Plasma ya nitrojeni-oksijeni (N₂/O₂ plasma), ni mbinu ya kimwili ya plasma inayolenga kuzalisha aina tendaji za oksijeni na nitrojeni kwa kutengeneza plasma ya umeme kutoka katika mtiririko unaodhibitiwa wa gesi ya nitrojeni na oksijeni. Utafiti huu ulichunguza athari za mazingira yaliyotibiwa kwa plasma ya N₂/O₂ katika modeli za adenokasinoma ya endometriamu HEC1A, kansa ya shingo ya kizazi HeLa, melanoma ya panya B16F10 na kansa ya mapafu ya binadamu isiyo ya seli ndogo H1299; kwa kutumia human primary fibroblasts kama udhibiti wa kawaida na pia modeli ya uvimbe ya panya B16F10/C57BL/6. Hitimisho kuu la chanzo ni kwamba plasma ya N₂/O₂ huongeza msongo wa oksidishaji katika modeli za kansa zilizochunguzwa na hasa huanzisha apoptosis, huku ikifuatana na uharibifu wa oksidishaji wa utando unaohusishwa na lipid peroxidation.

Katika majaribio ya in vitro, seli hazikuwekwa moja kwa moja chini ya mkondo wa plasma. Chanzo kinaeleza kuwa medium ya culture ilitibiwa kwa plasma kisha ikatumika kwa seli. Katika mbinu ya kawaida, culture medium ilitibiwa kwa plasma ya N₂/O₂ kwa dakika 10 na seli ziliinkubatiwa katika medium hiyo kwa saa 24; katika baadhi ya figures, matibabu ya plasma ya dakika 0, 5 au 10 na muda tofauti wa incubation pia yalitumika.

Katika seli za HEC1A, uhai wa seli ulipungua kadiri kiwango cha plasma kilivyoongezeka, ilhali upungufu huo ulio wazi haukuonekana katika human primary fibroblasts. Katika seli za H1299, 1 µM carboxy-PTIO iliyotumika kupunguza athari za aina tendaji za nitrojeni ilipunguza athari ya cytotoxic ya plasma ya N₂/O₂. Hata hivyo, utafiti ulifanya ulinganisho na aina moja tu maalum ya seli ya kawaida; matokeo hayamaanishi kwamba tishu zote za kawaida hustahimili plasma au kwamba mbinu hii ni salama kwa binadamu.

Apoptosis iliungwa mkono na Annexin V/propidium iodide flow cytometry, kuongezeka kwa jeni pro-apoptotic Bax na Bak1, kupungua kwa anti-apoptotic Bcl-2, Bcl-xl na Bcl-w katika Figure 2, cleavage ya PARP na caspase-3, kuongezeka kwa γH2AX, phosphorylation ya p53 Ser15, kuongezeka kwa viashiria vya ER stress BIP na CHOP, na kupotea kwa mitochondrial membrane potential iliyopimwa kwa JC-1.

Reactive oxygen species za ndani ya seli (ROS) ziliongezeka kadiri muda ulivyopita baada ya plasma ya N₂/O₂. Urejeshaji wa uhai wa seli unaotegemea dozi wakati mzigo wa ROS ulipopunguzwa kwa Glutathione (GSH) unaunga mkono kwamba oxidative stress si kiashiria kinachoambatana tu na kifo cha seli bali ni kichocheo muhimu cha upstream. Hata hivyo, utafiti haukutambua moja moja aina zote mahususi za oksijeni na nitrojeni zilizozalishwa, na hasa haukutatua kikamilifu mchango wa jamaa wa aina tendaji zinazotokana na nitrojeni.

RNA-seq na majaribio ya kiutendaji yalionyesha mabadiliko katika jeni zinazohusishwa na ferroptosis na kuongezeka kwa lipid peroxidation. Ferrostatin-1 ilirejesha kwa sehemu uhai wa seli, huku sorafenib ikiimarisha cytotoxicity ya plasma. Kinyume chake, chelator ya chuma deferoxamine haikupunguza kwa kiasi kikubwa kifo cha seli au lipid peroxidation. Slc7a11 na Slc7a5 ziliongezeka huku Acsl4 ikipungua. Kwa hiyo, chanzo hakitafsiri kifo cha seli kama ferroptosis ya kawaida inayotegemea chuma, bali kama cytotoxicity inayohusishwa na oxidative stress na lipid peroxidation inayoambatana na apoptosis inayotawala.

Katika jaribio la panya, ukuaji wa uvimbe ulioundwa kwa seli za melanoma B16F10 katika panya wa kike C57BL/6 ulipungua katika kundi lililopewa PBS iliyotibiwa kwa plasma ikilinganishwa na udhibiti. Hata hivyo, matumizi ya mfumo mzima, histopathology ya kiwango cha organi, ulinganisho wa tishu za kawaida na uchambuzi mpana wa toxicity haukufanywa. Kwa hiyo, utafiti huu hauuthibitishi ufanisi au usalama wa matibabu ya kansa kwa binadamu.

Plasma ni nini?

Plasma ni mazingira ya kimwili ambapo molekuli za gesi hupokea nishati na kuingia katika hali yenye nishati ya juu zaidi iliyo na elektroni, ioni na aina mbalimbali tendaji. Katika tafiti za biomedical plasma, lengo si kuzalisha joto la juu pekee; ni kuunda kwa udhibiti reactive oxygen species (ROS), reactive nitrogen species (RNS), nyuga za umeme na vipengele vingine vya fizikia-kemia vinavyoweza kuingiliana na seli.

Katika mpangilio wa majaribio wa makala hii, nitrojeni na oksijeni hutolewa kupitia mifumo tofauti ya mass-flow controller, huunganishwa katika mixing chamber na kuchakatwa katika chanzo cha plasma cha high voltage. Kwa kuwa chanzo hakiripoti joto la gesi inayotoka au thamani halisi ya shinikizo la anga, Verianla haitengenezi thamani ya joto au shinikizo ambayo haipo katika chanzo kwa kifaa hiki.

