааст, дастгирӣ карда шудааст.

Намудҳои реактивии оксиген дар дохили ҳуҷайра (ROS) пас аз плазмаи N₂/O₂ бо мурури вақт афзоиш ёфтанд. Вақте ки бори ROS бо Glutathione (GSH) коҳиш дода шуд, барқароршавии вобаста ба доза дар қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳо нишон медиҳад, ки стресси оксидӣ дар марги ҳуҷайра на танҳо нишондиҳандаи ҳамроҳ, балки як омили муҳими upstream мебошад. Бо вуҷуди ин, таҳқиқот ҳамаи намудҳои мушаххаси оксиген ва нитрогени ҳосилшударо алоҳида муайян накарда ва махсусан саҳми нисбии намудҳои реактивии аз нитроген ҳосилшударо пурра ҳал накардааст.

RNA-seq ва таҷрибаҳои функсионалӣ тағйирот дар генҳои марбут ба ферроптоз ва афзоиши пероксидатсияи липидҳоро нишон доданд. Ferrostatin-1 қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳоро қисман барқарор кард, sorafenib бошад ситотоксикии плазмаро қавитар намуд. Баръакс, хелатори оҳан deferoxamine марги ҳуҷайра ё пероксидатсияи липидҳоро ба таври назаррас кам накард. Slc7a11 ва Slc7a5 зиёд шуда, Acsl4 коҳиш ёфт. Аз ин рӯ, манбаъ марги ҳуҷайраро на ҳамчун ферроптози классикии вобаста ба оҳан, балки ҳамчун ситотоксикии марбут ба стресси оксидӣ ва пероксидатсияи липидҳо, ки апоптози бартаридоштаро ҳамроҳӣ мекунад, тафсир мекунад.

Дар таҷрибаи муш, афзоиши омосҳое, ки бо ҳуҷайраҳои меланомаи B16F10 дар мушҳои модаи C57BL/6 ба вуҷуд оварда шуда буданд, дар гурӯҳе, ки PBS-и бо плазма коркардшударо гирифт, нисбат ба назорат кам шуд. Аммо истифодаи системавӣ, гистопатология дар сатҳи узв, муқоисаи бофтаҳои муқаррарӣ ва таҳлили фарогири токсикӣ анҷом дода нашудаанд. Аз ин рӯ, ин таҳқиқот самаранокӣ ё бехатарии табобати саратонро дар одамон исбот намекунад.

Плазма чист?

Плазма муҳити физикиест, ки дар он молекулаҳои газ энергия гирифта, ба ҳолати баландтари энергетикӣ мегузаранд, ки электронҳо, ионҳо ва намудҳои гуногуни реактивӣ доранд. Дар таҳқиқоти плазмаи биотиббӣ ҳадаф танҳо истеҳсоли ҳарорати баланд нест; балки ба таври назоратшаванда ҳосил кардани намудҳои реактивии оксиген (reactive oxygen species, ROS), намудҳои реактивии нитроген (reactive nitrogen species, RNS), майдонҳои барқӣ ва дигар ҷузъҳои физикӣ-кимиёвие мебошад, ки метавонанд бо ҳуҷайраҳо ҳамтаъсир кунанд.

Дар дастгоҳи таҷрибавии ин мақола нитроген ва оксиген тавассути системаҳои ҷудогонаи mass-flow controller дода шуда, дар камераи омехтакунӣ якҷо ва дар манбаи плазмаи баландшиддат коркард мешаванд. Азбаски манбаъ ҳарорати гази баромад ё қимати дақиқи фишори атмосфериро гузориш намедиҳад, Verianla барои ин дастгоҳ ҳарорат ё фишоре, ки дар манбаъ нест, эҷод намекунад.

Чаро нитроген ва оксиген якҷо истифода шудаанд?

Асоси кори муаллифон ин аст, ки дар системаҳои асосёфта ба газҳои асил, ба монанди гелий ё аргон, химияи намудҳои реактивӣ метавонад ба омехташавии ҳавои муҳит ва шароити маҳдуди гази иловагӣ ҳассос бошад; инчунин газҳои асил аз ҷиҳати арзиш ва таъминот камбудӣ эҷод карда метавонанд. Омехтаи N₂/O₂ аз ҷиҳати имкони якҷо тавлид кардани намудҳои реактивии оксиген ва нитроген аз газҳои дастрастар ва назорат кардани таркиби кимиёвӣ арзёбӣ шудааст.

Бо вуҷуди ин, таҳқиқот мустақиман ва бо муқоиса нишон надодааст, ки омехтаи N₂/O₂ аз ҳамаи омехтаҳои алтернативии газ самараноктар, арзонтар ё аз ҷиҳати клиникӣ беҳтар аст.

Дастгоҳи плазма чӣ гуна кор мекунад?

Намудҳои реактивии оксиген ва нитроген чӣ маъно доранд?

ROS, номи умумии молекулаҳо ва радикалҳои дорои оксиген ва реактивияти баланд аст. RNS бошад намудҳои реактивии дорои нитрогенро дар бар мегирад. Ин молекулаҳо дар сатҳҳои паст ва танзимшуда метавонанд ба сигнализатсияи ҳуҷайравӣ саҳм гузоранд, аммо ҳангоми аз ҳад зиёд ҳосил шудан метавонанд сафедаҳо, липидҳо ва кислотаҳои нуклеиниро ба таври оксидӣ тағйир диҳанд.

Манбаъ намудҳои реактивии нитрогенро бо Nitrite Assay Kit-и асосёфта ба Griess Reagent арзёбӣ карда, абсорбансро дар 540 nm чен кардааст. Figure 1 инро ҳамчун “nitric oxide concentration” пешниҳод мекунад. Аз ин рӯ, Verianla ин ченкуниро бевосита ҳамчун профили миқдории кимиёвии ҳамаи намудҳои мушаххаси RNS тафсир намекунад.

Плазмаи Нитроген-Оксиген Ҳуҷайраҳои Саратонро Чӣ Гуна Мекушад?

Механизми асосие, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад, ин аст, ки намудҳои реактивии бо плазмаи N₂/O₂ ҳосилшуда тавозуни редоксии ҳуҷайраро халалдор мекунанд; ин афзоиши ROS, осеби DNA, стресси ER, аз даст рафтани потенсиали мембранаи митохондрия ва осеби мембранаи марбут ба пероксидатсияи липидҳоро ба вуҷуд оварда, ин роҳҳои стресс асосан дар марги апоптотикии ҳуҷайраи вобаста ба каспаза якҷо мешаванд.

