Azot-oksigen plazması (N₂/O₂ plasma), nəzarət olunan azot və oksigen qaz axınından elektrik plazması yaradaraq reaktiv oksigen və azot növləri əmələ gətirməyi məqsəd qoyan fiziki plazma yanaşmasıdır. Bu tədqiqat N₂/O₂ plazması ilə işlənmiş mühitlərin endometrial adenokarsinoma HEC1A, servikal karsinoma HeLa, siçan melanoması B16F10 və insanın kiçik hüceyrəli olmayan ağciyər xərçəngi H1299 modellərindəki təsirlərini; normal nəzarət kimi insan ilkin fibroblastlarını və həmçinin B16F10/C57BL/6 siçan şiş modelini istifadə etməklə araşdırmışdır. Mənbənin əsas nəticəsi budur ki, N₂/O₂ plazması araşdırılan xərçəng modellərində oksidləşdirici stresi artıraraq əsasən apoptozu işə salır və buna lipid peroksidasiyası ilə əlaqəli oksidləşdirici membran zədələnməsi müşayiət olunur.

İn vitro təcrübələrdə hüceyrələr birbaşa plazma şırnağının altında saxlanılmamışdır. Mənbədə kultura mühitinin plazma ilə işləndiyi və daha sonra hüceyrələrə tətbiq edildiyi bildirilir. Standart üsulda kultura mühiti N₂/O₂ plazması ilə 10 dəqiqə işlənmiş, hüceyrələr bu mühitlə 24 saat inkubasiya edilmişdir; bəzi şəkillərdə 0, 5 və ya 10 dəqiqəlik plazma işləmələri və fərqli inkubasiya müddətləri də ayrıca istifadə olunmuşdur.

HEC1A hüceyrələrində plazma səviyyəsi artdıqca hüceyrə canlılığı azalarkən, insan ilkin fibroblastlarında eyni aydın itki müşahidə edilməmişdir. H1299 hüceyrələrində reaktiv azot növlərinin təsirini məhdudlaşdırmaq üçün istifadə olunan 1 µM carboxy-PTIO, N₂/O₂ plazmasının sitotoksik təsirini azaltmışdır. Bununla belə, tədqiqat yalnız müəyyən bir normal hüceyrə tipi ilə müqayisə aparmışdır; nəticə bütün normal toxumaların plazmaya davamlı olduğu və ya üsulun insanlar üçün təhlükəsiz olduğu anlamına gəlmir.

Apoptoz Annexin V/propidium iodide axın sitometriyası, pro-apoptotik Bax və Bak1 genlərinin yüksəlməsi, anti-apoptotik Bcl-2, Bcl-xl və Figure 2-də Bcl-w səviyyəsinin azalması, PARP və caspase-3 parçalanması, γH2AX artımı, p53 Ser15 fosforilləşməsi, ER stresi göstəriciləri BIP və CHOP-un yüksəlməsi və JC-1 ilə ölçülən mitoxondri membran potensialının itirilməsi ilə dəstəklənmişdir.

Hüceyrədaxili reaktiv oksigen növləri (ROS) N₂/O₂ plazmasından sonra zamanla artmışdır. Glutathione (GSH) ilə ROS yükü azaldıldıqda hüceyrə canlılığının dozadan asılı şəkildə bərpa olunması oksidləşdirici stressin hüceyrə ölümündə yalnız müşayiət edən göstərici deyil, mühüm upstream hərəkətverici olduğunu dəstəkləyir. Bununla belə, tədqiqat əmələ gələn bütün spesifik oksigen və azot növlərini ayrı-ayrılıqda müəyyən etməmiş və xüsusilə azot mənşəli reaktiv növlərin nisbi töhfəsini tam həll etməmişdir.

RNA-seq və funksional təcrübələr ferroptozla əlaqəli genlərdə dəyişiklik və lipid peroksidasiyasında artım göstərmişdir. Ferrostatin-1 hüceyrə canlılığını qismən bərpa etmiş, sorafenib isə plazma sitotoksikliyini gücləndirmişdir. Buna qarşı dəmir şelatoru deferoxamine hüceyrə ölümünü və ya lipid peroksidasiyasını əhəmiyyətli dərəcədə azaltmamışdır. Slc7a11 və Slc7a5 yüksələrkən Acsl4 azalmışdır. Buna görə mənbə hüceyrə ölümünü klassik dəmirdən asılı ferroptoz kimi deyil, dominant apoptoza müşayiət edən oksidləşdirici stress və lipid-peroksidasiyası ilə əlaqəli sitotoksiklik kimi şərh edir.

Siçan təcrübəsində dişi C57BL/6 siçanlarında B16F10 melanoma hüceyrələri ilə yaradılmış şişlərin böyüməsi plazma ilə işlənmiş PBS verilən qrupda nəzarətlə müqayisədə azalmışdır. Lakin sistemik tətbiq, orqan səviyyəli histopatologiya, normal toxuma müqayisəsi və geniş toksiklik analizi aparılmamışdır. Buna görə bu tədqiqat insanlarda xərçəng müalicəsinin effektivliyini və ya təhlükəsizliyini sübut etmir.

Plazma nədir?

Plazma qaz molekullarının enerji alaraq elektron, ion və müxtəlif reaktiv növlərin mövcud olduğu daha yüksək enerjili vəziyyətə keçdiyi fiziki mühitdir. Biotibbi plazma tədqiqatlarında məqsəd yalnız yüksək temperatur yaratmaq deyil; hüceyrələrlə qarşılıqlı təsir göstərə bilən reaktiv oksigen növlərini (reactive oxygen species, ROS), reaktiv azot növlərini (reactive nitrogen species, RNS), elektrik sahələrini və digər fiziki-kimyəvi komponentləri nəzarətli şəkildə yaratmaqdır.

Bu məqalənin təcrübə qurğusunda azot və oksigen ayrı mass-flow controller sistemləri ilə verilir, qarışdırma kamerasında birləşdirilir və yüksək gərginlikli plazma mənbəyində işlənir. Mənbə çıxış qazının temperaturunu və ya dəqiq atmosfer təzyiqi dəyərini bildirmədiyi üçün Verianla bu cihaz üçün mənbədə olmayan temperatur və ya təzyiq dəyəri yaratmır.

Niyə azot və oksigen birlikdə istifadə olunub?