Kwa nini nitrojeni na oksijeni zilitumika pamoja?

Sababu ya waandishi ya kufanya utafiti ni kwamba katika mifumo inayotegemea noble gases kama helium au argon, kemia ya aina tendaji inaweza kuwa nyeti kwa kuchanganyika kwa hewa ya mazingira na hali finyu za gesi ya nyongeza; pia noble gases zinaweza kuwa na hasara za gharama na upatikanaji. Mchanganyiko wa N₂/O₂ ulitathminiwa kwa uwezo wake wa kuzalisha kwa pamoja aina tendaji za oksijeni na nitrojeni kutoka gesi zinazopatikana kwa urahisi zaidi na kudhibiti muundo wa kikemia.

Hata hivyo, utafiti haukuonyesha kwa ulinganisho wa moja kwa moja kwamba mchanganyiko wa N₂/O₂ ni bora zaidi, nafuu zaidi au bora kliniki kuliko mchanganyiko wote mbadala wa gesi.

Mpangilio wa plasma unafanyaje kazi?

Reactive oxygen na nitrogen species zinamaanisha nini?

ROS, ni jina la jumla la molekuli na radicals zenye oksijeni na reactivity kubwa. RNS hujumuisha aina tendaji zenye nitrojeni. Molekuli hizi zinaweza kuchangia cellular signaling katika viwango vya chini na vinavyodhibitiwa, lakini zikizalishwa kupita kiasi zinaweza kubadilisha kwa oxidation protini, lipids na nucleic acids.

Chanzo kilitathmini reactive nitrogen species kwa Nitrite Assay Kit inayotegemea Griess Reagent na kupima absorbance katika 540 nm. Figure 1 inawasilisha hii kama “nitric oxide concentration”. Kwa hiyo, Verianla haitafsiri kipimo hiki moja kwa moja kama quantitative chemical profile ya aina zote mahususi za RNS.

Plasma ya Nitrojeni-Oksijeni Inauaje Seli za Kansa?

Mechanism kuu inayoungwa mkono na utafiti ni kwamba aina tendaji zinazozalishwa na plasma ya N₂/O₂ huvuruga cellular redox balance; jambo hili husababisha kuongezeka kwa ROS, DNA damage, ER stress, kupotea kwa mitochondrial membrane potential na uharibifu wa membrane unaohusishwa na lipid peroxidation, na njia hizi za stress hukutana hasa katika caspase-dependent apoptotic cell death.

Jaribio la c-PTIO linaonyesha nini?

Carboxy-PTIO ni scavenger iliyotumika katika utafiti kupunguza athari za aina tendaji zinazohusiana na NO. Katika seli za H1299, 1 µM c-PTIO ilipunguza upotevu wa uhai wa seli unaoonekana kwa plasma ya N₂/O₂. Matokeo haya yanaunga mkono kwamba reactive nitrogen species zinazotokana na gesi zina jukumu katika athari ya kibiolojia.

Hata hivyo, uingiliaji wa c-PTIO hauonyeshi hitimisho kwamba “cytotoxicity yote husababishwa na NO pekee”. Majaribio ya baadaye ya utafiti yanaonyesha kwamba ROS za ndani ya seli pia zina jukumu kuu.

Kwa nini ROS inachukuliwa kuwa kichocheo cha upstream?

Katika seli za HEC1A, signal ya fluorescence ya ROS iliongezeka kadiri muda ulivyopita baada ya plasma ya N₂/O₂. Kwa kuwa correlation hii pekee haitoshi kwa mechanism, watafiti waliingilia kwa glutathione (GSH). Katika Figure 3B, uhai wa seli uliongezeka kwa kutegemea dozi wakati 10 na 100 µM GSH zilitumika.

Iwapo inhibition au kuondolewa kwa hatua ya kati ya kibiolojia kunapunguza matokeo ya downstream, hilo linaunga mkono jukumu la kiutendaji la hatua hiyo katika mechanism. Kwa hiyo, matokeo ya GSH yanaonyesha kwamba ROS si kiashiria kinachoambatana tu na kifo cha seli bali ni factor ya upstream inayochangia cytotoxicity.

γH2AX inaonyesha nini?

H2AX ni histone protein inayoweza kufosforilishwa katika DNA damage response. Umbo lake lililofosforilishwa, γH2AX, ni kiashiria kinachotumika sana hasa kwa DNA breaks na activation ya DNA damage response. Kuongezeka kwa γH2AX baada ya plasma ya N₂/O₂ kuliunga mkono kwamba DNA damage response imeamilishwa katika seli.

Kwa nini phosphorylation ya p53 Ser15 ilipimwa?

p53 ni tumor suppressor protein inayoshiriki katika kusimamia kusimama kwa cell cycle au apoptotic response chini ya DNA damage na cellular stress. Phosphorylation katika eneo la Ser15 ni mojawapo ya viashiria vya activation vinavyohusishwa na DNA damage response. Katika utafiti, phosphorylation ya p53 Ser15 iliongezeka na, pamoja na matokeo ya γH2AX, iliunga mkono DNA damage/stress response.

BIP na CHOP zinaonyesha nini?

BIP, ni mojawapo ya chaperones zinazohusishwa na mzigo wa protein folding katika endoplasmic reticulum na unfolded protein response. CHOP ni stress-response transcription factor inayoweza kuchangia apoptotic program wakati wa ER stress ya muda mrefu au kali. Kuongezeka kwa protini zote mbili ni mojawapo ya matokeo yanayounga mkono kwamba plasma ya N₂/O₂ imevuruga ER proteostasis.

Kwa nini cleavage ya PARP na caspase-3 ni muhimu?