Таҷрибаи c-PTIO чиро нишон медиҳад?

Carboxy-PTIO дар таҳқиқот ҳамчун scavenger барои маҳдуд кардани таъсири намудҳои реактивии марбут ба NO истифода шудааст. Дар ҳуҷайраҳои H1299, 1 µM c-PTIO талафи қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳоро, ки бо плазмаи N₂/O₂ дида шуд, коҳиш дод. Ин натиҷа дастгирӣ мекунад, ки намудҳои реактивии нитрогени аз газ ҳосилшуда дар таъсири биологӣ нақш доранд.

Аммо мудохилаи c-PTIO натиҷаи “тамоми ситотоксикӣ танҳо аз ҷониби NO ба вуҷуд меояд”-ро нишон намедиҳад. Таҷрибаҳои минбаъдаи таҳқиқот нишон медиҳанд, ки ROS-и дохили ҳуҷайра низ нақши марказӣ дорад.

Чаро ROS омили upstream шуморида мешавад?

Дар ҳуҷайраҳои HEC1A сигнали флуоресцентии ROS пас аз плазмаи N₂/O₂ бо мурури вақт зиёд шуд. Азбаски танҳо ин коррелятсия барои механизм кофӣ набуд, муҳаққиқон бо glutathione (GSH) мудохила карданд. Дар Figure 3B ҳангоми истифодаи 10 ва 100 µM GSH қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳо вобаста ба доза зиёд шуд.

Агар боздошт ё тоза кардани як марҳилаи миёнаи биологӣ натиҷаи downstream-ро коҳиш диҳад, ин нақши функсионалии он марҳиларо дар механизм дастгирӣ мекунад. Аз ин рӯ, натиҷаи GSH нишон медиҳад, ки ROS танҳо нишондиҳандаи ҳамроҳи марги ҳуҷайра нест, балки як омили upstream аст, ки ба ситотоксикӣ саҳм мегузорад.

γH2AX чиро нишон медиҳад?

H2AX сафедаи гистонест, ки дар ҷавоби осеби DNA метавонад фосфорилатсия шавад. Шакли фосфорилатсияшудаи он γH2AX, махсусан барои шикастҳои DNA ва фаъолшавии DNA damage response нишондиҳандаи васеъ истифодашаванда аст. Афзоиши γH2AX пас аз плазмаи N₂/O₂ фаъол шудани ҷавоби осеби DNA-ро дар ҳуҷайраҳо дастгирӣ кард.

Чаро фосфорилатсияи p53 Ser15 чен шудааст?

p53 сафедаи фурӯнишонандаи омос мебошад, ки дар шароити осеби DNA ва стресси ҳуҷайравӣ дар боздошти даври ҳуҷайра ё танзими ҷавоби апоптотикӣ иштирок мекунад. Фосфорилатсия дар минтақаи Ser15 яке аз нишондиҳандаҳои фаъолшавии марбут ба DNA damage response аст. Дар таҳқиқот фосфорилатсияи p53 Ser15 зиёд шуда, якҷо бо бозёфти γH2AX ҷавоби осеби DNA/стрессро дастгирӣ кардааст.

BIP ва CHOP чиро нишон медиҳанд?

BIP, яке аз шаперонҳоест, ки бо бори қатшавии сафеда дар ретикулуми эндоплазмӣ ва unfolded protein response алоқаманд аст. CHOP бошад омили транскрипсионии ҷавоби стресс аст, ки ҳангоми стресси тӯлонӣ ё шадиди ER метавонад ба барномаи апоптотикӣ саҳм гузорад. Афзоиши ҳар ду сафеда аз ҷумлаи бозёфтҳоест, ки вайрон шудани протеостази ER-ро аз ҷониби плазмаи N₂/O₂ дастгирӣ мекунад.

Чаро пора шудани PARP ва caspase-3 муҳим аст?

Caspase-3 яке аз каспазаҳои иҷрокунандаи апоптоз аст. Caspase-3-и фаъолшуда бисёр ҳадафҳои ҳуҷайравиро мебурад; PARP низ яке аз онҳост. Дидани cleaved caspase-3 ва cleaved PARP далели биокимиёвиест, ки нишон медиҳад ҳуҷайра танҳо зери стресс нест, балки механизми иҷрои апоптотикӣ фаъол шудааст.

Потенсиали мембранаи митохондрия чӣ гуна чен карда шуд?

Дар ҳуҷайраҳои HeLa рангкунандаи флуоресцентии JC-1 ва тасвиргирии ҳуҷайраи зинда дар асоси holotomography истифода шудааст. Дар митохондрияҳои солим ва поляризатсияшуда JC-1 сигнали сурхи aggregate бештар медиҳад, дар ҳоле ки ҳангоми паст шудани потенсиали мембрана сигнали сабзи monomer зиёд мешавад.

Пас аз плазмаи N₂/O₂ нисбати флуоресценсияи сурх/сабз коҳиш ёфт ва ҳиссаи нисбии monomer-ҳои JC-1 зиёд шуд. Ин натиҷа деполяризатсияи митохондрия ва фаъол шудани роҳи intrinsic апоптотикиро дастгирӣ мекунад.

Дар бахши Methods консентратсияи JC-1 ҳамчун 1 mM чоп шудааст. Ин қимат аз ҷониби Verianla хомӯшона ба воҳиди дигар табдил дода нашудааст; ҳамон гуна ки дар манбаъ навишта шудааст, нигоҳ дошта мешавад.

Оё Пероксидатсияи Липидҳо Дар Ин Таҳқиқот Далели Ферроптоз Аст?

Не. Пероксидатсияи липидҳо зиёд шуда ва ferrostatin-1 марги ҳуҷайраҳоро қисман кам кардааст; аммо хелатсияи оҳан натиҷаро барқарор накард, инчунин афзоиши Slc7a11/Slc7a5 ва коҳиши Acsl4 бештар ба мутобиқшавии муҳофизатии редокс ишора карданд, на ба ферроптози каноникӣ. Хулосаи манбаъ ферроптози классикии вобаста ба оҳан нест, балки ситотоксикии оксидии марбут ба пероксидатсияи липидҳо мебошад, ки апоптозро ҳамроҳӣ мекунад.

Ферроптоз чист?

Ферроптоз шакли танзимшудаи марги ҳуҷайра мебошад, ки пероксидатсияи липидҳои вобаста ба оҳан хусусияти муайянкунандаи он аст. Он аз апоптоз хусусиятҳои молекулавӣ ва морфологии фарқкунанда дорад. Аз ин рӯ, танҳо афзоиши пероксидатсияи липидҳо дар ҳуҷайра барои ташхиси ферроптоз кофӣ нест.

