Azot-kislorod plazmasi (N₂/O₂ plasma), nazorat qilinadigan azot va kislorod gaz oqimidan elektr plazma hosil qilib, reaktiv kislorod va azot turlarini yaratishga qaratilgan fizik plazma yondashuvidir. Ushbu tadqiqot N₂/O₂ plazmasi bilan ishlov berilgan muhitlarning endometrial adenokarsinoma HEC1A, servikal karsinoma HeLa, sichqon melanomasi B16F10 va inson kichik hujayrali boʻlmagan oʻpka saratoni H1299 modellaridagi ta’sirlarini; normal nazorat sifatida inson birlamchi fibroblastlarini hamda B16F10/C57BL/6 sichqon oʻsma modelini qoʻllab oʻrgangan. Manbaning asosiy xulosasi shuki, N₂/O₂ plazmasi oʻrganilgan saraton modellarida oksidlovchi stressni oshirib, asosan apoptozni faollashtiradi va bunga lipid peroksidatsiyasi bilan bogʻliq oksidlovchi membrana shikastlanishi hamrohlik qiladi.

In vitro tajribalarda hujayralar toʻgʻridan-toʻgʻri plazma oqimi ostida ushlab turilmagan. Manbada kultura muhiti plazma bilan ishlov berilgani va keyin hujayralarga qoʻllangani koʻrsatilgan. Standart usulda kultura muhiti N₂/O₂ plazmasi bilan 10 daqiqa ishlangan, hujayralar bu muhit bilan 24 soat inkubatsiya qilingan; ayrim rasmlarda 0, 5 yoki 10 daqiqalik plazma ishlovlari va turli inkubatsiya muddatlari ham alohida qoʻllangan.

HEC1A hujayralarida plazma darajasi oshgani sari hujayra yashovchanligi pasaygan, inson birlamchi fibroblastlarida esa ayni darajadagi aniq yoʻqotish kuzatilmagan. H1299 hujayralarida reaktiv azot turlarining ta’sirini cheklash uchun qoʻllangan 1 µM carboxy-PTIO N₂/O₂ plazmasining sitotoksik ta’sirini kamaytirgan. Biroq tadqiqot faqat muayyan bir normal hujayra turi bilan taqqoslagan; natija barcha normal toʻqimalar plazmaga chidamli yoki usul insonlar uchun xavfsiz degani emas.

Apoptoz Annexin V/propidium iodide oqim sitometriyasi, pro-apoptotik Bax va Bak1 genlarining oshishi, anti-apoptotik Bcl-2, Bcl-xl va Figure 2 da Bcl-w ning kamayishi, PARP va caspase-3 parchalanishi, γH2AX oshishi, p53 Ser15 fosforlanishi, ER stress koʻrsatkichlari BIP va CHOP ning koʻtarilishi hamda JC-1 bilan oʻlchangan mitoxondriya membrana potensialining yoʻqolishi bilan qoʻllab-quvvatlangan.

Hujayra ichidagi reaktiv kislorod turlari (ROS) N₂/O₂ plazmasidan soʻng vaqt oʻtishi bilan oshgan. Glutathione (GSH) yordamida ROS yuki kamaytirilganda hujayra yashovchanligining dozaga bogʻliq ravishda tiklanishi oksidlovchi stress hujayra oʻlimida shunchaki hamroh belgi emas, balki muhim upstream harakatlantiruvchi omil ekanini qoʻllab-quvvatlaydi. Biroq tadqiqot hosil boʻlgan barcha maxsus kislorod va azot turlarini alohida aniqlamagan va ayniqsa azotdan kelib chiqadigan reaktiv turlarning nisbiy hissasini toʻliq aniqlamagan.

RNA-seq va funksional tajribalar ferroptoz bilan bogʻliq genlarda oʻzgarish va lipid peroksidatsiyasida oshish koʻrsatgan. Ferrostatin-1 hujayra yashovchanligini qisman tiklagan, sorafenib esa plazma sitotoksikligini kuchaytirgan. Aksincha, temir xelatori deferoxamine hujayra oʻlimi yoki lipid peroksidatsiyasini sezilarli kamaytirmagan. Slc7a11 va Slc7a5 oshgan, Acsl4 esa kamaygan. Shu sababli manba hujayra oʻlimini klassik temirga bogʻliq ferroptoz sifatida emas, balki ustun apoptozga hamroh boʻladigan oksidlovchi stress va lipid-peroksidatsiyasi bilan bogʻliq sitotoksiklik sifatida talqin qiladi.

Sichqon tajribasida urgʻochi C57BL/6 sichqonlarda B16F10 melanoma hujayralari bilan hosil qilingan oʻsmalarning oʻsishi plazma bilan ishlov berilgan PBS berilgan guruhda nazoratga qaraganda kamaygan. Biroq sistemali qoʻllash, organ darajasidagi gistopatologiya, normal toʻqima taqqoslashi va keng qamrovli toksiklik tahlili bajarilmagan. Shuning uchun bu tadqiqot insonlarda saraton davolashining samaradorligi yoki xavfsizligini isbotlamaydi.

Plazma nima?

Plazma — gaz molekulalari energiya olib, elektronlar, ionlar va turli reaktiv turlar mavjud boʻlgan yuqoriroq energiyali holatga oʻtadigan fizik muhitdir. Biotibbiy plazma tadqiqotlarida maqsad faqat yuqori harorat hosil qilish emas; hujayralar bilan oʻzaro ta’sir qila oladigan reaktiv kislorod turlari (reactive oxygen species, ROS), reaktiv azot turlari (reactive nitrogen species, RNS), elektr maydonlari va boshqa fizik-kimyoviy komponentlarni nazoratli ravishda hosil qilishdir.

Ushbu maqolaning tajriba qurilmasida azot va kislorod alohida mass-flow controller tizimlari orqali beriladi, aralashtirish kamerasida birlashtiriladi va yuqori kuchlanishli plazma manbasida ishlanadi. Manba chiqish gazining harorati yoki aniq atmosfera bosimi qiymatini bildirmagani sababli Verianla bu qurilma uchun manbada boʻlmagan harorat yoki bosim qiymatini yaratmaydi.

Nega azot va kislorod birgalikda ishlatilgan?