Caspase-3 ni mojawapo ya executioner caspases za apoptosis. Caspase-3 iliyoamilishwa hukata malengo mengi ya seli; PARP ni mojawapo ya malengo hayo. Kuonekana kwa cleaved caspase-3 na cleaved PARP ni ushahidi wa kibiokemia unaounga mkono kwamba seli haiko tu chini ya stress bali apoptotic execution mechanism imeamilishwa.

Mitochondrial membrane potential ilipimwaje?

Katika seli za HeLa, JC-1 fluorescent dye na live-cell imaging inayotegemea holotomography zilitumika. Katika mitochondria zenye afya na polarized, JC-1 hutengeneza signal zaidi ya red aggregate, wakati membrane potential inaposhuka green monomer signal huongezeka.

Baada ya plasma ya N₂/O₂, uwiano wa fluorescence nyekundu/kijani ulipungua na uwiano wa jamaa wa JC-1 monomers ukaongezeka. Matokeo haya yanaunga mkono mitochondrial depolarization na kuanzishwa kwa intrinsic apoptotic pathway.

Katika sehemu ya Methods, concentration ya JC-1 imechapishwa kama 1 mM. Thamani hii haijabadilishwa kimya kimya na Verianla kwenda kitengo kingine; imehifadhiwa jinsi ilivyoandikwa katika chanzo.

Je, Lipid Peroxidation Katika Utafiti Huu Ni Ushahidi wa Ferroptosis?

Hapana. Lipid peroxidation iliongezeka na ferrostatin-1 ilipunguza kwa sehemu kifo cha seli; lakini iron chelation haikuokoa matokeo, na pia kuongezeka kwa Slc7a11/Slc7a5 na kupungua kwa Acsl4 kulielekea zaidi kwenye protective redox adaptation kuliko canonical ferroptosis. Hitimisho la chanzo si classical iron-dependent ferroptosis, bali oxidative cytotoxicity inayohusiana na lipid peroxidation inayoambatana na apoptosis.

Ferroptosis ni nini?

Ferroptosis ni aina ya regulated cell death ambayo iron-dependent lipid peroxidation ndiyo sifa yake ya msingi. Ina sifa za molekuli na morphology tofauti na apoptosis. Kwa hiyo, kuongezeka kwa lipid peroxidation katika seli peke yake hakutoshi kutambua ferroptosis.

Kwa nini RNA-seq iliibua uwezekano wa ferroptosis?

Transcriptomic profiling katika seli za B16F10 ilionyesha mabadiliko katika gene sets zinazohusishwa na ferroptosis pamoja na apoptotic signaling pathways na oxidative stress responses. Katika volcano plot, chanzo kinaonyesha kwamba jeni 335 zilikuwa significantly upregulated na jeni 206 downregulated.

Miongoni mwa jeni teule zinazohusishwa na ferroptosis, Slc7a11 na Slc7a5 ziliongezeka huku Acsl4 ikipungua. Waandishi wanaeleza hasa kwamba pattern hii inaashiria redox-regulatory na anti-ferroptotic adaptation dhidi ya oxidative load zaidi kuliko progression hai ya canonical ferroptosis.

Kwa nini Slc7a11 ni muhimu?

Slc7a11 ni mojawapo ya vipengele muhimu vya mfumo wa cystine/glutamate antiporter na huchangia kuingiza cystine inayohitajika kwa synthesis ya glutathione ya seli. Kuongezeka kwake kunaweza kuendana na stress-adaptation response ambapo seli hujaribu kudumisha antioxidant capacity ili kubuffer oxidative load.

Kwa nini Acsl4 ni muhimu?

ACSL4 ni enzyme inayoshiriki katika kuingiza polyunsaturated fatty acids kwenye membrane lipids na imehusishwa na ferroptosis sensitivity katika modeli nyingi za ferroptosis. Katika utafiti, kupungua kwa Acsl4 mRNA ni mojawapo ya vipengele vinavyounga mkono tafsiri ya protective/anti-ferroptotic adaptation badala ya canonical ferroptosis.

Majaribio ya sorafenib na ferrostatin-1 yanaonyesha nini?

Chanzo kilitumia sorafenib kama modulator inayochochea ferroptosis katika jaribio hili. Wakati 1 µM sorafenib ilipotumika pamoja na plasma ya N₂/O₂, cytotoxicity katika seli za B16F10 iliongezeka.

10 µM ferrostatin-1 ilirejesha kwa sehemu uhai wa seli uliopunguzwa na plasma ya N₂/O₂. Kwa kuwa ferrostatin-1 ni ferroptosis inhibitor inayozuia lipid peroxidation, matokeo haya yanaunga mkono kwamba lipid peroxidation inachangia mzigo wa kifo cha seli.

Hata hivyo, “partial rescue” pia inaonyesha kwamba athari zote za plasma hazitokei kupitia ferroptosis.

Kwa nini jaribio la Deferoxamine ni muhimu?

Deferoxamine (DFO) ni chelator inayofunga chuma. Ikiwa kifo cha seli kilichoonekana kingeelezwa na classical iron-dependent ferroptosis, iron chelation ingetazamiwa kupunguza kifo cha seli na lipid peroxidation. Chanzo kinaripoti kwamba DFO haikufanya hivyo kwa kiasi kikubwa.

Kwa hiyo, waandishi wanakubali kuwepo kwa lipid peroxidation lakini hawaiainishi matokeo kama classical iron-dependent ferroptosis.

Je, apoptosis na lipid peroxidation zinaweza kuwepo wakati mmoja?

Ndiyo. Mechanisms za kifo cha seli si lazima zitenganishwe kabisa kila wakati. Oxidative stress kali inaweza kuathiri kwa wakati mmoja lipid membranes, DNA, mifumo ya protein folding na mitochondria. Pattern ya ushahidi wa utafiti huu inaunga mkono kwamba dominant execution mechanism ni apoptosis; lipid peroxidation huunda tabaka la ziada la oxidative damage.

Je, Utafiti Huu Ni Ushahidi wa Matibabu ya Kansa kwa Binadamu?