Müəlliflərin tədqiqat əsaslandırması budur ki, helium və ya argon kimi nəcib qaz əsaslı sistemlərdə reaktiv növlərin kimyası ətraf havanın qarışmasına və dar əlavə qaz şərtlərinə həssas ola bilər; həmçinin nəcib qazlar xərc və təchizat baxımından mənfi cəhət yarada bilər. N₂/O₂ qarışığı daha asan əldə edilən qazlardan reaktiv oksigen və azot növlərini birlikdə yaratmaq və kimyəvi tərkibə nəzarət etmək imkanı baxımından qiymətləndirilmişdir.

Bununla belə, tədqiqat N₂/O₂ qarışığının bütün alternativ qaz qarışıqlarından daha effektiv, daha ucuz və ya klinik baxımdan üstün olduğunu birbaşa müqayisəli şəkildə göstərməmişdir.

Plazma qurğusu necə işləyir?

Reaktiv oksigen və azot növləri nə deməkdir?

ROS, oksigen tərkibli yüksək reaktiv molekul və radikalların ümumi adıdır. RNS isə azot tərkibli reaktiv növləri əhatə edir. Bu molekullar aşağı və tənzimlənmiş səviyyələrdə hüceyrə siqnallaşmasına töhfə verə bilsə də, həddindən artıq əmələ gəldikdə zülalları, lipidləri və nuklein turşularını oksidləşdirici şəkildə dəyişdirə bilər.

Mənbə reaktiv azot növlərini Griess Reagent əsaslı Nitrite Assay Kit ilə qiymətləndirmiş və absorbansı 540 nm-də ölçmüşdür. Figure 1 bunu “nitric oxide concentration” kimi təqdim edir. Buna görə Verianla bu ölçməni birbaşa bütün spesifik RNS növlərinin kəmiyyət kimyəvi profili kimi şərh etmir.

Azot-Oksigen Plazması Xərçəng Hüceyrələrini Necə Öldürür?

Tədqiqatın dəstəklədiyi əsas mexanizm N₂/O₂ plazması ilə yaranan reaktiv növlərin hüceyrə redoks tarazlığını pozması; bunun ROS artımı, DNA zədəsi, ER stresi, mitoxondri membran potensialının itirilməsi və lipid peroksidasiyası ilə əlaqəli membran zədəsini tetikləməsi və bu stress yollarının əsasən kaspaza-asılı apoptotik hüceyrə ölümündə birləşməsidir.

c-PTIO təcrübəsi nəyi göstərir?

Carboxy-PTIO tədqiqatda NO ilə əlaqəli reaktiv növlərin təsirini məhdudlaşdırmaq məqsədilə istifadə olunan scavenger-dir. H1299 hüceyrələrində 1 µM c-PTIO N₂/O₂ plazması ilə görülən hüceyrə canlılığı itkisini azaltmışdır. Bu nəticə qaz mənşəli reaktiv azot növlərinin bioloji təsirdə rol oynadığını dəstəkləyir.

Lakin c-PTIO müdaxiləsi “bütün sitotoksiklik yalnız NO tərəfindən yaranır” nəticəsini göstərmir. Tədqiqatın sonrakı təcrübələri hüceyrədaxili ROS-un da mərkəzi rol daşıdığını göstərir.

ROS niyə upstream hərəkətverici hesab olunur?

HEC1A hüceyrələrində ROS floresans siqnalı N₂/O₂ plazmasından sonra zamanla artmışdır. Təkcə bu korrelyasiya mexanizm üçün kifayət etmədiyi üçün tədqiqatçılar glutathione (GSH) ilə müdaxilə etmişlər. Figure 3B-də 10 və 100 µM GSH istifadə olunduqda hüceyrə canlılığı dozadan asılı şəkildə artmışdır.

Bioloji ara mərhələnin inhibə edilməsi və ya təmizlənməsi downstream nəticəni azaldırsa, bu, həmin ara mərhələnin mexanizmdə funksional rolunu dəstəkləyir. Buna görə GSH nəticəsi ROS-un yalnız hüceyrə ölümünə müşayiət edən göstərici olmadığını, sitotoksikliyə töhfə verən upstream amil olduğunu göstərir.

γH2AX nəyi göstərir?

H2AX DNA zədələnməsi cavabında fosforilləşə bilən histon zülalıdır. Onun fosforilləşmiş forması γH2AX, xüsusilə DNA qırılmaları və DNA damage response aktivləşməsi üçün geniş istifadə olunan göstəricidir. N₂/O₂ plazmasından sonra γH2AX-ın artması hüceyrələrdə DNA zədələnməsi cavabının aktivləşdiyini dəstəkləmişdir.

p53 Ser15 fosforilləşməsi niyə ölçülüb?

p53 DNA zədəsi və hüceyrə stresi şəraitində hüceyrə dövrünün dayanmasının və ya apoptotik cavabın tənzimlənməsində iştirak edən şiş supressor zülalıdır. Ser15 sahəsində fosforilləşmə DNA damage response ilə əlaqəli aktivləşmə göstəricilərindən biridir. Tədqiqatda p53 Ser15 fosforilləşməsi artmış və γH2AX tapıntısı ilə birlikdə DNA zədəsi/stress cavabını dəstəkləmişdir.

BIP və CHOP nəyi göstərir?

BIP, endoplazmik retikulumdakı zülal qatlanması yükü və unfolded protein response ilə əlaqəli şaperonlardan biridir. CHOP isə uzanmış və ya şiddətli ER stresi zamanı apoptotik proqrama töhfə verə bilən stress-cavab transkripsiya faktorudur. Hər iki zülalın artması N₂/O₂ plazmasının ER proteostazını pozduğunu dəstəkləyən tapıntılardandır.

PARP və caspase-3 parçalanması niyə vacibdir?

Caspase-3 apoptotik icraçı kaspazalardan biridir. Aktivləşmiş caspase-3 bir çox hüceyrə hədəfini kəsir; PARP da bu hədəflərdən biridir. Cleaved caspase-3 və cleaved PARP-ın görünməsi hüceyrənin yalnız stress altında olmadığını, apoptotik icra mexanizminin aktivləşdiyini dəstəkləyən biokimyəvi sübutdur.

Mitoxondri membran potensialı necə ölçüldü?