Mualliflarning tadqiqot asoslantirishi shundan iboratki, geliy yoki argon kabi inert gazlarga asoslangan tizimlarda reaktiv turlar kimyosi atrof havosining aralashishi va tor qoʻshimcha gaz sharoitlariga sezgir boʻlishi mumkin; bundan tashqari inert gazlar xarajat va ta’minot jihatidan kamchilik tugʻdirishi mumkin. N₂/O₂ aralashmasi osonroq mavjud gazlardan reaktiv kislorod va azot turlarini birgalikda hosil qilish hamda kimyoviy tarkibni nazorat qilish imkoniyati nuqtayi nazaridan baholangan.

Biroq tadqiqot N₂/O₂ aralashmasi barcha muqobil gaz aralashmalaridan samaraliroq, arzonroq yoki klinik jihatdan ustun ekanini bevosita taqqoslash bilan koʻrsatmagan.

Plazma qurilmasi qanday ishlaydi?

Reaktiv kislorod va azot turlari nimani anglatadi?

ROS, kislorod saqlovchi yuqori reaktiv molekulalar va radikallarning umumiy nomidir. RNS esa azot saqlovchi reaktiv turlarni qamrab oladi. Bu molekulalar past va tartibga solingan darajalarda hujayraviy signal uzatishga hissa qoʻshishi mumkin, ammo haddan tashqari hosil boʻlganda oqsillar, lipidlar va nuklein kislotalarni oksidlovchi tarzda oʻzgartirishi mumkin.

Manba reaktiv azot turlarini Griess Reagent asosidagi Nitrite Assay Kit bilan baholagan va absorbansni 540 nm da oʻlchagan. Figure 1 buni “nitric oxide concentration” sifatida taqdim etadi. Shu sababli Verianla bu oʻlchovni barcha maxsus RNS turlarining miqdoriy kimyoviy profili sifatida bevosita talqin qilmaydi.

Azot-Kislorod Plazmasi Saraton Hujayralarini Qanday Oʻldiradi?

Tadqiqot qoʻllab-quvvatlaydigan asosiy mexanizm N₂/O₂ plazmasi hosil qilgan reaktiv turlar hujayraviy redoks muvozanatini buzishi; bu ROS oshishi, DNA shikastlanishi, ER stressi, mitoxondriya membrana potensiali yoʻqolishi va lipid peroksidatsiyasi bilan bogʻliq membrana shikastlanishini qoʻzgʻatishi hamda bu stress yoʻllari asosan kaspazaga bogʻliq apoptotik hujayra oʻlimida birlashishidir.

c-PTIO tajribasi nimani koʻrsatadi?

Carboxy-PTIO tadqiqotda NO bilan bogʻliq reaktiv turlarning ta’sirini cheklash maqsadida ishlatilgan scavenger-dir. H1299 hujayralarida 1 µM c-PTIO N₂/O₂ plazmasi bilan kuzatilgan hujayra yashovchanligi yoʻqotilishini kamaytirgan. Bu natija gazdan kelib chiqadigan reaktiv azot turlari biologik ta’sirda rol oʻynashini qoʻllab-quvvatlaydi.

Biroq c-PTIO aralashuvi “barcha sitotoksiklik faqat NO tomonidan yuzaga keladi” degan xulosani koʻrsatmaydi. Tadqiqotning keyingi tajribalari hujayra ichidagi ROS ham markaziy rol oʻynashini koʻrsatadi.

Nega ROS upstream harakatlantiruvchi omil deb hisoblanadi?

HEC1A hujayralarida ROS floresans signali N₂/O₂ plazmasidan keyin vaqt oʻtishi bilan oshgan. Faqat bu korrelyatsiya mexanizm uchun yetarli boʻlmagani sabab tadqiqotchilar glutathione (GSH) bilan aralashuv qilgan. Figure 3B da 10 va 100 µM GSH ishlatilganda hujayra yashovchanligi dozaga bogʻliq ravishda oshgan.

Agar biologik oraliq bosqichning inhibisiyasi yoki yoʻq qilinishi downstream natijani kamaytirsa, bu oraliq bosqich mexanizmda funksional rol oʻynashini qoʻllab-quvvatlaydi. Shu sababli GSH natijasi ROS faqat hujayra oʻlimiga hamroh belgi emas, balki sitotoksiklikka hissa qoʻshadigan upstream omil ekanini koʻrsatadi.

γH2AX nimani koʻrsatadi?

H2AX DNA shikastlanish javobida fosforlanishi mumkin boʻlgan giston oqsilidir. Uning fosforlangan shakli γH2AX, ayniqsa DNA uzilishlari va DNA damage response faollashuvi uchun keng qoʻllanadigan koʻrsatkichdir. N₂/O₂ plazmasidan keyin γH2AX oshishi hujayralarda DNA shikastlanish javobi faollashganini qoʻllab-quvvatlagan.

p53 Ser15 fosforlanishi nega oʻlchangan?

p53 DNA shikastlanishi va hujayraviy stress ostida hujayra siklining toʻxtashi yoki apoptotik javobning boshqarilishida qatnashadigan oʻsma bostiruvchi oqsildir. Ser15 sohasidagi fosforlanish DNA damage response bilan bogʻliq faollashuv koʻrsatkichlaridan biridir. Tadqiqotda p53 Ser15 fosforlanishi oshgan va γH2AX topilmasi bilan birga DNA shikastlanishi/stress javobini qoʻllab-quvvatlagan.

BIP va CHOP nimani koʻrsatadi?

BIP, endoplazmatik retikulumdagi oqsil buklanish yuki va unfolded protein response bilan bogʻliq shaperonlardan biridir. CHOP esa choʻzilgan yoki kuchli ER stressi vaqtida apoptotik dasturga hissa qoʻsha oladigan stress-javob transkripsiya omilidir. Ikkala oqsilning oshishi N₂/O₂ plazmasi ER proteostazini buzganini qoʻllab-quvvatlaydigan topilmalardan biridir.

PARP va caspase-3 parchalanishi nega muhim?

Caspase-3 apoptotik ijrochi kaspazalardan biridir. Faollashgan caspase-3 koʻplab hujayraviy nishonlarni kesadi; PARP ham shu nishonlardan biridir. Cleaved caspase-3 va cleaved PARP koʻrinishi hujayra faqat stress ostida emas, balki apoptotik ijro mexanizmi faollashganini qoʻllab-quvvatlovchi biokimyoviy dalildir.