Чаро RNA-seq эҳтимоли ферроптозро ба миён гузошт?

Transcriptomic profiling дар ҳуҷайраҳои B16F10 дар баробари роҳҳои сигнализатсияи апоптотикӣ ва ҷавобҳои стресси оксидӣ, инчунин дар маҷмӯаҳои генҳои марбут ба ферроптоз тағйирот нишон дод. Дар volcano plot манбаъ нишон медиҳад, ки 335 ген ба таври назаррас upregulated ва 206 ген downregulated мебошанд.

Аз генҳои интихобшудаи марбут ба ферроптоз Slc7a11 ва Slc7a5 зиёд шуда, Acsl4 кам шудааст. Муаллифон махсусан қайд мекунанд, ки ин намуна бештар мутобиқшавии redox-regulatory ва anti-ferroptotic-ро дар муқобили бори оксидӣ нишон медиҳад, на пешравии фаъоли canonical ferroptosis.

Чаро Slc7a11 муҳим аст?

Slc7a11 яке аз ҷузъҳои муҳими системаи cystine/glutamate antiporter мебошад ва ба ворид шудани cystine, ки барои синтези glutathione-и ҳуҷайра зарур аст, саҳм мегузорад. Афзоиши он метавонад бо ҷавоби стресс-мутобиқшавӣ мувофиқ бошад, ки ҳуҷайра кӯшиш мекунад қобилияти antioxidant-и худро барои буфер кардани бори оксидӣ нигоҳ дорад.

Чаро Acsl4 муҳим аст?

ACSL4 ферментест, ки дар ворид шудани кислотаҳои равғании бисёрносершуда ба липидҳои мембрана иштирок мекунад ва дар бисёр моделҳои ферроптоз бо ҳассосият ба ферроптоз алоқаманд аст. Коҳиши mRNA-и Acsl4 дар таҳқиқот яке аз унсурҳоест, ки тафсири муҳофизатӣ/anti-ferroptotic-ро ба ҷойи canonical ferroptosis дастгирӣ мекунад.

Таҷрибаҳои sorafenib ва ferrostatin-1 чиро нишон медиҳанд?

Манбаъ sorafenib-ро дар ин таҷриба ҳамчун модулятори ташвиқкунандаи ферроптоз истифода кардааст. Вақте 1 µM sorafenib якҷо бо плазмаи N₂/O₂ татбиқ шуд, ситотоксикӣ дар ҳуҷайраҳои B16F10 зиёд шуд.

10 µM ferrostatin-1 бошад қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳоро, ки бо плазмаи N₂/O₂ коҳиш ёфта буд, қисман барқарор кард. Азбаски ferrostatin-1 ингибитори ферроптоз аст, ки пероксидатсияи липидҳоро бозмедорад, ин натиҷа саҳми пероксидатсияи липидҳоро ба бори марги ҳуҷайра дастгирӣ мекунад.

Аммо “барқароршавии қисман” ҳамчунин нишон медиҳад, ки тамоми таъсири плазма тавассути ферроптоз ба амал намеояд.

Чаро таҷрибаи Deferoxamine муҳим аст?

Deferoxamine (DFO) хелаторест, ки оҳанро мебандад. Агар марги мушоҳидашудаи ҳуҷайра бо ферроптози классикии вобаста ба оҳан шарҳ дода мешуд, интизор мерафт, ки хелатсияи оҳан марги ҳуҷайра ва пероксидатсияи липидҳоро кам кунад. Манбаъ хабар медиҳад, ки DFO ин корро ба таври назаррас анҷом надод.

Аз ин рӯ, муаллифон мавҷудияти пероксидатсияи липидҳоро қабул мекунанд, аммо натиҷаро ҳамчун классикии iron-dependent ferroptosis тасниф намекунанд.

Оё апоптоз ва пероксидатсияи липидҳо ҳамзамон вуҷуд дошта метавонанд?

Бале. Механизмҳои марги ҳуҷайра ҳамеша аз ҳам пурра ҷудо нестанд. Стресси шадиди оксидӣ метавонад ҳамзамон ба мембранаҳои липидӣ, DNA, системаҳои қатшавии сафеда ва митохондрия таъсир расонад. Намунаи далелҳои ин таҳқиқот дастгирӣ мекунад, ки механизми бартаридоштаи иҷро апоптоз аст; пероксидатсияи липидҳо бошад қабати иловагии осеби оксидиро ташкил медиҳад.

Оё Ин Таҳқиқот Далели Табобати Саратон Дар Одамон Аст?

Не. Дар таҳқиқот хатҳои ҳуҷайравии саратони инсон ва модели allograft-и меланомаи муш истифода шудаанд, аммо дар беморони инсон табобати плазмаи N₂/O₂ татбиқ нашудааст; ҷавоби клиникии омос, доза, нуфуз ба бофта, бехатарии системавӣ, токсикии узв ё самаранокии дарозмуддат арзёбӣ нашудаанд.

Таҷрибаи муш чӣ гуна анҷом дода шуд?

Мушҳои модаи болиғи C57BL/6 дар ҳар гурӯҳ бо n=9 истифода шуданд. 1 × 10⁶ ҳуҷайраи меланомаи муши B16F10 дар омехтаи 1:1 аз PBS-и хунук ва Corning Matrigel омода шуда, ба минтақаи flank-и мушҳо зери пӯст тазриқ шудааст.

Вақте омосҳо тақрибан ба 50 mm³ расиданд, мушҳо ба гурӯҳҳои табобатӣ тасодуфӣ тақсим шуданд. Ба мушҳои назоратӣ 100 µL PBS, ба гурӯҳи таҷрибавӣ 100 µL PBS-и бо плазма коркардшуда дода шуд. Татбиқ ҳафтае панҷ маротиба, дар маҷмӯъ 15 табобат, барои 21 рӯз идома ёфт.

Бахши Methods-и манбаъ ин татбиқҳоро “subcutaneous injections” менависад, дар ҳоле ки Abstract ва Discussion ибораи “intratumoral administration”-ро истифода мебаранд. Азбаски манбаъ ин фарқи терминологиро шарҳ намедиҳад, Verianla ҷойгиршавии дақиқи анатомии татбиқро бо интихоби яке аз онҳо аз нав муайян намекунад.

Дар анҷоми табобат омосҳо хориҷ карда шуданд ва андозаи омос дар гурӯҳи гирифтани PBS-и бо плазма коркардшуда нисбат ба назорат ба таври назаррас камтар буд.