HeLa hüceyrələrində JC-1 floresan boyası və holotomography əsaslı canlı hüceyrə görüntülənməsi istifadə edilmişdir. Sağlam qütbləşmiş mitoxondrilərdə JC-1 daha çox qırmızı aggregate siqnalı yaradır, membran potensialı düşdükdə isə yaşıl monomer siqnalı artır.

N₂/O₂ plazmasından sonra qırmızı/yaşıl floresans nisbəti azalmış və JC-1 monomerlərinin nisbi nisbəti artmışdır. Bu nəticə mitoxondrial depolarizasiyanı və intrinsic apoptotik yolun işə düşməsini dəstəkləyir.

Methods bölməsində JC-1 konsentrasiyası 1 mM kimi çap edilmişdir. Bu dəyər Verianla tərəfindən səssizcə başqa vahidə çevrilməmişdir; mənbədə yazıldığı kimi qorunur.

Lipid Peroksidasiyası Bu Tədqiqatda Ferroptoz Sübutudurmu?

Xeyr. Lipid peroksidasiyası artmış və ferrostatin-1 hüceyrə ölümünü qismən azaltmışdır; lakin dəmir şelasiyası nəticəni bərpa etməmiş, həmçinin Slc7a11/Slc7a5 artımı və Acsl4 azalması kanonik ferroptozdan daha çox qoruyucu redoks adaptasiyasına işarə etmişdir. Mənbənin gəldiyi nəticə klassik dəmirdən asılı ferroptoz deyil, apoptoza müşayiət edən lipid-peroksidasiyası ilə əlaqəli oksidləşdirici sitotoksiklikdir.

Ferroptoz nədir?

Ferroptoz dəmirdən asılı lipid peroksidasiyasının müəyyənedici olduğu tənzimlənən hüceyrə ölümü formasıdır. Apoptozdan fərqli molekulyar və morfoloji xüsusiyyətlərə malikdir. Buna görə hüceyrədə lipid peroksidasiyasının artması təkbaşına ferroptoz diaqnozu üçün kifayət deyil.

RNA-seq niyə ferroptoz ehtimalını gündəmə gətirdi?

B16F10 hüceyrələrində aparılan transcriptomic profiling apoptotik siqnal yolları və oksidləşdirici stress cavabları ilə yanaşı ferroptozla əlaqələndirilmiş gen qruplarında da dəyişiklik göstərmişdir. Volcano plot-da mənbə 335 genin əhəmiyyətli dərəcədə upregulated, 206 genin isə downregulated olduğunu göstərir.

Ferroptozla əlaqəli seçilmiş genlərdən Slc7a11 və Slc7a5 yüksələrkən Acsl4 azalmışdır. Müəlliflər xüsusilə bu nümunənin canonical ferroptosis-in aktiv şəkildə irəliləməsindən daha çox oksidləşdirici yük qarşısında redox-regulatory və anti-ferroptotic adaptasiyanı düşündürdüyünü bildirirlər.

Slc7a11 niyə vacibdir?

Slc7a11 cystine/glutamate antiporter sisteminin mühüm komponentlərindən biridir və hüceyrənin glutathione sintezi üçün lazım olan cystine-in hüceyrəyə daxil olmasına kömək edir. Onun yüksəlməsi hüceyrənin oksidləşdirici yükü tamponlamaq üçün antioxidant qabiliyyətini qorumağa çalışdığı stress-adaptasiya cavabı ilə uyğun ola bilər.

Acsl4 niyə vacibdir?

ACSL4 çoxlu doymamış yağ turşularının membran lipidlərinə daxil edilməsində rol oynayan və bir çox ferroptoz modelində ferroptoza həssaslıqla əlaqələndirilən fermentdir. Tədqiqatda Acsl4 mRNA-sının azalması müəlliflərin canonical ferroptosis əvəzinə qoruyucu/anti-ferroptotic adaptasiya şərhini dəstəkləyən amillərdən biridir.

Sorafenib və ferrostatin-1 təcrübələri nəyi göstərir?

Mənbə sorafenib-i bu təcrübədə ferroptozu təşviq edən modulyator kimi istifadə etmişdir. 1 µM sorafenib N₂/O₂ plazması ilə birlikdə tətbiq olunduqda B16F10 hüceyrələrində sitotoksiklik artmışdır.

10 µM ferrostatin-1 isə N₂/O₂ plazması ilə azalmış hüceyrə canlılığını qismən bərpa etmişdir. Ferrostatin-1 lipid peroksidasiyasını maneə törədən ferroptoz inhibitoru olduğuna görə bu nəticə lipid peroksidasiyasının hüceyrə ölümü yükünə töhfə verdiyini dəstəkləyir.

Lakin “qismən bərpa” plazmanın bütün təsirinin ferroptoz vasitəsilə baş vermədiyini də göstərir.

Deferoxamine təcrübəsi niyə kritikdir?

Deferoxamine (DFO) dəmiri bağlayan şelatordur. Əgər müşahidə edilən hüceyrə ölümü klassik dəmirdən asılı ferroptozla izah olunsaydı, dəmir şelasiyasının hüceyrə ölümünü və lipid peroksidasiyasını azaltması gözlənilərdi. Mənbə DFO-nun bunu əhəmiyyətli dərəcədə etmədiyini bildirir.

Buna görə müəlliflər lipid peroksidasiyasının mövcudluğunu qəbul etməklə yanaşı nəticəni klassik iron-dependent ferroptosis kimi təsnif etmirlər.

Apoptoz ilə lipid peroksidasiyası eyni vaxtda mövcud ola bilərmi?

Bəli. Hüceyrə ölümü mexanizmləri həmişə bir-birindən tam təcrid olunmur. Güclü oksidləşdirici stress lipid membranlarını, DNA-nı, zülal qatlanması sistemlərini və mitoxondrini eyni vaxtda təsirləndirə bilər. Bu tədqiqatın sübut nümunəsi dominant icra mexanizminin apoptoz olduğunu; lipid peroksidasiyasının isə əlavə oksidləşdirici zədə qatını yaratdığını dəstəkləyir.

Bu Tədqiqat İnsanlarda Xərçəng Müalicəsinin Sübutudurmu?

Xeyr. Tədqiqatda insan xərçəng hüceyrə xətləri və siçan melanoma allograft modeli istifadə edilmişdir, lakin insan xəstələrdə N₂/O₂ plazma müalicəsi tətbiq edilməmiş; klinik şiş cavabı, doza, toxuma penetrasiyası, sistemik təhlükəsizlik, orqan toksikliyi və ya uzunmüddətli effektivlik qiymətləndirilməmişdir.