Mitoxondriya membrana potensiali qanday oʻlchandi?

HeLa hujayralarida JC-1 floresan boʻyogʻi va holotomography asosidagi tirik hujayra tasvirlash ishlatilgan. Sogʻlom qutblangan mitoxondriyalarda JC-1 koʻproq qizil aggregate signalini hosil qiladi, membrana potensiali pasayganda esa yashil monomer signali oshadi.

N₂/O₂ plazmasidan soʻng qizil/yashil floresans nisbati kamaygan va JC-1 monomerlarining nisbiy ulushi oshgan. Bu natija mitoxondrial depolyarizatsiya va intrinsic apoptotik yoʻl ishga tushishini qoʻllab-quvvatlaydi.

Methods boʻlimida JC-1 konsentratsiyasi 1 mM deb bosilgan. Bu qiymat Verianla tomonidan boshqa birlikka yashirincha aylantirilmagan; manbada yozilgani kabi saqlanadi.

Lipid Peroksidatsiyasi Ushbu Tadqiqotda Ferroptoz Dalilimi?

Yoʻq. Lipid peroksidatsiyasi oshgan va ferrostatin-1 hujayra oʻlimini qisman kamaytirgan; biroq temir xelatsiyasi natijani tiklamagan, shuningdek Slc7a11/Slc7a5 oshishi va Acsl4 kamayishi kanonik ferroptozdan koʻra himoyalovchi redoks adaptatsiyasiga ishora qilgan. Manbaning xulosasi klassik temirga bogʻliq ferroptoz emas, balki apoptozga hamroh boʻladigan lipid-peroksidatsiyasi bilan bogʻliq oksidlovchi sitotoksiklikdir.

Ferroptoz nima?

Ferroptoz — temirga bogʻliq lipid peroksidatsiyasi belgilovchi boʻlgan tartibga solinadigan hujayra oʻlimi shaklidir. U apoptozdan farqli molekulyar va morfologik xususiyatlarga ega. Shu sababli hujayrada lipid peroksidatsiyasining oshishi oʻz-oʻzidan ferroptoz tashxisi uchun yetarli emas.

Nega RNA-seq ferroptoz ehtimolini kun tartibiga olib chiqdi?

B16F10 hujayralarida bajarilgan transcriptomic profiling apoptotik signal yoʻllari va oksidlovchi stress javoblari bilan birga ferroptoz bilan bogʻlangan gen toʻplamlarida ham oʻzgarish koʻrsatgan. Volcano plot da manba 335 gen sezilarli darajada upregulated, 206 gen esa downregulated ekanini koʻrsatadi.

Ferroptoz bilan bogʻliq tanlangan genlardan Slc7a11 va Slc7a5 oshgan, Acsl4 esa kamaygan. Mualliflar ayniqsa bu naqsh canonical ferroptosis faol ravishda davom etishidan koʻra oksidlovchi yukka qarshi redox-regulatory va anti-ferroptotic adaptatsiyani koʻrsatishini ta’kidlaydi.

Slc7a11 nega muhim?

Slc7a11 cystine/glutamate antiporter tizimining muhim tarkibiy qismlaridan biri boʻlib, hujayraning glutathione sintezi uchun zarur cystine ni ichkariga olishiga hissa qoʻshadi. Uning oshishi hujayra oksidlovchi yukni tamponlash uchun antioxidant qobiliyatini saqlashga urinadigan stress-adaptatsiya javobiga mos kelishi mumkin.

Acsl4 nega muhim?

ACSL4 koʻp toʻyinmagan yogʻ kislotalarining membrana lipidlariga qoʻshilishida rol oʻynaydigan va koʻplab ferroptoz modellarida ferroptozga sezgirlik bilan bogʻlangan fermentdir. Tadqiqotda Acsl4 mRNA kamayishi mualliflarning canonical ferroptosis oʻrniga himoyalovchi/anti-ferroptotic adaptatsiya talqinini qoʻllab-quvvatlaydigan omillardan biridir.

Sorafenib va ferrostatin-1 tajribalari nimani koʻrsatadi?

Manba sorafenib ni ushbu tajribada ferroptozni ragʻbatlantiruvchi modulyator sifatida ishlatgan. 1 µM sorafenib N₂/O₂ plazmasi bilan birga qoʻllanganda B16F10 hujayralaridagi sitotoksiklik oshgan.

10 µM ferrostatin-1 esa N₂/O₂ plazmasi bilan kamaygan hujayra yashovchanligini qisman tiklagan. Ferrostatin-1 lipid peroksidatsiyasini toʻsadigan ferroptoz ingibitori boʻlgani sabab bu natija lipid peroksidatsiyasi hujayra oʻlimi yukiga hissa qoʻshishini qoʻllab-quvvatlaydi.

Biroq “qisman tiklanish” plazmaning barcha ta’siri ferroptoz orqali sodir boʻlmasligini ham koʻrsatadi.

Deferoxamine tajribasi nega kritik?

Deferoxamine (DFO) temirni bogʻlaydigan xelatordir. Agar kuzatilgan hujayra oʻlimi klassik temirga bogʻliq ferroptoz bilan tushuntirilsa, temir xelatsiyasi hujayra oʻlimi va lipid peroksidatsiyasini kamaytirishi kutilardi. Manba DFO buni sezilarli darajada amalga oshirmaganini bildiradi.

Shu sababli mualliflar lipid peroksidatsiyasi mavjudligini tan olsalar-da, natijani klassik iron-dependent ferroptosis sifatida tasniflamaydi.

Apoptoz va lipid peroksidatsiyasi bir vaqtda boʻlishi mumkinmi?

Ha. Hujayra oʻlim mexanizmlari har doim bir-biridan butunlay ajralgan emas. Kuchli oksidlovchi stress lipid membranalarini, DNA, oqsil buklanish tizimlari va mitoxondriyani bir vaqtda ta’sirlantirishi mumkin. Ushbu tadqiqot dalillari ustun ijro mexanizmi apoptoz ekanini; lipid peroksidatsiyasi esa qoʻshimcha oksidlovchi shikastlanish qatlamini hosil qilishini qoʻllab-quvvatlaydi.

Bu Tadqiqot Insonlarda Saraton Davolashiga Dalilmi?