Аммо таҳқиқот гистопатологияи узвҳои муқаррарӣ, токсикии системавӣ ё интихобпазирии бофтаи муқаррарӣ/омосро in vivo муқоиса накардааст. Илова бар ин, азбаски татбиқ локалӣ буд, таъсиррасонии системавӣ маҳдуд аст.

Фарқи allograft ва xenograft чист?

Syngeneic allograft, модели омосест, ки дар он ҳайвони ҳамон намуд ва аз ҷиҳати генетикӣ мувофиқ бо ҳуҷайраи омос истифода мешавад. Дар ин таҳқиқот B16F10 ҳуҷайраи меланомаи муш ва C57BL/6 низ муш аст, бинобар ин бахши Methods системаро ҳамчун syngeneic murine melanoma/allograft муайян мекунад.

Xenograft бошад ҳуҷайра ё бофтаи байни намудҳои гуногун кӯчонидашударо ифода мекунад; масалан, додани ҳуҷайраи омоси инсон ба муш. Дар тавзеҳи Figure 1F ба таҷрибаи B16F10/C57BL/6 “xenograft” гуфта шудааст, ки бо таърифи Methods мувофиқ нест. Ин номувофиқии терминологӣ дар версияи Article in Press аз ҷониби Verianla хомӯшона ислоҳ нашудааст.

Усул Ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Параметрҳои техникии системаи тавлиди плазма

Моделҳои ҳуҷайравии истифодашуда дар таҳқиқот

Шароити фарҳанги ҳуҷайра

Ҳамаи ҳуҷайраҳо дар муҳити DMEM бо %10 fetal bovine serum ва %1 penicillin-streptomycin, дар 37 °C ва инкубатори намнокшудаи %5 CO₂ парвариш карда шуданд.

Санҷиши зиндамонии MTT

Қобилияти зиндамонии ҳуҷайра бо усули Cell Proliferation Kit I MTT арзёбӣ шуд. Ҳуҷайраҳо ба 96-well plate бо 1 × 10⁴ ҳуҷайра/well шинонда шуда, абсорбанс бо SpectraMax 190 microplate reader дар 570 nm чен карда шуд.

MTT нишондиҳандаи нисбии зиндамонии ҳуҷайра дар асоси фаъолияти метаболикӣ мебошад. Аз ин рӯ, коҳиши сигнали MTT худ ба худ муайян намекунад, ки кадом шакли марги ҳуҷайра ба амал омадааст. Барои ҳамин манбаъ инчунин Annexin V/PI, caspase/PARP ва дигар таҷрибаҳои механистиро истифода кардааст.

Annexin V ва propidium iodide чиро аз ҳам ҷудо мекунанд?

Annexin V ба phosphatidylserine мепайвандад, ки ҳангоми апоптоз ба сатҳи берунии мембранаи ҳуҷайра мегузарад. Propidium iodide (PI) бошад ба ҳуҷайраҳое ворид мешавад, ки якпорчагии мембранаашонро аз даст додаанд, ва DNA-ро ранг мекунад.

Манбаъ барои ҳар намуна зиёда аз 10.000 ҳуҷайраро таҳлил карда, BD FACSAria III Cell Sorter ва BD FACSDiva v8.0.3-ро истифода кардааст.

Матни асосии Article in Press Figure 2A дар HEC1A афзоиши равшани апоптотикӣ ва дар фибробластҳои ибтидоӣ набудани ҳамон тамоюлро мегӯяд ва панели FACS бо ин тавсиф мувофиқ аст. Аммо мувофиқати намоёни legend/пуркунии bar graph-и ҷамъбастии тарафи рост бо матн пурра мувофиқ намебошад. Аз ин рӯ, Verianla аз Figure 2A қиматҳои нави дақиқи фоизӣ ҳосил намекунад.

Дар генҳои марбут ба апоптоз чӣ тағйир ёфт?

Дар ҳуҷайраҳои B16F10 пас аз плазмаи N₂/O₂ mRNA-ҳои проапоптотикии Bax ва Bak1 зиёд шуданд. Антиапоптотикии Bcl-2 ва Bcl-xl кам шуданд. Figure 2B инчунин дар сатҳи Bcl-w коҳиши равшанро нишон медиҳад.

Манбаъ мегӯяд, ки дар ин бахш махсусан сатҳҳои mRNA арзёбӣ шудаанд ва ин тағйироти генӣ бояд дар сатҳи сафеда алоҳида тасдиқ карда шаванд.

qRT-PCR ва усули ΔΔCt

RNA бо RNeasy Plus Mini Kit гирифта шуда, бо Nano-400A чен, бо AccuPower RT PreMix ба cDNA табдил дода ва дар AriaMx Real-Time PCR System qPCR-и асосёфта ба SYBR Green анҷом дода шудааст. GAPDH ҳамчун housekeeping gene истифода шудааст.

Манбаъ мегӯяд, ки экспрессияи генро бо усули ΔΔCt таҳлил кардааст. Азбаски манбаъ муодилаҳоро алоҳида нанавиштааст, математикаи зерин тавсеаи стандартии омӯзишии усул аст; муодилаи нави таҳқиқот нест:

\(\Delta Ct = Ct_{\mathrm{hedef}} - Ct_{\mathrm{referans}}\)

\(\Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{\mathrm{işlem}} - \Delta Ct_{\mathrm{kontrol}}\)

\(\mathrm{Göreli\ ekspresyon} = 2^{-\Delta\Delta Ct}\)

Формула чиро ҳисоб мекунад? Тағйироти нисбии сатҳи mRNA-и гени ҳадафро, ки ба housekeeping gene нормализатсия шудааст, нисбат ба шароити назоратӣ.

Ct чист? Шумораи cycle аст, ки сигнали флуоресцентии qPCR аз ҳадди муқарраршуда мегузарад.

ΔCt чӣ кор мекунад? Гени ҳадафро ба гени истинодии ҳамон намуна нормализатсия мекунад.

ΔΔCt чӣ кор мекунад? Гурӯҳи коркардшудаи нормализатсияшударо бо гурӯҳи назоратии нормализатсияшуда муқоиса мекунад.

2^−ΔΔCt чӣ медиҳад? Тағйироти нисбии чандкаратаи беандозаро.

Ҳадди тафсир: Азбаски манбаъ қиматҳои хоми Ct-ро дар шакли ҷадвал намедиҳад, Verianla қиматҳои нави fold-change-ро ҳисоб намекунад.