Siçan təcrübəsi necə aparıldı?

Yetkin dişi C57BL/6 siçanları hər qrupda n=9 olmaqla istifadə edilmişdir. 1 × 10⁶ B16F10 siçan melanoma hüceyrəsi soyuq PBS ilə Corning Matrigel-in 1:1 qarışığında hazırlanmış və siçanların flank nahiyəsinə dərialtı olaraq inyeksiya edilmişdir.

Şişlər təxminən 50 mm³-ə çatdıqda siçanlar müalicə qruplarına randomizə edilmişdir. Nəzarət siçanlarına 100 µL PBS, təcrübə qrupuna 100 µL plazma ilə işlənmiş PBS verilmişdir. Tətbiq həftədə beş dəfə, ümumilikdə 15 müalicə olmaqla 21 gün davam etdirilmişdir.

Mənbənin Methods bölməsi bu tətbiqləri “subcutaneous injections” kimi yazır, Abstract və Discussion isə “intratumoral administration” ifadəsini istifadə edir. Mənbə bu terminoloji fərqi izah etmədiyi üçün Verianla tətbiqin dəqiq anatomik mövqeyini bunlardan birini seçərək yenidən müəyyən etmir.

Müalicənin sonunda şişlər çıxarılmış və plazma ilə işlənmiş PBS alan qrupda şiş ölçüsü nəzarətlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə aşağı olmuşdur.

Lakin tədqiqat normal orqan histopatologiyası, sistemik toksiklik və ya normal-toxuma/şiş seçiciliyini in vivo müqayisə etməmişdir. Bundan əlavə, tətbiqin lokal olması səbəbindən sistemik məruzqalma məhduddur.

Allograft ilə xenograft arasındakı fərq nədir?

Syngeneic allograft, eyni növdən və genetik baxımdan uyğun heyvanla şiş hüceyrəsinin istifadə edildiyi şiş modelidir. Bu tədqiqatda B16F10 siçan melanoma hüceyrəsi, C57BL/6 isə siçan olduğuna görə Methods bölməsi sistemi syngeneic murine melanoma/allograft kimi müəyyən edir.

Xenograft isə müxtəlif növlər arasında köçürülən hüceyrə və ya toxumanı ifadə edir; məsələn, insan şiş hüceyrəsinin siçana verilməsi. Figure 1F izahında B16F10/C57BL/6 təcrübəsinə “xenograft” deyilməsi Methods tərifi ilə uyğun deyil. Article in Press versiyasındakı bu terminoloji uyğunsuzluq Verianla tərəfindən səssizcə düzəldilməmişdir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Plazma istehsal sisteminin texniki parametrləri

Tədqiqatda istifadə olunan hüceyrə modelləri

Hüceyrə kulturası şərtləri

Bütün hüceyrələr DMEM mühitində %10 fetal bovine serum və %1 penicillin-streptomycin ilə, 37 °C-də və nəmləndirilmiş %5 CO₂ inkubatorda yetişdirilmişdir.

MTT canlılıq testi

Hüceyrə canlılığı Cell Proliferation Kit I MTT üsulu ilə qiymətləndirilmişdir. Hüceyrələr 96-well plate-lərə 1 × 10⁴ hüceyrə/well olmaqla əkilmiş və absorbans SpectraMax 190 microplate reader ilə 570 nm-də ölçülmüşdür.

MTT metabolik aktivliyə əsaslanan nisbi hüceyrə canlılığı göstəricisidir. Buna görə MTT siqnalının azalması təkbaşına hansı hüceyrə ölümü formasının baş verdiyini müəyyən etmir. Mənbə buna görə əlavə olaraq Annexin V/PI, caspase/PARP və digər mexanistik təcrübələrdən istifadə etmişdir.

Annexin V və propidium iodide nəyi ayırır?

Annexin V apoptoz zamanı hüceyrə membranının xarici səthinə daşınan phosphatidylserine bağlanır. Propidium iodide (PI) isə membran bütövlüyünü itirmiş hüceyrələrə daxil olaraq DNA-nı boyayır.

Mənbə hər nümunə üçün 10.000-dən çox hüceyrəni analiz etmiş və BD FACSAria III Cell Sorter ilə BD FACSDiva v8.0.3 istifadə etmişdir.

Article in Press Figure 2A-nın əsas mətni HEC1A-da aydın apoptotik artım, ilkin fibroblastlarda isə eyni trendin olmadığını bildirir və FACS paneli bu izahla uyğundur. Buna qarşı sağdakı xülasə bar qrafikinin görünən legend/dolğu uyğunluğu mətnlə tam uyğun görünmür. Buna görə Verianla Figure 2A-dan yeni dəqiq faiz dəyərləri çıxarmır.

Apoptozla əlaqəli genlərdə nə dəyişdi?

B16F10 hüceyrələrində N₂/O₂ plazmasından sonra pro-apoptotik Bax və Bak1 mRNA-ları yüksəlmişdir. Anti-apoptotik Bcl-2 və Bcl-xl azalmışdır. Figure 2B həmçinin Bcl-w səviyyəsində də aydın azalma göstərir.

Mənbə bu bölmədə xüsusilə mRNA səviyyələrini qiymətləndirdiyini və bu gen dəyişikliklərinin zülal səviyyəsində ayrıca təsdiqlənməsinin lazım olduğunu bildirir.

qRT-PCR və ΔΔCt üsulu

RNA RNeasy Plus Mini Kit ilə çıxarılmış, Nano-400A ilə ölçülmüş, AccuPower RT PreMix ilə cDNA-ya çevrilmiş və AriaMx Real-Time PCR System üzərində SYBR Green əsaslı qPCR aparılmışdır. GAPDH housekeeping gene kimi istifadə edilmişdir.

Mənbə gen ekspressiyasını ΔΔCt üsulu ilə analiz etdiyini bildirir. Mənbə tənlikləri ayrıca yazmadığı üçün aşağıdakı riyaziyyat üsulun öyrədici standart açılımıdır; tədqiqatın yeni tənliyi deyil:

\(\Delta Ct = Ct_{\mathrm{hedef}} - Ct_{\mathrm{referans}}\)

\(\Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{\mathrm{işlem}} - \Delta Ct_{\mathrm{kontrol}}\)

\(\mathrm{Göreli\ ekspresyon} = 2^{-\Delta\Delta Ct}\)

Formula nəyi hesablayır? Hədəf gen mRNA-sının housekeeping gene-ə normallaşdırılmış səviyyəsinin nəzarət şərtinə görə nisbi dəyişməsini.