Yoʻq. Tadqiqotda inson saraton hujayra liniyalari va sichqon melanoma allograft modeli ishlatilgan, biroq inson bemorlarida N₂/O₂ plazma davolashi qoʻllanmagan; klinik oʻsma javobi, doza, toʻqima penetratsiyasi, sistemali xavfsizlik, organ toksikligi yoki uzoq muddatli samaradorlik baholanmagan.

Sichqon tajribasi qanday bajarildi?

Voyaga yetgan urgʻochi C57BL/6 sichqonlar har bir guruhda n=9 qilib ishlatilgan. 1 × 10⁶ B16F10 sichqon melanoma hujayrasi sovuq PBS va Corning Matrigel ning 1:1 aralashmasida tayyorlangan va sichqonlarning flank sohasiga teri ostiga inyeksiya qilingan.

Oʻsmalar taxminan 50 mm³ ga yetganda sichqonlar davolash guruhlariga randomizatsiya qilingan. Nazorat sichqonlariga 100 µL PBS, tajriba guruhiga 100 µL plazma bilan ishlov berilgan PBS berilgan. Qoʻllash haftasiga besh marta, jami 15 davolash boʻlib, 21 kun davom ettirilgan.

Manbaning Methods boʻlimi bu qoʻllashlarni “subcutaneous injections” deb yozadi, Abstract va Discussion esa “intratumoral administration” iborasidan foydalanadi. Manba bu terminologik farqni tushuntirmagani sabab Verianla qoʻllashning aniq anatomik joyini ulardan birini tanlab qayta ta’riflamaydi.

Davolash yakunida oʻsmalar olib tashlangan va plazma bilan ishlov berilgan PBS olgan guruhda oʻsma oʻlchami nazoratga nisbatan sezilarli darajada past boʻlgan.

Biroq tadqiqot normal organ gistopatologiyasi, sistemali toksiklik yoki normal-toʻqima/oʻsma selektivligini in vivo taqqoslamagan. Bundan tashqari qoʻllash lokal boʻlgani uchun sistemali ta’sirlanish cheklangan.

Allograft va xenograft oʻrtasidagi farq nima?

Syngeneic allograft, ayni turdagi va genetik jihatdan mos hayvon hamda oʻsma hujayrasi ishlatiladigan oʻsma modelidir. Ushbu tadqiqotda B16F10 sichqon melanoma hujayrasi, C57BL/6 ham sichqon boʻlgani uchun Methods boʻlimi tizimni syngeneic murine melanoma/allograft sifatida ta’riflaydi.

Xenograft esa turli turlar oʻrtasida koʻchirib oʻtkazilgan hujayra yoki toʻqimani anglatadi; masalan, inson oʻsma hujayrasini sichqonga berish. Figure 1F izohida B16F10/C57BL/6 tajribasiga “xenograft” deyilishi Methods ta’rifiga mos emas. Article in Press versiyasidagi bu terminologik nomuvofiqlik Verianla tomonidan yashirincha tuzatilmagan.

Tadqiqot Usuli va Natijalari

Plazma ishlab chiqarish tizimining texnik parametrlari

Tadqiqotda ishlatilgan hujayra modellari

Hujayra kulturasi sharoitlari

Barcha hujayralar DMEM muhitida %10 fetal bovine serum va %1 penicillin-streptomycin bilan, 37 °C da va namlangan %5 CO₂ inkubatorda oʻstirilgan.

MTT yashovchanlik testi

Hujayra yashovchanligi Cell Proliferation Kit I MTT usuli bilan baholangan. Hujayralar 96-well plate larga 1 × 10⁴ hujayra/well miqdorida ekilgan va absorbans SpectraMax 190 microplate reader bilan 570 nm da oʻlchangan.

MTT metabolik faollikka asoslangan nisbiy hujayra yashovchanligi koʻrsatkichidir. Shuning uchun MTT signalining kamayishi oʻz-oʻzidan qaysi hujayra oʻlim shakli sodir boʻlganini aniqlamaydi. Shu sababli manba qoʻshimcha ravishda Annexin V/PI, caspase/PARP va boshqa mexanistik tajribalardan foydalangan.

Annexin V va propidium iodide nimani ajratadi?

Annexin V apoptoz paytida hujayra membranasining tashqi yuzasiga koʻchadigan phosphatidylserine ga bogʻlanadi. Propidium iodide (PI) esa membrana yaxlitligini yoʻqotgan hujayralarga kirib DNA ni boʻyaydi.

Manba har bir namuna uchun 10.000 dan ortiq hujayrani tahlil qilgan va BD FACSAria III Cell Sorter hamda BD FACSDiva v8.0.3 dan foydalangan.

Article in Press Figure 2A ning asosiy matni HEC1A da aniq apoptotik oshish, birlamchi fibroblastlarda esa ayni tendensiya yoʻqligini aytadi va FACS paneli bu bayonga mos keladi. Biroq oʻngdagi xulosa bar grafigining koʻrinadigan legend/toʻldirish mosligi matn bilan toʻliq mos koʻrinmaydi. Shu sababli Verianla Figure 2A dan yangi aniq foiz qiymatlarini chiqarmaydi.

Apoptoz bilan bogʻliq genlarda nima oʻzgardi?

B16F10 hujayralarida N₂/O₂ plazmasidan keyin pro-apoptotik Bax va Bak1 mRNA lari oshgan. Anti-apoptotik Bcl-2 va Bcl-xl kamaygan. Figure 2B shuningdek Bcl-w darajasida ham aniq kamayish koʻrsatadi.

Manba bu boʻlimda ayniqsa mRNA darajalari baholanganini va bu gen oʻzgarishlari oqsil darajasida alohida tasdiqlanishi kerakligini bildiradi.

qRT-PCR va ΔΔCt usuli

RNA RNeasy Plus Mini Kit bilan ajratilgan, Nano-400A bilan oʻlchangan, AccuPower RT PreMix yordamida cDNA ga aylantirilgan va AriaMx Real-Time PCR System da SYBR Green asosidagi qPCR bajarilgan. GAPDH housekeeping gene sifatida ishlatilgan.