Primer-ҳои qPCR, ки дар манбаъ дода шудаанд

Таҳлили Western blot

Ҳуҷайраҳо бо RIPA buffer лизис шуда, дар 15.000 × g барои 5 дақиқа центрифуга карда шуданд ва сафедаҳо дар гелҳои 5-20% gradient ё %15 SDS-PAGE ҷудо карда шуданд. Пас аз интиқол ба мембранаҳои Nitrocellulose, антителоҳои γH2AX, BIP, CHOP, PARP, caspase-3, p53 ва phospho-p53(Ser15) истифода шуданд.

Манбаъ dilution-и антителоро дар матн ҳамчун “1:2-3000” чоп кардааст. Ин ифода дар матни версияи барвақт аз ҷиҳати типографӣ норавшан аст; Verianla онро хомӯшона ба қимати нави 1:2000 ё 1:3000 табдил намедиҳад.

RNA-seq чӣ гуна анҷом дода шуд?

Аз ҳуҷайраҳои B16F10 total RNA бо RNeasy Mini Kit гирифта шуда; сифат бо Agilent 2100 Bioanalyzer ва RNA 6000 Nano LabChip санҷида шуд. Дар ҳамаи намунаҳо RNA integrity number (RIN) >9 гузориш шудааст.

Poly(A)+ mRNA бо TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit ҷудо ва фрагментатсия шуда; секвенсия дар платформаи Illumina NovaSeq 6000 аз ҷониби Macrogen анҷом дода шудааст.

Methods мегӯяд, ки барои ҳар шароит се такрори биологӣ истифода шудааст. Аммо дар heatmap-и асосии Article in Press Figure 4D сатрҳои намоён Control #1, Control #2, N₂/O₂ Plasma #1 ва N₂/O₂ Plasma #2 мебошанд. Манбаъ шарҳ намедиҳад, ки чаро такрори сеюм дар heatmap дида намешавад.

Меъёри гени дифференсиалӣ чӣ гуна муайян шуд?

Барои ҳар ген Student's t-test татбиқ шуда ва бо истифода аз sample label permutation барои T-statistic empirical null distributions сохта шуданд.

Барои он ки ген ҳамчун differentially expressed gene (DEG) қабул шавад, ду шарт ҳамзамон талаб шуданд:

Adjusted p-value ≤ 0.05

ва

|log₂(fold change)| > 0.428

Манбаъ мегӯяд, ки ҳадди 0.428 тақрибан ба тағйироти 1.35-fold мувофиқ аст ва ба миёнаи процентилҳои 0.5. ва 99.5.-и тақсимоти null log₂ fold-change асос ёфтааст.

log₂(fold-change) чиро нишон медиҳад?

Fold-change нишон медиҳад, ки ген дар гурӯҳи коркардшуда нисбат ба назорат чӣ қадар тағйир ёфтааст. Табдили Log₂ афзоиш ва коҳишро ба миқёси симметрӣ мебарад. log₂ fold-change-и мусбат афзоишро, қимати манфӣ коҳишро нишон медиҳад.

Чаро −log₁₀(P) дар volcano plot истифода мешавад?

Меҳвари y-и Figure 4C аз табдили \(-\log_{10}(P)\) истифода мебарад. Ҳар қадар P хурд шавад, −log₁₀(P) калон мешавад; аз ин рӯ қиматҳои аз ҷиҳати оморӣ хурдтари P дар график болотар пайдо мешаванд. Ин табдил бузургии нави биологӣ ба вуҷуд намеорад, танҳо P-ро дар график хонданбоб мекунад.

Натиҷаи асосии намоёни RNA-seq

Таҳлилҳои pathway enrichment равандҳое чун apoptosis, oxidative stress response ва reactive oxygen species response-ро барҷаста карданд. Ferroptosis низ дар натиҷаҳои enrichment дида шуд; аммо танҳо ғанишавии як gene-set исбот намекунад, ки ҳуҷайра бо ферроптоз мурдааст. Аз ин рӯ, манбаъ таҷрибаҳои функсионалии sorafenib, ferrostatin-1, пероксидатсияи липидҳо ва DFO-ро низ алоҳида анҷом додааст.

Тасвиргирии ҳуҷайраи зинда дар асоси Holotomography

Вақте ҳуҷайраҳо дар TomoDish тақрибан ба %60 confluency расиданд, муҳити фарҳангӣ бо plasma-treated medium иваз карда шуда, як соат инкубатсия шуд. Сипас муҳит бо HBSS-и дорои Liperfluo ё JC-1 иваз карда шуд.

Барои lipid peroxidation 1 µmol/L Liperfluo; барои mitochondrial membrane potential JC-1 истифода шуд, ки дар манбаъ 1 mM навишта шудааст. Пас аз рангкунии 30 дақиқа, ҳуҷайраҳо дар микроскопи Tomocube HT-2H бо holotomography-и асосёфта ба refractive-index тасвир карда шуданд. Шиддатҳои флуоресценсия бо ImageJ2 миқдорӣ карда шуданд.

Таҳлили оморӣ

Маълумот аз ҳадди ақал се таҷрибаи мустақил гирифта шуда ва ҳамчун миёна ± хатои стандартӣ (mean ± SEM) дода шудааст. Барои муқоисаи ду гурӯҳ two-tailed Student's t-test, барои муқоисаҳои чандгурӯҳӣ one-way ANOVA ва Tukey post-hoc test истифода шудааст.

Ҳадди аҳамияти оморӣ P<0.05 мебошад. Системаи аломатгузорӣ *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 ва N.S.=not significant аст.

Бозёфти асосии Figure 1

Бо зиёд шудани баромади плазма сигнали Griess-асосёфтаи NO/RNS афзуд. Қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳои HEC1A бо дозаҳои плазма кам шуд, дар ҳоле ки фибробластҳои ибтидоии муқаррарӣ дар тафсири манбаъ нисбатан ҳифз шуданд. Барқарор кардани зиндамонӣ аз ҷониби c-PTIO дар ҳуҷайраҳои H1299 саҳми намудҳои реактивии нитрогенро дастгирӣ кард.

Дар таҷрибаи муши B16F10/C57BL/6, андозаи омос дар гурӯҳи гирифтани PBS-и бо плазма коркардшуда нисбат ба назорат ба таври назаррас кам шуд. Азбаски ҷадвали додаҳои хом пешниҳод нашудааст, Verianla аз график қиматҳои нави дақиқи ҳаҷми омосро тавлид намекунад.

Бозёфти асосии Figure 2

Тақсимоти Annexin V/PI бо афзоиши популятсияи апоптотикӣ дар ҳуҷайраҳои HEC1A пас аз плазмаи N₂/O₂ мувофиқ аст. Дар натиҷаҳои qPCR-и B16F10, Bax ва Bak1 зиёд шуда, Bcl-2, Bcl-xl ва Bcl-w дар Figure 2B кам шудаанд.