Hapana. Utafiti ulitumia human cancer cell lines na mouse melanoma allograft model, lakini matibabu ya plasma ya N₂/O₂ hayakutumika kwa wagonjwa wa binadamu; clinical tumor response, dozi, tissue penetration, systemic safety, organ toxicity au long-term efficacy havikutathminiwa.

Jaribio la panya lilifanywaje?

Panya wa kike C57BL/6 waliokomaa walitumika kwa n=9 katika kila kundi. 1 × 10⁶ seli za melanoma ya panya B16F10 ziliandaliwa katika mchanganyiko wa 1:1 wa PBS baridi na Corning Matrigel na kudungwa subcutaneously katika eneo la flank la panya.

Uvimbe ulipofikia takribani 50 mm³, panya waligawanywa kwa randomization katika makundi ya matibabu. Panya wa udhibiti walipewa 100 µL PBS, na kundi la majaribio likapewa 100 µL PBS iliyotibiwa kwa plasma. Matumizi yaliendelea mara tano kwa wiki, jumla ya matibabu 15, kwa siku 21.

Sehemu ya Methods ya chanzo inaandika matumizi haya kama “subcutaneous injections”, ilhali Abstract na Discussion hutumia “intratumoral administration”. Kwa kuwa chanzo hakielezi tofauti hii ya terminolojia, Verianla haifafanui upya eneo halisi la anatomia la matumizi kwa kuchagua mojawapo.

Mwishoni mwa matibabu, uvimbe ulitolewa na ukubwa wa uvimbe ulikuwa mdogo kwa kiasi kikubwa katika kundi lililopokea PBS iliyotibiwa kwa plasma ikilinganishwa na udhibiti.

Hata hivyo, utafiti haukulinganisha normal-organ histopathology, systemic toxicity au normal-tissue/tumor selectivity in vivo. Pia, kwa sababu matumizi yalikuwa ya eneo maalum, systemic exposure ilikuwa ndogo.

Tofauti kati ya allograft na xenograft ni nini?

Syngeneic allograft, ni modeli ya uvimbe inayotumia mnyama wa spishi hiyo hiyo na anayelingana kijeni pamoja na seli ya uvimbe. Katika utafiti huu B16F10 ni seli ya melanoma ya panya na C57BL/6 pia ni panya, kwa hiyo sehemu ya Methods inaeleza mfumo kama syngeneic murine melanoma/allograft.

Xenograft humaanisha seli au tishu zinazohamishwa kati ya spishi tofauti; kwa mfano, kutoa seli za uvimbe wa binadamu kwa panya. Maelezo ya Figure 1F kuita jaribio la B16F10/C57BL/6 “xenograft” hayalingani na ufafanuzi wa Methods. Tofauti hii ya terminolojia katika toleo la Article in Press haijasahihishwa kimya kimya na Verianla.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Vigezo vya kiufundi vya mfumo wa kuzalisha plasma

Modeli za seli zilizotumika katika utafiti

Hali za culture ya seli

Seli zote zilikuzwa katika medium ya DMEM yenye %10 fetal bovine serum na %1 penicillin-streptomycin, katika 37 °C na incubator yenye unyevunyevu wa %5 CO₂.

Jaribio la uhai la MTT

Uhai wa seli ulitathminiwa kwa mbinu ya Cell Proliferation Kit I MTT. Seli ziliwekwa kwenye 96-well plate kwa 1 × 10⁴ seli/well na absorbance ikapimwa katika 570 nm kwa SpectraMax 190 microplate reader.

MTT ni kiashiria cha uhai wa seli wa jamaa kinachotegemea metabolic activity. Kwa hiyo, kupungua kwa signal ya MTT peke yake hakuamui ni aina gani ya kifo cha seli iliyotokea. Ndiyo maana chanzo pia kilitumia Annexin V/PI, caspase/PARP na majaribio mengine ya mechanism.

Annexin V na propidium iodide zinatenganisha nini?

Annexin V hufunga phosphatidylserine inayohamia kwenye uso wa nje wa cell membrane wakati wa apoptosis. Propidium iodide (PI) huingia kwenye seli zilizopoteza membrane integrity na kuipaka DNA.

Chanzo kilichambua zaidi ya seli 10.000 kwa kila sample na kutumia BD FACSAria III Cell Sorter pamoja na BD FACSDiva v8.0.3.

Main text ya Article in Press Figure 2A inasema kuna ongezeko wazi la apoptosis katika HEC1A lakini trend hiyo hiyo haipo katika primary fibroblasts, na panel ya FACS inaendana na maelezo hayo. Hata hivyo, ulinganifu unaoonekana wa legend/fill wa summary bar graph ya kulia hauonekani kuendana kikamilifu na text. Kwa hiyo, Verianla haitoi percentage values mpya na sahihi kutoka Figure 2A.

Nini kilibadilika katika jeni zinazohusiana na apoptosis?

Katika seli za B16F10 baada ya plasma ya N₂/O₂, pro-apoptotic Bax na Bak1 mRNA ziliongezeka. Anti-apoptotic Bcl-2 na Bcl-xl zilipungua. Figure 2B pia inaonyesha kupungua wazi kwa Bcl-w.

Chanzo kinaeleza kuwa katika sehemu hii kilitathmini hasa viwango vya mRNA na kwamba mabadiliko haya ya jeni yanahitaji kuthibitishwa pia katika kiwango cha protini.

qRT-PCR na mbinu ya ΔΔCt

RNA ilitolewa kwa RNeasy Plus Mini Kit, ikapimwa kwa Nano-400A, ikabadilishwa kuwa cDNA kwa AccuPower RT PreMix, na qPCR ya SYBR Green ikafanywa kwenye AriaMx Real-Time PCR System. GAPDH ilitumika kama housekeeping gene.