Manba gen ekspressiyasini ΔΔCt usuli bilan tahlil qilganini bildiradi. Manba tenglamalarni alohida yozmagani sabab quyidagi matematika usulning oʻquviy standart ochilishidir; tadqiqotning yangi tenglamasi emas:

\(\Delta Ct = Ct_{\mathrm{hedef}} - Ct_{\mathrm{referans}}\)

\(\Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{\mathrm{işlem}} - \Delta Ct_{\mathrm{kontrol}}\)

\(\mathrm{Göreli\ ekspresyon} = 2^{-\Delta\Delta Ct}\)

Formula nimani hisoblaydi? Maqsad gen mRNA sining housekeeping gene ga normallashtirilgan darajasining nazorat sharoitiga nisbatan oʻzgarishini.

Ct nima? qPCR floresans signali belgilangan chegaradan oʻtadigan cycle sonidir.

ΔCt nima qiladi? Maqsad genni ayni namunadagi etalon gene ga normallashtiradi.

ΔΔCt nima qiladi? Normallashtirilgan ishlov guruhini normallashtirilgan nazorat guruhi bilan taqqoslaydi.

2^−ΔΔCt nima beradi? Oʻlchovsiz nisbiy karra oʻzgarishini.

Talqin chegarasi: Manba xom Ct qiymatlarini jadval shaklida bermagani sabab Verianla yangi fold-change qiymatlarini hisoblamaydi.

Manbada berilgan qPCR primerlari

Western blot tahlili

Hujayralar RIPA buffer bilan parchalanib, 15.000 × g da 5 daqiqa sentrifugalangan va oqsillar 5-20% gradient yoki %15 SDS-PAGE gellarida ajratilgan. Nitrocellulose membranalarga koʻchirilgandan keyin γH2AX, BIP, CHOP, PARP, caspase-3, p53 va phospho-p53(Ser15) antitanalari ishlatilgan.

Manba antitana suyultirilishini matnda “1:2-3000” shaklida bosadi. Ifoda erta-versiya matnida tipografik jihatdan noaniq; Verianla buni yashirincha 1:2000 yoki 1:3000 kabi yangi qiymatga aylantirmaydi.

RNA-seq qanday bajarildi?

B16F10 hujayralaridan total RNA RNeasy Mini Kit bilan ajratilgan; sifat Agilent 2100 Bioanalyzer va RNA 6000 Nano LabChip bilan tekshirilgan. Barcha namunalarda RNA integrity number (RIN) >9 deb xabar qilingan.

Poly(A)+ mRNA TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit bilan ajratilgan va parchalangan; sekvenslash Illumina NovaSeq 6000 platformasida Macrogen tomonidan bajarilgan.

Methods har bir sharoit uchun uchta biologik takror ishlatilganini bildiradi. Biroq asosiy Article in Press Figure 4D heatmap da koʻrinadigan qatorlar Control #1, Control #2, N₂/O₂ Plasma #1 va N₂/O₂ Plasma #2 shaklida. Manba uchinchi takror nega heatmap da koʻrinmasligini tushuntirmaydi.

Differensial gen mezoni qanday belgilandi?

Har bir gen uchun Student's t-test qoʻllanib, sample label permutation yordamida T-statistic uchun empirical null distributions hosil qilingan.

Gen differentially expressed gene (DEG) deb qabul qilinishi uchun ikki shart birga talab qilingan:

Adjusted p-value ≤ 0.05

va

|log₂(fold change)| > 0.428

Manba 0.428 chegarasi taxminan 1.35-fold oʻzgarishga mos kelishini va null log₂ fold-change taqsimotining 0.5. va 99.5. percentillarining oʻrtachasiga asoslanishini bildiradi.

log₂(fold-change) nimani anglatadi?

Fold-change genning ishlov guruhida nazoratga nisbatan qanchalik oʻzgarganini bildiradi. Log₂ oʻzgartirish oshish va kamayishlarni simmetrik shkalaga oʻtkazadi. Musbat log₂ fold-change oshishni, manfiy qiymat kamayishni koʻrsatadi.

Nega −log₁₀(P) volcano plot da ishlatiladi?

Figure 4C ning y oʻqi \(-\log_{10}(P)\) oʻzgartirishidan foydalanadi. P kichraygani sari −log₁₀(P) kattalashadi; shu sabab statistik jihatdan kichikroq P qiymatlari grafikda yuqoriroq koʻrinadi. Bu oʻzgartirish yangi biologik kattalik hosil qilmaydi, faqat P qiymatlarini grafikda oʻqiladigan qiladi.

RNA-seq ning asosiy koʻrinadigan natijasi

Pathway enrichment tahlillari apoptosis, oxidative stress response va reactive oxygen species response kabi jarayonlarni ajratib koʻrsatgan. Ferroptosis ham enrichment natijalarida koʻringan; biroq birgina gen-set boyishi hujayra ferroptoz orqali oʻlganini isbotlamaydi. Shu sabab manba funksional sorafenib, ferrostatin-1, lipid-peroksidatsiya va DFO tajribalarini ham alohida bajargan.

Holotomography asosidagi tirik hujayra tasvirlash

Hujayralar TomoDish ichida taxminan %60 confluency ga yetganda kultura muhiti plasma-treated medium bilan almashtirilgan va bir soat inkubatsiya qilingan. Keyin muhit Liperfluo yoki JC-1 saqlovchi HBSS bilan almashtirilgan.

Lipid peroxidation uchun 1 µmol/L Liperfluo; mitochondrial membrane potential uchun manbada 1 mM deb yozilgan JC-1 ishlatilgan. 30 daqiqalik boʻyashdan soʻng hujayralar Tomocube HT-2H mikroskopida refractive-index asosidagi holotomography bilan tasvirlangan. Floresans intensivliklari ImageJ2 bilan miqdorlashtirilgan.

Statistik tahlil

Ma’lumotlar kamida uchta mustaqil tajribadan olingan va oʻrtacha ± standart xato (mean ± SEM) koʻrinishida berilgan. Ikki guruh taqqoslashlarida two-tailed Student's t-test, koʻp guruhli taqqoslashlarda one-way ANOVA va Tukey post-hoc test ishlatilgan.

Statistik ahamiyatlilik chegarasi P<0.05. Belgilash tizimi *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 va N.S.=not significant shaklida.

Figure 1 ning asosiy topilmasi

Plazma chiqishi oshgani sari Griess-asosidagi NO/RNS signali oshgan. HEC1A hujayra yashovchanligi plazma dozasi bilan pasaygan, normal birlamchi fibroblastlar esa manba talqinida nisbatan saqlangan. c-PTIO ning H1299 hujayralarida yashovchanlikni tiklashi reaktiv azot turlarining hissasini qoʻllab-quvvatlagan.