Бозёфти асосии Figure 3

Сигнали ROS дар нуқтаҳои вақти 0, 2, 4 ва 8 соат умуман намунаи афзоишёбандаро нишон дод. GSH зиндамониро вобаста ба доза барқарор кард. Афзоиши γH2AX, phospho-p53(Ser15), BIP ва CHOP; пора шудани PARP ва caspase-3; ва коҳиши нисбати сурх/сабзи JC-1 якҷо осеби DNA, стресси ER, дисфунксияи митохондрия ва механизми иҷрои апоптотикиро дастгирӣ мекунанд.

Бозёфти асосии Figure 4

Таҳлили Transcriptome барномаҳои генҳои марбут ба apoptosis ва oxidative-stress-ро тасдиқ карда, дар генҳои ferroptosis-associated низ тағйирот нишон дод. Sorafenib ситотоксикии плазмаро зиёд кард, ferrostatin-1 бошад rescue-и қисман дод. Дар ҳуҷайраҳои HeLa сигнали Liperfluo афзоиши lipid peroxidation-ро нишон дод.

Матни асосӣ дар бораи Supplementary Figure S2 мегӯяд, ки DFO қобилияти зиндамонии ҳуҷайра ё lipid peroxidation-ро ба таври назаррас барқарор накард. Азбаски Supplementary PDF аз ҷониби корбар алоҳида пешниҳод нашудааст, Verianla қиматҳои хоми графикии ин таҷрибаро тавлид намекунад.

Бозсозии мустақили механизм барои Verianla

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

• Муҳити бо плазмаи N₂/O₂ коркардшуда қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳои саратони омӯхташударо кам кард.
• Фибробластҳои ибтидоии инсон дар муқоисаи in vitro нисбат ба ҳуҷайраҳои саратон камтар таъсир диданд.
• Натиҷаи c-PTIO саҳми намудҳои реактивии нитрогенро ба таъсири ситотоксикӣ дастгирӣ мекунад.
• ROS-и дохили ҳуҷайра зиёд шуд ва GSH қобилияти зиндамонии ҳуҷайраҳоро қисман/вобаста ба доза барқарор кард.
• Натиҷаҳои Annexin V/PI, caspase-3 ва PARP апоптозро дастгирӣ мекунанд.
• γH2AX ва фосфорилатсияи p53 Ser15 фаъолшавии DNA damage response-ро дастгирӣ мекунанд.
• Афзоиши BIP ва CHOP ҷавоби ER-stress/proteostatic-stress-ро дастгирӣ мекунад.
• Натиҷаи JC-1 нишон медиҳад, ки потенсиали мембранаи митохондрия коҳиш ёфтааст.
• RNA-seq барномаҳои apoptosis ва oxidative-stress-ро дастгирӣ кардааст.
• Таъсири rescue-и қисмии Ferrostatin-1 ва натиҷаи Liperfluo саҳми lipid peroxidation-ро ба марги ҳуҷайра дастгирӣ мекунанд.
• Набудани rescue дар натиҷаи DFO бар зидди тафсири каноникии iron-dependent ferroptosis мебошад.
• PBS-и бо плазма коркардшуда афзоиши омосро дар модели омоси B16F10-и муш кам кард.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

• Нишон дода нашудааст, ки плазмаи N₂/O₂ дар беморони саратони инсон табобати самаранок ва бехатар аст.
• Нишон дода нашудааст, ки ҳамаи намудҳои саратон ҳассосияти якхела доранд.
• Нишон дода нашудааст, ки ҳамаи бофтаҳои муқаррарии инсон аз табобат муҳофизат мешаванд.
• Интихобпазирии бофтаи муқаррарӣ in vivo ё токсикии фарогири системавӣ санҷида нашудааст.
• Самаранокии системавии intravenous ё intraperitoneal нишон дода нашудааст.
• Таркиби миқдории кимиёвии ҳамаи намудҳои ҳосилшудаи ROS ва RNS муайян карда нашудааст.
• Саҳми нисбии биологии намудҳои мушаххаси реактивии аз нитроген ҳосилшуда пурра ҳал нашудааст.
• Натиҷаи lipid peroxidation далели canonical ferroptosis нест.
• Натиҷаҳои sorafenib ва ferrostatin-1 нишон намедиҳанд, ки тамоми механизми марг ферроптоз аст.
• Табобати локалии муш нуфузи бофта ё дозаи клиникиро дар одамон муайян намекунад.

Ҷиҳатҳои асосии қавии таҳқиқот

Таҳқиқот бо як модели ягонаи ҳуҷайраи саратон маҳдуд нашуда; моделҳои саратони эндометрӣ, сервикалӣ, меланома ва шушро аз сарчашмаҳои гуногуни бофта якҷо арзёбӣ кардааст. Ин равиш кӯмак кардааст нишон дода шавад, ки ҷавоб ба плазмаи N₂/O₂ танҳо ба як хатти ҳуҷайравӣ хос нест.

Ҷиҳати қавии дуюм ин аст, ки марги ҳуҷайра танҳо бо коҳиши зиндамонии MTT арзёбӣ нашудааст. Annexin V/PI, экспрессияи генҳои апоптотикӣ, пора шудани caspase/PARP, нишондиҳандаҳои DNA damage, нишондиҳандаҳои ER-stress ва потенсиали мембранаи митохондрия қабатҳои мустақили далелҳоро ба вуҷуд оварданд, ки ҳамдигарро пурра мекунанд.

Ҷиҳати қавии сеюм ин аст, ки барои стресси оксидӣ танҳо афзоиши ROS нишон дода нашуда, балки мудохилаи rescue бо GSH низ анҷом дода шудааст. Ҳамин тавр, робитаи функсионалӣ байни ROS ва ситотоксикӣ қавитар шудааст.

Ҷиҳати қавии чорум ин аст, ки тафсири ферроптоз танҳо ба натиҷаи ferroptosis-related gene set вогузор нашудааст. Бо истифода аз таҷрибаҳои sorafenib, ferrostatin-1, Liperfluo ва DFO, lipid peroxidation аз canonical ferroptosis ҷудо карда шудааст.

Ҷиҳати қавии панҷум ин аст, ки натиҷаҳои фарҳанги ҳуҷайра бо модели муши B16F10/C57BL/6 дар сатҳи афзоиши омоси in vivo иловатан санҷида шудаанд.