Ct nədir? qPCR floresans siqnalının müəyyən edilmiş həddi keçdiyi cycle sayıdır.

ΔCt nə edir? Hədəf geni eyni nümunədəki istinad geninə normallaşdırır.

ΔΔCt nə edir? Normallaşdırılmış işləmə qrupunu normallaşdırılmış nəzarət qrupu ilə müqayisə edir.

2^−ΔΔCt nə verir? Ölçüsüz nisbi qat dəyişməsini.

Şərh sərhədi: Mənbə xam Ct dəyərlərini cədvəl şəklində vermədiyi üçün Verianla yeni fold-change dəyərləri hesablamır.

Mənbədə verilən qPCR primerləri

Western blot analizi

Hüceyrələr RIPA buffer ilə parçalanmış, 15.000 × g-də 5 dəqiqə sentrifuqalanmış və zülallar 5-20% gradient və ya %15 SDS-PAGE gellərində ayrılmışdır. Nitrocellulose membranlara köçürüldükdən sonra γH2AX, BIP, CHOP, PARP, caspase-3, p53 və phospho-p53(Ser15) anticisimləri istifadə edilmişdir.

Mənbə anticisim durulaşdırılmasını mətndə “1:2-3000” formasında çap edir. İfadə erkən-versiya mətnində tipoqrafik baxımdan qeyri-müəyyəndir; Verianla bunu səssizcə 1:2000 və ya 1:3000 kimi yeni dəyərə çevirmir.

RNA-seq necə aparıldı?

B16F10 hüceyrələrindən total RNA RNeasy Mini Kit ilə çıxarılmış; keyfiyyət Agilent 2100 Bioanalyzer və RNA 6000 Nano LabChip ilə yoxlanmışdır. Bütün nümunələrdə RNA integrity number (RIN) >9 olaraq bildirilmişdir.

Poly(A)+ mRNA TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit ilə ayrılmış və parçalanmış; sekvensləmə Illumina NovaSeq 6000 platformasında Macrogen tərəfindən həyata keçirilmişdir.

Methods hər şərt üçün üç bioloji təkrar istifadə edildiyini bildirir. Buna qarşı əsas Article in Press Figure 4D heatmap-də görünən sətirlər Control #1, Control #2, N₂/O₂ Plasma #1 və N₂/O₂ Plasma #2 şəklindədir. Mənbə üçüncü təkrarın heatmap-də niyə görünmədiyini izah etmir.

Diferensial gen meyarı necə müəyyən edildi?

Hər gen üçün Student's t-test tətbiq edilmiş və sample label permutation istifadə edilərək T-statistic üçün empirical null distributions yaradılmışdır.

Genin differentially expressed gene (DEG) hesab olunması üçün iki şərt birlikdə tələb olunmuşdur:

Adjusted p-value ≤ 0.05

və

|log₂(fold change)| > 0.428

Mənbə 0.428 həddinin təxminən 1.35-fold dəyişikliyə uyğun gəldiyini və null log₂ fold-change paylanmasının 0.5. və 99.5. persentillərinin ortalamasına əsaslandığını bildirir.

log₂(fold-change) nəyi ifadə edir?

Fold-change genin işləmə qrupunda nəzarətlə müqayisədə nə qədər dəyişdiyini ifadə edir. Log₂ çevrilməsi artım və azalmaları simmetrik miqyasa keçirir. Müsbət log₂ fold-change artımı, mənfi dəyər isə azalmanı göstərir.

−log₁₀(P) niyə volcano plot-da istifadə olunur?

Figure 4C-nin y oxu \(-\log_{10}(P)\) çevrilməsindən istifadə edir. P kiçildikcə −log₁₀(P) böyüyür; buna görə statistik baxımdan daha kiçik P dəyərləri qrafikdə daha yuxarı görünür. Bu çevrilmə yeni bioloji kəmiyyət yaratmır, yalnız P dəyərlərini qrafikdə oxunaqlı edir.

RNA-seq-in əsas görünən nəticəsi

Pathway enrichment analizləri apoptosis, oxidative stress response və reactive oxygen species response kimi prosesləri önə çıxarmışdır. Ferroptosis də enrichment nəticələrində görünmüşdür; lakin təkcə gen-set zənginləşməsi hüceyrənin ferroptozla öldüyünü sübut etmir. Buna görə mənbə funksional sorafenib, ferrostatin-1, lipid-peroksidasiyası və DFO təcrübələrini ayrıca aparmışdır.

Holotomography əsaslı canlı hüceyrə görüntülənməsi

Hüceyrələr TomoDish daxilində təxminən %60 confluency-yə çatdıqda kultura mühiti plasma-treated medium ilə əvəz edilmiş və bir saat inkubasiya edilmişdir. Daha sonra mühit Liperfluo və ya JC-1 tərkibli HBSS ilə əvəz edilmişdir.

Lipid peroxidation üçün 1 µmol/L Liperfluo; mitochondrial membrane potential üçün mənbədə 1 mM olaraq yazılan JC-1 istifadə edilmişdir. 30 dəqiqəlik boyamadan sonra hüceyrələr Tomocube HT-2H mikroskopunda refractive-index əsaslı holotomography ilə görüntülənmişdir. Floresans intensivlikləri ImageJ2 ilə kəmiyyətləşdirilmişdir.

Statistik analiz

Məlumatlar ən azı üç müstəqil təcrübədən əldə edilmiş və orta ± standart xəta (mean ± SEM) kimi verilmişdir. İki qrup müqayisələrində two-tailed Student's t-test, çoxsaylı qrup müqayisələrində one-way ANOVA və Tukey post-hoc test istifadə edilmişdir.

Statistik əhəmiyyətlilik həddi P<0.05-dir. İşarələmə sistemi *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 və N.S.=not significant formasındadır.

Figure 1-in əsas tapıntısı

Plazma çıxışı artdıqca Griess-əsaslı NO/RNS siqnalı yüksəlmişdir. HEC1A hüceyrə canlılığı plazma dozası ilə azalarkən normal ilkin fibroblastlar mənbənin şərhində nisbi olaraq qorunmuşdur. c-PTIO-nun H1299 hüceyrələrində canlılığı bərpa etməsi reaktiv azot növlərinin töhfəsini dəstəkləmişdir.