B16F10/C57BL/6 sichqon tajribasida plazma bilan ishlov berilgan PBS olgan guruhda oʻsma oʻlchami nazoratga nisbatan sezilarli kamaygan. Xom ma’lumot jadvali berilmagani sabab Verianla grafikdan yangi aniq oʻsma hajmi qiymatlarini yaratmaydi.

Figure 2 ning asosiy topilmasi

Annexin V/PI taqsimoti N₂/O₂ plazmasidan keyin HEC1A hujayralarida apoptotik populyatsiya oshishi bilan mos. B16F10 qPCR natijalarida Bax va Bak1 oshgan, Bcl-2, Bcl-xl va Figure 2B da Bcl-w kamaygan.

Figure 3 ning asosiy topilmasi

ROS signali 0, 2, 4 va 8 soatlik vaqt nuqtalarida umuman oshib boruvchi naqsh koʻrsatgan. GSH yashovchanlikni dozaga bogʻliq ravishda tiklagan. γH2AX, phospho-p53(Ser15), BIP va CHOP oshishi; PARP va caspase-3 parchalanishi; JC-1 qizil/yashil nisbatining kamayishi birgalikda DNA shikastlanishi, ER stressi, mitoxondrial disfunksiya va apoptotik ijro mexanizmini qoʻllab-quvvatlaydi.

Figure 4 ning asosiy topilmasi

Transcriptome tahlili apoptosis va oxidative-stress bilan bogʻliq gen dasturlarini tasdiqlagan; ferroptosis-associated genlarda ham oʻzgarish koʻrsatgan. Sorafenib plazma sitotoksikligini oshirgan, ferrostatin-1 esa qisman rescue bergan. HeLa hujayralarida Liperfluo signali lipid peroxidation oshishini koʻrsatgan.

Supplementary Figure S2 ga oid asosiy matn DFO hujayra yashovchanligi yoki lipid peroxidation ni sezilarli tiklamaganini bildiradi. Supplementary PDF foydalanuvchi tomonidan alohida taqdim etilmagani sabab Verianla bu tajribaning xom grafik qiymatlarini yaratmaydi.

Mexanizmning Verianla uchun mustaqil qayta qurilishi

Tadqiqot qoʻllab-quvvatlaydigan natijalar

• N₂/O₂ plazmasi bilan ishlov berilgan muhit oʻrganilgan saraton hujayralarida yashovchanlikni kamaytirgan.
• Inson birlamchi fibroblastlari in vitro taqqoslashda saraton hujayralariga qaraganda kamroq ta’sirlangan.
• c-PTIO natijasi reaktiv azot turlarining sitotoksik ta’sirga hissasini qoʻllab-quvvatlaydi.
• Hujayra ichidagi ROS oshgan va GSH hujayra yashovchanligini qisman/dozaga bogʻliq ravishda tiklagan.
• Annexin V/PI, caspase-3 va PARP natijalari apoptozni qoʻllab-quvvatlaydi.
• γH2AX va p53 Ser15 fosforlanishi DNA damage response faollashuvini qoʻllab-quvvatlaydi.
• BIP va CHOP oshishi ER-stress/proteostatic-stress javobini qoʻllab-quvvatlaydi.
• JC-1 natijasi mitoxondriya membrana potensiali kamayganini koʻrsatadi.
• RNA-seq apoptosis va oxidative-stress dasturlarini qoʻllab-quvvatlagan.
• Ferrostatin-1 ning qisman rescue ta’siri va Liperfluo natijasi lipid peroxidation hujayra oʻlimiga hissa qoʻshishini qoʻllab-quvvatlaydi.
• DFO natijasida tiklanish boʻlmagani kanonik iron-dependent ferroptosis talqiniga qarshi.
• Plazma bilan ishlov berilgan PBS sichqon B16F10 oʻsma modelida oʻsma oʻsishini kamaytirgan.

Tadqiqot qoʻllab-quvvatlamaydigan natijalar

• N₂/O₂ plazmasi inson saraton bemorlarida samarali va xavfsiz davolash ekani koʻrsatilmagan.
• Barcha saraton turlari bir xil sezgirlikka ega ekani koʻrsatilmagan.
• Barcha normal inson toʻqimalari davolashdan himoyalanishi koʻrsatilmagan.
• In vivo normal toʻqima selektivligi yoki keng qamrovli sistemali toksiklik sinovdan oʻtkazilmagan.
• Sistemali intravenoz yoki intraperitoneal samaradorlik koʻrsatilmagan.
• Hosil boʻlgan barcha ROS va RNS turlarining miqdoriy kimyoviy tarkibi aniqlanmagan.
• Azot manbali maxsus reaktiv turlarning nisbiy biologik hissasi toʻliq aniqlanmagan.
• Lipid peroxidation natijasi canonical ferroptosis dalili emas.
• Sorafenib va ferrostatin-1 natijalari butun oʻlim mexanizmi ferroptoz ekanini koʻrsatmaydi.
• Lokal sichqon davolashi insonlarda toʻqima penetratsiyasi yoki klinik dozani belgilamaydi.

Tadqiqotning asosiy kuchli tomonlari

Tadqiqot bitta saraton hujayra modeli bilan cheklanmagan; turli toʻqima kelib chiqishidagi endometrial, servikal, melanoma va oʻpka saratoni modellarini birgalikda baholagan. Bu yondashuv N₂/O₂ plazmasiga javob faqat bitta hujayra liniyasiga xos emasligini koʻrsatishga yordam bergan.

Ikkinchi kuchli tomon hujayra oʻlimi faqat MTT yashovchanlik kamayishi bilan baholanmaganidir. Annexin V/PI, apoptotik gen ekspressiyasi, caspase/PARP parchalanishi, DNA damage koʻrsatkichlari, ER-stress koʻrsatkichlari va mitoxondriya membrana potensiali bir-birini toʻldiruvchi mustaqil dalil qatlamlarini yaratgan.

Uchinchi kuchli tomon oksidlovchi stress uchun faqat ROS oshishi koʻrsatilmagan; GSH bilan rescue aralashuvi ham bajarilgan. Shu tariqa ROS va sitotoksiklik oʻrtasidagi funksional bogʻlanish kuchaytirilgan.