Chanzo kinaripoti kuwa gene expression ilichambuliwa kwa mbinu ya ΔΔCt. Kwa kuwa chanzo hakiandiki equations moja moja, mathematics ifuatayo ni standard didactic expansion ya mbinu; si equation mpya ya utafiti:

\(\Delta Ct = Ct_{\mathrm{hedef}} - Ct_{\mathrm{referans}}\)

\(\Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{\mathrm{işlem}} - \Delta Ct_{\mathrm{kontrol}}\)

\(\mathrm{Göreli\ ekspresyon} = 2^{-\Delta\Delta Ct}\)

Formula inahesabu nini? Mabadiliko ya jamaa ya kiwango cha mRNA cha target gene kilichonormalishwa kwa housekeeping gene ikilinganishwa na control condition.

Ct ni nini? Ni idadi ya cycle ambapo qPCR fluorescence signal huvuka threshold iliyowekwa.

ΔCt inafanya nini? Hulinormalisha target gene kwa reference gene katika sample hiyo hiyo.

ΔΔCt inafanya nini? Hulinganisha normalized treatment group na normalized control group.

2^−ΔΔCt inatoa nini? Mabadiliko ya relative fold yasiyo na dimension.

Kikomo cha tafsiri: Kwa kuwa chanzo hakitoi raw Ct values katika table, Verianla haihesabu fold-change values mpya.

qPCR primers zilizotolewa katika chanzo

Uchambuzi wa Western blot

Seli zilivunjwa kwa RIPA buffer, zikacentrifuge katika 15.000 × g kwa dakika 5, na protini zikatenganishwa kwenye gels za 5-20% gradient au %15 SDS-PAGE. Baada ya transfer kwenda kwenye Nitrocellulose membranes, antibodies za γH2AX, BIP, CHOP, PARP, caspase-3, p53 na phospho-p53(Ser15) zilitumika.

Chanzo kinachapisha antibody dilution katika text kama “1:2-3000”. Usemi huu haueleweki vizuri typographically katika early-version text; Verianla haubadilishi kimya kimya kuwa thamani mpya kama 1:2000 au 1:3000.

RNA-seq ilifanywaje?

Total RNA ilitolewa kutoka seli za B16F10 kwa RNeasy Mini Kit; quality ikakaguliwa kwa Agilent 2100 Bioanalyzer na RNA 6000 Nano LabChip. Katika samples zote, RNA integrity number (RIN) iliripotiwa kuwa >9.

Poly(A)+ mRNA ilitenganishwa na kufragmentiwa kwa TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit; sequencing ikafanywa na Macrogen kwenye Illumina NovaSeq 6000 platform.

Methods inaeleza kuwa biological replicates tatu zilitumika kwa kila condition. Hata hivyo, katika main Article in Press Figure 4D heatmap, rows zinazoonekana ni Control #1, Control #2, N₂/O₂ Plasma #1 na N₂/O₂ Plasma #2. Chanzo hakielezi kwa nini replicate ya tatu haionekani kwenye heatmap.

Kigezo cha differential gene kilifafanuliwaje?

Student's t-test ilitumika kwa kila gene na empirical null distributions kwa T-statistic zikatengenezwa kwa sample label permutation.

Ili gene ikubalike kama differentially expressed gene (DEG), conditions mbili zilitakiwa kwa pamoja:

Adjusted p-value ≤ 0.05

na

|log₂(fold change)| > 0.428

Chanzo kinaeleza kuwa cutoff ya 0.428 inalingana na takribani 1.35-fold change na inategemea average ya percentiles za 0.5. na 99.5. za null log₂ fold-change distribution.

log₂(fold-change) inaeleza nini?

Fold-change inaonyesha kiasi ambacho gene imebadilika katika treatment group ikilinganishwa na control. Log₂ transformation huweka ongezeko na upungufu kwenye scale ya symmetric. Positive log₂ fold-change inaonyesha ongezeko, negative value inaonyesha upungufu.

Kwa nini −log₁₀(P) hutumika katika volcano plot?

Y-axis ya Figure 4C inatumia transformation ya \(-\log_{10}(P)\). Kadiri P inavyopungua, −log₁₀(P) huongezeka; kwa hiyo P values ndogo zaidi statistically huonekana juu zaidi kwenye graph. Transformation hii haitengenezi biological quantity mpya, inaifanya tu P values zisomeke kwenye graph.

Matokeo makuu yanayoonekana ya RNA-seq

Pathway enrichment analyses ziliangazia processes kama apoptosis, oxidative stress response na reactive oxygen species response. Ferroptosis pia ilionekana katika enrichment results; lakini gene-set enrichment pekee haithibitishi kuwa seli imekufa kwa ferroptosis. Kwa hiyo chanzo kilifanya pia majaribio ya kiutendaji ya sorafenib, ferrostatin-1, lipid-peroxidation na DFO.

Live-cell imaging inayotegemea Holotomography

Seli zilipofikia takribani %60 confluency ndani ya TomoDish, culture medium ilibadilishwa na plasma-treated medium na kuinkubatiwa kwa saa moja. Kisha medium ikabadilishwa na HBSS yenye Liperfluo au JC-1.

Kwa lipid peroxidation, 1 µmol/L Liperfluo ilitumika; kwa mitochondrial membrane potential, JC-1 iliyoandikwa kama 1 mM katika chanzo ilitumika. Baada ya staining ya dakika 30, seli ziliimagingiwa kwenye Tomocube HT-2H microscope kwa refractive-index-based holotomography. Fluorescence intensities zilifanyiwa quantification kwa ImageJ2.

Uchambuzi wa takwimu

Data zilipatikana kutoka angalau majaribio matatu huru na zilitolewa kama wastani ± standard error (mean ± SEM). Katika comparisons za groups mbili, two-tailed Student's t-test ilitumika; katika comparisons za groups nyingi, one-way ANOVA na Tukey post-hoc test zilitumika.

Threshold ya statistical significance ni P<0.05. Mfumo wa alama ni *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 na N.S.=not significant.