B16F10/C57BL/6 siçan təcrübəsində plazma ilə işlənmiş PBS alan qrupda şiş ölçüsü nəzarətlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır. Xam məlumat cədvəli verilmədiyi üçün Verianla qrafikdən yeni dəqiq şiş həcmi dəyərləri yaratmır.

Figure 2-nin əsas tapıntısı

Annexin V/PI paylanması N₂/O₂ plazmasından sonra HEC1A hüceyrələrində apoptotik populyasiyanın artması ilə uyğundur. B16F10 qPCR nəticələrində Bax və Bak1 yüksəlmiş, Bcl-2, Bcl-xl və Figure 2B-də Bcl-w azalmışdır.

Figure 3-ün əsas tapıntısı

ROS siqnalı 0, 2, 4 və 8 saatlıq zaman nöqtələrində ümumilikdə yüksələn nümunə göstərmişdir. GSH canlılığı dozadan asılı şəkildə bərpa etmişdir. γH2AX, phospho-p53(Ser15), BIP və CHOP artımı; PARP və caspase-3 parçalanması; JC-1 qırmızı/yaşıl nisbətinin azalması birlikdə DNA zədəsi, ER stresi, mitoxondri disfunksiyası və apoptotik icra mexanizmini dəstəkləyir.

Figure 4-ün əsas tapıntısı

Transcriptome analizi apoptosis və oxidative-stress ilə əlaqəli gen proqramlarını təsdiqləmiş; ferroptosis-associated genlərdə də dəyişiklik göstərmişdir. Sorafenib plazma sitotoksikliyini artırarkən ferrostatin-1 qismən rescue təmin etmişdir. HeLa hüceyrələrində Liperfluo siqnalı lipid peroxidation artımını göstərmişdir.

Supplementary Figure S2 ilə bağlı əsas mətn DFO-nun hüceyrə canlılığını və ya lipid peroxidation-ı əhəmiyyətli şəkildə bərpa etmədiyini bildirir. Supplementary PDF istifadəçi tərəfindən ayrıca təqdim edilmədiyi üçün Verianla bu təcrübənin xam qrafik dəyərlərini yaratmır.

Mexanizmin Verianla üçün müstəqil yenidən qurulması

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• N₂/O₂ plazması ilə işlənmiş mühit araşdırılan xərçəng hüceyrələrində canlılığı azaltmışdır.
• İnsan ilkin fibroblastları in vitro müqayisədə xərçəng hüceyrələrindən daha az təsirlənmişdir.
• c-PTIO nəticəsi reaktiv azot növlərinin sitotoksik təsirə töhfəsini dəstəkləyir.
• Hüceyrədaxili ROS artmış və GSH hüceyrə canlılığını qismən/dozadan asılı şəkildə bərpa etmişdir.
• Annexin V/PI, caspase-3 və PARP nəticələri apoptozu dəstəkləyir.
• γH2AX və p53 Ser15 fosforilləşməsi DNA damage response aktivləşməsini dəstəkləyir.
• BIP və CHOP artımı ER-stress/proteostatic-stress cavabını dəstəkləyir.
• JC-1 nəticəsi mitoxondri membran potensialının azaldığını göstərir.
• RNA-seq apoptosis və oxidative-stress proqramlarını dəstəkləmişdir.
• Ferrostatin-1-in qismən rescue təsiri və Liperfluo nəticəsi lipid peroxidation-ın hüceyrə ölümünə töhfəsini dəstəkləyir.
• DFO nəticəsinin bərpa təmin etməməsi kanonik iron-dependent ferroptosis şərhinə qarşıdır.
• Plazma ilə işlənmiş PBS siçan B16F10 şiş modelində şiş böyüməsini azaltmışdır.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

• N₂/O₂ plazmasının insan xərçəng xəstələrində effektiv və təhlükəsiz müalicə olduğu göstərilməmişdir.
• Bütün xərçəng növlərinin eyni həssaslığa malik olduğu göstərilməmişdir.
• Bütün normal insan toxumalarının müalicədən qorunacağı göstərilməmişdir.
• İn vivo normal toxuma seçiciliyi və ya geniş sistemik toksiklik sınaqdan keçirilməmişdir.
• Sistemik intravenoz və ya intraperitoneal effektivlik göstərilməmişdir.
• Yaranan bütün ROS və RNS növlərinin kəmiyyət kimyəvi tərkibi müəyyən edilməmişdir.
• Azot mənşəli spesifik reaktiv növlərin nisbi bioloji töhfəsi tam aydınlaşdırılmamışdır.
• Lipid peroxidation nəticəsi canonical ferroptosis sübutu deyil.
• Sorafenib və ferrostatin-1 nəticələri bütün ölüm mexanizminin ferroptoz olduğunu göstərmir.
• Lokal siçan müalicəsi insanlarda toxuma penetrasiyasını və ya klinik dozanı müəyyən etmir.

Tədqiqatın əsas güclü tərəfləri

Tədqiqat tək xərçəng hüceyrə modeli ilə məhdudlaşmamış; müxtəlif toxuma mənşəli endometrial, servikal, melanoma və ağciyər xərçəngi modellərini birlikdə qiymətləndirmişdir. Bu yanaşma N₂/O₂ plazmasına cavabın yalnız bir hüceyrə xəttinə məxsus olmadığını göstərməyə kömək etmişdir.

İkinci güclü tərəf hüceyrə ölümünün yalnız MTT canlılıq azalması ilə qiymətləndirilməməsidir. Annexin V/PI, apoptotik gen ekspressiyası, caspase/PARP parçalanması, DNA damage göstəriciləri, ER-stress göstəriciləri və mitoxondri membran potensialı bir-birini tamamlayan müstəqil sübut qatları yaratmışdır.

Üçüncü güclü tərəf oksidləşdirici stress üçün yalnız ROS artımının göstərilməməsi; GSH ilə rescue müdaxiləsinin aparılmasıdır. Beləliklə ROS ilə sitotoksiklik arasındakı funksional əlaqə gücləndirilmişdir.

Dördüncü güclü tərəf ferroptoz şərhinin yalnız ferroptosis-related gene set nəticəsinə buraxılmamasıdır. Sorafenib, ferrostatin-1, Liperfluo və DFO təcrübələri istifadə edilərək lipid peroxidation ilə canonical ferroptosis bir-birindən ayrılmışdır.