Маҳдудиятҳои асосии таҳқиқот

Маҳдудияти аввал: Интихобпазирии ҳуҷайраи муқаррарӣ in vitro танҳо бо фибробластҳои ибтидоии инсон арзёбӣ шудааст. Ҳуҷайраҳои гуногуни эпителиалӣ, эндотелиалӣ, иммунӣ ё узвҳои муқаррарӣ ба таври систематикӣ муқоиса нашудаанд.

Маҳдудияти дуюм: Таҷрибаи in vivo ба истифодаи локалӣ асос меёбад. Азбаски гистопатологияи узвҳои муқаррарӣ ва токсикии системавӣ анҷом дода нашудаанд, ҳадди бехатарии физиологӣ муайян нашудааст.

Маҳдудияти сеюм: Тамоми спектри намудҳои реактивӣ тавсиф нашудааст. Гарчанде барои NO/RNS таҳлили Griess/c-PTIO ва барои ROS таҳлили ҳуҷайравӣ анҷом дода шуд, саҳми алоҳидаи specific nitrogen-derived reactive species маълум нест.

Маҳдудияти чорум: Нишон дода нашудааст, ки таҳлилҳои механистӣ дар ҳамаи моделҳои ҳуҷайравӣ бо ҳамон амиқӣ такрор шудаанд. Баъзе таҷрибаҳо дар HEC1A, баъзеҳо дар HeLa, B16F10 ё H1299 гузаронида шуданд.

Маҳдудияти панҷум: Таҳқиқот дозабандии клиникӣ, нуфуз ба бофта, pharmacodynamics ва истифодаҳои такрории дарозмуддатро арзёбӣ накардааст.

Маҳдудияти шашум: Дар версияи Article in Press номувофиқиҳои терминологӣ/редаксионӣ мавҷуданд: allograft/xenograft, ибораи intratumoral/subcutaneous injection, баъзе намуди legend-и Figure 2 ва намоёнии такрорҳои биологӣ дар Methods-heatmap метавонанд пеш аз тартиббандии ниҳоӣ равшан гарданд.

Маҳдудияти ҳафтум: Азбаски Supplementary Figure S1/S2 дар бадани пурраи визуалии илмии PDF-и асосии боршуда мавҷуд нестанд, графикҳои хоми таҷрибаҳои иловагӣ дар ин мақолаи Verianla аз нав тавлид нашудаанд.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Унвони аслӣ: Nitrogen-oxygen plasma induces selective cancer cell death via apoptosis with lipid-peroxidation-associated mechanisms across multiple cancer cell models.

Муаллифон ва тартиб: Bum-Ho Bin, Sofia Brito, Sun Ju Park, Ki Bok Yoon, Hyojin Heo, Hantae Jo, Sehyun Chae, Byung Mook Weon, Sung Kweon Cho, Jiyoon Kim.

Саҳми баробар: Bum-Ho Bin, Sofia Brito ва Sung Kweon Cho.

Муаллифи масъул: Jiyoon Kim.

Муассиса 1: Department of Biological Sciences, Ajou University, Suwon, Republic of Korea.

Муассиса 2: The Anti-Aging Lab, Co. Ltd., Suwon, Republic of Korea.

Муассиса 3: Department of Pharmacology, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Republic of Korea.

Муассиса 4: Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB), Daejeon, Republic of Korea.

Фарқи манбаъ барои муассисаи 5: Article in Press PDF барои Hantae Jo сабти Department of Neurosurgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul-ро медиҳад. Саҳифаи ҷории библиографии Nature бошад сабти Department of Nuclear Medicine, Yonsei University College of Medicine, Seoul-ро нишон медиҳад. Ин фарқ байни версияи дастрасии барвақт ва metadata-и ҷории нашр ошкоро ҳифз шудааст.

Муассиса 6: Department of Smart Health Science and Technology, Kangwon National University, Chuncheon, Republic of Korea.

Муассиса 7: Department of Biotechnology and Bioengineering, College of ACE, Kangwon National University, Chuncheon, Republic of Korea.

Муассиса 8: School of Advanced Materials Science and Engineering, Sungkyunkwan University, Suwon, South Korea.

Муассиса 9: Department of Pharmacology, Ajou University School of Medicine, Suwon, South Korea.

Муассиса 10: Department of Medical Sciences, Graduate School, The Catholic University of Korea, Seoul, South Korea.

Муассиса 11: Institute for Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, South Korea.

Маҷалла: Scientific Reports.

Ношир: Nature Portfolio / Springer Nature.

DOI: 10.1038/s41598-026-59131-4.

Санаи қабул: 9 май 2025.

Санаи пазируфтан: 18 июн 2026.

Санаи нашри онлайн: 6 июл 2026.

Навъи манбаъ ва вазъи рецензия: Мақолаи таҳқиқотии Scientific Reports, ки аз рецензия гузашта ва қабул шудааст; PDF-и ҳозираи боршуда ва саҳифаи ҷории Nature ҳамчун версияи Article in Press/unedited early-access ишора шудаанд.

Вазъи Version of Record: Саҳифаи расмии ҷорӣ мегӯяд, ки ин версия пас аз анҷоми равандҳои ниҳоии редаксионӣ ба таври худкор бо final Version of Record иваз мешавад; аз ин рӯ PDF-и ҳозира ҳамчун final VOR тамғагузорӣ нашудааст.

Ҷилд / шумора / рақами мақола: Дар PDF-и ҳозираи Article in Press ва намоиши расмии библиографии дастрасии барвақт рақами ниҳоии мақола ба таври ошкоро дода нашудааст; Verianla ин майдонро тахмин накардааст.

Иҷозатнома: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Навъи таҳқиқот: Фарҳанги ҳуҷайраи in vitro + механизми молекулавӣ + transcriptomics + модели омоси in vivo syngeneic murine melanoma.

Моделҳои асосии ҳуҷайравӣ: HEC1A, HeLa, B16F10, H1299 ва human primary fibroblasts.

Дастгоҳи асосии плазма: Системаи custom-built-и плазма jet бо ду электроди параллел, ки аз ҷониби TGT, Daejeon, Korea таъмин шудааст; як электрод бо диэлектрики сафолӣ пӯшонида шудааст; 5 kW ва 30 kHz high-voltage power supply; circulating water cooling.

Параметрҳои газ: N₂ 10 cc/min, O₂ 5 cc/min; 135.200 mm³ mixing chamber; манбаъ дар ҳамон ҷумла қимати 225 V-ро медиҳад, аммо робитаи ин қиматро бо параметрҳои манбаи баландшиддат алоҳида шарҳ намедиҳад.

Ченкунии RNS: Nitrite Assay Kit / Griess Reagent; абсорбанс 540 nm, SpectraMax 190.