Ugunduzi mkuu wa Figure 1

Kadiri plasma output ilivyoongezeka, Griess-based NO/RNS signal iliongezeka. HEC1A cell viability ilipungua kwa plasma dose, huku normal primary fibroblasts zikihifadhiwa kwa kiasi kulingana na tafsiri ya chanzo. Urejeshaji wa viability na c-PTIO katika H1299 uliunga mkono mchango wa reactive nitrogen species.

Katika jaribio la panya B16F10/C57BL/6, tumor size ilipungua kwa kiasi kikubwa katika group lililopokea plasma-treated PBS ikilinganishwa na control. Kwa kuwa raw data table haikutolewa, Verianla haitengenezi precise tumor-volume values mpya kutoka kwenye graph.

Ugunduzi mkuu wa Figure 2

Mgawanyo wa Annexin V/PI unaendana na kuongezeka kwa apoptotic population katika HEC1A baada ya plasma ya N₂/O₂. Katika B16F10 qPCR results, Bax na Bak1 ziliongezeka, Bcl-2, Bcl-xl na Bcl-w katika Figure 2B zikapungua.

Ugunduzi mkuu wa Figure 3

ROS signal ilionyesha pattern ya kuongezeka kwa jumla katika time points za saa 0, 2, 4 na 8. GSH ilirejesha viability kwa kutegemea dozi. Kuongezeka kwa γH2AX, phospho-p53(Ser15), BIP na CHOP; cleavage ya PARP na caspase-3; na kupungua kwa red/green ratio ya JC-1 kwa pamoja vinaunga mkono DNA damage, ER stress, mitochondrial dysfunction na apoptotic execution mechanism.

Ugunduzi mkuu wa Figure 4

Transcriptome analysis ilithibitisha gene programs zinazohusiana na apoptosis na oxidative-stress; pia ikaonyesha mabadiliko katika ferroptosis-associated genes. Sorafenib iliongeza plasma cytotoxicity huku ferrostatin-1 ikitoa partial rescue. Katika HeLa cells, Liperfluo signal ilionyesha kuongezeka kwa lipid peroxidation.

Main text kuhusu Supplementary Figure S2 inaripoti kwamba DFO haikurejesha kwa kiasi kikubwa cell viability au lipid peroxidation. Kwa kuwa Supplementary PDF haikutolewa kando na mtumiaji, Verianla haitengenezi raw graph values za jaribio hili.

Ujenzi upya huru wa mechanism kwa Verianla

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• Medium iliyotibiwa kwa plasma ya N₂/O₂ ilipunguza viability katika seli za kansa zilizochunguzwa.
• Human primary fibroblasts ziliathiriwa kidogo kuliko seli za kansa katika ulinganisho wa in vitro.
• Matokeo ya c-PTIO yanaunga mkono mchango wa reactive nitrogen species kwenye cytotoxic effect.
• Intracellular ROS iliongezeka na GSH ikarejesha cell viability kwa sehemu/kutegemea dozi.
• Matokeo ya Annexin V/PI, caspase-3 na PARP yanaunga mkono apoptosis.
• γH2AX na phosphorylation ya p53 Ser15 vinaunga mkono activation ya DNA damage response.
• Kuongezeka kwa BIP na CHOP kunaunga mkono ER-stress/proteostatic-stress response.
• Matokeo ya JC-1 yanaonyesha kuwa mitochondrial membrane potential imepungua.
• RNA-seq iliunga mkono apoptosis na oxidative-stress programs.
• Partial rescue ya Ferrostatin-1 na matokeo ya Liperfluo yanaunga mkono mchango wa lipid peroxidation katika cell death.
• Kukosekana kwa rescue kwa DFO kunapingana na tafsiri ya canonical iron-dependent ferroptosis.
• Plasma-treated PBS ilipunguza tumor growth katika mouse B16F10 tumor model.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono

• Haijaonyeshwa kwamba plasma ya N₂/O₂ ni treatment yenye ufanisi na salama kwa wagonjwa wa kansa wa binadamu.
• Haijaonyeshwa kwamba aina zote za kansa zina sensitivity sawa.
• Haijaonyeshwa kwamba tishu zote za kawaida za binadamu zitalindwa dhidi ya treatment.
• In vivo normal-tissue selectivity au comprehensive systemic toxicity haikujaribiwa.
• Ufanisi wa systemic intravenous au intraperitoneal haujaonyeshwa.
• Muundo wa kikemia wa kiasi wa aina zote za ROS na RNS zilizozalishwa haujaamuliwa.
• Mchango wa jamaa wa kibiolojia wa aina mahususi tendaji zinazotokana na nitrojeni haujatatuliwa kikamilifu.
• Matokeo ya lipid peroxidation si ushahidi wa canonical ferroptosis.
• Matokeo ya sorafenib na ferrostatin-1 hayaonyeshi kwamba mechanism yote ya kifo ni ferroptosis.
• Local mouse treatment haiamui tissue penetration au clinical dose kwa binadamu.

Nguvu kuu za utafiti

Utafiti haukuishia kwenye modeli moja ya seli ya kansa; ulitathmini kwa pamoja modeli za saratani ya endometriamu, shingo ya kizazi, melanoma na mapafu kutoka asili tofauti za tishu. Mbinu hii ilisaidia kuonyesha kwamba response kwa plasma ya N₂/O₂ si ya cell line moja pekee.

Nguvu ya pili ni kwamba cell death haikutathminiwa kwa kupungua kwa MTT viability pekee. Annexin V/PI, apoptotic gene expression, caspase/PARP cleavage, viashiria vya DNA damage, viashiria vya ER-stress na mitochondrial membrane potential ziliunda tabaka huru za ushahidi zinazokamilishana.

Nguvu ya tatu ni kwamba kwa oxidative stress, si ongezeko la ROS pekee lililoonyeshwa; rescue intervention kwa GSH pia ilifanywa. Hivyo functional link kati ya ROS na cytotoxicity iliimarishwa.