Beşinci güclü tərəf hüceyrə kulturası nəticələrinin B16F10/C57BL/6 siçan modeli ilə in vivo şiş böyüməsi səviyyəsində əlavə olaraq sınaqdan keçirilməsidir.

Tədqiqatın əsas məhdudiyyətləri

Birinci məhdudiyyət: Normal hüceyrə seçiciliyi in vitro olaraq yalnız insan ilkin fibroblastları ilə qiymətləndirilmişdir. Müxtəlif normal epitel, endotel, immun və ya orqan hüceyrələri sistematik şəkildə müqayisə edilməmişdir.

İkinci məhdudiyyət: İn vivo təcrübə lokal tətbiqə əsaslanır. Normal orqan histopatologiyası və sistemik toksiklik aparılmadığı üçün fizioloji təhlükəsizlik sərhədi müəyyən edilməmişdir.

Üçüncü məhdudiyyət: Reaktiv növlərin bütün spektri xarakterizə edilməmişdir. NO/RNS üçün Griess/c-PTIO və ROS üçün hüceyrə analizi aparılsa da, spesifik nitrogen-derived reactive species-lərin ayrı-ayrı töhfəsi bilinmir.

Dördüncü məhdudiyyət: Mexanistik analizlərin bütün hüceyrə modellərində eyni dərinlikdə təkrarlandığı göstərilməmişdir. Bəzi təcrübələr HEC1A, bəziləri HeLa, B16F10 və ya H1299 üzərində aparılmışdır.

Beşinci məhdudiyyət: Tədqiqat klinik dozalanma, toxuma penetrasiyası, pharmacodynamics və uzunmüddətli təkrar tətbiqləri qiymətləndirməmişdir.

Altıncı məhdudiyyət: Article in Press versiyasında terminoloji/redaktə uyğunsuzluqları mövcuddur: allograft/xenograft, intratumoral/subcutaneous inyeksiya ifadəsi, bəzi Figure 2 legend görünüşü və Methods-heatmap bioloji təkrar görünürlüğü kimi məqamlar final səhifələnmədən əvvəl aydınlaşdırıla bilər.

Yeddinci məhdudiyyət: Supplementary Figure S1/S2 mövcud yüklənmiş əsas PDF-in tam elmi vizual gövdəsində olmadığı üçün əlavə təcrübələrin xam qrafikləri bu Verianla məqaləsində yenidən yaradılmamışdır.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal başlıq: Nitrogen-oxygen plasma induces selective cancer cell death via apoptosis with lipid-peroxidation-associated mechanisms across multiple cancer cell models.

Müəlliflər və sıra: Bum-Ho Bin, Sofia Brito, Sun Ju Park, Ki Bok Yoon, Hyojin Heo, Hantae Jo, Sehyun Chae, Byung Mook Weon, Sung Kweon Cho, Jiyoon Kim.

Bərabər töhfə: Bum-Ho Bin, Sofia Brito və Sung Kweon Cho.

Məsul müəllif: Jiyoon Kim.

Qurum 1: Department of Biological Sciences, Ajou University, Suwon, Republic of Korea.

Qurum 2: The Anti-Aging Lab, Co. Ltd., Suwon, Republic of Korea.

Qurum 3: Department of Pharmacology, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Republic of Korea.

Qurum 4: Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB), Daejeon, Republic of Korea.

Qurum 5 üçün mənbə fərqi: Article in Press PDF Hantae Jo üçün Department of Neurosurgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul qeydini verir. Cari Nature biblioqrafik səhifəsi isə Department of Nuclear Medicine, Yonsei University College of Medicine, Seoul qeydini göstərir. Bu fərq erkən giriş versiyası ilə cari nəşr metadata-sı arasında açıq şəkildə qorunmuşdur.

Qurum 6: Department of Smart Health Science and Technology, Kangwon National University, Chuncheon, Republic of Korea.

Qurum 7: Department of Biotechnology and Bioengineering, College of ACE, Kangwon National University, Chuncheon, Republic of Korea.

Qurum 8: School of Advanced Materials Science and Engineering, Sungkyunkwan University, Suwon, South Korea.

Qurum 9: Department of Pharmacology, Ajou University School of Medicine, Suwon, South Korea.

Qurum 10: Department of Medical Sciences, Graduate School, The Catholic University of Korea, Seoul, South Korea.

Qurum 11: Institute for Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, South Korea.

Jurnal: Scientific Reports.

Nəşriyyat: Nature Portfolio / Springer Nature.

DOI: 10.1038/s41598-026-59131-4.

Alınma tarixi: 9 may 2025.

Qəbul tarixi: 18 iyun 2026.

Onlayn nəşr tarixi: 6 iyul 2026.

Mənbə növü və peer-review statusu: Peer review-dan keçmiş və qəbul edilmiş Scientific Reports tədqiqat məqaləsi; mövcud yüklənmiş PDF və cari Nature səhifəsi Article in Press/unedited early-access versiyası kimi işarələnmişdir.

Version of Record statusu: Mövcud rəsmi səhifə bu versiyanın son redaktə proseslərindən sonra avtomatik olaraq final Version of Record ilə əvəz olunacağını bildirir; buna görə mövcud PDF final VOR kimi işarələnməmişdir.

Cild / nömrə / məqalə nömrəsi: Mövcud Article in Press PDF və rəsmi erkən giriş biblioqrafik görünüşündə yekun məqalə nömrəsi açıq şəkildə verilmir; Verianla bu sahəni təxmin etməmişdir.

Lisenziya: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Tədqiqat növü: İn vitro hüceyrə kulturası + molekulyar mexanizm + transcriptomics + in vivo syngeneic murine melanoma şiş modeli.

Əsas hüceyrə modelləri: HEC1A, HeLa, B16F10, H1299 və human primary fibroblasts.

Əsas plazma cihazı: TGT, Daejeon, Korea tərəfindən təmin edilən custom-built iki paralel elektrodlu plazma jet sistemi; bir elektrod keramika dielektriklə örtülüb; 5 kW və 30 kHz high-voltage power supply; circulating water cooling.

Qaz parametrləri: N₂ 10 cc/min, O₂ 5 cc/min; 135.200 mm³ mixing chamber; mənbə eyni cümlədə 225 V dəyərini verir, lakin bu dəyərin yüksək gərginlik mənbəyi parametrləri ilə əlaqəsini ayrıca izah etmir.