Toʻrtinchi kuchli tomon ferroptoz talqini faqat ferroptosis-related gene set natijasiga qoldirilmaganidir. Sorafenib, ferrostatin-1, Liperfluo va DFO tajribalari yordamida lipid peroxidation va canonical ferroptosis bir-biridan ajratilgan.

Beshinchi kuchli tomon hujayra kulturasi natijalari B16F10/C57BL/6 sichqon modeli bilan in vivo oʻsma oʻsishi darajasida qoʻshimcha sinovdan oʻtkazilganidir.

Tadqiqotning asosiy cheklovlari

Birinchi cheklov: Normal hujayra selektivligi in vitro faqat inson birlamchi fibroblastlari bilan baholangan. Turli normal epiteliy, endoteliy, immun yoki organ hujayralari tizimli ravishda taqqoslanmagan.

Ikkinchi cheklov: In vivo tajriba lokal qoʻllashga asoslangan. Normal organ gistopatologiyasi va sistemali toksiklik bajarilmagani sabab fiziologik xavfsizlik chegarasi belgilanmagan.

Uchinchi cheklov: Reaktiv turlarning butun spektri tavsiflanmagan. NO/RNS uchun Griess/c-PTIO va ROS uchun hujayraviy tahlil bajarilgan boʻlsa-da, maxsus nitrogen-derived reactive species larning alohida hissasi noma’lum.

Toʻrtinchi cheklov: Mexanistik tahlillar barcha hujayra modellarida bir xil chuqurlikda takrorlangani koʻrsatilmagan. Ayrim tajribalar HEC1A, ayrimlari HeLa, B16F10 yoki H1299 da bajarilgan.

Beshinchi cheklov: Tadqiqot klinik dozalash, toʻqima penetratsiyasi, pharmacodynamics va uzoq muddatli takroriy qoʻllashlarni baholamagan.

Oltinchi cheklov: Article in Press versiyasida terminologik/tahririy nomuvofiqliklar mavjud: allograft/xenograft, intratumoral/subcutaneous inyeksiya iborasi, ayrim Figure 2 legend koʻrinishi va Methods-heatmap biologik takror koʻrinuvchanligi kabi jihatlar final terimdan oldin aniqlashtirilishi mumkin.

Yettinchi cheklov: Supplementary Figure S1/S2 mavjud yuklangan asosiy PDF ning toʻliq ilmiy vizual tanasida boʻlmagani sabab qoʻshimcha tajribalarning xom grafiklari bu Verianla maqolasida qayta yaratilmagan.

Manba va Usul Haqida Izoh

Original sarlavha: Nitrogen-oxygen plasma induces selective cancer cell death via apoptosis with lipid-peroxidation-associated mechanisms across multiple cancer cell models.

Mualliflar va tartib: Bum-Ho Bin, Sofia Brito, Sun Ju Park, Ki Bok Yoon, Hyojin Heo, Hantae Jo, Sehyun Chae, Byung Mook Weon, Sung Kweon Cho, Jiyoon Kim.

Teng hissa: Bum-Ho Bin, Sofia Brito va Sung Kweon Cho.

Mas’ul muallif: Jiyoon Kim.

Muassasa 1: Department of Biological Sciences, Ajou University, Suwon, Republic of Korea.

Muassasa 2: The Anti-Aging Lab, Co. Ltd., Suwon, Republic of Korea.

Muassasa 3: Department of Pharmacology, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Republic of Korea.

Muassasa 4: Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB), Daejeon, Republic of Korea.

Muassasa 5 boʻyicha manba farqi: Article in Press PDF Hantae Jo uchun Department of Neurosurgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul yozuvini beradi. Hozirgi Nature bibliografik sahifasi esa Department of Nuclear Medicine, Yonsei University College of Medicine, Seoul yozuvini koʻrsatadi. Bu farq erta kirish versiyasi bilan hozirgi nashr metadata si oʻrtasida ochiq saqlangan.

Muassasa 6: Department of Smart Health Science and Technology, Kangwon National University, Chuncheon, Republic of Korea.

Muassasa 7: Department of Biotechnology and Bioengineering, College of ACE, Kangwon National University, Chuncheon, Republic of Korea.

Muassasa 8: School of Advanced Materials Science and Engineering, Sungkyunkwan University, Suwon, South Korea.

Muassasa 9: Department of Pharmacology, Ajou University School of Medicine, Suwon, South Korea.

Muassasa 10: Department of Medical Sciences, Graduate School, The Catholic University of Korea, Seoul, South Korea.

Muassasa 11: Institute for Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, South Korea.

Jurnal: Scientific Reports.

Nashriyot: Nature Portfolio / Springer Nature.

DOI: 10.1038/s41598-026-59131-4.

Qabul qilib olingan sana: 9 may 2025.

Qabul qilingan sana: 18 iyun 2026.

Onlayn nashr sanasi: 6 iyul 2026.

Manba turi va taqriz holati: Taqrizdan oʻtgan va qabul qilingan Scientific Reports tadqiqot maqolasi; mavjud yuklangan PDF va hozirgi Nature sahifasi Article in Press/unedited early-access versiyasi sifatida belgilangan.

Version of Record holati: Mavjud rasmiy sahifa bu versiya soʻnggi tahrir jarayonlaridan keyin avtomatik ravishda final Version of Record bilan almashtirilishini bildiradi; shu sabab mavjud PDF final VOR sifatida belgilanmagan.

Jild / son / maqola raqami: Mavjud Article in Press PDF va rasmiy erta kirish bibliografik koʻrinishida yakuniy maqola raqami aniq berilmagan; Verianla bu maydonni taxmin qilmagan.

Litsenziya: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Tadqiqot turi: In vitro hujayra kulturasi + molekulyar mexanizm + transcriptomics + in vivo syngeneic murine melanoma oʻsma modeli.

Asosiy hujayra modellari: HEC1A, HeLa, B16F10, H1299 va human primary fibroblasts.

Asosiy plazma qurilmasi: TGT, Daejeon, Korea tomonidan taqdim etilgan custom-built ikki parallel elektrodli plazma jet tizimi; bitta elektrod keramika dielektrik bilan qoplangan; 5 kW va 30 kHz high-voltage power supply; circulating water cooling.

Gaz parametrlari: N₂ 10 cc/min, O₂ 5 cc/min; 135.200 mm³ mixing chamber; manba ayni jumlada 225 V qiymatini beradi, biroq bu qiymatning yuqori kuchlanish manbai parametrlari bilan aloqasini alohida tushuntirmaydi.