Nguvu ya nne ni kwamba tafsiri ya ferroptosis haikuachwa kwa matokeo ya ferroptosis-related gene set pekee. Majaribio ya sorafenib, ferrostatin-1, Liperfluo na DFO yalitumiwa kutenganisha lipid peroxidation na canonical ferroptosis.

Nguvu ya tano ni kwamba matokeo ya cell culture yalijaribiwa zaidi katika kiwango cha in vivo tumor growth kwa modeli ya panya B16F10/C57BL/6.

Vikwazo vikuu vya utafiti

Kikwazo cha kwanza: Normal-cell selectivity ilitathminiwa in vitro kwa human primary fibroblasts pekee. Aina tofauti za normal epithelial, endothelial, immune au organ cells hazikulinganishwa kwa utaratibu.

Kikwazo cha pili: Jaribio la in vivo lilitegemea local application. Kwa kuwa normal-organ histopathology na systemic toxicity hazikufanywa, kikomo cha physiological safety hakikuamuliwa.

Kikwazo cha tatu: Spectrum nzima ya reactive species haikufafanuliwa. Ingawa Griess/c-PTIO ilitumika kwa NO/RNS na cellular analysis kwa ROS, mchango wa kila specific nitrogen-derived reactive species haujulikani.

Kikwazo cha nne: Haijaonyeshwa kwamba mechanistic analyses zilirudiwa kwa depth sawa katika modeli zote za seli. Baadhi ya majaribio yalifanywa kwenye HEC1A, mengine kwenye HeLa, B16F10 au H1299.

Kikwazo cha tano: Utafiti haukutathmini clinical dosing, tissue penetration, pharmacodynamics au long-term repeated applications.

Kikwazo cha sita: Kuna inconsistencies za terminology/editorial katika toleo la Article in Press: allograft/xenograft, usemi wa intratumoral/subcutaneous injection, baadhi ya Figure 2 legend appearance na visibility ya biological replicates katika Methods-heatmap zinaweza kufafanuliwa kabla ya final typesetting.

Kikwazo cha saba: Kwa kuwa Supplementary Figure S1/S2 hazipo katika full scientific visual body ya main PDF iliyopakiwa, raw graphs za majaribio ya ziada hazijazalishwa upya katika makala hii ya Verianla.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Kichwa asili: Nitrogen-oxygen plasma induces selective cancer cell death via apoptosis with lipid-peroxidation-associated mechanisms across multiple cancer cell models.

Waandishi na mpangilio: Bum-Ho Bin, Sofia Brito, Sun Ju Park, Ki Bok Yoon, Hyojin Heo, Hantae Jo, Sehyun Chae, Byung Mook Weon, Sung Kweon Cho, Jiyoon Kim.

Mchango sawa: Bum-Ho Bin, Sofia Brito na Sung Kweon Cho.

Mwandishi anayewajibika: Jiyoon Kim.

Taasisi 1: Department of Biological Sciences, Ajou University, Suwon, Republic of Korea.

Taasisi 2: The Anti-Aging Lab, Co. Ltd., Suwon, Republic of Korea.

Taasisi 3: Department of Pharmacology, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Republic of Korea.

Taasisi 4: Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB), Daejeon, Republic of Korea.

Tofauti ya chanzo kwa taasisi 5: Article in Press PDF inatoa affiliation ya Hantae Jo kama Department of Neurosurgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul. Ukurasa wa sasa wa bibliografia wa Nature unaonyesha Department of Nuclear Medicine, Yonsei University College of Medicine, Seoul. Tofauti hii imehifadhiwa wazi kati ya early-access version na current publication metadata.

Taasisi 6: Department of Smart Health Science and Technology, Kangwon National University, Chuncheon, Republic of Korea.

Taasisi 7: Department of Biotechnology and Bioengineering, College of ACE, Kangwon National University, Chuncheon, Republic of Korea.

Taasisi 8: School of Advanced Materials Science and Engineering, Sungkyunkwan University, Suwon, South Korea.

Taasisi 9: Department of Pharmacology, Ajou University School of Medicine, Suwon, South Korea.

Taasisi 10: Department of Medical Sciences, Graduate School, The Catholic University of Korea, Seoul, South Korea.

Taasisi 11: Institute for Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, South Korea.

Jarida: Scientific Reports.

Mchapishaji: Nature Portfolio / Springer Nature.

DOI: 10.1038/s41598-026-59131-4.

Tarehe ya kupokelewa: 9 Mei 2025.

Tarehe ya kukubaliwa: 18 Juni 2026.

Tarehe ya kuchapishwa mtandaoni: 6 Julai 2026.

Aina ya chanzo na hali ya peer review: Makala ya utafiti ya Scientific Reports iliyopitiwa na peer review na kukubaliwa; PDF iliyopakiwa sasa na ukurasa wa sasa wa Nature zimeainishwa kama Article in Press/unedited early-access version.

Hali ya Version of Record: Ukurasa rasmi wa sasa unaeleza kwamba version hii itabadilishwa kiotomatiki na final Version of Record baada ya final editorial processing; kwa hiyo PDF ya sasa haijaainishwa kama final VOR.

Volume / issue / article number: Katika Article in Press PDF ya sasa na official early-access bibliographic view, final article number haijatolewa wazi; Verianla haijakisia field hii.

Leseni: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Aina ya utafiti: In vitro cell culture + molecular mechanism + transcriptomics + in vivo syngeneic murine melanoma tumor model.

Modeli kuu za seli: HEC1A, HeLa, B16F10, H1299 na human primary fibroblasts.

Kifaa kikuu cha plasma: Custom-built plasma jet system yenye parallel electrodes mbili iliyotolewa na TGT, Daejeon, Korea; electrode moja imefunikwa kwa ceramic dielectric; 5 kW na 30 kHz high-voltage power supply; circulating water cooling.