Татбиқи пешфарзи плазма in vitro: Culture medium барои 10 дақиқа бо плазма коркард мешавад; ҳуҷайраҳо асосан 24 соат коркард мешаванд. Дар Figure 1 инчунин шароити коркарди плазмаи 0, 5 ва 10 дақиқа мавҷуд аст.

Модели муш: Муши модаи C57BL/6, n=9/гурӯҳ; 1 × 10⁶ ҳуҷайраи B16F10; PBS:Matrigel 1:1; flank subcutaneous tumor establishment; randomization дар тақрибан 50 mm³.

Табобати муш: 100 µL PBS ё plasma-treated PBS; ҳафтае панҷ маротиба, дар маҷмӯъ 15 татбиқ, 21 рӯз.

Ёддошти терминологияи тазриқ: Methods “subcutaneous injections”, Abstract ва Discussion бошанд ибораи “intratumoral administration”-ро истифода мебаранд. Фарқи манбаъ ҳифз шудааст.

Ёддошти терминологияи модели омос: Methods системаи B16F10/C57BL/6-ро ҳамчун syngeneic murine melanoma/allograft муайян мекунад; Figure 1F caption калимаи “xenograft”-ро истифода мебарад. Сохтори биологии модел бо таърифи allograft мувофиқ аст, аммо Verianla номувофиқии матни манбаъро пинҳон намекунад.

Тасдиқи ахлоқии ҳайвонот: Semyung University Institutional Animal Care and Use Committee, Approval No. smecae 22-08-02; ARRIVE guidelines.

MTT: 1 × 10⁴ ҳуҷайра/well, 96-well plate, абсорбанс 570 nm.

FACS: >10.000 ҳуҷайра; Annexin V-FITC/PI apoptosis detection; BD FACSAria III; BD FACSDiva v8.0.3.

FACS-и пероксидатсияи липидҳо: 1 µmol/L Liperfluo, 1 соат.

qRT-PCR: RNeasy Plus Mini Kit, AccuPower RT PreMix, SYBR Green, AriaMx Real-Time PCR System; GAPDH истинод; усули ΔΔCt.

Ҳадафҳои Western blot: γH2AX, BIP, CHOP, PARP, caspase-3, p53 ва phospho-p53(Ser15).

RNA-seq: RIN >9; Poly(A)+ mRNA; TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit; Illumina NovaSeq 6000; Macrogen; манбаъ Methods барои ҳар шароит се такрори биологиро гузориш медиҳад.

Меъёрҳои DEG: adjusted p≤0.05 ва |log₂ fold-change|>0.428; манбаъ инро ҳамчун ҳадди тақрибан 1.35-fold муайян мекунад.

Holotomography: Tomocube HT-2H; TomoStudio; ImageJ2; 1 µmol/L Liperfluo ё JC-1, ки дар манбаъ ҳамчун 1 mM чоп шудааст.

Модуляторҳои ферроптоз: Sorafenib 1 µM; ferrostatin-1 10 µM; консентратсияи DFO дар матни асосии дахлдори PDF-и асосӣ дақиқ дода нашудааст ва аз ҷониби Verianla сохта нашудааст.

Омор: Ҳадди ақал се таҷрибаи мустақил; mean±SEM; two-tailed Student's t-test ё one-way ANOVA + Tukey post-hoc; P<0.05.

Механизми асосии марг: Апоптоз; oxidative-stress-associated lipid peroxidation саҳми иловагӣ медиҳад.

Ҳадди ферроптоз: Canonical iron-dependent ferroptosis дастгирӣ намешавад; DFO rescue надода, Slc7a11/Slc7a5 зиёд ва Acsl4 кам шудааст.

Data availability: Додаҳои Raw ва processed RNA-seq дар GEO GSE231561 нигоҳ дошта шудаанд.

Маблағгузорӣ: Ajou University Research Fund; National Research Foundation of Korea Basic Science Research Program, RS-2021-NR060141 ва RS-2024-00405790; Korea Health Technology R&D Project/KHIDI, RS-2025-25459560.

Саҳми муаллифон: Sofia Brito ва Bum-Ho Bin таҳқиқотро тарҳрезӣ карданд. Hyojin Heo, Ki Bok Yoon, Hantae Jo ва Sehyun Chae таҳқиқот ва ҷамъоварии додаҳоро анҷом доданд. Sofia Brito, Sun Ju Park ва Sung Kweon Cho formal analysis ва visualization-ро иҷро карданд. Byung Mook Weon методология ва дастгирии захираҳои техникӣ дод. Jiyoon Kim ва Bum-Ho Bin вазифаҳои таъмин намудани захираҳо, supervision ва тафсирро ба уҳда гирифтанд. Sofia Brito ва Bum-Ho Bin тарҳи аслиро навиштанд; Sun Ju Park, Sung Kweon Cho ва Jiyoon Kim матнро бозбинӣ ва таҳрир карданд.

Барҳамхӯрии манфиатҳо: Муаллифон гузориш додаанд, ки competing interests надоранд.

Ҳадди supplementary-material: PDF-и асосӣ ба Figure S1 ва Figure S2 ишора мекунад. Азбаски корбар файли supplementary-ро алоҳида пешниҳод накардааст, ин версияи Verianla танҳо натиҷаҳоеро истифода мебарад, ки PDF-и асосӣ дар бораи ин таҷрибаҳои иловагӣ ошкоро хабар медиҳад; аз шаклҳои иловагӣ рақамҳои нави нонамоён намебарорад.

Ёддошти версияи барвақти Figure 2: Гарчанде матни асосии Figure 2A ва панелҳои FACS тафсири apoptosis-и қавитарро дар ҳуҷайраи саратон дастгирӣ мекунанд, намуди bar-graph legend/пуркунӣ дар нашри Article in Press бо матн пурра мувофиқ наменамояд. Аз ин рӯ қиматҳои дақиқи фоизӣ аз нав тавлид нашудаанд.

Ёддошти такрорҳои RNA-seq: Гарчанде Methods барои ҳар шароит се такрори биологиро гузориш медиҳад, Figure 4D heatmap ба таври намоён ду сатри control ва ду сатри plasma нишон медиҳад. Манбаъ ин фарқро шарҳ намедиҳад.

Ҳадди клиникӣ: Табобат дар одамон санҷида нашудааст. Додаҳои in vivo ба модели локалии муши B16F10/C57BL/6 тааллуқ доранд; systemic exposure, organ toxicity, normal-tissue histopathology ва human therapeutic efficacy нишон дода нашудаанд.