RNS oʻlchovi: Nitrite Assay Kit / Griess Reagent; absorbans 540 nm, SpectraMax 190.

Standart in vitro plazma qoʻllashi: Culture medium 10 daqiqa plazma bilan ishlov beriladi; hujayralar koʻpincha 24 soat ishlovda saqlanadi. Figure 1 da 0, 5 va 10 daqiqalik plazma ishlov sharoitlari ham alohida mavjud.

Sichqon modeli: Urgʻochi C57BL/6, n=9/guruh; 1 × 10⁶ B16F10 hujayrasi; PBS:Matrigel 1:1; flank subcutaneous tumor establishment; taxminan 50 mm³ da randomizatsiya.

Sichqon davolashi: 100 µL PBS yoki plasma-treated PBS; haftasiga besh marta, jami 15 qoʻllash, 21 kun.

Inyeksiya terminologiyasi qaydi: Methods “subcutaneous injections”, Abstract va Discussion esa “intratumoral administration” iborasidan foydalanadi. Manba farqi saqlangan.

Oʻsma modeli terminologiyasi qaydi: Methods B16F10/C57BL/6 tizimini syngeneic murine melanoma/allograft deb ta’riflaydi; Figure 1F caption “xenograft” soʻzidan foydalanadi. Biologik model tuzilishi allograft ta’rifiga mos, biroq Verianla manba matnidagi nomuvofiqlikni yashirmaydi.

Hayvon etik tasdigʻi: Semyung University Institutional Animal Care and Use Committee, Approval No. smecae 22-08-02; ARRIVE guidelines.

MTT: 1 × 10⁴ hujayra/well, 96-well plate, absorbans 570 nm.

FACS: >10.000 hujayra; Annexin V-FITC/PI apoptosis detection; BD FACSAria III; BD FACSDiva v8.0.3.

Lipid-peroksidatsiya FACS: 1 µmol/L Liperfluo, 1 soat.

qRT-PCR: RNeasy Plus Mini Kit, AccuPower RT PreMix, SYBR Green, AriaMx Real-Time PCR System; GAPDH etalon; ΔΔCt usuli.

Western blot nishonlari: γH2AX, BIP, CHOP, PARP, caspase-3, p53 va phospho-p53(Ser15).

RNA-seq: RIN >9; Poly(A)+ mRNA; TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit; Illumina NovaSeq 6000; Macrogen; manba Methods har bir sharoit uchun uchta biologik takrorni bildiradi.

DEG mezonlari: adjusted p≤0.05 va |log₂ fold-change|>0.428; manba buni taxminan 1.35-fold chegara deb ta’riflaydi.

Holotomography: Tomocube HT-2H; TomoStudio; ImageJ2; 1 µmol/L Liperfluo yoki manbada 1 mM deb bosilgan JC-1.

Ferroptoz modulyatorlari: Sorafenib 1 µM; ferrostatin-1 10 µM; DFO konsentratsiyasi asosiy PDF ning tegishli asosiy matnida aniq berilmagan va Verianla tomonidan oʻylab topilmagan.

Statistika: Kamida uchta mustaqil tajriba; mean±SEM; two-tailed Student's t-test yoki one-way ANOVA + Tukey post-hoc; P<0.05.

Asosiy oʻlim mexanizmi: Apoptoz; oxidative-stress-associated lipid peroxidation qoʻshimcha hissa qoʻshadi.

Ferroptoz chegarasi: Kanonik iron-dependent ferroptosis qoʻllab-quvvatlanmaydi; DFO rescue bermagan, Slc7a11/Slc7a5 oshgan va Acsl4 kamaygan.

Data availability: Raw va processed RNA-seq ma’lumotlari GEO GSE231561 ostida saqlangan.

Moliyalashtirish: Ajou University Research Fund; National Research Foundation of Korea Basic Science Research Program, RS-2021-NR060141 va RS-2024-00405790; Korea Health Technology R&D Project/KHIDI, RS-2025-25459560.

Muallif hissalari: Sofia Brito va Bum-Ho Bin tadqiqotni loyihalagan. Hyojin Heo, Ki Bok Yoon, Hantae Jo va Sehyun Chae tadqiqot va ma’lumot yigʻishni bajargan. Sofia Brito, Sun Ju Park va Sung Kweon Cho formal analysis va visualization ni amalga oshirgan. Byung Mook Weon metodologiya va texnik resurs yordamini bergan. Jiyoon Kim va Bum-Ho Bin resurs ta’minoti, supervision va talqin vazifalarini bajargan. Sofia Brito va Bum-Ho Bin original qoralamani yozgan; Sun Ju Park, Sung Kweon Cho va Jiyoon Kim matnni koʻrib chiqib tahrirlagan.

Manfaatlar toʻqnashuvi: Mualliflar competing interests yoʻqligini bildirgan.

Supplementary-material chegarasi: Asosiy PDF Figure S1 va Figure S2 ga havola qiladi. Foydalanuvchi tomonidan alohida supplementary fayl berilmagani sabab bu Verianla versiyasi faqat asosiy PDF ushbu qoʻshimcha tajribalar haqida ochiq bildirgan natijalardan foydalanadi; qoʻshimcha rasmlardan koʻrinmaydigan yangi son chiqarmaydi.

Figure 2 erta-versiya qaydi: Figure 2A ning asosiy matni va FACS panellari saraton hujayrasida kuchliroq apoptosis talqinini qoʻllab-quvvatlasa-da, bar-graph legend/toʻldirish koʻrinishi Article in Press bosmasida matn bilan toʻliq mos koʻrinmaydi. Shu sabab aniq foiz qiymatlari qayta yaratilmagan.

RNA-seq takror qaydi: Methods har bir sharoit uchun uchta biologik takrorni bildirsa-da, Figure 4D heatmap koʻrinadigan tarzda ikkita control va ikkita plasma qatorini koʻrsatadi. Manba bu farqni tushuntirmaydi.

Klinik chegara: Insonlarda davolash sinovdan oʻtkazilmagan. In vivo ma’lumot lokal B16F10/C57BL/6 sichqon modeliga tegishli; systemic exposure, organ toxicity, normal-tissue histopathology va human therapeutic efficacy koʻrsatilmagan.