Vigezo vya gesi: N₂ 10 cc/min, O₂ 5 cc/min; 135.200 mm³ mixing chamber; chanzo kinatoa thamani ya 225 V katika sentensi hiyo hiyo lakini hakielezi kando uhusiano wa thamani hii na high-voltage source parameters.

Upimaji wa RNS: Nitrite Assay Kit / Griess Reagent; absorbance 540 nm, SpectraMax 190.

Matumizi ya kawaida ya plasma in vitro: Culture medium hutibiwa kwa plasma kwa dakika 10; seli kwa kawaida hutibiwa kwa saa 24. Figure 1 pia ina hali za plasma treatment za dakika 0, 5 na 10.

Modeli ya panya: C57BL/6 wa kike, n=9/group; 1 × 10⁶ B16F10 cells; PBS:Matrigel 1:1; flank subcutaneous tumor establishment; randomization katika takribani 50 mm³.

Matibabu ya panya: 100 µL PBS au plasma-treated PBS; mara tano kwa wiki, jumla ya applications 15, siku 21.

Maelezo ya terminology ya injection: Methods hutumia “subcutaneous injections”, huku Abstract na Discussion zikitumia “intratumoral administration”. Tofauti ya chanzo imehifadhiwa.

Maelezo ya terminology ya tumor model: Methods inaeleza mfumo wa B16F10/C57BL/6 kama syngeneic murine melanoma/allograft; Figure 1F caption hutumia neno “xenograft”. Muundo wa kibiolojia wa model unaendana na allograft definition, lakini Verianla haifichi inconsistency ya source text.

Idhini ya maadili ya wanyama: Semyung University Institutional Animal Care and Use Committee, Approval No. smecae 22-08-02; ARRIVE guidelines.

MTT: 1 × 10⁴ seli/well, 96-well plate, absorbance 570 nm.

FACS: >10.000 seli; Annexin V-FITC/PI apoptosis detection; BD FACSAria III; BD FACSDiva v8.0.3.

Lipid-peroxidation FACS: 1 µmol/L Liperfluo, saa 1.

qRT-PCR: RNeasy Plus Mini Kit, AccuPower RT PreMix, SYBR Green, AriaMx Real-Time PCR System; GAPDH reference; mbinu ya ΔΔCt.

Malengo ya Western blot: γH2AX, BIP, CHOP, PARP, caspase-3, p53 na phospho-p53(Ser15).

RNA-seq: RIN >9; Poly(A)+ mRNA; TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit; Illumina NovaSeq 6000; Macrogen; chanzo Methods kinaripoti biological replicates tatu kwa kila condition.

Vigezo vya DEG: adjusted p≤0.05 na |log₂ fold-change|>0.428; chanzo kinafafanua hii kama threshold ya takribani 1.35-fold.

Holotomography: Tomocube HT-2H; TomoStudio; ImageJ2; 1 µmol/L Liperfluo au JC-1 iliyochapishwa kama 1 mM katika chanzo.

Modulators za ferroptosis: Sorafenib 1 µM; ferrostatin-1 10 µM; concentration ya DFO haijatolewa kwa uhakika katika main text husika ya main PDF na haijabuniwa na Verianla.

Takwimu: Angalau majaribio matatu huru; mean±SEM; two-tailed Student's t-test au one-way ANOVA + Tukey post-hoc; P<0.05.

Mechanism kuu ya kifo: Apoptosis; oxidative-stress-associated lipid peroxidation hutoa mchango wa ziada.

Kikomo cha ferroptosis: Canonical iron-dependent ferroptosis haiungwi mkono; DFO haikutoa rescue, Slc7a11/Slc7a5 ziliongezeka na Acsl4 ikapungua.

Data availability: Raw na processed RNA-seq data zimehifadhiwa chini ya GEO GSE231561.

Ufadhili: Ajou University Research Fund; National Research Foundation of Korea Basic Science Research Program, RS-2021-NR060141 na RS-2024-00405790; Korea Health Technology R&D Project/KHIDI, RS-2025-25459560.

Michango ya waandishi: Sofia Brito na Bum-Ho Bin walibuni utafiti. Hyojin Heo, Ki Bok Yoon, Hantae Jo na Sehyun Chae walifanya utafiti na ukusanyaji wa data. Sofia Brito, Sun Ju Park na Sung Kweon Cho walifanya formal analysis na visualization. Byung Mook Weon alitoa methodology na technical resource support. Jiyoon Kim na Bum-Ho Bin walishughulikia resource provision, supervision na interpretation. Sofia Brito na Bum-Ho Bin waliandika original draft; Sun Ju Park, Sung Kweon Cho na Jiyoon Kim walikagua na kuhariri text.

Mgongano wa maslahi: Waandishi wameripoti kuwa hakuna competing interests.

Kikomo cha supplementary-material: Main PDF inarejelea Figure S1 na Figure S2. Kwa kuwa separate supplementary file haikutolewa na mtumiaji, version hii ya Verianla hutumia tu matokeo ambayo main PDF inaripoti wazi kuhusu majaribio haya ya ziada; haitoi numbers mpya zisizoonekana kutoka supplementary figures.

Maelezo ya early-version ya Figure 2: Ingawa main text ya Figure 2A na FACS panels zinaunga mkono tafsiri ya apoptosis iliyo kubwa zaidi katika cancer cell, mwonekano wa bar-graph legend/fill katika Article in Press print hauonekani kuendana kikamilifu na text. Kwa hiyo precise percentage values hazijazalishwa upya.

Maelezo ya replicate ya RNA-seq: Ingawa Methods inaripoti biological replicates tatu kwa kila condition, Figure 4D heatmap inaonyesha wazi rows mbili za control na mbili za plasma. Chanzo hakielezi tofauti hii.

Kikomo cha kliniki: Matibabu hayajajaribiwa kwa binadamu. In vivo data ni ya local B16F10/C57BL/6 mouse model; systemic exposure, organ toxicity, normal-tissue histopathology na human therapeutic efficacy hazijaonyeshwa.