RNS ölçümü: Nitrite Assay Kit / Griess Reagent; absorbans 540 nm, SpectraMax 190.

Standart in vitro plazma tətbiqi: Culture medium 10 dəqiqə plazma ilə işlənir; hüceyrələr əsasən 24 saat işləməyə məruz qalır. Figure 1-də 0, 5 və 10 dəqiqəlik plazma işləmə şərtləri ayrıca mövcuddur.

Siçan modeli: Dişi C57BL/6, n=9/qrup; 1 × 10⁶ B16F10 hüceyrəsi; PBS:Matrigel 1:1; flank subcutaneous tumor establishment; təxminən 50 mm³-də randomizasiya.

Siçan müalicəsi: 100 µL PBS və ya plasma-treated PBS; həftədə beş dəfə, ümumilikdə 15 tətbiq, 21 gün.

İnyeksiya terminologiyası qeydi: Methods “subcutaneous injections”, Abstract və Discussion isə “intratumoral administration” ifadəsini istifadə edir. Mənbə fərqi qorunmuşdur.

Şiş modeli terminologiyası qeydi: Methods B16F10/C57BL/6 sistemini syngeneic murine melanoma/allograft kimi müəyyən edir; Figure 1F caption “xenograft” sözünü istifadə edir. Bioloji model quruluşu allograft tərifi ilə uyğundur, lakin Verianla mənbə mətnindəki uyğunsuzluğu gizlətmir.

Heyvan etik təsdiqi: Semyung University Institutional Animal Care and Use Committee, Approval No. smecae 22-08-02; ARRIVE guidelines.

MTT: 1 × 10⁴ hüceyrə/well, 96-well plate, absorbans 570 nm.

FACS: >10.000 hüceyrə; Annexin V-FITC/PI apoptosis detection; BD FACSAria III; BD FACSDiva v8.0.3.

Lipid-peroksidasiyası FACS: 1 µmol/L Liperfluo, 1 saat.

qRT-PCR: RNeasy Plus Mini Kit, AccuPower RT PreMix, SYBR Green, AriaMx Real-Time PCR System; GAPDH istinad; ΔΔCt üsulu.

Western blot hədəfləri: γH2AX, BIP, CHOP, PARP, caspase-3, p53 və phospho-p53(Ser15).

RNA-seq: RIN >9; Poly(A)+ mRNA; TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit; Illumina NovaSeq 6000; Macrogen; mənbə Methods hər şərt üçün üç bioloji təkrar bildirir.

DEG meyarları: adjusted p≤0.05 və |log₂ fold-change|>0.428; mənbə bunu təxminən 1.35-fold həddi kimi müəyyən edir.

Holotomography: Tomocube HT-2H; TomoStudio; ImageJ2; 1 µmol/L Liperfluo və ya mənbədə 1 mM olaraq çap edilmiş JC-1.

Ferroptoz modulyatorları: Sorafenib 1 µM; ferrostatin-1 10 µM; DFO konsentrasiyası əsas PDF-in müvafiq əsas mətnində dəqiq verilməmişdir və Verianla tərəfindən uydurulmamışdır.

Statistika: Ən azı üç müstəqil təcrübə; mean±SEM; two-tailed Student's t-test və ya one-way ANOVA + Tukey post-hoc; P<0.05.

Əsas ölüm mexanizmi: Apoptoz; oxidative-stress-associated lipid peroxidation əlavə töhfə verir.

Ferroptoz sərhədi: Kanonik iron-dependent ferroptosis dəstəklənmir; DFO rescue təmin etməmiş, Slc7a11/Slc7a5 yüksəlmiş və Acsl4 azalmışdır.

Data availability: Raw və processed RNA-seq məlumatları GEO GSE231561 altında saxlanılmışdır.

Maliyyələşdirmə: Ajou University Research Fund; National Research Foundation of Korea Basic Science Research Program, RS-2021-NR060141 və RS-2024-00405790; Korea Health Technology R&D Project/KHIDI, RS-2025-25459560.

Müəllif töhfələri: Sofia Brito və Bum-Ho Bin tədqiqatı layihələndirmişdir. Hyojin Heo, Ki Bok Yoon, Hantae Jo və Sehyun Chae tədqiqat və məlumat toplama işlərini aparmışdır. Sofia Brito, Sun Ju Park və Sung Kweon Cho formal analysis və visualization həyata keçirmişdir. Byung Mook Weon metodologiya və texniki resurs dəstəyi vermişdir. Jiyoon Kim və Bum-Ho Bin resurs təminatı, supervision və şərh vəzifələrini üzərlərinə götürmüşdür. Sofia Brito və Bum-Ho Bin ilkin layihəni yazmış; Sun Ju Park, Sung Kweon Cho və Jiyoon Kim mətni nəzərdən keçirib redaktə etmişdir.

Maraqlar toqquşması: Müəlliflər competing interests olmadığını bildirmişdir.

Supplementary-material sərhədi: Əsas PDF Figure S1 və Figure S2-yə istinad edir. İstifadəçi tərəfindən ayrıca supplementary fayl verilmədiyi üçün bu Verianla versiyası yalnız əsas PDF-in bu əlavə təcrübələr haqqında açıq şəkildə bildirdiyi nəticələrdən istifadə edir; əlavə şəkillərdən görünməyən yeni rəqəm çıxarmır.

Figure 2 erkən-versiya qeydi: Figure 2A-nın əsas mətni və FACS panelləri xərçəng hüceyrəsində daha güclü apoptosis şərhini dəstəkləsə də, bar-graph legend/dolğu görünüşü Article in Press çapında mətnlə tam uyğun görünmür. Buna görə dəqiq faiz dəyərləri yenidən yaradılmamışdır.

RNA-seq təkrar qeydi: Methods hər şərt üçün üç bioloji təkrar bildirsə də, Figure 4D heatmap görünən şəkildə iki control və iki plasma sətri göstərir. Mənbə bu fərqi izah etmir.

Klinik sərhəd: İnsanlarda müalicə sınaqdan keçirilməmişdir. İn vivo məlumat lokal B16F10/C57BL/6 siçan modelinə aiddir; systemic exposure, organ toxicity, normal-tissue histopathology və human therapeutic efficacy göstərilməmişdir.